AGES-Webribo
Systematik in Clostridium difficile PCR-Ribotyping
Alexander Indra
AGES-Institut für medizinische Mikrobiologie und Hygiene Wien
Nationale Referenzzentrale für Clostridium difficile
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Clostridium difficile
Clostridium difficile ist auch in Österreich ein bedeutender nosokomialer
Erreger
• im Jahr 2003 wurden 777 Fälle registriert
– 53 davon mit tödlichem Ausgang
• Im Jahr 2010 wurden von Spitälern 2.186 Clostridium-difficile-Infektionen
gemeldet
– 181 davon mit tödlichem Ausgang
Das ist nur die Spitze des Eisbergs!
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Clostridium-difficile-Diagnostik in der österreichischen Referenzzentrale
•C. difficile Antigen Nachweis aus Stuhlproben
•C. difficile Toxinnachweis aus Stuhl (Tox A/B)
•C. difficile Kulturdiagnostik
– direkte Anzucht
– Flüssig-Anreicherung mit Alkoholschock
– Resistenztestung mittels E-Test
•Molekularbiologischer Nachweis von tcdA, tcdB, tcdC-Deletionen, cdtA und cdtB
•PCR-Ribotyping mittels Kapillar-Gel-Elektrophorese
• Im Bedarfsfall
– MLVA-Typisierung zur Subtypisierung im Ausbruchsfall
– tcdC Sequenzierung
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PCR-Ribotyping
• im Clostridium-difficile-Genom befinden sich bis zu 15 Kopien des
ribosomalen RNA-Operons
– in diesem Operon finden sich Gene für 16s, 23s und 5s RNA
– die Gene der 5s, 16s und 23s-RNA sind durch kurze DNA-
Abschnitte, die Intergenic-Spacer-Regions (ISR), getrennt
– die Abschnitte zwischen 16s und 23s können unterschiedlich
lang sein (zw. 200 und 650bp)
•durch PCR-Amplifikation der 16s-23s-ISR und die Bestimmung der
Fragmentlängen ist eine Typisierung möglich
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PCR-Ribotyping: Was steckt dahinter
Verantwortlich für die für die Unterschiede zwischen verschiednenen PCR Ribotypen sind 9bp langer Repeat im ISR
Dieser Repeat trennt
33 bp
53 bp lange variable DNA Sequenzen
Innerhalb einiger ISR findet man auch eine 172 bp lange spacer sequence die eine tRNA-Ala codiert
Dies ist zeigt eine eine hoch strukturierte Organisation des 16S–23S ISR von C. difficile
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182 bp ISRstart-v1 IB 0 bp IB ISRend-v2
215 bp ISRstart-v1 IB 33 bp v2 IB ISRend-v4
215 bp ISRstart-v2 IB 33 bp v2 IB ISRend-v1
215 bp ISRstart-v1 IB 33 bp v2 IB ISRend-v1
214 bp ISRstart-v3 IB 33 bp v3 IB ISRend-v5
215 bp ISRstart-v3 IB 33 bp v3 IB ISRend-v1
215 bp ISRstart-v3 IB 33 bp v3 IB ISRend-v6
215 bp ISRstart-v1 IB 33 bp v3 IB ISRend-v1
375 bp ISRstart-v4 IB 33 bp v5 IB ISRend-v1
259 bp ISRstart-v5 IB 33 bp v11 IB 33 bp v10 IB ISRend-v3
277 bp ISRstart-v1 IB 33 bp v14 IB IB ISRend-v1
277 bp ISRstart-v1 IB IB 33 bp v1 IB ISRend-v1
277 bp ISRstart-v1 IB IB 33 bp v1 IB ISRend-v1
279 bp ISRstart-v1 IB IB 33 bp v4 IB ISRend-v3
276 bp ISRstart-v1 IB IB 33 bp v5 IB ISRend-v5
277 bp ISRstart-v1 IB IB 33 bp v5 IB ISRend-v1
498 bp ISRstart-v4 IB IB IB-T:C 33 bp v6 IB ISRend-v1
318 bp ISRstart-v1 IB IB 33 bp v11 IB 33 bp v7 IB ISRend-v5
500 bp ISRstart-v4 IB IB IB 33 bp v8 IB ISRend-v7
321 bp ISRstart-v1 IB IB 33 bp v12 IB 33 bp v9 IB ISRend-v3
363 bp ISRstart-v1 IB-T:G IB 33 bp v12 IB 33 bp v10 IB 33 bp v10 IB ISRend-v3
361 bp ISRstart-v1 IB-T:G IB 33 bp v12 IB 33 bp v10 IB-C:T 33 bp v10 IB ISRend-v8
319 bp ISRstart-v1 IB-T:G IB 33 bp v13 IB 33 bp v10 IB ISRend-v9
397 bp ISRstart-v4 IB IB ISRend-v3172 bp v2
172 bp v1
171 bp v1
172 bp v1
53 bp v2
53 bp v1
53 bp v6
53 bp v6
53bp v8
53bp v8
53bp v8
53bp v9
53 bp v3
53 bp v4
53 bp v5
53 bp v1
53 bp v7
53 bp v1
53 bp v7
53 bp v7
Indra & Blaschitz et al .2010
PCR-Ribotyping: Was steckt dahinter
• slipped-strand mispairing • Homologe intra-chromosomal Rekombination • Homologe inter-chromosomal Rekombination?
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PCR-Ribotyping
• ist derzeit die wichtigste Methode zur Clostridium-difficile-Typisierung
•derzeit sind mehr als 250 PCR-Ribotypen in der Referenzzentrale in
Wales bekannt
•weltweit die wichtigsten PCR-Ribotypen sind 001, 014, 017,078 und
027
– neben dem ersten Nachweis eines Ribotyps 027 in Österreich
konnten auch ca. 350 verschiedene Ribotypen bestimmt werden
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konventionelles PCR-Ribotyping: Probleme
•problematischer Datenaustausch
– keine einheitliche Nomenklatur
•schwer zu beeinflussende Laufbedingungen beeinflussen die Analyse
– DNA Konzentration
– verwendete Agarose
– Temperatur
– Spannung
•schwierige Interpretation von Bandenmustern
– z.B. PCR-Ribotyp 066
– in Literatur mit Toxinotyp V und VI beschrieben
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PCR-Ribotyping
Ribotyping
100
98
96
94
92
90
88
86
PCR-Ribotyping
Probe 118
Probe 195
Probe 124
Probe 182
Probe 32
Probe 41
Probe 160
Probe 104
Probe 350
Probe 143
Probe 100
Probe 129
Probe 342
Probe 349
Probe 212
Probe 112
Probe 156
Probe 123
Probe 132
Probe 101
Probe 159
Probe 201
Probe 202
Probe 30
Probe 40
053
AI-52
078
078
027
AI-14
AI-29
AI-23
AI-50
AI-19
014
014
014
014
AI-9
017
AI-20
AI-27
AI-12
001
001
001
001
001
001
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konventionelles PCR-Ribotyping
• was muss verbessert werden?
– Vergleichbarkeit von Ergebnissen
– Datenzuverlässigkeit
– jedes Labor produziert vergleichbare Daten
– eine Datenbank zur Dateninterpretation
» Unabhängigkeit von Stammsammlungen
– einheitliche Nomenklatur
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Capillary gel electrophoresis based PCR ribotyping
• hohe Reproduzierbarkeit durch Verwendung
– eines Flureszenz markierten Primers
– eines vorgegebenen Größenstandards, der gleichzeitig mit jeder Probe
mitläuft
– reproduzierbare Laufbedingungen
• höherer Proben-Durchsatz bei
niedrigeren Kosten
• Vergleichbarkeit der Ergebnisse
• einfache Datenanalyse
• höhere Diskreminationsfähigkeit
– Fragmente mit 1.5 Basen Abstand
und mehr können
unterschieden werden
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Capillary gel electrophoresis based PCR ribotyping: Diskreminationsfähigkeit
6 verschiedene 014 Subtypen
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AGES-WEBRIBO
•AGES-Webribo
– ist eine kostenlose Web-Datenbank zur Interpretation von
Clostridium-difficile-Typisierungsergebnissen, die mittels Kapillar-
Gel-Elektrophorese basierenden PCR-Ribotyping gewonnen wurden
– Die Fragmentlängen und die dazugehörenden Peakhöhen der
Proben können direkt durch AGES-WEBRIBO oder mittels
GENESCANNER-, GENEMAPPER- oder PEAKSCANNER-Software
bestimmt werden
– Der Datenimport erfolgt mittels FSA, CSV- oder Excel-Files
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AGES-WEBRIBO
•Aufgrund vorgegebener Analysekriterien wird ein Qualitätscheck der Ergebnisse durch die AGES-Webribo-Software durchgeführt
– z.B. eine maximal erlaubte Peakhöhe verhindert die falsche Interpretation von „Split-peaks“
– Eine minimale Peakhöhe verhindert die falsche Interpretation von „Pull-Ups“
– Ergebnisse werden sofort als E-Mail versandt
– Informationen zu jedem PCR-Ribotyp sind online verfügbar
– neue PCR-Ribotypen müssen durch erneute Analyse bestätigt werden
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AGES-WEBRIBO
AGES-WEBRIBO verwendet einen neu entwickelten Algorithmus
zum Vergleich von neuen Proben mit der Datenbank
•dies erlaubt den Vergleich
von Daten unabhängig von
– Größenstandard
– dieser muss den Analysebereich (150-650Basen) umfassen
– Sequencer
– jedweder Kapillarlänge
– der verwendeten Gele
– Primer
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•52 Ausbruchsfälle werden identifiziert
• 38 PCR-Ribotype-027-CDI-Fälle allein im Spital HX
– 9 von 10 Pavillons des Spitals sind betroffen
– alleine 25 PCR-Ribotype-027-CDI-Fälle in einem der 9
• die 14 anderen Fälle traten in 4 weiteren Wiener Spitälern auf
– alle 14 waren eindeutig mit dem Spital HX assoziiert
10
9
8
7 ONE CASE
6
5
4
3
2
1
45 46 47 48 49 50 51 52 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35
Nov Dec Jan Feb Mar Apr May Jun Jul Aug
THE INDEX CASE
AGES-WEBRIBO: PCR-Ribotyp 027 Ausbruch in Wien
AGES-Webribo 24
zwischen März und August wurden 720 Proben allein aus Wiener Spitälern an die Referenzzentrale übersandt
insgesamt wurden 1320 C.-difficile-Proben in dieser Zeit untersucht
1042 C.-difficile-Proben konnten angezüchtet werden
die Typisierung erfolgte mittels Capillar Gel Electrophorese PCR-ribotying in Kombination mit AGES-WEBRIBO
152 unterschiedliche PCR-Ribotypen wurden identifiziert
alle 52 PCR-Ribotype-027-Proben wurden auch MLVA-typisiert
die Arbeit wurde von nur 2 Teilzeit-BMAs zusätzlich zur weiteren Routinearbeit durchgeführt
• die durchschnittliche Zeit bis zum Befund betrug 6 Tage
AGES-WEBRIBO: PCR-Ribotyp 027 Ausbruch in Wien
AGES-Webribo 27
Das Team
Fr. BMA. Hasenberger
Fr. BMA. Kunczer
Fr. BMA. Herold
Fr. BMA Fiedler
Hr. Dr. Hufnagl
Fr. Mag. Pecavar
Fr. Dr. Blaschitz
Fr. Dr. Huhulescu