16 de marzo de 2011
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Analisis de
Contaminantes Orgánicos
Emergents per UHPLC/MS
Jaume C. Morales
Especialista Productos LC/MS
Agilent Technologies
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La Gran Problemática en Análisis de
Aguas: los Contaminantes
Emergentes
• La gran cantidad de potenciales
contaminantes “desconocidos” que
pueden llegar a emerger.
• La sensibilidad en los Q y QqQ se va
reduciendo con el nº de compuestos a
controlar que coeluyen.
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Triazine & phenyl urea herbicides
Chlorinated phenoxy acid herbicides
Glyphosate
Asulam
Surfactants
Oestrogenic Steroids
Organophosphorus compounds
Paraquat, Diquat, Chlormequat
Carbamates
Acrylamide
Veterinary drug residues
Pharmaceutical residues
PFOS/PFOA
Brominated flame retardents
Natural products
PCP Personal care products
Bis phenol A
Toxins
PROGRAMA: Análisis
de Contaminantes
Orgánicos Emergentes
por UHPLC/MS:
• Retos Analíticos
• Tipos de Enfoque Analítico
• Herramientas (según enfoque) y
Posibilidades.
Ejemplo Aplicación:
• Cuantificación y screening de
productos farmacéuticos y de
higiene personal en aguas de
consumo humano (PPCPs)
mediante Triple Cuadrupolo y
sistemas de Tiempo de Vuelo
TOF/QqTOF.
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Retos Analíticos en Análisis de Aguas
• Sensibilidad y Selectividad: Muy bajos niveles (especialmente en
aguas debido a su elevada ingesta).
– Uso MS y preconcentración.
• Rapidez y reducción supresión ionización.
– Mejorar con UHPLC la cromatografía sin incrementar el tiempo.
– Reducir los tiempos con UHPLC manteniendo la resolución
cromatográfica.
• El elevado número de potenciales contaminantes
conocidos y “desconocidos” que pueden llegar a emerger:
“Screening” de cientos/miles de compuestos.
• Automatización preconcentración y “clean-up”.
• ………
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Tipos de EnfoqueAnalítico
Análisis de
Contaminantes
Orgánicos Emergentes
por UHPLC/MS:
Enfoque Específico:
• Cribado y Cuantificación de
contaminantes Diana:
“Targets”.
Enfoque Genérico:
• Cribado Masivo (“ilimitado”) de
Contaminantes: “Non Targets” +
“Targets”
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Enfoque Específico:
• Cribado y Cuantificación de
contaminantes Diana:
“Targets”.
• Requiere un MS Sensible, Específico y
Muy Rápido
• Equipo ideal: QqQ en modalidad MRM.
• Alternativas TOF/ QTOF en modo MS.
• Virtudes modalidad MRM:
• Sensibilidad: hasta zeptomoles inyectados.
• Rapidez: hasta 300 MRM‟s/segundo.
• Robustez.
• Limitaciones modalidad MRM:
• Requiere patrones/muestras para optimizar
MRM’s y conocer sus tiempos de retención.
• Pierde sensibilidad al aumentar el nº de
contaminantes coeluyentes
170 210 250 290
210
222
268 280165
Espectro con
iones del “fondo”(API: ESI, APCI,…)
Q1 sólo deja pasar
el ión “precursor”
210 pass
190 210
210
Q3 monitoriza sólo los
fragmentos 158 y 191
característicos del ión
210 para cuantificar y
cualificar con máx.
sensibilidad
160
158
190
191
sin “fondo químico”
Espectro de
una
fenilurea
Celda Colisión
rompe el ión
210 (y sus
productos)
150 170 190 210
210158
191
Transición: 210 158
MRM (Multiple Reaction Monitoring) para Cuantificar con Máxima
Sensibilidad, Selectividad y Rapidez
QqQ
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Enfoque Genérico:
• Cribado Masivo (“ilimitado”)
de Contaminantes: “Non
Targets” + “Targets”
• Requiere un MS:
• Universal y Muy Selectivo.
• Masa Exacta y Fidelidad Isotópica*.
• Masa Exacta independiente de la
concentración del analito
• Sensible y Rápido.
• Equipo ideal:TOF/ QTOF en modo MS.
• Alternativas: ninguna adecuada*
• Virtudes TOF/ QTOF en modo MS.
• Se puede detectar cualquier compuesto
ionizado Cribados ilimitados (no se
requieren patrones).
• Rapidez: admite picos de tan sólo
0,5-1 segundo de ancho en línea de base.
• Limitaciones :
• Menor sensibilidad que QqQ en MRM de gama
equivalente.
• Ficheros de tamaño considerable.*Tampoco hibridas con masa exacta.
MS/MS con Q-TOF para Cuantificar y Cualificar con Máxima Selectividad e Independencia de Compuestos Coeluyentes
170 210 250 290
210
222
268 280165
Espectro con
iones del
“fondo” (API:
ESI, APCI,…)
Q1 sólo deja
pasar el ión
“precursor”
210 pass
190 210
210
Celda Colisión
rompe el ión
210 (y sus
productos)
Tubo de Vuelo monitoriza con “masa exacta” TODOS los
fragmentos característicos del ión 210 para cuantificar y cualificar con máxima
información y seguridad.
sin “fondo químico” y con “masa exacta”
DC Quad
Octopole 2
Ion Pulser
Ion Mirror
Detector
Tur
bo
Filtro Masa: Cuadrupolo 1 (Q1) Celda Colisión
150 170 190 210
210.222
158.123
191.321
Espectro completo
QTOF
TOF
slide
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“El poder la Masa Exacta ROBUSTA”: Selectividad
Cuantitativa tipo MS/MS con Cromatogramas de MS con Iones
con Masa Exacta. Ejemplo: 2ng/ml (2ppb) Clenbuterol en Orina
IC: 277.1 m/z - Ventana Extración 1 Da
Clenbuterol S/N = 14
Rango extracción típico Cuadrupolo /TRAP /QqQ /QTRAP
IC: 277.087 m/z - Ventana Extración 0.016 Da +/- 30ppm
S/N = 102
LC/MS-TOF Agilent 6210
Ejemplo con 6210
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PROGRAMA: Análisis de
Contaminantes Orgánicos
Emergentes por
UHPLC/MS:
• Retos Analíticos
• Tipos de Enfoque Analítico
• Herramientas y Posibilidades.
Ejemplo Aplicación:
• Cuantificación y screening de
productos farmacéuticos y de higiene
personal en aguas de consumo
humano (PPCPs) mediante Triple
Cuadrupolo y sistemas de Tiempo de
Vuelo TOF/QqTOF.
Enfoque Específico:
• Cribado y Cuantificación de
contaminantes Diana:
“Targets”.
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Herramientas para Solventar Retos en Análisis
Aguas:
• LC/MS más sensibles y rápidos:
– Agilent 6490/6460 i-Funnel /Jet Stream-QqQ.
• Herramientas de software que optimizan la eficiencia del proceso de medida:
– DMRM: Dynamic MRM, Nuevo tMRM
– MRM Optimizer
• Cromatografía más rápida y eficiente: UHPLC/MS:
– Nuevo Agilent UHPLC/RRLC: 1290/1260 Infinity.
• Disponibilidad de Kits de Aplicaciones(y de preparación muestras).
• Herramientas de automatización, “Screnning” masivo,..……
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Herramientas para Solventar Retos en Análisis
Aguas:
• LC/MS más sensibles y rápidos:
– Agilent 6490/6460 i-Funnel /Jet Stream-QqQ.
• Herramientas de software que optimizan la eficiencia del proceso de medida:
– DMRM: Dynamic MRM, Nuevo tMRM
– MRM Optimizer
• Cromatografía más rápida y eficiente: UHPLC/MS:
– Nuevo Agilent UHPLC/RRLC: 1290/1260 Infinity.
• Disponibilidad de Kits de Aplicaciones(y de preparación muestras).
• Herramientas de automatización, “Screnning” masivo,..……
¿Límites de Sensibilidad Actuales con Triple Cuadrupolo?:
Agilent QqQ-6490 con iFunnel Technology
Hexabore Capillary
• Capilar con 6 entradas.
• Muestrea x10 más gas
rico en iones de la fuente.
• Captura la mayor parte del
gas de la región de la
fuente.
Agilent Jet Stream
• Confinamiento térmico
de la pluma de ESI.
• Muy eficiente
desolvatación para crear
iones en fase gaseosa.
• Crea una zona rica en
iones.
Dual Ion Funnel
• Elimina el gas, pero
captura los iones
• Elimina el ruido de
neutros
• Prolonga la vida útil de
la bomba turbo
Página 14
Nuevo: Agilent Jet Stream. Thermal Gradient Focusing Technology
Gas de
nebulización
Capilar de
resistivo
Gas de
secado
Flujo colimado de
gotas nebulizadas
generan un mejor
rendimiento en fuente
Entrada LC
Sheath gas
calentado (hasta 400ºC)
Elevada mejora en Sensibilidad.
Mejora en la Nebulización.
Mejora en la Desolvatación.
Iones Focalizados en una zona
colimada por contención térmica.
Mejora en la Eficiencia de la
Ionización y Muestreo.
Página 15
Antes de Calentar el “Sheath Gas” en
Jet Stream: modo electrospray convencional
Sin calentar el “Sheath Gas”
Página 16
Página 17
Con el “Sheath Gas” calentado
Con el “Sheath Gas” Calentado
modo “Jet Stream”
QqQ-6490
Hexabore
capillary
¿Cómo Funciona el Ion Funnel?
The RF Voltage
focuses the ions
to the center.
The DC Voltage
accelerates the
ions to the exit.
RF Drive
DC Drive
Unfocused
Ions and Gas
Enter
Focused
Ions Out
La tecnología iFunnel
del 6490 permite una
muy rápida
conmutación (30ms) de
polaridad + / -
Página
18
10-20m
200 zeptomoles
90 atogramos
Verapamil
Injectados en-columna
Acquisition Time (min)
+ MRM (455.3 -> 164.9)
0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9
1x10
4.2
4.3
4.4
4.5
Triple Cuadrupolo 6490 Proporciona
Limites Detección Zeptomolares
Página 19
¿Qué es un Zeptomol?
¿¿¿¿ Zepto ???FACTOR POR EL QUE HAY QUE MULTIPLICAR
LA UNIDADMULTIPLO PREFIJO
ABREVIATU
RA
0,1 mol 10-1 mol decimol dM
0,01 mol 10-2 mol centimol cM
0,0001 mol 10-3 mol milimol mM
0,0000001 mol 10-6 mol micromol μM
0,0000000001 mol 10-9 mol nanomol nM
0,0000000000001 mol 10-12 mol picomol pM
0,0000000000000001 mol 10-15 mol femtomol fM
0,0000000000000000001 mol 10-18 mol attomol aM
0,0000000000000000000001 mol 10-21 mol zeptomol zM
0,0000000000000000000000001 mol 10-24 mol yoctomol yM
Page
20
602 moleculas
< 1molécula
Página 20
Re
se
rpin
e R
es
po
ns
e
(Sig
nal/N
ois
e)
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
10000
2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010
AB/Sciex
Agilent
New Agilent 6490
Ag
ile
nt
64
60
Ag
ile
nt
64
30
Ag
ile
nt
64
10
T R I P L E Q U A D R U P O L E I N S T R U M E N T S P E C I F I C AT I O N S
¿Qué Aporta Disponer la Enorme Sensibilidad de
un Triple Cuadrupolo?
Página 22
• Poder simplificar el proceso de preparación de muestra mediante
una simple dilución con un factor muy elevado.
• Poder abordar en buenas condiciones las analíticas más
exigentes en sensibilidad, evitando el uso de pre-concentración.
• Poder disponer de una “buena”* sensibilidad en modo Scan (aunque
mucho peor que en MRM) comparada con otras técnicas tradicionalmente
más sensibles en modo barrido.
* Pero sin la selectividad de la masa exacta
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Herramientas para Solventar Retos en Análisis
Aguas:
• LC/MS más sensibles y rápidos:
– Agilent 6490/6460 i-Funnel /Jet Stream-QqQ.
• Herramientas de software que optimizan la eficiencia del proceso de medida:
– DMRM: Dynamic MRM, Nuevo tMRM
– MRM Optimizer
• Cromatografía más rápida y eficiente: UHPLC/MS:
– Nuevo Agilent UHPLC/RRLC: 1290/1260 Infinity.
• Disponibilidad de Kits de Aplicaciones(y de preparación muestras).
• Herramientas de automatización, “Screnning” masivo,..……
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x3 x4 x4 x3 x4 x2 x1
Cycle time
Rt
QqQ-dMRM “Dynamic Multiple Reaction Monitoring”:
Mayor Sensibilidad
= nº Concurrent dMRM
dMRM:
• MRM Dinámico con ventanas de
monitorización individuales
creadas automáticamente a partir
del tiempo de cada compuesto.
• Permite mejorar la
sensibilidad (↑ dwell time) o la
frecuencia de adquisición de datos
para poder reducir tiempo de análisis.
dMRM
RSD%
requeridoPtos./pico
necesarios
<1% 15
1-3% 12
10-12% 8
“Triggered MRM (tMRM) Data Dependent”: ~“Scan”
Especifico con la Sensibilidad y Rapidez de un MRM
Cuantificar e Identificar con la sensibilidad y rapidez de un MRM
“Espectro MS/MS compuesto para analito b”
co
un
ts
100 200 300 m/z
Product %MRM
Ion Scan Sensitivity
Time
QTRAP
5500~ 100 msec ~ 10%
Vantage ~ 150 msec ~ 2%
Xevo ~ 150 msec ~ 2%
6460/90 ~ 30 msec 100%
1 MRM de monitorización por compuesto dispara hasta 8 MRM de
confirmación de cada uno de los compuestos detectados
Muy útil para cuantificación y confirmación masiva de analitos con
Triple Cuadrupolo: péptidos, metabolitos, análisis multiresiduos, …
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Página 26
Mass Hunter Optimizer : La Solución para el Desarrollo
Automatizado de Métodos MRM (QqQ) con Centenares de
Compuestos. Compound Entry & Method Setup
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Herramientas para Solventar Retos en Análisis
Medioambiental:
• LC/MS más sensibles y rápidos:
– Agilent 6460 Jet Stream-QqQ.
• Herramientas de software que optimizan la eficiencia del proceso de medida:
– Nuevo DMRM: Dynamic MRM.
– Nuevo MRM Optimizer
• Cromatografía más rápida y eficiente: UHPLC/MS:
– Nuevo Agilent UHPLC: 1290 infinity.
• Disponibilidad de Kits de Aplicaciones(y de preparación muestras) Nuevo!!.
• Herramientas automatización, “Screnning” masivo,..……
7m
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La Importancia de una Buena Separación incluso con LC/MS Altamente Selectivos
30:70 agua/metanol, 0.2 % ácido acético
Inte
nsity
, cps
Difenhidramina
m/z 256.17
Ketoprofeno
m/z 255.10
Time, min
0.0
6.0e4
1.2e5
1.8e5
2.4e5
3.0e5
3.6e5
4.2e5
4.8e5
0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0.90 1.00 1.10 1.20 1.30 1.40
Difenhidramina
m/z 256.17
0.0
6.0e4
1.2e5
1.8e5
2.4e5
3.0e5
3.6e5
4.2e5
4.8e5
Inte
nsity
, cps
0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0.90 1.00
Time, min
Ketoprofeno
m/z 255.10
5:95 agua/metanol, 0.2 % ácido acético
1/7 respuesta (-85%)
Una buena cromatografía
puede mejorar
considerablemente la
sensibilidad y robustez de
los resultados por LC/MS
¿Porqué es Importante la Velocidad en UHPLC / RRLC?El poder de separación de elevadas velocidades lineales
Cromatogramas con escala de tiempo alineada a primer y último picoI.D. & I.M - Waldbronn 5/2009
Columna: ZORBAX RRHD SB-C18 2.1 x 100mm 1.8 µm
Gradiente: ACN/H2O 30/70 a 100/0 a 40ºC Cromatogr. A: 0.5mL/min en 3.0min // B: 0.833mL/min en 1.8min
Inyección: 1µL (Uracilo, Fenol, Metil/Etil/Propil/Butil/Heptil-parabens).
P máx. grad. A= 590bars. B= 905 bars
A 0.5mL/m gr.. 3.0min
K„ = (87 x F x Tg) / ( % x V0 x S)
FxTg = 0.5x3 = 0.833x1.8 = 1.5
B 0.833mL/m
gr. 1.8min
3min Si el producto de Flujo x Tgrad se mantiene
constante el poder de separación no variará (utlizando la misma columna y sin variar los %
solvente orgánico)
1.8min
↑Flujo: Reduce tiempo análisis y mejora
capacidad de separación en gradientes
A 0.5mL/m gr.. 3.0min
B 0.833mL/m
gr. 1.8min
Columnas RRHD & RRHT permiten subir el
flujo SIN reducir resolución para:
- Reducir tiempos (subiendo flujo)
- Aumentar resolución (sin sacrificar tiempo)
Página: 29
0
200
400
600
800
1000
1200
0 1 2 3 4 5
1290 Infinity
1200 Infinity Series: Aumentado los Estándares
y Compatibilidad en HPLC y UHPLC
bar
ml/min
Standard LC
Vendor A1.7µm columns
Agilent RRLC: 1220 & 1260
Infinity Series Columnas 1.8µm
Vendor B1.9µm columns
Vendor C
Vendor D
1290 Infinity le permitirá la máxima reducción de sus tiempos de
análisis y/o aumento de la resolución de sus aplicaciones
52
1200
HPLC Estándar
RRLC
Agilent 1100 y 1200
600
Página: 30
Página: 31
1260
Infinity LC
Modular
600bar
80Hz
2-10x Sensibilidad UV
Precio HPLC–Prestaciones RRLC
100% Compatible con HPLC
1220
Infinity LC
Integrado
600bar
80Hz
2-10x* Sensibilidad UV
Most affordable
HPLC and RRLC
1290
Infinity LC
Modular
1200bar
160Hz
Las Mejores Prestaciones
Máxima FlexibilidadCostes Mantenimiento de HPLC
*2x for build-in VWD, 10x via add-on 1260/1290 DAD
Nueva Serie Agilent 1200 Infinity: Mejorando los
Estándares en HPLC – Mayor Valor para Cualquier Presupuesto
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Bombas 1290 Infinity “versus” 1200/1260 Infinity-El más bajo volumen de retardo para una más rápida cromatografía.
1200 Series
Channel A
Passive Damper
0 - 300 µl
Passive Mixer
400 µl
1200 Series
Channel B
1290 Inifinity
Chanel A
1290 Inifinity
Chanel B
Very Low Noise
~ 800 µl
+ =Active Damping
10µl
Jet Weaver Mixer
35µl
Lowest Noise
• min. 50% lower
Delay Volume
• 10µl / 45µl
• 80x / 20x lower
1290 Infinity
Agilent 1290 Infinity el mejor UHPLC para LC/MS
11
00/1
200/ 1
22
0 &
12
60
In
f.
La Solución: Fibra no recubierta (sílice fundida)
V
V
mD
LFr
24
42
1290 Infinity DAD: Mejora hasta x10 Sensibilidad-1290 Infinity DAD: 11.4 x 1200 Series DAD SL
1290 DAD
60 mm
1200 DAD SL
10mm
Height [mAU] 28.87579 4.93845
Noise [mAU] 0.009806 0.01908
Signal/ noise 2944 259
Sensitivity
increase
+11.4
Columns: 150 x 4.6mm Zorbax SB C18, 5µm
Sample: Anthracene: 835 pg/µL
Mobile phase: A: Water, B: Acetonitrile
Elution: isocratic 80 % B
Injection volume: 5 µL
Flow: 1.5 mL/min
DAD: 251/4nm, Ref= 450/80nm,
2.5Hz, slit width 4nm
min0 1 2 3 4 5
mAU
0
5
10
15
20
25
30
1290 Infinity DAD
1200 Series DAD SL1290 DAD
60 mm
1200 VWD
10mm
Height [mAU] 28.87579 4.79998
Noise [mAU] 0.009806 0.01894
Signal/ noise 2944 253
Sensitivity
increase
+11.61290 Infinity DAD
el detector UV/VIS más sensible del mercado
Página: 33
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Página 34
Herramientas para Solventar Retos en Análisis
Medioambiental:
• LC/MS más sensibles y rápidos:
– Agilent 6460 Jet Stream-QqQ.
• Herramientas de software que optimizan la eficiencia del proceso de medida:
– Nuevo DMRM: Dynamic MRM.
– Nuevo MRM Optimizer
• Cromatografía más rápida y eficiente: UHPLC/MS:
– Nuevo Agilent UHPLC: 1290 infinity.
• Disponibilidad de Kits de Aplicaciones(y de preparación muestras) Nuevo!!.
• Herramientas automatización, “Screnning” masivo,..……
11m
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Página 35
5990-4254EN
Kits de Aplicaciones para
LC/MS-QqQ
Kits Base de Datos DMRM
• Adaptables a la cromatografía del usuario.
• Chequeo opcional de la aplicación on-site.
• Kit 600 pesticidas incluye:
– Columna y mezcla de test específica.
– QuEChERS Trial pack para preparación muestra.
– DVD con los parámetros del métodos/s (LC y MS).
– Nota de aplicación y guía de inicio rápido.
– Ejemplos con distintas configuraciones y HPLC‟s.
• Kit 200 compuestos de interés Toxicológico incluye:
– Columna y mezcla de test específica.
– DVD con los parámetros del métodos/s.
– Nota de aplicación y guía de inicio rápido.
– Contiene esencialmente drogas de abuso y fármacos PPCP’s
5990-4253EN
16 de marzo de 2011
Página 36
Etapas en la creación de un Método de Adquisición
dMRM propio a partir de la Base de Datos*.
Create a Dynamic MRM method
Import the results generated in the custom report into acquisition method
Specify delta retention time window
Analizar mezclas de estándares de concentración media
fixed dwell time for each MRM transition using one time segment
MHW Quantitative Data Analysis gets retention times
Obtener MRM desde base de datos
Nombres de compuestos, ISTD (opcional)
MRM transiciones, fragmentor , energías de colisión
*Los métodos dMRM también se pueden crear manualmente.
Crear un método MRM Dinámico (dMRM)
16 de marzo de 2011
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PROGRAMA: Análisis de
Contaminantes Orgánicos
Emergentes por
UHPLC/MS:
• Retos Analíticos
• Tipos de Enfoque Analítico
• Herramientas y Posibilidades.
Ejemplo Aplicación:
• Cuantificación y screening de
productos farmacéuticos y de
higiene personal en aguas de
consumo humano (PPCPs) mediante
Triple Cuadrupolo y sistemas de
Tiempo de Vuelo TOF/QqTOF.
Enfoque Genérico:
• Cribado Masivo (“ilimitado”)
de Contaminantes: “Non
Targets” + “Targets”
Base Heramientas:
• Masa Exacta ROBUSTA
• Independiente de la
concentración de Analito
• Buena Fidelidad Isotópica
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Screening por Extracción de Cromatogramas de Iones con Masa Exacta: SCAN MS con Selectividad Cuantitativa tipo MS/MS
TIC de mta nº119
BPC
1.4 x 108
1.2 x 106
La extracción de iones en un rango muy estrecho de masa (m/z: <0.1) proporciona una Excelente Selectividad y Sensibilidad para el análisis de “compuestos diana”
Muestra Agua Residual ESI+ TOF
EIC Agua Residual
m/z: 237.0-237.1
EIC Agua Residual
m/z: 256.1-256.2
TIC Agua Residual
0.2 ppb Carbamecepina
0.2 ppb Difenhidramina
4.0 x 105
4.0 x 105
1.4 x 108
x350
El “Poder” la de la Masa Exacta: Análisis a
“Posteriori” de Compuestos No Esperados
Laboratorio Químico Microbiológico - Murcia
• Los Agilent TOF/QTOF
proporcionan unas excelentes
prestaciones CUANTITATIVAS.
• El aspecto diferencial de los
TOF/QTOF es su capacidad
cualitativa.
DIURON
Fórmula empírica: C9H10Cl2N2O
Masa Exacta : 243.0243 (El software incluye una calculadora de masas)
Fase 1.- Localización de Potenciales Positivos:
- Extraer IC‟s de “masa exacta” (muy finas ventanas de extracción)
- NO se requieren patrones.
Diuron
Fase 2.- Confirmación /Cuantificación
de Positivos:
- Confirmar con patrones por Tr y
relaciones de iones de “pseudo MS/MS”
- Posibilidad de cuantificar reprocesando
retrospectivamente mediante “factores
de respuesta relativos” (sin tener que
reanalizar la muestra)
Laboratorio Químico Microbiológico - Murcia
El “Poder” la de la Masa Exacta: Análisis a
“Posteriori” de Compuestos No Esperados
Espectros Clenbuterol: en canal a bajo fragmentador se observa el “íón precursor” aislado
cromatográficamente. En el de elevado fragmentador (fig. inferior) se puede observar el “pseudo espectro de
MS/MS” obtenido por Disociación Inducida por Colisión (CID)
+TOF MS: Experiment 2, 5.688 to 5.849 min from lowhigh03.wiff Agilent
Max. 1.9e5 counts.
100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290
m/z, amu
0.01.0e42.0e43.0e44.0e45.0e46.0e47.0e48.0e49.0e41.0e51.1e51.2e51.3e51.4e51.5e51.6e51.7e51.8e51.9e5
132.0624168.0385 203.0076
205.0046
121.0520170.0359
149.0898133.0675
140.0202
Inte
nsity,
counts
+TOF MS: Experiment 1, 5.672 to 5.833 min from lowhigh03.wiff Agilent
Max. 5.4e5 counts.
100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 2900.0
2.0e45.0e4
1.0e5
1.5e5
2.0e5
2.5e5
3.0e5
3.5e5
4.0e5
4.5e5
5.0e5
5.4e5
Inte
nsity, co
un
ts 277.0868
279.0839
121.0510
Fragmentador: 140 volts
Fragmentador: 250 volts
NH
NH2
Cl
Cl
OH
CH3
CH3CH3
ClenbuterolC12H18Cl2N2O [M+H]+=277.0874 Error masa: - 2.2ppm
Error masa: - 2.1ppm
“pseudo espectro de MS/MS”con masa exacta
“ión precursor”
El Agilent TOF Series 1100 puede adquirir señales simultáneas a varios voltajes de fragmentador
La elevada resolución espectral permite confirmar identificación del compuesto por comparación de "pseudo espectro de MS/MS" con masa exacta con patrón (aunque no exista una buena separación cromatográfica)
Confirmación Identificación con LC/MS-TOF por Espectros Simultáneos Con y Sin Fragmentación (“pseudo MS/MS”)
MassHunter Qual. Máxima Productividad en
Extracción de Información: Productividad x 10-100 veces!!
Opcionales
Página 42
“Compound-centric” Data Processing”
MassHunter Qual. Máxima Productividad en
Extracción de Información: Productividad x 10-100 veces!!
Opcionales
Foco presentación:
Automatización de la
Extracción de Información
“Non target” y
Comparación de
Resultados basada en
masa exacta
TOF & Q-TOF
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Extracción Automática de la Información Relevante:
Agilent “Molecular Feature Extractor” (MFE)
TCC Procesado con MFE
Gráfico 3D
Original
TIC Original
(modo MS)
Gráfico 3D
Procesado con MFE
M.F.E.
M.F.E.
Reducción de Datos (MFE): suma juntos las intensidades de isótopos, aductos,
“clusters” e Iones con múltiples cargas.
Algoritmo de Data Mining patentado por Agilent
Technologies. Mucho más que un simple reporting de
presencia de iones con datos de masa exacta
m/z
min.
ECC‟s de las “Features”
extraídos por MFE
Avanzado Algoritmo de Deconvolución “Mass Hunter
Molecular Feature Extractor (MFE)”: proporciona la Masa
Exacta de ”todos” los Compuestos Ionizados.
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Espectros Deconvolucionados
TICIC‟s0
Forma parte del soft. de TOF y Q-TOF
MFE: software clave en
“non target” análisis,
metabolómica o
comparación de muestras.
MassHunter Qual. Máxima Productividad en
Extracción de Información: Productividad x 10-100 veces!!
Opcionales
Foco presentación:
Automatización de
Búsquedas en Bases de
Datos de masa exacta TOF &
Q-TOF Bibliotecas MS/MS
Página 46
5990-4252EN
Kits Aplicaciones para “Screenings”
Masivos por LC/MS-TOF/QTOF
5990-4251EN
Kits Base de Datos de Masa Exacta*• Adaptables a la cromatografía del usuario.
• Chequeo opcional de la aplicación on-site.
Kit 1600 pesticidas incluye:– Columna y mezcla de test específica.
– QuEChERS Trial pack para preparación muestra.
– DVD con los parámetros del métodos/s (LC y MS).
– Nota de aplicación y guía de inicio rápido.
– Ejemplos con distintas configuraciones y HPLC‟s.
Kit 7300 compuestos de interés Toxicológico*:– Columna y mezcla de test específica.
– DVD con los parámetros del métodos/s.
– Nota de aplicación y guía de inicio rápido.
– Contiene esencialmente drogas de abuso, alcaloides, fármacos, pesticidas, disruptores endocrinologicos….
Los TOF y QTOF facilitan mucho la ampliación del alcance del laboratorio (nº compuestos a monitorizar)
*versión con Bibliotecas de espectros MS/MS de 2600 compostos.
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Agilent 6230 TOF /QTOF- 20K resolution
- 5 decades in-scan
- Low pg Sensitivity
TIC
Bases de Datos de Masa Exacta. La Solución para Cribados
“ilimitados” de Compuestos:
Agilent TOF /QTOF P.C.DB.:
• 27000 metabolitos endógenos (METLIN).
• 7300 comp. Forénsicos / Toxicología.
• 1600 Pesticidas.
• Bases de Datos propias.
FBF
Find by
Formula
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Ejemplo Resultados Búsqueda en Base de Datos
de Pesticidas y Cálculo Fórmula Empírica.
La fidelidad isotópica es
una herramienta clave
en la correcta
asignación de fórmulas
empíricas
Resultados del “Screening” usando
MFE + PCDB de pesticidas
COMPUESTOS TARGET - RTs conocidos – Estándares inyectados
COMPUESTOS NO TARGET - RTs desconocidos pero presentes en la DB – Estándares no inyectados
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MassHunter Qual. Máxima Productividad en
Extracción de Información: Productividad x 10-100 veces!!
Opcionales
Foco presentación:
Automatización de la
Identificación de Desconocidos
basada en masa exacta
TOF & Q-TOF / Espectros
MS/MS
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?
¿Qué Significa “Masa Exacta en “Pequeñas/ Medianas” Moléculas?
Disponer de Masa Exacta reduce enormemente el nº de posibles
fórmulas empíricas.
Algunos AAS tienen m/z muy parecidas: Leu=Ile=113.084 / Lys=128.095 Gln=128.058
Para poder obtener “masa exacta” se requerirá la adición en continuo de algunos compuestos como referencia interna para m/z.
45.5272 seg
Sistema medida Tiempo de Vuelo Basado en conversor AD
Exactitud Masa
(ppm)
Nº posibles fórmulas
empíricasTecnología
165 ppm 209 QUAD/TRAP
10ppm 13
5 ppm 7
2 ppm 2 TOF /Q-TOF
Comp.: Reserpina (C33H40N2O9). [M+H]+: 609.281 m/z
• En LC/MS NO existen bibliotecas universales de espectros.
• La identificación de desconocidos en LC/MS se base en la masa exacta
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TOFs
La Importancia de disponer de “Masa Exacta” para “centrar” la búsqueda:
Al aumentar la Exactitud de la masa analizada se reducen muy considerablemente el nº de posibles composiciones elementales que pueden dar la masa en cuestión.
En moléculas pequeñas el poder determinar el peso molecular con la tercera cifra decimal permite típicamente definir una fórmula empírica inequívoca.
Exactitud Masa(u.m.a)
5.687
10
100
1000
1
0,1 0,05 0,01 0,005 0,001 0,0005 0,0001
176
386
882
1347
1672
5687
P.M.
882
176
386
1347
1672
P.M.(uma) para 2ppm100uma250uma5001.000
P.M.(uma) para 10ppm100uma2505001.000uma
Nº
Posib
les F
órm
ula
s
Em
pír
icas
QUADs
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Página 54
Identificación por Asignación de Fórmulas
Empíricas a partir de la Masa ExactaPara la asignación de la fórmula empírica más probable se considera:
1.- Exactitud de masa
2.- Fidelidad con la distribución isotópica teórica (tanto en intensidades relativas como en masas y en separación entre ellas)
- El parámetro de DBE (equivalencia en nº de dobles enlaces) puede ayudar a corroborar la asosicación de una fórmula empírica con una estructuras molecular
3.- Con MS/MS exacta (QTOF): asignación de fórmulas empíricas a los fragmentos coherentes con la del ión precursor
…. DBE
753.3092
754.3125
Counts vs. Mass-to-Charge (m/z)751 752 753 754 755 756 757
755.3095
756.3098
*
*
*
Se requiere una Buena y
Robusta Fidelidad
Isotópica para confirmar
una identificación
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MS/MS una Herramienta Adicional en la
Asignación de Fórmulas Empíricas: Menor nº
Formulas potenciales, Mejor Discriminación
Scores MS Scores MS/MS
Espectro MS
Espectro MS/MS prec.
• 4.- La fórmula empírica resultante se buscará en
bases de datos de fórmulas moleculares:
NIST, Index Merck, Chemspider, ChemIDlus,....
• 5.- Se confirmaría ID mediante cromatografía del
patrón con QTOF:MS/MS // TOF: Vfrag. elevado
Fragmento: C8H16NS
Pérd. Neutra: CH2O2
Precursor (H+): C9H17NO2S
+
MassHunter Qual. Máxima Productividad en
Extracción de Información: Productividad x 10-100 veces!!
Opcionales
Foco presentación:
Automatización de la
Extracción de Información
y Comparación de
Resultados basada en
masa exacta
TOF & Q-TOF
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4 Ensayos con Arroz transgénico1
2
3-INF
4
5
6-RES
7-INF
3-INF
7-INF 6-RES
5
2
3-INF7-INF
6-RES
5
2
mod. genet.
“bacteria salvaje”
“control”
“sin tratar”
+info: Nota de Aplicación Metabolomic Profiling of Bacterial Leaf Blight in Rice: 5989-6234EN
LCMS-ESI: ~ 1900 compuestos/mta ANOVA replicados 564 estadísticamente fiables
3 Ensayos con Arroz salvaje
Estudios de Impacto Medio-Ambiental: Correlación entre Composición y Propiedades de las Poblaciones Comparadas
mediante Análisis Estadístico Multivariante y Masa Exacta:
Requiere:
• Obtener de cada compuesto ionizado mediante
deconvolución 3D su:
• Tiempo de retención
• Masa exacta
• Intensidad de señal específica
• Comparar resultados normalizados de las diversas
poblaciones, mediante “Análisis de Componentes
Principales” (PCA) buscando correlaciones entre:
• Concentraciones de determinados compuestos
• Propiedades de la poblaciones comparadas
16 de marzo de 2011
Página 58
PROGRAMA: Análisis
de Contaminantes
Orgánicos Emergentes
por UHPLC/MS:
• Retos Analíticos
• Tipos de Enfoque Analítico
• Herramientas.
Ejemplo Aplicación:
• Cuantificación y screening de
productos farmacéuticos y de
higiene personal en aguas de
consumo humano (PPCPs)
mediante Triple Cuadrupolo y
sistemas de Tiempo de Vuelo
TOF/QqTOF.
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Target Screening de PPCP’s en matrices
acuosas por LC/MS/MS QQQ & QTOF (/TOF)• Los PPCPs (Pharmaceuticals and Personal Care Products): cualquier producto químico relacionado con la salud, cosmética o higiene personal, o con el mundo de la agroquímica y similares para favorecer el crecimiento o el mantenimiento de la salud de plantas y ganado.
• El término PPCPs comprende miles de substancias químicas incluyendo fármacos, fragancias, drogas veterinarias o cosméticos.
• Los PPCPs se encuentran frecuentemente en ambientes acuáticos al disolverse con facilidad y no evaporarse a temperatura ambiente. El uso de lodos de alcantarillado como fertilizantes (sewage sludge) o aguas de riego recicladas ponen en contacto los PPCPs con suelos y vertederos.
15m
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Página 60
EPA 1694 - Identificación de PPCP’s en
aguasIbuprofen
Isochlortetracycline (ICTC)
Lincomycin
Lomefloxacin
Metformin
Miconazole
Minocycline
Naproxen
Norfloxacin
Norgestimate
Ofloxacin
Ormetoprim
Oxacillin
Oxolinic acid
Oxytetracycline (OTC)
Penicillin V
Penicillin G
Ranitidine
Roxithromycin
Sarafloxacin
Sulfachloropyridazine
Sulfadiazine
Sulfadimethoxine
Sulfamerazine
Sulfamethazine
Sulfamethizole
Sulfamethoxazole
Sulfanilamide
Sulfathiazole
Tetracycline (TC)
Thiabendazole
Triclocarban
Triclosan
Trimethoprim
Tylosin
Virginiamycin
Warfarin
Other standards
Acetaminophen
Albuterol
Ampicillin
Anhydrochlortetracycline (ACTC)
Anhydrotetracycline (ATC)
Azithromycin
Caffeine
Carbadox
Carbamazepine
Cefotaxime
Chlortetracycline (CTC)
Cimetidine
Ciprofloxacin
Clarithromycin
Clinafloxacin
Cloxacillin
Codeine
Cotinine
Dehydronifedipine
Demeclocycline
Digoxigenin
Digoxin
Diltiazem
1,7-Dimethylxanthine
Diphenhydramine
Doxycycline
Enrofloxacin
4-Epianhydrochlortetracycline
(EACTC)
4-Epianhydrotetracycline (EATC)
4-Epichlortetracycline (ECTC)
4-Epioxytetracycline (EOTC)
4-Epitetracycline (ETC)
Erythromycin
Erythromycin anhydrate
Flumequine
Fluoxetine
Gemfibrozil
Antibioticos
Esteroides
Antidepresivos
Analgésicos
EPA Method 1694:
Pharmaceuticals and
Personal Care Products in
Water, Soil, Sediment, and
Biosolids by HPLC/MS/MS
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Página 61
Screening rápido de PPCP’s target con el nuevo Agilent
Jet Stream 6460 Triple Cuadrupolo + UHPLC 1290-Infinity
Sensibilidad on-column a nivel subfemtogramo
Linealidad superior a cinco órdenes de magnitud
rango de masas: 3,000 m/z
Pos/Neg switching, 30 msec
Nueva Method Development Tool – MH Optimizer
“Dynamic Multiple Reaction Monitoring” para establecimiento de MRMs en base al RT de los picos y NO por segmentos
16 de marzo de 2011
Página 62
UHPLC - PPCPs de EPA 1694 (Polaridad Positiva)
3 min analisis,
112 transiciones
65 compuestos
(agua del grifo)
Zorbax Eclipse C18
2.1x50mmx1.8um
Min dwell=4.3ms
1.8min
UHPLC
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Página 63
UHPLC - PPCPs de EPA 1694 (Polaridad Negativa)
130 segundos de analisis,
9 transiciones
6 compuestos
(agua del grifo)
Zorbax Eclipse C18
2.1x50mmx1.8um
Anchura de pico = 0.7sec.
Tiempo total + & -
análisis < 5 min
1.25min
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N= 5 (@100fg), %RSD (area) = 5.4%
Precisión cromatográfica (1290/6460, dynamic MRM)
Albuterol, 100fg en columna. Agua del grifo fortificada.
R2=0.99517 niveles de calibración
por quintuplicado
Transiciones QUANT/QUALcon tolerancias del 20%
N= 35 (all Cal levels), %RSD (RT) = 0.52%
16 de marzo de 2011
Página 65
N= 5 (@100fg), %RSD (area) = 6.9%
Precisión Cromatográfica (1290/6460, dynamic MRM)
Amfetamina, 100fg en columna. Agua del grifo fortificada
R2=0.99866 niveles de calibración
por quintuplicado
Transiciones QUANT/QUALcon tolerancias del 20%
N= 35 (all Cal levels), %RSD (RT) = 0.50%
Screening “ilimitado” de PPCP’s en Aguas por
LC/MS/MS Qq-TOF
16 de marzo de 2011
Página 66
App. Note: 5989-7339
Muestra de agua superficial (Colorado-US) 1L recogido en 0,5gr. Sorbente
Eluido 1mL metanol
Iyectan 5µL
Agilent 1100/6510-QTOF
Listado de PPCP’s Monitorizados:
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16 de marzo de 2011
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Resultados LC/MS-QTOF (/TOF): Localizados
8 compuestos del listado.
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Resumen Herramientas Agilent para Maximizar el
Rendimiento y Productividad en Análisis de Aguas
• LC/MS-QqQ proporcionará la máxima sensibilidad y repetibilidad
para cuantificar hasta unas pocas centenas de compuestos
– Agilent 6490 con i-Funnel/ 6460 con Jet Stream
• Cromatografía más rápida y eficiente con UHPLC/MS:
– Nuevo Agilent UHPLC: 1290 infinity
• LC/MS-TOF o QTOF permitirán cribados masivos “ilimitados”
– Agilent 6540 con 0.5ppm exactitud, Resolución 40K y tecnología
Jet Stream para una excelente sensibilidad cuantitativa.
• Con masa exacta son claves las herramientas de software que
automatizan la eficiencia de extracción de Datos:
– Molecular Feature Extractor (MFE).
– Bases de Datos de Masa Exacta /Bibliotecas de espectros MS/MS
– EFG: Generador de Fórmulas Empíricas.
– …….
•……
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¿Preguntas?