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ANALYTISCHE CHEMIE I
Trennmethoden
3. Spezielle LC-Methoden
WS 2007/2008
Analytical Chemistry, Department of Chemistry, University of Konstanz
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Spezielle LC – Methoden
• Molekülausschlußchromatographie (Gelfiltrations- oderGelpermeationschromatographie)
Durch unterschiedliche Zugänglichkeit der Probenmoleküle in die Poren der stationären Phase kommt es zur Trennung auf Grundunterschiedlicher Molekülgröße (Siebeffekt)
• Ionenaustauschchromatographie
Die Trennung erolgt auf Grund unterscheidlicher Ionenladung und Ionengröße. Die stationäre Phase ist ein Ionenaustauscher.
• Affinitätschromatographie
Die Trennung erfolgt durch sehr spezifische Wechselwirkung mit derstationären Phase. Die stationäre Phase ist mit einem geeignetenBindungspartner gekoppelt.
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Grundlagen der Gelfiltration
• Säulenchromatographisches Trennverfahren, bei demSubstanzen nach ihrer Molekülgröße getrennt werden.
• Verwendung poröser Gele als Säulenmaterial (Matrix)
• Der Porendurchmesser dieser Gele liegt in einemdefinierten Größenbereich.
• Moleküle, die größer als die größten Poren der Matrix sind, werden mit der mobilen Phase ohne Verzögerungdurch die Säule transportiert.
• Kleine Moleküle diffundieren in die Poren der Matrix und legen dadurch eine größere Wegstrecke zurück.
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Trennprinzip der Molekülausschluss-/Gelchromatographie
große Proteine können nicht in die Gelmatrix eindringen und werden "ausgeschlossen„
kleine Proteine dringen in die Matrix ein und benötigen folglich länger um durch die Säule zu wandern.
Animation
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Prinzip der Gelfiltration
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Gelfiltrationchromatographie
Trennmaterialien für Gelfiltration
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Gelfiltrationchromatographie
Trennmaterialien für Gelfiltration - Agarose
Agarose ist ein Polysaccharid aus D-Galactose und 3,6-Anhydro-L-galactose, die glycosidisch miteinander verbunden sind. Es stellt die Hauptkomponente des Agars dar und wird vor allem aus den Rotalgengattungen Gelidium und Gracillariagewonnen. Agarose ist ein starker Gelbildner und für die Gelierfähigkeit des Agars verantwortlich.
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Gelfiltrationschromatographie
Elutionsprofil einer Gelfiltrationssäule
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Verwendung der Gelchromatographie zur Molekulargewichtsbestimmung
Ausschlussgrenze
Permeationsgrenze
Retentionsvolumen
Log M
V0 Vp
V0 – AusschlussvolumenVp – Porenvolumen
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Verwendung der Gelchromatographie zur Molekulargewichtsbestimmung
• Vt = VP + V0
Vt, Bett Volumen der Säule;
VP, Volumen der Gelbeads;
V0, Volumen des Lösungsmittel um die Beads (void volume); Typischerweise ist V0 ~35% von Vt
• Ve, Elutionsvolumen eines bestimmten Proteins
• Relatives Elutionsvolumen, charakteristisch für jedesProtein, normalisiert für Säulengrösse, Ve/V0
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Verwendung der Gelchromatographie zur Molekulargewichtsbestimmung
Das relative Elutionsvolumen eines Proteins, Ve/V0, ist invers propor-tional zu seiner Masse
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Verwendung der Gelchromatographie zur Molekulargewichtsbestimmung
Mid to High MW Epoxy Resin
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Anwendung der Gelchromatographie
Beispiel: Gel-Filtrations-Bestimmung von Glukose (G), Fruktose (F) und Sukrose(S) in kommerziellen Fruchtsäften
Glukose (G)
Sucrose (S)
Fruktose (F)
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Anwendung der Gelfiltrationschromatographie für
Proteine
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Detektoren für die Gelfiltrationschromatographie
• Als Detektoren finden sogenannte Konzentrations-detektoren wie Brechungsindexdetektoren (RI-Detektor von engl. refractive index) und UV-DetektorenVerwendung. Bei diesen Detektoren steigt die Peakflächeproportional mit der Konzentration, was eine Quantifizierung einer Substanz ermöglicht
• Unter dem Synonym der molmassensensitivenDetektoren finden weiterhin Viskositätsdetektorenund Lichtstreuungdetektoren Verwendung. DieserDetektortyp ist nur in Kombination mit Konzentrations-detektoren verwendbar, weil zur Molmassenberechnungin jedem Fall die Konzentration benötigt wird
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Detektoren für die Gelfiltrationschromatographie
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Grundlagen der Ionenaustauschchromatographie
• Chromatographisches Trennverfahren für Substanzen mitelektrischen Ladungen
• Verwendung einer unlöslichen, polymeren Matrix mitchemisch gebundenen ionischen Gruppen
• die Gegenionen dieser Gruppen sind durchelektrostatische Kräfte nur locker gebunden
• Gegenionen können gegen Ionen der mobilen Phase ausgetauscht werden (reversibel)
R+A- + B- <-> R+B- + A- (Anionen Tausch)
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Ionenaustauschchromatographie
Kationenaustauscher Anionenaustauscher
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Ionenaustauschchromatographie
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Einteilung von Ionenaustauschern
Ionenaustauschermatrizes bestehen aus einem Polymer (quer-vernetzte Agarose), das negativ oder positiv geladene Gruppen trägt.
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Ionenaustauschchromatographie
Puffer für Kationenaustauscher
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Ionenaustauschchromatographie
Puffer für Anionenaustauscher
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Anwendungen der Ionenchromatographie
• Auftrennung von organischen und anorganische Ionen(insbesondere von Anionen, für die nur wenige verläßliche Trennmethoden existieren)
• Bestimmung von Kohlenhydraten an Anionentauschern(KH sind im alkalischen Millieu geladen!)
• Bestimmung von Aminosäuren an Kationentauschern(Aminosäuren sind amphotere Substanzen und liegen unterhalb von pH=6 vollständig als Kationen vor)
• Wichtige Methode bei der Trennung von Proteinen(AEC an schwachen Anionenaustauschern)
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Ionenchromatographische Analyse von Kationen
Trennung von Metallionen als Chlorkomplexe an einem stark basischen Anionenaustauscher mit einem stufenförmigen Gradientendes Eluenten HCl
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Suppressor (1)
• Suppressoren werden angewandt, wenn die Detektion mittels Leitfähigkeitsmessung erfolgt.
• Aufgabe ist es, die Grundleitfähigkeit des Eluenten zu vermindern; deshalb erfolgt die Suppression, bevor die mobile Phase in die Leitfähigkeitsmesszelle eintritt.
• Ein Suppressor besteht im einfachsten Fall aus einer Ionenaustauschsäule in Wasserstoffform, das heißt die Austauschionen sind H+ bzw. H3O
+. Folgende Gleichungen sollen diesen Austauschprozessverdeutlichen:
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Suppressor (2)
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• der Eluent ist Natriumhydrogencarbonat (NaHCO3): Harz-SO3H + NaHCO3 → Harz-SO3Na + [CO2 + H2O]
• der Eluent ist Natronlauge (NaOH): Harz-SO3H + NaOH → Harz-SO3Na + H2O.
• Die nachzuweisenden Substanzen werden in analoger Weise in ihre korrespondierenden Säuren überführt:
Analysensubstanz ist Natriumchlorid (NaCl): Harz-SO3H + NaCl → Harz-SO3Na + HCl
Analysensubstanz ist Natriumbromid (NaBr): Harz-SO3H + NaBr → Harz-SO3Na + HBr
• Die Produkte der Suppressorreaktion der Eluenten sind fast nicht elektrisch leitend. Die Reaktionsprodukte der Analysensubstanzen sind im Gegensatz dazu sehr gut leitend, da sie im Wasser weitgehend dissoziieren:
HCl + H2O → H3O+ + Cl- bzw. HBr + H2O → H3O
+ + Br-
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Ionenchromarographische Analyse von Anionen
(mit einer Suppressorsäule)
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Eluent: 2.8 mM NaHCO3 / 2.3 mM Na2CO3Detektor: Leitfähigkeit
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IonenaustauschchromatographieAnwendung für Proteine
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Die Nettoladung eines Proteins in Abhängigkeit des pH-Wertes.
Proteine bestehen aus verschiedenen Aminosäuren, deren Seitenketten neben ungeladenen auch saure und basische Reste tragen können und so zur Gesamtladung des Proteins beitragen.
Bei niedrigen pH-Werten ist die Gesamtladung wegen der Protonierung der geladenen Seitenketten positiv, bei höheren pH-Werten aufgrund der Deprotonierung negativ.
Zwischen diesen beiden Zuständen liegt der für jedes Protein charakteristische isoelektrische Punkt (pI). Hier gleichen sich positive und negative Ladungen aus und das Protein erscheint nach außen ungeladen.
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KationenaustauschchromatographieAnwendung für Proteine
Die Elution der gebundenen Proteine erfolgt durch Zugabe von Salzen (NaCl). Durch die Anwesenheit von geladenen Natrium- und Chloridionenwerden die elektrostatischen Wechselwirkungen von Proteinen mit der Matrix unterbunden, so dass die Proteine von der Matrix gelöst werden.
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IonenaustauschchromatographieAnwendung für Proteine
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KationenaustauschchromatographieAnwendung für Proteine
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Anwendungsbeispiel für die Ionenaustausch-HPLC
Trennung auf AnionenaustauscherGradient Eluent: 0.00075 –0.85 M NaOHDetektion: Konduktivititätsmessung
Trennung auf KationenaustauscherEluent: HCl und andere Säuren Detektion: Konduktivititätsmessung
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Grundlagen der Affinitätschromatographie
• Immobilisierung eines spezifischen Liganden, der nicht-kovalent, spezifisch und stark an das zu reinigende Protein bindet (z.B. Substrat, Inhibitor, Antikörper etc.)
• Die Elution erfolgt mit kompetitierenden Liganden oder durch Veränderung der Pufferzusammensetzung
• Vorteil: An Stelle kleiner physikalischer Unterschiede zwischen verschiedenen Molekülen werden die spezifischen Eigenschaften eines Moleküls ausgenutzt
• Nachteil: Die Affinitätschromatographiematrix muss oft selbst hergestellt werden; kleine Liganden müssen über längere Linker fixiert werden (synthetischer Aufwand)
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Affinitäts-Chromatographie
Ausnutzung der spezifischen reversiblen Interaktion eines Proteins mit spezifischen Liganden (z.B. zwischen Antikörper und Antigen, Enzym und Substrat, Enzym und Coenzym).
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Affinitätschromatographie(Prinzip)
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Affinitäts-Chromatographie
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Affinitäts-Chromatographie
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Elutionsverfahren bei der Affinitätschromatographie
Stufen- und Gradientenelution
Stufenelution Gradientenelution
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Affinitäts-Chromatographie
Gruppenspezifische Liganden
Lectine Glycoproteine
Protein A IgG
Protein G IgG
Heparin Coagulationproteine
Ca2+-bindende ProteineCalmodulin
Farbstoff Enzym
Nucleinsäuren Dehydrogenasen, Kinasen
Monospecifische Liganden
Antikörper Antigene
Enzymeinhibitoren Enzyme
MBP- or GST-Antibkörper recombinante (Fusions-)Proteine
Hormone Rezeptoren
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Bindungsaffinitäten von Protein A und G
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HiTrap and HiPrepTM affinity columns
Affinitätssäulen
Analytical Chemistry, Department of Chemistry, University of Konstanz
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Affinitätschromatographie Beispiel: Antikörperreinigung
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Ligandenkopplungüber Cyanogen-aktivierte Sepharose
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Ligandenkopplungüber Epoxy-aktivierte Sepharose
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Affinitäts-Chromatographie
Die Verwendung von spezifischen Antikörpern für die Reinigung eines Proteins
Nachteil: man muss schon einen Antikörper gegen das Protein haben, das man reinigen will.
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Schematischer Aufbau eines Antikörpers
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Antigen-Antikörper-Komplex
Antikörper
Antigen
Bindungsregion
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Reinigung rekombinanter Proteine durch Ni2+-NTA-Agarose
• Protein hat 5-6 Histidine am C-Terminus oder am N-Terminus
• Diese Histidine interagieren mit Nickelionen, die an derGelmatrix binden
• Elution mit saurem Puffer oder Imidazol
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Reinigung rekombinanter Proteine durch Ni2+-NTA-Agarose
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Vergleich verschiedener Trennprinzipien
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