i
ANDRESSA REGINATO
“MODULAÇÃO DE AUTOFAGIA NA PROLE DE ANIMAIS
SUBMETIDOS À DIETA HIPERLIPÍDICA NA VIDA
INTRAUTERINA, LACTAÇÃO E VIDA ADULTA”
LIMEIRA
2015
ii
iii
iv
v
vi
vii
Este e todos os outros trabalhos que farei em minha vida sempre serão dedicados a
minha amada mãe e amado namorado que me amam e apoiam incondicionalmente em
todos os momentos de minha vida.
DEDICAÇÃO
viii
ix
AGRADECIMENTOS
Seres humanos são especiais e únicos, e apesar de todas as transgressões que
existem no mundo, eu sou uma pessoa muito abençoada por estar rodeada de pessoas boas
que me influenciam de maneira positiva seja me alegrando, me apoiando, me amando e me
inspirando. E são todas essas pessoas que eu agradeço todos os dias, pois a vida sem elas
não faria sentido. Qual o sentido de uma alegria se você não pode compartilha-la? Como
sair da tristeza sem aquele ombro amigo ou apoio? Como divulgar os conhecimentos que a
ciência proporciona sem estudantes e pacientes que dão sentido a tudo?
Quando escolhi a nutrição como profissão eu jamais imaginaria a imensidão de
satisfação que essa profissão me traria toda vez que vejo o olho de alguém brilhar com
algum conceito que ensino, ou quando o meu olho brilha toda vez que aprendo coisas
novas a respeito da maravilhosa máquina eficiente que é o corpo humano. E, por isso eu
agradeço todas as pessoas que contribuíram para que meu caminho chegasse até aqui e
também para que eu continue tendo forças para traçá-lo.
À minha mãe que me deu a vida e que é capaz de me amar incondicionalmente eu
sou grata todos os dias! Como toda mãe, ela me apoia quando sorrio ou choro, me consola,
me faz rir... Sua dedicação e preocupação me tornou o que sou hoje, e me influencia a criar
o que serei amanhã. Por isso me esforço tanto para nunca descontentá-la e fazê-la feliz!! Te
amo mãe! Agradeço também por você possuir irmãos maravilhosos que sempre me
apoiaram como tios dedicados que me inspiram e apoiam! Ao meu pai agradeço pelas
lembranças de uma infância feliz, pelo carinho e diversão, e também por toda refeição
deliciosa quando vou à sua casa!
Ao meu amado namorado que já está comigo há mais de 7 anos, agradeço por me
apoiar e estar sempre ao meu lado nos momentos bons e ruins. Você participou do meu
crescimento como pessoa e isso me possibilitou correr atrás do que eu acho que seja
importante para mim. Todas as vezes que entro em conflito, é com você que eu conto! Te
amo muito! Sou muito grata por você ter surgido em meu caminho nesse mundo, e, por
dividir a vida comigo e minha mãe daqui para até quando Deus permitir.
x
A vida me presenteou também com amigos que transformam a minha vida em
alegria quando estamos juntos (e mesmo separados!). À querida “primamiga” que na
verdade é uma irmã, Karina, agradeço por ter feito a minha infância e adolescência
completa de risadas, e por me fazer sentir que mesmo longe, somos uma só! As queridas
amigas que a faculdade de nutrição me trouxe, Ariadne Cecílio, Mariana Tavares, Thais
Cardenuto e Thaís Crivello, nem tenho palavras a não ser dizer o quanto amo vocês. Vocês
transformaram a minha graduação em uma aventura, e, vocês foram fonte de risos e apoio
nessa nova fase de amadurecimento profissional e pessoal que foi o mestrado! Mari,
obrigada por se tornar a minha salvadora de insetos oficial, e, por entender que eu durmo
cedo e por me ensinar a ter esperança no fim do dia para encarar o amanhã! Aliás, Yura,
obrigada pelas risadas à noite e por me ensinar a fazer a reciclagem, rs!
Um agradecimento especial vai para a Thaís de Fante. Você se tornou uma segunda
irmã que não tive também! Desde a graduação ao meu lado, fazendo aquelas piadas que só
você sabe fazer e que quem escuta não imagina que saiu de você. Compartilhando todos os
principais momentos e angústias da minha vida, sempre falo a você, e hoje falo mais uma
vez, você é uma das pessoas que me faz seguir em frente! Tha, enfim muito obrigada por
estar ao meu lado sempre ok? E nossa já está bem extenso o seu parágrafo, mas eu não
posso deixar de agradecer você e sua mãe pelo meu quartinho e pelas comidas enquanto eu
não tinha um lar em Limeira!
Aos queridos colegas do laboratório LABDIME! Aos que já se foram do laboratório,
aos que ainda estão no laboratório, e aos que virão! O nosso laboratório repleto de presença
feminina é uma família que nos proporciona muito crescimento profissional e pessoal
também! Aquela recém- formada que entrou há 2 anos não é a mesma de hoje e nem será a
mesma amanhã. Toda a experiência no dia a dia com os projetos, aulas e reuniões
contribuíram (e contribuem) para a formação do meu caráter e amadurecimento
profissional e pessoal! Por isso agradeço a todos pela contribuição!
Tenho uma imensa admiração pela educação; por todos os educadores em geral. O
professor é quem ajuda a formar o caráter do aluno; é o professor que transmite o
conhecimento para que esse aluno decida a profissão; o professor da área da saúde ensina
xi
ao aluno como ensinar e tratar o futuro paciente, e, também ensina como esse aluno pode
melhorar o seu dia a dia com escolhas saudáveis! E, isso é um ciclo que deveria ser mais
valorizado! Pois os professores são aqueles que inspiram os alunos, e, inspiração essa que
eu carreguei comigo desde criança por todos os professores principalmente os de ciências,
biologia e história que passaram por meu caminho. E, isso não foi diferente quando cheguei
à graduação e pós- graduação! Agradeço com muito carinho a inspiração que vocês me
trouxeram caros queridos professores: Adriane Antunes, Adriana Torsoni, Dennys Cintra,
Fernando Simabuco, Josely Rimoli, Márcio Torsoni, Marciane Milanski, Maria Carolina
Mendes, Patrícia Prada, Rosângela Bezerra, e, todos os outros que trilharam o meu
caminho!
Por fim, mas não menos importante, eu agradeço à minha querida orientadora
Marciane Milanski pela oportunidade que me concedeu para seguir um caminho tão
importante em minha vida desde o TCC e também da supervisão de estágio, só ela sabe o
quão importante ela se tornou para mim desde aquele período! Possui personalidade
animada que contagia todos ao redor, e que motiva você a seguir em frente sempre. Uma
pessoa muito boa com o próximo, que esbanja gentileza e educação! Por isso, tenho certeza
que tive (e tenho) influência positiva o suficiente para estar sempre em busca de novos
conhecimentos e experiências que me realizem profissionalmente e pessoalmente!
Aos órgãos de fomento Faepex e Fapesp, agradeço por possibilitarem a realização
da pesquisa.
Obrigada!
xii
xiii
“Ensinar exige compreender que a educação é uma
forma de intervenção no mundo”
(Paulo Freire, 1968)
xiv
xv
RESUMO:
Na última década estudos em modelos animais na vida adulta retrataram que obesidade
e a sobrecarga de lipídeos são fatores que resultam no comprometimento da autofagia,
um processo de degradação lisossomal essencial para a manutenção da homeostase
celular. A autofagia é, portanto, responsável pela degradação e reciclagem de
componentes citoplasmáticos como organelas senescentes, proteínas agregadas ou mal
formadas, microrganismos invasores e macromoléculas. Apesar do conhecimento acerca
do prejuízo na atividade autofágica no contexto da obesidade, alterações na homeostase
deste processo na prole de mães obesas ainda não foram investigadas. Neste estudo, foi
avaliada a hipótese de que a obesidade materna induzida por dieta hiperlipídica (DH)
seria capaz de modular proteínas da via autofágica no hipotálamo e no fígado da prole
de camundongos. Embora sem nenhuma alteração na atividade de autofagia no
hipotálamo, a prole de mães obesas (HFD-O) ao nascimento (d0) apresentou prejuízo
nos marcadores de autofagia no fígado representado por aumento no conteúdo proteico
de p62 e diminuição no conteúdo proteico de LC3-II. Ao desmame (d18), a prole HFD-O
apresentou as mesmas alterações no conteúdo proteico de tais marcadores de autofagia,
porém agora em ambos os tecidos (fígado e hipotálamo) quando comparados à prole de
mães magras (SC-O). Após o desmame, a prole de mãe controle e a prole de mãe obesa
receberam dieta controle até a vida adulta (d82), caracterizando os grupos OC-C e OH-C
respectivamente. Nessa condição não houve modulação dos marcadores de autofagia
em nenhum dos tecidos avaliados, sendo que somente a reexposição à DH (dos 42 dias
até 82 dias) que originou o grupo OH-H foi responsável por alterar o conteúdo proteico
dos marcadores de autofagia tanto em fígado quanto em hipotálamo, quando
comparados aos animais com DH apenas na vida adulta (OC-H). Assim, parece que o
contato direto ou indireto com a DH é essencial para a modulação negativa dos
marcadores de autofagia na prole de mães obesas. Em conclusão, a prole de mãe obesa
apresentou comprometimento precoce de marcadores de autofagia no fígado e no
hipotálamo, o que pode estar associado ao desenvolvimento de distúrbios metabólicos
na prole na idade adulta.
xvi
xvii
ABSTRACT:
In adulthood, obesity and lipids overload constitute factors that result in impairment of
autophagy, a lysosomal degradation process essential for maintaining cellular
homeostasis. Thus, autophagy is responsible for degradation and recycling of
cytoplasmic components as senescent organelles, aggregated proteins or proteins poorly
formed, microorganisms invaders and macromolecules. It is known that obesity and the
use of high fat diet (HFD) have a negative impact on cellular homeostasis. However,
modulation of autophagy in the offspring of obese mothers has yet to be investigated.
This study tested the hypothesis that maternal obesity induced by HFD would be able to
modulate proteins of autophagy in the hypothalamus and liver of mice offspring. At birth
(d0), the offspring from obese dams (HFD-O) exhibited prejudice in autophagy markers
represented by an increase in content protein of p62 and decrease in LC3-II, however this
alteration was observed only in the liver. After weaning (d18) both tissues (liver and
hypothalamus) had compromised autophagy markers. The animals receiving control diet
after weaning until adulthood (d82) had no impairment of autophagy proteins in both
tissues examined (OC-C vs. OH-C groups). However, when the animals were re-exposed
to HFD (from 42 days until 82 days) they had alteration in protein content of autophagy,
when compared to animals with high fat diet without re-exposure (OH-H vs. OC-H). Thus,
the use direct or indirect of HFD seems to be essential for negative modulation of
autophagy markers. In conclusion, the offspring of obese mothers presented early
impairment of autophagy proteins in the liver and hypothalamus, which may be
associated with the development of metabolic disorders in the offspring in adulthood.
xviii
xix
LISTA DE ABREVIATURAS
3MA- 3-methyladenine
AgRP- Peptídeo relacionado ao agouti
AKT- Proteína quinase B
AMPK- Proteína quinase ativada por AMP
ARC- Núcleo arqueado
Atgs- Autophagy related genes
CART- Peptídeo regulado por cocaína e anfetamina
CMA- Autofagia mediada por chaperonas
DH- dieta hiperlipídica
DHGNA- Doença hepática gordurosa não alcoólica
DMN- Núcleo dorsomedial
ERE- Estresse de retículo endoplasmático
GLP-1- Glucose-like peptide 1
GLUT-1- Transportador de glicose 1
IKK- Quinase do inibidor kappa B
IL-1- Interleucina 1 ‘beta’
IκB- Inibidor kappa B
LC3- Microtubule-associated protein 1 light chain 3
LHA- Área hipotalâmica lateral
LIR- Domínio de ligação com LC3
mTORC1- Mammalian target of rapamycin (serine/threonine kinase) 1
MVMs- Microvilosidades de membranas plasmáticas
xx
NPY- Neuropeptídio Y
p62 ou SQSTM- Sequestosome 1
POMC- Pro-opiomelacortina
PVN- Núcleo paraventricular
TLR4- Toll-like receptor 4
TNF- Fator de necrose tumoral ‘alfa’
UBA- Domínio de ligação com proteínas ubiquitinadas
ULK1- proteína treonina-serina quinase 1
VMN- Núcleo ventromedial
Vps34- phosphatidylinositol 3-kinase
xxi
LISTA DE FIGURAS
Figura 01. Etapas da macroautofagia ................................................................... 08
Figura 02. Via de sinalização da macroautofagia ................................................. 11
xxii
xxiii
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO ...................................................................................................... 01
Autofagia e obesidade .......................................................................................... 07
OBJETIVOS .......................................................................................................... 14
Objetivo Geral ........................................................................................................ 14
Objetivo Específico ................................................................................................ 14
CAPÍTULO 1- Artigo referente à tese ................................................................. 15
DISCUSSÃO E CONCLUSÃO .............................................................................. 44
REFERÊNCIAS ..................................................................................................... 50
ANEXOS ............................................................................................................... 63
xxiv
1
1. INTRODUÇÃO
A modernização trouxe consigo alterações permanentes no estilo de vida
e perfil epidemiológico da sociedade. Diante disso, impulsionado principalmente pelo
crescimento econômico, a dieta e o estilo de vida mudaram significativamente em muitos
países (Monteiro et al. 2004), desencadeando uma pandemia global de obesidade
(Caballero, 2007; Swinburn et al. 2011). Relatório recente publicado pela OMS notificou
que em 2008, 10% dos homens e 14% das mulheres no mundo encontravam-se obesas,
comparado com 5% dos homens e 8% das mulheres em 1980 (WHO, 2012). No Brasil,
essa situação não é diferente sendo que 17,5% dos homens e mulheres na fase adulta
apresentavam IMC ≥ 30 kg/m² em 2013 (Brasil, 2014).
Definida pela presença de índice de massa corporal (IMC) acima de 30
kg/m² e acúmulo excessivo de gordura corporal em nível que compromete a saúde dos
indivíduos (WHO, 2000), a obesidade esta associada a efeitos adversos à saúde uma
vez que há correlação positiva entre o aumento de IMC e desenvolvimento de algumas
doenças como diabetes do tipo 2 (Guilherme et al. 2008), hipertensão (Sowers et al.
2003) e alguns tipos de câncer (Calle & Kaaks, 2004). Assim essas características são
preocupantes tanto do ponto de vista de saúde individual quanto da saúde coletiva e
contribuem para a ampla discussão acerca da gênese desta doença no meio científico.
Na etiologia da obesidade podem ser citados raros casos de defeitos
monogênicos (Farooqi & O’Rahilly, 2006) uma vez que em sua grande maioria a
obesidade se instala após um quadro clínico em que ocorre uma combinação complexa
de múltiplos fatores ambientais e fatores genéticos (Considine et al. 1996) responsáveis
por desencadear uma ruptura anômala na homeostase energética. Diante disso, há o
desequilíbrio entre ingestão alimentar e gasto energético culminando no
comprometimento imunológico e neuroendócrino (Friedman & Halaas 1998; Flier, 2004).
Contudo, na última década tornou-se aparente que o ambiente de desenvolvimento no
início de vida, em especial a nutrição precoce, proporcionam efeitos de longa duração
nas vias metabólicas relacionadas ao balanço energético direcionando o organismo a
uma condição de maior à susceptibilidade ao desenvolvimento de um largo espectro de
condições na vida adulta (Godfrey & Barker, 2001).
2
Assim, períodos críticos de desenvolvimento parecem proporcionar
modificações epigenéticas às quais vêm emergindo no contexto do entendimento acerca
da pandemia global da obesidade. O termo epigenética foi utilizado pela primeira vez
pelo pesquisador Conrad Waddington (1940) (Apud Ozzane, 2015) para definir
“interações entre o ambiente de desenvolvimento com os genes que levam a
modificações no fenótipo”. Os processos que medeiam às interações epigenéticas são
atualmente conhecidos e incluem alterações químicas na estrutura do DNA e histonas, e
envolvem mecanismos como metilação, modificações pós traducionais de histonas
(metilação, fosforilação, acetilação e ubiquitinação) e modulação da expressão de
pequenos RNAs não codificantes (microRNAs) (Vaiserman, 2014).
Diante a isso, estudos epidemiológicos e em modelos experimentais
reforçam que a composição corporal e a dieta materna são fatores determinantes nas
características dos filhos (Guo & Jen, 1995; Godfrey & Barker, 2001). A presença de
estresse ou estímulo negativo experimentado durante o desenvolvimento pode provocar
alterações permanentes na organização dos tecidos e órgãos, consequentemente
levando ao comprometimento irreversível na estrutura e função dos mesmos no
organismo (Godfrey & Barker, 2001; Martin-Gronert & Ozanne, 2013).
Neste contexto, tem-se que o conceito de “programação metabólica”
relaciona que as doenças metabólicas também têm sua origem no início da vida
intrauterina e pós-natal por meio da dieta consumida durante os períodos de gestação e
lactação. Assim, ambos os estados nutricionais da mãe (desnutrição e obesidade) podem
desempenhar um papel direto na transmissão de traços obesogênicos e diabetogênicos
de geração em geração (Hales & Baker, 2001).
Os primeiros relatos de estudos de programação metabólica envolveram
indivíduos na fase adulta nascidos nos anos 1944-45 durante o período de inverno na
Holanda em que a população de diferentes classes sociais da região oeste do país
vivenciou um período de escassez de alimentos. Com essa situação, cientistas tiveram
uma oportunidade única para estudar o efeito da desnutrição durante a gestação em
humanos (Roseboom et al. 2001). A exposição à fome durante qualquer estágio da
gestação foi associada com intolerância a glicose, entretanto, quando essa exposição
3
ocorreu no início da gestação, houve maior prevalência de doenças coronárias,
alterações no perfil lipídico e incidência de obesidade na vida adulta (Roseboom et al.
2006). Frente a tais achados, acredita-se que o início da gestação em humanos é um
período importante e vulnerável para os efeitos da desnutrição na saúde dos filhos
(Roseboom et al. 2006).
Os modelos animais fornecem uma ferramenta valiosa para estudar os
mecanismos subjacentes envolvidos na programação metabólica. Roedores e primatas
não humanos (NHP) são mamíferos com sistemas de embriologia, anatomia e fisiologia
semelhantes aos seres humanos o que possibilita maior compreensão dos mecanismos
envolvidos na programação fetal (Williamns et al. 2013).
Assim, para simular a restrição alimentar em períodos críticos ao
desenvolvimento, muitos estudos utilizaram extensivamente modelos experimentais de
ingestão materna pobre em proteínas (Ozanne & Hales, 1999) sendo que já foram
encontrados aumento de gotículas de lipídeos no fígado durante a vida fetal e após o
nascimento da prole de ratos. Acompanhando tais resultados, houve também aumento
na expressão de enzimas lipogênicas, induzindo a hipótese de que a esteatose na vida
adulta é programada durante a gestação (Yamada et al., 2011). Latorraca e
colaboradores (1998) verificaram que a prole de mães desnutridas apresentou
diminuição no peso do pâncreas e na secreção de insulina em resposta a glicose, o que
contribuiu para o desenvolvimento de alterações metabólicas como aumento de ácidos
graxos livres no soro desses animais.
Entretanto, ao analisar o perfil epidemiológico da população mundial nos
dias atuais, é possível verificar o significante aumento na prevalência da obesidade e
diminuição da prevalência da desnutrição em grande parte dos países desenvolvidos e
em desenvolvimento. Conforme descrito acima, isso pode ser uma consequência
metabólica do desenvolvimento em condições intrauterinas adversas aliadas ao
frequente consumo na sociedade ocidental de dietas hipercalóricas, ricas em gordura
saturada, carboidratos simples e altamente palatáveis, qualificando-se como outro
importante fator epidemiológico na predisposição para a obesidade (Galgani & Ravussin,
2008).
No Brasil, 16,9% das mulheres com 20 ou mais anos de idade
4
apresentavam-se obesas entre os anos de 2008 a 2009 (Brasil, 2010), evidenciando que
a prevalência da obesidade em mulheres em idade reprodutiva aumenta a cada ano
(Guelinckx et al. 2008). Assim, a obesidade materna é alvo importante de atenção para
os planejamentos em saúde pública em nível nacional e internacional já que esse
excesso nutricional representa grande impacto ao sistema de saúde.
Do ponto de vista clínico, as gestantes com sobrepeso e obesidade
apresentam alto risco para o desenvolvimento de complicações médicas e obstetrícias
(Yogev et al. 2009; Triunfo & Lanzone, 2014). Pesquisas revelaram que 15- 40% das
gestações são complicadas pela obesidade materna, com destaque para o aumento na
frequência de situações como a diminuição na detecção de má formação fetal em
exames de imagem devido a menor visibilidade proporcionada pelo excesso de tecido
adiposo materno; defeitos na formação do tubo neural; maior probabilidade de
nascimento precoce em adição ao aumento na mortalidade materno-fetal (ACOG, 2013;
Flenady et al. 2011).
Adicionalmente, o ambiente obesogênico materno representa outra
condição adversa que contribui para o surgimento do fenótipo obeso na prole.
Corroborando essas ideias, Samuelsson e colaboradores (2008) encontraram que a
obesidade materna durante a gestação em camundongos foi responsável por alterações
em parâmetros metabólicos na prole como hiperfagia e aumento na adiposidade, além
da diminuição na atividade locomotora acompanhada por aumento na glicose de jejum
quando comparados aos animais controle. Outros estudos apontaram que o uso de dieta
hiperlipídica (DH) durante a gestação e a lactação proporcionou efeitos adversos na
prole independente da presença ou não da obesidade da mãe (Williamns et al, 2013).
Ressalta-se que os mecanismos moleculares envolvidos no
comprometimento dos parâmetros metabólicos em modelos experimentais de obesidade
materna induzida por DH ainda são pouco conhecidos. O transporte de nutrientes por
meio da placenta parece ser um dos primeiros fatores envolvidos no surgimento do
fenótipo obeso na prole. De fato, Jones e colaboradores (2009) verificaram que o uso de
DH antes e durante a gestação de camundongos foi responsável pela super-regulação
do transportador de glicose 1 (GLUT1) em microvilosidades de membranas plasmáticas
(MVMs) isoladas da placenta (Jones et al. 2009). Estudo em humanos, estudo conduzido
5
por Jansson e colaboradores (2013) encontrou que as MVMs isoladas da placenta
também apresentaram aumento na permeabilidade de nutrientes representado pela
super-regulação de isoformas específicas de transportadores de aminoácidos, o que
pareceu contribuir para o aumento do peso do neonato.
Em roedores na fase adulta, houve aumento de marcadores inflamatórios
como p-IKK acompanhado pela diminuição na fosforilação da proteína AKT em tecido
hepático na prole de mães obesas quando comparados à prole controle (Ashino et al.
2012). Em adição, tem-se que o sistema nervoso central também está comprometido na
prole de mães obesas, o que evidencia o papel da nutrição neonatal na programação das
redes hipotalâmicas ligadas ao controle da ingestão alimentar e gasto energético na vida
adulta (Bouret, 2009).
O peso corporal é regulado por uma interação complexa entre hormônios
e neuropeptídeos, sob o controle principal do hipotálamo (Woods et al. 1998; Schwartz et
al. 2000), região do sistema nervoso central responsável por receber e integrar
informações periféricas sobre o estatus energético corporal. Por sua vez, o hipotálamo é
subdividido em núcleos de interconexão, incluindo o núcleo arqueado (ARC), núcleo
paraventricular (PVN), núcleo ventromedial (VMN), núcleo dorsomedial (DMN) e área
hipotalâmica lateral (LHA) (Schwartz et al. 2000).
A região do ARC no hipotálamo merece destaque para as funções de
controle de ingestão alimentar, balanço energético e metabolismo (Elmquist et al. 2005;
Velloso, 2009). Duas grandes populações neuronais do ARC estão implicadas nessa
regulação. A primeira composta por neurônios tipo NPY (neuropeptídio Y) e AgRP
(peptídeo relacionado ao agouti) esta relacionada com o aumento da ingestão de
alimentos. A segunda população engloba neurônios do tipo POMC (pro-opiomelacortina)
e CART (Peptídeo regulado por cocaína e anfetamina), e, esta relacionada com a
diminuição da ingestão alimentar (Flier, 2004; Elmquist et al. 2005, Araújo et al, 2010).
Os hormônios insulina e leptina ao atravessarem a barreira
hematoencefálica agem de forma combinada ao incitar receptores dos núcleos
hipotalâmicos na sinalização da ingestão alimentar (Velloso, 2009). A leptina possui
características estruturais de citocina, sendo produzida pelo tecido adiposo branco em
resposta ao armazenamento de gordura ou ao excesso de ingestão alimentar, e,
6
representa também um importante marcador da quantidade de tecido adiposo (Elmquist
et al, 2005). A insulina é produzida pelas células beta do pâncreas, e a sua concentração
sérica aumenta, principalmente, em resposta aos níveis crescentes de glicose plasmática
(Woods et al. 1998).
Os sinais de outros hormônios gastrointestinais (como colecistocinina e
grelina) representam importantes sinalizadores periféricos da disponibilidade de
nutrientes e interagem com as vias de sinalização celular da leptina e insulina,
completando a regulação do comportamento alimentar (Fonseca-Alaniz et al. 2006).
Conforme citado acima, dados de diferentes modelos animais suportam a
ideia de que o ambiente pré-natal é crítico ao balanço energético (Levin, 2006; Bouret et
al. 2009). O desenvolvimento dos circuitos hipotalâmicos em roedores acontece
principalmente em dois períodos críticos que englobam a metade da gestação e o início
da vida pós-natal durante as duas primeiras semanas de vida. Em contrapartida, em
primatas, grande parte do conhecimento do desenvolvimento das vias neurais vem
sendo baseado em estudos de primatas não humanos, sendo que esses circuitos
parecem se desenvolver ainda durante a vida intrauterina (Bouret et al. 2009).
Os níveis circulantes de hormônios como insulina e leptina parecem ser
fatores chave para esse evento (Bouret et al. 2009) sendo que, por exemplo, injeções
maternas de insulina em animais magros durante o terceiro semestre de gestação
induziram aumento na massa corporal na prole a partir de sete semanas de idade
quando comparado a prole controle que recebeu injeções de salina. Interessantemente,
ao nascer e durante a lactação a massa corporal desses animais não diferiu dos animais
controle (Jones et al. 1990).
Em adição, a indução de deficiência materna de insulina por meio de
injeções de streptozotocina durante a gestação provocou na prole alterações como
aumento na massa corporal, aumento na ingestão alimentar, alterações dos níveis de
glicose de jejum acompanhado por aumento de insulina e leptina séricas, porém com
redução na habilidade da leptina em ativar a sinalização intracelular no ARC. Houve
também redução nas projeções neuronais a partir do ARC para o PVN durante a vida
adulta da prole (Steculorum & Bouret, 2011). Complementarmente, a leptina neonatal
parece ser importante fator trópico de regulação na homeostase energética sendo que
7
animais com deficiência desse hormônio apresentaram interrupção nas projeções
neuronais a partir do núcleo arqueado o que prejudicou a regulação do peso corporal na
vida adulta (Bouret et al. 2004).
O período pós-natal precoce rico em nutrientes caracteriza-se como
outro importante interferente para as modificações nas regiões regulatórias do
hipotálamo, sendo que a redução de ninhada em ratos após o nascimento ampliou o
acesso à alimentação, resultando em superalimentação pós-natal e além de interferir no
desenvolvimento de características como hiperfagia, hiperleptinemia e hiperinsulinemia
na prole em sua vida adulta (Davidowa & Plagemann, 2007).
A manutenção da homeostase energética exercida pelo hipotálamo
parece receber influência direta de outra importante via celular conhecida como
autofagia. No contexto da obesidade materna e do aumento na permeabilidade de
nutrientes na placenta em resposta à DH, destacamos que a modulação de autofagia na
prole caracteriza-se como uma importante questão a ser explorada.
A autofagia e obesidade
O termo autofagia foi primeiramente definido pelo pesquisador Cristian
de Duve há mais de 50 anos quando o mesmo foi ganhador do prêmio Nobel pela
descoberta dos lisossomos. Os lisossomos são organelas responsáveis pela maior parte
da degradação celular nos organismos eucarióticos, sendo que essa degradação é feita
por três vias distintas: fagociotose, endociotose e autofagia (De Duve, 1983).
Por sua vez, a autofagia é responsável pela degradação e reciclagem de
componentes citoplasmáticos como organelas senescentes, proteínas agregadas ou mal
formadas, microrganismos invasores e macromoléculas (Yorimitsu & Kliosnky, 2005;
Mizushima & Komatsu, 2011). Existem três formas de autofagia: macroautofagia,
microautofagia e autofagia mediada por chaperonas (CMA) (Glick et al. 2010; Mizushima
& Komatsu, 2011) sendo que elas se diferem quanto as suas funções fisiológicas e a
maneira de transportar o material a ser degradado para o interior do lisossomo
(Mizushima & Komatsu, 2011).
A macroautofagia (a partir daqui citada apenas como autofagia) é
8
responsável por mais de 90% da autofagia celular, sendo por isso a mais estudada e
conhecida (Behrends, 2010). Nela há a formação de uma dupla membrana que circunda
o conteúdo a ser degradado, dando origem à estrutura conhecida por autofagossomo, o
qual posteriormente se fundirá ao lisossomo, que por sua vez será denominado
autofagolisossomo. No autofagolisossomo as macromoléculas, organelas e
microrganismos são degradados pelas enzimas lisossomais (Glick et al. 2010) e ocorre o
fim do processo (Mizushima & Komatsu, 2011) (Figura 01).
Figura 01. Etapas da macroautofagia. Adaptado Lavallard & Philippe Gual, 2014.
Existem evidências de que a autofagia seja regulada por mais de 30
genes Atgs (autophagy related genes) os quais em sua maioria são evolutivamente
conservados entre diferentes espécies (Yordy et al, 2012; Mizushima & Komatsu, 2011).
Ela ocorre em níveis basais na maioria dos tecidos de eucariontes (cataboliza 1,5% de
todas as proteínas celulares por hora) de modo a contribuir para a viabilidade celular e
possibilitar o adequado turnover dos componentes citoplasmáticos (Ameeta, 2005).
Entretanto, a autofagia é largamente reconhecida como um processo induzível em
9
resposta à inanição, fatores de crescimento ou invasão patogênica (Levine, 2005).
Os sinais capazes de levar à indução de autofagia ainda não estão
completamente entendidos (Klionsky, 2005), mas classicamente a via autofágica é
ativada pelo aumento nos níveis circulantes de glucagon ou depleção de aminoácidos
durante a inanição, porém é inibida por aminoácidos e insulina por meio da regulação
negativa exercida pelo complexo mTORC1 e AKT, após a ingestão alimentar (Arsham,
2006). Assim a atividade autofágica flutua conforme os períodos de ingestão alimentar e
inanição (Arsham, 2006). Adicionalmente temos que os níveis intracelulares de nutrientes
como os aminoácidos e glicose podem atuar também diretamente na transcrição de
genes Atgs ou pelo aumento nos níveis de AMPK (proteína quinase ativada por AMP)
respectivamente (Kim & Lee, 2014).
A formação da estrutura do autofagossomo requer ação complexa e
concisa das proteínas Atgs, sendo que o processo é divido nas etapas de indução,
nucleação e alongamento de vesículas autofágicas além de sua fusão com o lisossomo
(Kim & Lee, 2014). A etapa inicial acontece concomitantemente à desfosforilação e
ativação da proteína treonina-serina quinase 1 (ULK1), que por sua vez recruta o
complexo Beclin-1/ Vps34 por meio da fosforilação da proteína Ambra1, desencadeando
a formação do fagófaro (a porção inicial da membrana do autofagossomo) (Mizushima &
Komatsu, 2011; Kim & Lee, 2014). A continuidade na expansão do fagófaro é mediada
pelas proteínas Atgs em dois sistemas principais de conjugação com reações
enzimáticas similares a ubiquitinação de proteínas. Inicialmente, Atg12 é conjugada à
Atg5 por meio da ação de Atg7 (que age como uma enzima de ativação semelhante a
E1) e Atg10 (que age como uma enzima de conjugação semelhante a E2) (Tanida et al,
2001). Posteriormente, o conjugado Atg12- Atg5 se liga à Atg16L para formar o complexo
Atg12-Atg5-Atg16L que participa da conjugação de LC3 (microtubule-associated protein
1 light chain 3) (Fujita et al, 2008).
A proteína LC3, gerada a partir da proteína pró-LC3 citosólica pela ação
da protease Atg4, é conjugada a fosfatidiletanolamida por meio da ação de Atg3, Atg7 e
do complexo Atg12-Atg5-Atg16L. Depois da conjugação, LC3- PE ou LC3-II localiza-se
na membrana do autofagossomo e participa da expansão do mesmo, correlacionando-se
diretamente com o número de autofagossomos formados o que a retrata como um dos
10
principais marcadores de atividade de autofagia celular. Após o término na formação da
estrutura do autofagossomo, o complexo Atg12-Atg5-Atg16L é desfeito e separa-se da
vesícula (Fujita et al, 2008; Mizushima & Komatsu, 2011) (Figura 02A).
Os componentes celulares alvos para a degradação autofágica são
reconhecidos e transportados para a degradação por meio de proteínas adaptadoras
responsáveis pela conexão entre essas duas etapas. A primeira proteína com função
adaptadora identificada foi a proteína p62 (SQSTM1), que possui até o momento
identificados seis domínios necessários para a interação com a maquinaria autofágica e
outras vias de sinalização (Figura 02B).
Assim, a proteína p62 apresenta um domínio UBA (domínio de ligação
com proteínas ubiquitinadas) que se liga aos alvos de degradação e o domínio LIR
(domínio de ligação com LC3), responsável por entregar os alvos à degradação,
desempenhando um papel importante para o fluxo autofágico (Maloney et al. 2013).
Evidências demonstraram que os níveis de p62 são inversamente correlacionados com a
degradação de autofagia, sendo que a perda de genes Atgs ou outros fatores requeridos
para a fusão do autofagossomo com o lisossomo resultam em acúmulo de agregados
marcados por p62 (Maloney et al. 2013).
Por fim, a degradação autofágica finaliza quando o autofagossomo se
funde aos lisossomos de modo dependente à presença da proteína de membrana
lisossomal LAMP2. Neste momento, as enzimas lisossomais proporcionam o ambiente
de degradação e reciclagem do conteúdo entregue (Mizushima & Komatsu, 2011).
11
Figura 02. Sinalização intracelular da macroautofagia. Adaptado Lavallard & Philippe
Gual, 2014; Maloney, 2013).
No contexto do desenvolvimento embrionário é crescente o número de
evidências que descrevem a autofagia como via celular essencial para tal período devido
a sua capacidade em direcionar rápidas mudanças celulares permitindo condições
apropriadas para a diferenciação e desenvolvimento (Mizushima & Levine, 2010). De
fato, a ausência de Beclin-1 leva a letalidade precoce (dia embrionário 7.5) (Yue et al.
2003) e a deficiência de Ambra-1 desencadeia defeitos na formação do tubo neural
(Fimia et al. 2007).
Adicionalmente, modelos de knockout para a proteína Atg5 em oócitos
falham em se desenvolver além das fases de 4 a 8 células caso não sejam fertilizados
por espermatozoide de camundongos controle, confirmando que a autofagia é essencial
para a fase de transição de oócito para embrião (Tsukamoto et al. 2008).
Lee e colaboradores (2011) investigaram os efeitos da inibição por 3MA
(3-methyladenine) e indução por rapamicina na atividade de autofagia no
desenvolvimento embrionário in vitro durante o estágio de uma célula até a evolução
12
para blastocisto. Inicialmente encontraram que a expressão de LC3 é abundante no
zigoto e permanece presente em todos os estágios do desenvolvimento. Após o
tratamento com 3MA houve diminuição significativa nas taxas de desenvolvimento e no
número total de células, aliado ao aumento nas taxas de apoptose. Entretanto, apesar do
tratamento com rapamicina não afetar as taxas de desenvolvimento houve redução no
número de células e também aumento nas taxas de apoptose, reafirmando o papel da
modulação de autofagia durante o desenvolvimento embrionário.
Além do papel no desenvolvimento, a autofagia também atua na
homeostase energética, sendo que a privação de nutrientes ativa a autofagia em
neurônios AgRP para a regulação da ingestão e balanço energético, especificamente na
região do ARC (Kaushik et al. 2011). Adicionalmente, tem se que a inibição de autofagia
em neurônios POMC foi responsável por induzir aumento no peso corporal, ingestão
alimentar e diminuição no gasto energético. Além disso, esses animais apresentaram
prejuízos na via de sinalização de leptina (Quan et al. 2012). Ressaltamos assim, que
esses achados demonstram o papel essencial da autofagia para o funcionamento de
neurônios responsáveis pelo controle da ingestão alimentar e gasto energético.
Durante a vida adulta, dados recentes retrataram o comprometimento da
atividade de autofagia nos modelos experimentais de obesidade induzida pelo uso de
DH, fato esse que vêm motivando nos últimos anos os cientistas a investigarem a
modulação da autofagia no contexto da gênese da obesidade. A exposição à DH por
doze semanas levou à indução de inflamação hipotalâmica por meio da ativação de IkB
(inibidor kappa B), interferindo no controle do balanço energético e acelerando o
desenvolvimento da obesidade e co-morbidades associado à diminuição de marcadores
de autofagia no hipotálamo médio basal (Meng & Cai, 2011). Portovedo e colaboradores
(2015) demonstraram que a disfunção na autofagia hipotalâmica após o uso crônico de
DH se deu por efeito direto de ácidos graxos saturados.
Em tecidos periféricos como o fígado, a homeostase na modulação de
autofagia também é crucial para a função normal e prevenção do desenvolvimento de
doenças hepáticas (Czaja et al. 2013). Ezaki e colaboradores (2011) relataram que a
inanição e consequente ativação de autofagia são capazes de liberar aminoácidos no
fígado para serem metabolizados, em parte, pela gliconeogênese o que contribui para a
13
manutenção da concentração de glicose circulante. A autofagia também atua no
metabolismo lipídico hepático ao regular os estoques de lipídeos intracelulares e eliminar
triglicerídeos, o que previne o desenvolvimento de esteatose hepática (Signh et al. 2009).
Já foi demonstrado em hepatócitos que ácidos graxos saturados
suprimem a atividade de autofagia e induzem a apoptose ao passo que ácidos graxos
insaturados parecem induzir a autofagia com mínimos efeitos na indução de apoptose
(Mei et al. 2011).
Outros dados em animais, o experimento de time course durante a
indução de obesidade por DH resultou em comprometimento da autofagia após 16
semanas sendo que ela encontrava-se completamente abolida após 22 semanas. Os
pesquisadores verificaram nesse modelo aumento na protease dependente de cálcio
(Calpain-2), importante para a degradação das proteínas Atg7, Atg5 e Beclin-1, fato este
que culminou na hipótese de que esse mecanismo possa ser importante para a
diminuição da autofagia durante a obesidade (Yang et al. 2010). Adicionalmente, em
modelos experimentais in vivo a DH (60% do total de calorias) também reduziu em 70%
a fusão do autofagossomo com o lisossomo no tecido hepático, levando os autores a
acreditarem que alterações na composição da membrana lipídica tenham influenciado na
redução da autofagia (Koga et al. 2010). Assim, a modulação de autofagia hepática
poderia ser considerada para ser um novo alvo terapêutico no tratamento de doenças
hepáticas relacionadas à obesidade.
Diante do exposto, fica evidente que a obesidade tornou-se um problema
de difícil solução já que os fatores moleculares envolvidos em sua gênese são
complexos e ainda pouco conhecidos. Além disso, a obesidade materna e/ou o excesso
de nutrientes durante períodos críticos de desenvolvimento influenciam negativamente
no fenótipo da prole na vida adulta. Tendo em vista que a autofagia tem sido considerada
como importante sistema para a homeostase celular e para a manutenção das funções
hipotalâmicas e hepáticas na vida adulta, aventou-se a hipótese de que o ambiente
obesogênico durante a gestação e lactação poderiam comprometer marcadores de
autofagia nesses tecidos na prole. Portanto, o nosso objetivo foi avaliar a modulação de
marcadores de autofagia em hipotálamo e fígado da prole de animais submetidos à DH
durante a gestação, lactação e reexposição à DH na vida adulta.
14
1. OBJETIVOS:
2.1 Objetivo Geral:
Avaliar a modulação de autofagia em hipotálamo e fígado da prole de animais da
linhagem Swiss, cujas mães foram submetidas à dieta hiperlipídica na gestação e
lactação.
2.2 Objetivos Específicos:
Avaliar o ganho de peso e adiposidade das mães controles (SC) e mães obesas
(HFD).
Avaliar os parâmetros metabólicos da prole (SC-O e HFD-O) ao nascer (d0) bem
como o conteúdo proteico de marcadores da autofagia no hipotálamo e fígado dos
animais em d0.
Avaliar os parâmetros metabólicos da prole (SC-O e HFD-O) após o desmame
(d18) bem como o conteúdo proteico de marcadores da autofagia no hipotálamo e
fígado dos animais em d18.
Avaliar os parâmetros metabólicos da prole (OC-C vs.OH-C; OC-H vs. OH-H) na
vida adulta (d82) bem como o conteúdo proteico de marcadores da autofagia no
hipotálamo e fígado dos animais em d82.
15
2. Capítulo 01- Artigo Científico
1. TITLE PAGE
Autophagy proteins are modulated in liver and hypothalamus of offspring
from mice with diet-induced obesity
Andressa Reginato¹, Thaís de Fante¹, Mariana Portovedo¹, Natália Ferreira da Costa¹,
Tanyara da Silva Baliani¹, Letícia M. Ignácio-Souza², Lício A. Velloso³, Márcio A. Torsoni¹,
Adriana S. Torsoni¹, Marciane Milanski¹.
¹Faculty of Applied Sciences, State University of Campinas, Campinas, SP, Brazil.
²Faculty of Nutrition, Federal University of Mato Grosso - UFMT - MT, Brazil.
³Departament of Clinical Medicine, State University of Campinas, Campinas, SP, Brazil.
A.R contributed to design research, conduct research, reviewed the literature, conducted
the statistical analysis and wrote the manuscript. T. F; M.P; N.F.C and T.S.B, contributed
to experimental planning and discusses of results. L. M. I.-S.; L. A. V.; M. A. T.; A.S.T and
M.M provided essential reagents, materials and others financial support besides provided
advice regarding about interpretation of the results. L. M. I.-S edited the manuscript. M.
M. was responsible for design research, conduct research, data collection, provided
advice regarding and edited the manuscript.
Abreviated title: Autophagy modulation in hypothalamus and liver offspring
*Corresponding author and person to who reprint requests should be addressed:
Marciane Milanski, PhD. Laboratório de Distúrbios do Metabolismo, Faculdade de Ciências
Aplicadas. Universidade Estadual de Campinas. Pedro Zaccarias, 13484-350, Limeira SP –
Brazil. Telephone: +5519 37016705.
Email: [email protected]
16
2. ABSTRACT
The nutritional excess during pregnancy and lactation has a negative impact on offspring
phenotype. In adulthood, obesity and lipid overload represent factors that compromise
autophagy, a process of lysosomal degradation that is essential for the maintenance of
cellular homeostasis. Despite knowledge of the impact of obesity on autophagy cellular
homeostasis, changes in offspring autophagy from obese dams have yet to be
investigated. In this study, we tested the hypothesis that maternal obesity induced by a
high fat diet modulates autophagy proteins in the hypothalamus and liver of mouse
offspring. At birth (d0), offspring of obese dams showed impaired liver autophagy and
after weaning (d18) both tissues had impairment of autophagy markers. Animals that
received control diet after weaning until adulthood (d82) had no impairment of autophagy
proteins in both tissues analyzed. Overall, this study demonstrates that offspring
autophagy markers are also highly associated with exposure to lipids. In conclusion,
mouse offspring from obese dams show early impairment of altered autophagy proteins in
the liver and hypothalamus which can be associated with metabolic disorders in the
offspring during adulthood.
3. KEYWORDS
High-fat diet, obesity, offspring, autophagy, hypothalamus, liver.
17
4. INTRODUCTION
Despite the knowledge that obesity (body mass index ≥ 30 kg/m²) is a global
pandemic health problem, its worldwide prevalence almost doubled between the years
1980 and 2008 (43). Several studies in recent years describe that prenatal obesity or
malnutrition are highly recognized risk factors for development of chronic diseases in
offspring, creating to the concept of “metabolic programming” (13, 14). This occurs when
an abnormal metabolic environment occur at critical or sensitive periods of development.
During these early periods of "plasticity”, fetal metabolic changes that promote survival in
an inappropriate environment can remain permanent in adulthood. Thus, in adulthood,
after nutritional abundance promoted by consumption of a western diet (which is very
common nowadays), the organism may respond negatively, leading to metabolic
disturbances that promote the development of diseases, such as hypertension, obesity
and diabetes (14, 34, 25).
Autophagy, an important cellular pathway has emerged with implications in the
development of chronic disease. Autophagy is one of the most powerful cell cleaning
systems in which cellular organelles, proteins, and invading microorganisms are
degraded by lysosomes; this maintains a balance between the synthesis, degradation,
and subsequent recycling of cellular components, providing homeostasis and cell survival
(11, 30). Has been shown that autophagy is divided into three types: macroautophagy,
microautophagy and chaperone-mediated autophagy, depending of physiological
functions and the molecular components involved in each of these steps (30, 29, 12, 37).
Macroautophagy (hereafter referred to as autophagy) is responsible more than 90% of
cellular autophagy (3); thus, this paper focuses on this mechanism.
Recent studies have also highlighted the importance of the association between
autophagy and lipid content. High-fat diet (HFD) is responsible for the reduction of
autophagosomes with lysosome fusion suggesting that the lipid composition of
membranes is important in the homeostasis of autophagy (19). Other animal experiments
show that chronic exposure to HFD is associated with inflammation and impairment in
autophagy activity in the region of the basal medium hypothalamus, resulting in changes
in the control of energy balance that is responsible for accelerating the development of
obesity and other associated metabolic disorders (28). Additionally, our group recently
18
reported that hypothalamic autophagy dysfunction occurs after chronic exposure to HFD
by the direct effects of saturated fatty acids (32).
In peripheral tissues, such the liver, autophagy is also crucial for normal function in
addition to preventing the development of liver diseases, such as steatosis and
nonalcoholic fatty liver disease (9). Autophagy inhibition in both hepatocytes and mouse
liver leads to increased triglyceride storage in lipid droplets, demonstrating that autophagy
has a critical function in lipid metabolism with important implications for human diseases
characterized by lipid over-accumulation such as those that comprise the metabolic
syndrome (38). Consistent with this idea, other researchers have found a decrease in
liver autophagy accompanied by an increase in Beclin-1, Atg7, and Atg5 protein
degradation, which may be an important mechanism that explains the impairment of
autophagy during the development of obesity after exposure to HFD (44).
Then, we hypothesized that intrauterine and lactation environments have a
negative impact on autophagy modulation. Therefore, we investigated for the first time if
exposure to HFD in utero, during lactation and adulthood can alter autophagy proteins in
mouse offspring. Our results showed that at birth (d0) the animals presented changes in
autophagy markers in the liver. After weaning (d18), we found modulation of autophagy
markers in both the hypothalamus and liver. Animals that received control diet after
weaning until adulthood (d82) had no impairment of autophagy proteins in both tissues
analyzed. At this age, animals with re-exposure to HFD had impaired of autophagy
proteins when compared with their control. Thus, the changes observed in offspring
autophagy modulation, as well as experimental models in adulthood as previously
reported; also appear to be mainly linked to exposure to HFD.
5. MATERIALS AND METHODS
5.1 Animals Procedures
All experiments were approved by the Ethical Committee for Animal Use (ECAU)
(ID protocol: 3383-1) of the Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), Campinas,
São Paulo, Brazil, following all the recommendations of the Brazilian College of Animal
Experimentation (COBEA) guidelines. Virgin female and male (5-week-old) Swiss mice
19
were obtained from the breeding colony at UNICAMP and maintained in individual
polypropylene cages in a room at 22°C ± 1°C with lights on from 6:00 a.m. to 6:00 p.m.
Before mating, the females were randomly divided into two groups: females fed with
standard chow (SC) or HFD; both groups had free access to food and water for 3 weeks
to allow adaptation. HFD was prepared according to the AIN-93G modified for high-fat
(45%) content based on a protocol previously published by our group (4, 27). Mating was
performed by housing females with adult males (fed with SC) for 1 week. Pregnancy was
confirmed by monitoring the weight. Pregnant females were separated again into
individual cages and received the same diet (SC or HFD) ad libitum during pregnancy and
lactation. On the first day after birth (d0), the litter size of both groups was adjusted to 8
animals (preferably males) per litter. Some animals were sacrificed for experimental
analyzes (d0 group). The male offspring were weaning and sacrificed at 18 days
representing the second experimental group (d18). At both time points, the hypothalamus
and liver were extracted, whereas at 18 days adipose tissue was also extracted adipose
from both groups (SC-O and HFD-O). After weaning, male offspring were fed with SC
until 42 days old; on this day of adulthood, the animals were divided into four groups:
offspring of dams control-fed with SC (OC-C), offspring of dams control-fed with HFD
(OC-H), offspring of dams HFD-fed with SC (OH-C), and offspring of dams HFD-fed with
HFD (OH-H). The animals received each type of diet until they completed 82 days of life.
At the end of the experimental period, all male mice were sacrificed, and the
hypothalamus, liver, and adipose tissue were extracted, representing the third
experimental group (d82). Data of adipose tissue fat weight in all the experimental groups
were expressed as a percentage, adjusted by animal weight.
5.2 Metabolic Assessments
Maternal weight was measured during all experimental period. After lactation we
also measured adiposity of dams. Offspring fasting glucose was measured at 18 and 82
days by using an Accu-Chek Performa glucometer. To obtain the Lee Index [from the ratio
of BW(g)1/3/ nasoanal length (cm) x 1000], were measured body weight (BW), and length
of offspring at birth (d0) and at weaning (d18) (22). The consumption of breast milk was
20
obtained on the basis of fasted and fed pups’ weight gain at 16 days of age, following the
procedure previously described (36). In adulthood (d82), food intake was evaluated after
2 weeks of adaptation by the difference between the initial and final weight of the food
during 5 days. Values of food intake were expressed as a percentage by calories
corrected by animal weight. Commercial kits were used according to the manufacturer’s
instructions for the quantification of serum cholesterol (CHOD-PAP/ Roche Diagnostics),
serum triglycerides (GPO-PAP, Roche Diagnostics), and serum or plasma TNF-α (Mouse
TNF- α, DY410-05, R&D Systems).
5.3 Immunoblotting
After extraction, tissue samples of the hypothalamus and liver (d0, d18, d82) were
homogenized in freshly prepared ice-cold buffer [1% (v/v) Triton X-100, 0.1 mol L−1 Tris,
pH 7.4, 0.1 mol L−1 sodium pyrophosphate, 0.1 mol L−1 sodium fluoride, 0.01 mol L−1
EDTA, 0.01 mol L−1 sodium vanadate, 0.002 mol L−1 PMSF and 0.01 mg aprotinin/mL].
Insoluble material was removed by centrifugation (10,000 × g) for 25 min at 4°C. The
protein concentration of the supernatant was determined by the Bradford dye-binding
method (hypothalamus) or Biuret (liver). The supernatant was suspended in Laemmli
sample buffer and boiled for 5 min before separation by SDS-PAGE using a miniature gel
apparatus (Bio Rad, Richmond, CA, USA). Following electrophoresis, the proteins were
transferred to nitrocellulose membranes. The membranes were treated with blocking
buffer (5% non-fat dried milk, 10 mM Tris, 150 nM NaCl and 0,02% Tween 20) and were
subsequently incubated overnight at 4° with specific antibodies (anti-SQSTM1/ ab91526;
anti-LC3B/ ab48394). Posteriorly, the membranes were incubated with HRP-conjugated
secondary antibodies (KPL, Gaithersburg, MD, USA). The proteins recognized by the
secondary antibodies were detected by chemiluminescence (Amersham ECL, kit RPN
2232, Buckinghamshire, UK) as visualized by exposure of the blot to Kodak XAR film.
Band intensities were quantified by optical densitometry of developed autoradiographs
(Scion Image software, ScionCorp, MD, USA), and the intensities of the bands were
normalized to the loading control β-actin (ab8227) or α-tubulin (T5168, Sigma-Aldrich,
MO, USA).
21
5.4 Real- time Quantitative PCR
Real-time quantitative PCR was performed to measure mRNA levels of TNF-α.
Hypothalamic and liver total RNA was extracted using Trizol reagent according to the
manufacturer’s instructions (Invitrogen Corporation, CA, USA). Total RNA was quantified
on a Nanodrop ND-2000 (Thermo Electron, WI, USA). Reverse transcription was
performed using total RNA from hypothalamic and liver samples. Real-time PCR analysis
of gene expression was performed in an ABI Prism 7500 Fast Sequence Detection
System (Applied Biosystems). The primers used were obtained from Applied Biosystems:
TNF-α (Mm00443258_m1) and GAPDH as the endogenous control (4352339E mouse
GAPDH, Life Technologies Corporation). Each PCR contained 20 ng of reverse-
transcribed RNA and was run according to the manufacturer’s recommendation using the
TaqMan PCR Master Mix (Applied Biosystems). Target mRNA expression was normalized
to GAPDH expression and expressed as a relative value using the comparative threshold
cycle (Ct) method (2 − ΔΔCt) according to the manufacturer’s instructions.
5.5 Statistical Analysis
The results are expressed as the mean ± SE of the indicated number of
experiments. Blot results are presented as direct band comparisons in autoradiographs
and quantified by densitometry using Scion Image software. The statistical analyses were
carried out using Student’s t tests of unpaired samples or ANOVA for multiple
comparisons, and the level of significance was set at p < 0.05.
6. RESULTS
6.1. HFD alters weight and adiposity of dams
To examine the effects of maternal obesity induced by diet (DIO) in hypothalamus
and liver autophagy of offspring, female mice were fed with HFD (45%). As expected, the
dams fed HFD showed an increase in body mass after 2 weeks of exposure, maintaining
22
the difference throughout pregnancy compared with control dams (56.93 ± 3.93 vs. 30.63
± 2.91, respectively) and lactation (50.33 ± 1.18 vs 30.63 ± 2.91, respectively ) (Fig. 1A).
The increase in body mass was accompanied by increased gonadal adipose tissue (1.55
± 0.20 g in SC dams vs. 3.54 ± 0.39 g in HFD dams) and rWAT (0.74 ± 0.13 g in SC
dams vs. 0.25 ± 0.04 g in HFD dams) (Figure 1B).
6.2 Metabolic parameters and autophagy evaluation of offspring on day of birth
The weight of offspring from obese dams was significantly lower (11%) than those
from lean dams (Figure 2A). This result of body mass was accompanied by decrease in
the Lee Index (Figure 2B), although no differences were observed in TNF-α plasma
levels, cholesterol, and triglycerides serum levels (Figure 2C–E). After assessing
metabolic parameters, we investigated the modulation of autophagy on the first day of
birth. No differences in autophagy markers in the hypothalamus between the groups were
observed (Figure 3B and 3C). Because of this, we decided to investigate whether the liver
showed any change in autophagy. Interestingly, we observed an increase in protein
content of p62 (Figure 3E) and decrease in conversion of LC3-I to LC3-II (Figure 3F),
suggesting a decreased autophagy process in the liver of offspring from obese dams at
birth. The gene expression of TNF-α did not differ in any of the tissues analyzed (Figure
3A and 3D).
6.3 Metabolic parameters of male offspring after lactation
Next, we evaluate the metabolic characteristics of the offspring during lactation.
The offspring of obese dams had differences in body weight from the 14th day until 18th
day, when compared with control mice (1.4 fold in both ages) (Figure 4A). This was
accompanied by an increase in Lee Index (Figure 4B) and increase in eWAT (0.18 ± 0.08
g in SC-O mice vs. 1.42 ± 0.26 g in HFD-O mice), rWAT (0.10 ± 0.12 g in SC-O mice vs.
0.41 ± 0.10 g in HFD-O mice), and BAT (0.49 ± 0.07 g in SC-O mice vs. 0.69 ± 0.13 g in
HFD-O mice) tissues (Figure 4C). We also observed an increase in fasting glucose,
serum cholesterol, and triglycerides (Figure 4D–4F). No difference in serum TNF- α was
23
found (Figure 4G). In addition, the consumption of breast milk from the offspring of obese
mothers was higher compared with the control (Figure 4H). Animals with 18 days didn’t
show any differences in energy expenditure measured by indirect calorimetry (data not
show).
6.4. Autophagy evaluation of male offspring after weaning
After weaning, the modulation of autophagy in the hypothalamus and liver were
evaluated. As observed at birth, the liver autophagy remained decreased in the HFD-O
group compared to SC-O. In addition, lactation resulted in negative regulation in the
hypothalamic autophagy, which was demonstrated by an increase in the content of p62
protein (Figure 5B) and decrease of LC3-II (Figure 5C) in the offspring HFD-O when
compared with SC-O. We observed an increase in gene expression of TNF-α in
hypothalamus and no differences in gene expression of TNF-α in the liver (Figure 5A and
5D, respectively).
6.5. Metabolic parameters and autophagy evaluation of offspring in adult life
To evaluate the effects of HFD re-exposure in the modulation of autophagy in
adulthood of the offspring from SC- and HFD-fed dams, the animals were fed with SC or
HFD diet from day 42 until day 82. At 42 days, offspring from obese dams remained with
higher body mass (p<0.0001), which was developed during lactation. By using the
ANOVA variance analysis, we found that the re-exposure to HFD was effective in
increasing the body mass of offspring in adulthood. After this analysis, we performed
comparisons between groups remained the same diet in adulthood. Thus, HFD offspring
(OH-C) maintained with SC exhibit an increased body mass (11, 3%) (Figure 6A), fasting
glucose (1.4 fold) (Figure 6C) and adiposity (eWAT: 1.3 fold; rWAT: 1.4 fold and BAT: 1.3
fold) (Figure 6D) when compared with OC-C, although the groups did not show any
difference in the relative caloric intake (Figure 6B). Interestingly, these animals did not
show any modulation in autophagy markers in the hypothalamus (Figure 7A and 7B) and
liver (Figure 7C and 7D) tissues. When the groups SC-O and HFD-O were exposed to
24
HFD (OC-H and OH-H groups), the comparison between these groups showed an
increase in body mass (11%) (Figure 6E), accompanied by an increase in caloric intake
(1.2 fold) (Figure 6F) in addition an increase in fasting glucose (1.5 fold) (Figure 6G) and
adiposity (eWAT: 1.2 fold and rWAT: 1.3 fold) (Figure 6H). Regarding autophagy markers,
we saw an increase in protein content of p62 in hypothalamus (Figure 8A) and liver
(Figure 8B) tissues in OH-H compared with OC-H group. However, the protein content of
LC3-II decreased only in the hypothalamus between these groups (Figure 8D).
7. DISCUSSION
It is well documented that autophagy has several physiological and pathological
proprieties, including the adaptive response to starvation, quality control of intracellular
proteins and organelles, anti-aging, suppression of tumor formation, elimination of
intracellular pathogens, and antigen presentation (23, 29),. In the context of obesity some
studies show that autophagy is often compromised in the central nervous system (28) and
in peripheral tissues (22, 44), probably contributing to the progression of this disease.
This present study investigated the hypothesis that maternal obesity induced by HFD
modulates autophagy proteins in the hypothalamus and liver of mouse offspring.
In physiological conditions, autophagy has important roles during development by
its ability to drive fast cellular changes. Thereafter, the autophagy process provides a
favorable environment for differentiation and development (31). When autophagy is
defective in these periods, some abnormalities in various organisms such as fungi (41),
protozoa (1), and insects (18) were reported.
Our first result demonstrated that offspring from obese dams had reduced body
mass, accordingly previous report (27, 35) and presented a decrease in Lee Index, even
without any change in other metabolic parameter evaluated. Although the reason for the
reduced body size is unclear, we hypothesize that the placental function or the inefficient
reutilization of nutrients during embryogenesis may be important situations in maternal
obesity. Interestingly, animals with ablation of some Atgs genes, essential to the
autophagy pathway, were born with a similar phenotype in body mass (20, 21).
Furthermore, we also observed down-regulation of autophagy in the liver of offspring from
25
obese dams but, no differences in hypothalamus tissue at birth. Importantly, the survival
rate of neonates deficient in Atg5 or Atg7 after exposure to starvation is much shorter
when compared to wild-type mice, showing that autophagy is important for the first
moments of mouse neonate’s life (20, 21).
Additionally, it has been reported that autophagy is involved in placenta
development during human pregnancy (15). Maternal obesity during pregnancy
contributes to increased placental permeability by up-regulation of placental amino acid
transporter, resulting in activation of mTOR signaling (16). This activation could
downregulate of autophagy in the liver tissue of neonates because mTOR signaling is an
important negative regulator of this system (45). On the other hand, rodents complete
their development of neural circuits during lactation (5), which may influence the protein
content of hypothalamic autophagy markers at birth.
In accordance with this idea, metabolic parameters were compromised after
weaning, and hepatic autophagy remained decreased in the HFD-O group as well as the
hypothalamus tissue. Indeed, lactation seems to be highly sensitive in rodents, providing
important changes in response to maternal HFD (40). The use of HFD during lactation
also has a negative impact on the development of neuronal projections of offspring, which
results in metabolic alterations, such as food intake and glucose homeostasis (42).
Importantly, deletion of Atg7 in POMC neurons causes higher post-weaning body mass,
increased adiposity, and presented a marked reduction in POMC fiber density; thus, the
authors suggested that autophagy is an important mechanism for the normal
development of neuron projection (8).
Because there were no differences in energy expenditure between the groups in
d18 (data not shown), we suggest that higher body mass of HFD-O animals can be
explained by breast milk caloric intake, but this modification should be confirmed by direct
measurement of milk intake. In addition, it would be interesting to evaluate the
composition of breast milk in our model because the maternal dietary source of fat can
affect the amount and the composition of fatty acid in breast milk of rats (33).
Several reports described an important highlight crosstalk between lipids and
autophagy. In addition to other interactions, the lipid profile can directly affect the
physicochemical properties of lipid bilayers interfering with its fluidity and in the
26
remodeling of the cell membrane (19, 33). Thus, even poorly understood it is known that
lipids can influence various steps of autophagy including initiation, autophagosome
biogenesis and maturation (7, 10). Accordingly, we suspect that altered milk from obese
dams can alter lipid membrane composition, which leads to impairment on the
autophagossome-lysosome fusion (7, 19). Then, the future study of lipid composition of
membranes may be interesting in our experimental model.
Recently was demonstrated that offspring from obese dams after 10 days of
weaning present some metabolic changes accompanied by activation of inflammatory
pathways, insulin resistance and modulation in endoplasmatic reticulum stress in the
hypothalamus (27). These animals also had hepatic steatosis and maternal consumption
of HFD was responsible to affect the early lipid metabolism of offspring by modulating the
expression of hepatic β-oxidation-related genes and microRNA (4). Taking into account
that autophagy has an important link with hepatic lipid metabolism we believe that the
origin of this alteration is associated with down-regulation of liver autophagy found here in
our study. This hypothesis is consistent with studies that show mice with hepatocyte-
specific knockout of Atg7 that were fed with HFD developed markedly increased liver
triglycerides and cholesterol content (44); this indicate that defects in autophagy can
promote hepatic steatosis (38, 44) and that autophagy induction by rapamycin treatment
protects the liver from HFD-induced lipotoxicity and may be an important therapeutic
target for liver disease associated with obesity (26).
In addition, some studies reported that the suppression of autophagy increases
inflammation in metabolic tissues, with the overexpression of certain types of cytokines;
however, the exact mechanisms by which cytokines mediate autophagy regulation and
immune cell function remain unknown (17). TNF-α content is not different in most of our
analyses, similar to data published by our group (4, 27). Perhaps the levels were below of
detection by methods used in this work. Thus, at least in part, the inability of methods
used may explain our results of TNF-α between the groups.
During adulthood, both groups (SC or HFD) exhibited significant alterations in
metabolic parameters, reproducing data of other studies (2, 6, 39). Nevertheless, the
comparison between groups OCC and OHC revealed that maternal DIO during
pregnancy and lactation appear not to be sufficient to negatively modulate the autophagy
27
proteins in adulthood. Therewith, we suspect that HFD during adult life is responsible for
enhancing possible epigenetic changes in our experimental model. However, additional
studies such as evaluation microRNAs that can modulate the autophagy pathway or
acetylation and methylation of autophagy genes, should be conducted to confirm this
idea. We also suspect that the impairment of autophagy markers in the hypothalamus and
liver during initial life and after re-exposure to HFD may contribute to metabolic
disturbances and an obese phenotype of offspring, therefore being another point to be
studied in our future research.
In summary, results from this study demonstrate that offspring from obese dams
have impairment of liver autophagy proteins at birth and after lactation both in
hypothalamus and liver tissues, which show down-regulation of autophagy. Surprisingly,
the offspring from obese dams receiving control diet after weaning until adulthood have
no impairment of autophagy’s protein in both tissues analyzed. Thus, exposure to lipids is
likely to be an essential condition for enhancing modulation of autophagy proteins in our
experimental model. However, we highlight the importance of further studies using
additional techniques for measuring autophagy activity, especially in hypothalamus and
liver lipid membrane composition of the offspring of obese dams.
8. ACKNOWLEGEMENTS
The present study was supported by São Paulo Research Foundation (FAPESP)
process 2011/51205-6. The funders had no direct influence over the present study. The
authors don’t have any conflict of interest to declare.
28
9. REFERENCES:
1. Alvarez VE, Kosec G, Sant'Anna C, Turk V, Cazzulo JJ, Turk B.
Autophagy is involved in nutritional stress response and differentiation in Trypanos
oma cruzi. J Biol Chem 283(6):3454-64, 2008.
2. Ashino NG, Saito KN, Souza FD, Nakutz FS, Roman EA, Velloso
LA, Torsoni AS, Torsoni MA. Maternal high-fat feeding through pregnancy and
lactation predisposes mouse offspring to molecular insulin resistance and fatty
liver. J Nutr Biochem 23(4):341-8, 2012 doi: 10.1016/j.jnutbio.2010.
3. Behrends C, Sowa ME, Gygi SP, Harper JW. Network organization of the human
autophagy system. Nature 466(7302): 68-76, 2010. doi: 10.1038/nature09204.
4. Benatti RO, Melo AM, Borges FO, Ignacio-Souza LM, Simino LA, Milanski
M, Velloso LA, Torsoni MA, Torsoni AS. Maternal high-fat diet consumption
modulates hepatic lipid metabolism and microRNA-122 (miR-122) and microRNA-
370 (miR-370) expression in offspring. Br J Nutr 111(12):2112-22, 2014 doi:
10.1017/S0007114514000579.
5. Bouret SG. Early life origins of obesity: role of hypothalamic programming. J
Pediatr Gastroenterol Nutr 48 Suppl 1:S31-8, 2009.
6. Burgueño AL, Cabrerizo R, Gonzales Mansilla N, Sookoian S, Pirola CJ.
Maternal high-fat intake during pregnancy programs metabolic-syndrome-
related phenotypes through livermitochondrial DNA copy number and transcription
al activity of liver PPARGC1A. J Nutr Biochem 24(1): 6-13, 2013. doi:
10.1016/j.jnutbio.2011.12.008.
7. Carlsson SR, Simonsen A. Membrane dynamics in autophagosome biogenesis. J
Cell Sci 128(2):193-205, 2015.
8. Coupé B, Ishii Y, Dietrich MO, Komatsu M, Horvath TL, Bouret SG.
Loss of autophagy in pro-
opiomelanocortin neurons perturbs axon growth and causes metabolic dysregulati
on. Cell Metab 15(2):247-55, 2012.
9. Czaja MJ, Ding WX, Donohue TM Jr, Friedman SL, Kim JS, Komatsu
M, Lemasters JJ, Lemoine A, Lin JD, Ou JH, Perlmutter DH, Randall G, Ray
29
RB, Tsung A, Yin XM. Functions of autophagy in normal and diseased liver.
Autophagy 9(8):1131-58, 2013 doi: 10.4161/auto.25063.
10. Dall'Armi C, Devereaux KA, Di Paolo G. The role of lipids in
the control of autophagy. Curr Biol 23(1): R33-45, 2013 doi:
10.1016/j.cub.2012.10.041.
11. De Duve C, Wattiaux R. Functions of lysosomes. Annu Rev Physiol 28:435-92,
1966.
12. Glick D, Barth S, Macleod KF. Autophagy: cellular and molecular mechanisms. The
Journal of Pathology 221(1): 3-12, 2010.
13. Godfrey KM, Barker DJ. Fetal programming and adult health. Public Health
Nutr 4(2B): 611-24, 2001.
14. Hales CN, Barker DJ. The thrifty phenotype hypothesis. Br Med Bull 60: 5-20,
2001.
15. Hung TH, Hsieh TT, Chen SF, Li MJ, Yeh YL. Autophagy in the
human placenta throughout gestation. PLoS One 8(12):e83475, 2013 doi:
10.1371/journal.pone.0083475.
16. Jansson N, Rosario FJ, Gaccioli F, Lager S, Jones HN, Roos S, Jansson T, Powell
TL. Activation of placental mTOR signaling and amino acid transporters in obese
women giving birth to large babies. J Clin Endocrinol Metab 98(1): 105-13, 2013
doi: 10.1210/jc.2012-2667.
17. Joven J, Guirro M, Mariné-Casadó R, Rodríguez-Gallego E, Menéndez JA.
Autophagy is an inflammation related defensive mechanism against disease. Adv
Exp Med Biol 824:43-59, 2014 doi: 10.1007/978-3-319-07320-0_6.
18. Juhász G, Csikós G, Sinka R, Erdélyi M, Sass M.
The Drosophila homolog of Aut1 is essential for autophagy and development.
FEBS Lett 543(1-3): 154-8, 2003.
19. Koga H, Kaushik S, Cuervo AM.
Altered lipid content inhibits autophagic vesicular fusion. Faseb J. 24(8):3052-65,
2010 doi: 10.1096/fj.09-144519
20. Komatsu M, Waguri S, Ueno T, Iwata J, Murata S, Tanida I, Ezaki J, Mizushima
N, Ohsumi Y, Uchiyama Y, Kominami E, Tanaka K, Chiba T.
30
Impairment of starvation-induced and constitutive autophagy in Atg7-
deficient mice. J Cell Biol 169(3):425-34, 2005.
21. Kuma A, Hatano M, Matsui M, Yamamoto A, Nakaya H, Yoshimori T, Ohsumi
Y, Tokuhisa T, Mizushima N. The role of autophagy during
the early neonatal starvation period. Nature 432(7020):1032-6, 2004.
22. Lee, M. O. Determination of the surface area of the white rat with application to the
expression of metabolic results. Am J Physiol, 89: 24-33, 1929.
23. Levine B, Kroemer G. Autophagy in the pathogenesis of disease. Cell. 132(1):27-
42, 2008 doi: 10.1016/j.cell.2007.12.018.
24. Liu HY, Han J, Cao SY, Hong T, Zhuo D, Shi J, Liu Z, Cao W.
Hepatic autophagy is suppressed in
the presence of insulin resistance and hyperinsulinemia: inhibition of FoxO1-
dependent expression of key autophagy genes by insulin. J Biol Chem 284(45):
31484-92, 2009 doi: 10.1074/jbc.M109.033936.
25. Martin-Gronert MS, Ozanne SE. Early life programming of obesity. Med Wieku
Rozwoj. 17(1):7-12, 2013.
26. Mei S, Ni HM, Manley S, Bockus A, Kassel KM, Luyendyk JP, Copple BL, Ding
WX. Differential roles of unsaturated and saturated fatty acids
on autophagy and apoptosis in hepatocytes. J Pharmacol Exp Ther 339(2): 487-
98, 2011 doi: 10.1124/jpet.111.184341.
27. Melo AM, Benatti RO, Ignacio-Souza LM, Okino C, Torsoni AS, Milanski M, Velloso
LA, Torsoni MA. Hypothalamic endoplasmic reticulum stress and insulin resistance
in offspring of mice dams fed high-fat diet during pregnancy and lactation.
Metabolism. 63(5):682-92, 2014 doi: 10.1016/j.metabol.2014.02.002.
28. Meng Q, Cai D. Defective hypothalamic autophagy directs the central
pathogenesis of obesity via the IkappaB kinase beta (IKKbeta)/NF-kappaB
pathway. J Biol Chem 286(37):32324-32, 2011. doi: 10.1074/jbc.M111.254417
29. Mizushima N & Komatsu M. Autophagy: renovation of cells and tissues.
Cell 147(4): 728-41, 2011. doi: 10.1016/j.cell.2011.10.026.
31
30. Mizushima N, Levine B, Cuervo AM, Klionsky DJ. Autophagy fights disease
through cellular self-digestion. Nature 451(7182): 1069-75, 2008. doi:
10.1038/nature06639
31. Mizushima N & Levine B.
Autophagy in mammalian development and differentiation. Nat Cell Biol 12(9):823-
30, 2010 doi: 10.1038/ncb0910-823.
32. Portovedo M, Ignacio-Souza L, Bombassaro B, Coope A, Reginato A, Razolli D.N,
Torsoni MA, Torsoni AS, Leal RF, Velloso LA, Milanski M. Saturated fatty acids
modulate autophagy’s proteins in the hypothalamus. PLoS One. 2015 Mar
18;10(3):e0119850. doi: 10.1371/journal.pone.0119850
33. Priego T, Sánchez J, García AP, Palou A, Picó C.
Maternal dietary fat affects milk fatty acid profile and impacts on weight gain and th
ermogenic capacity ofsuckling rats. Lipids 48(5): 481-95, 2013 doi:
10.1007/s11745-013-3764-8.
34. Ravelli AC, van Der Meulen JH, Osmond C, Barker DJ, Bleker OP. Obesity at the
age of 50 y in men and women exposed to famine prenatally. Am J Clin Nutr
70(5):811-6, 1999.
35. Reynolds CM, Vickers MH, Harrison CJ, Segovia SA, Gray C. High
fat and/or high salt intake during pregnancy alters maternal meta-inflammation and
offspring growth and metabolic profiles. Physiol Rep 2(8): e12110, 2014 doi:
10.14814/phy2.12110.
36. Russell JA. Milk yield, suckling behaviour and milk ejection in the lactating rat
nursing litters of different sizes. J Physiol 303:403-15, 1980.
37. Schneider JL & Cuervo AM. Liver autophagy: much more than
just taking out the trash. Nat Rev Gastroenterol Hepatol 11(3):187-200, 2014 doi:
10.1038/nrgastro.2013.211.
38. Singh R, Kaushik S, Wang Y, Xiang Y, Novak I, Komatsu M, Tanaka K, Cuervo
AM, Czaja MJ. Autophagy regulates lipid metabolism. Nature 458(7242): 1131-5,
2009 doi: 10.1038/nature07976
39. Sullivan EL, Smith MS, Grove KL. Perinatal exposure to high-
fat diet programs energy balance, metabolism and behavior in adulthood.
32
Perinatal exposure to high
fat diet programs energy balance, metabolism and behavior in adulthood.
Neuroendocrinology 93(1): 1-8, 2011 doi: 10.1159/000322038.
40. Sun, B., Purcell, R.H., Terrillion, C.E., Yan, J., Moran, T.H., and Tamashiro, K.L.
Maternal high-fat diet during gestation or suckling differentially affects offspring
leptin sensitivity and obesity. Diabetes 61:2833–2841, 2012.
41. Tsukada M, Ohsumi, Y. Isolation and characterization of autophagy-defective
mutants of Saccharomyces cerevisiae. FEBS Lett 333(1-2): 169-74, 1993.
42. Vogt MC, Paeger L, Hess S, Steculorum SM, Awazawa M, Hampel B, Neupert
S, Nicholls HT, Mauer J, Hausen AC, Predel R, Kloppenburg P, Horvath
TL, Brüning JC.
Neonatal insulin action impairs hypothalamic neurocircuit formation in response to
maternal high-fat feeding. Cell, 156(3): 495-509, 2014 doi:
10.1016/j.cell.2014.01.008.
43. WHO, World Health Organization. World Health Statistics 2012. Report of a WHO
Consultation on Obesity. Geneva: WHO; 2012.
44. Yang L, Li P, Fu S, Calay ES, Hotamisligil GS.
Defective hepatic autophagy in obesity promotes ER stress and causes insulin
resistance. Cell Metab 11(6):467-78, 2010 doi: 10.1016/j.cmet.2010.04.005.
45. Yang Z, Klionsky DJ.
Mammalian autophagy: core molecular machinery and signaling regulation. Curr
Opin Cell Biol 22(2): 124-31 2010 doi: 10.1016/j.ceb.2009.11.014.
33
10. FIGURES
Figure 1. Body weight and adiposity of dams (SC or HFD) during pregnancy and
after weaning. (A) Weight of dams since exposure to SC or HFD until the weaning.
(B) Adiposity (%) of dams after weaning (gWAT, gonadal white adipose tissue;
rWAT, retroperitoneal white adipose tissue; BAT, brown adipose tissue). Values are
means ± SEM, n = 5-7 dams/group. *p < 0.05 *SC vs HFD
34
Figure 2. Metabolic characterization of male offspring (SC-O or HFD-O) at birth (d0).
(A) and (B) body weight and Lee Index, respectively (n = 30 pups/group). (C) Plasma
TNF-α (n = 6 per group). (D) Serum cholesterol (n = 6 per group). (E) Serum
triglycerides (n = 6 per group). Values are means ± SEM, *p < 0.05; *SC-O x HFD-O.
35
Figure 3. Inflammatory marker and protein content of autophagy markers in hypothalamus
and liver of male offspring (SC-O or HFD-O) at birth (d0). (A) and (D) hypothalamus and liver
relative gene expression of TNF-α. Representative western blotting of hypothalamus (B)
p62/β-actin. (C) LC3-II/LC3- I. Representative western blotting of liver (E) p62/β-actin. (F)
LC3-II/LC3- I. Values are means ± SEM, n = 4-6 pups per group. *p <0.05; *SC-O x HFD-O.
36
Figure 4. Metabolic parameters of male offspring (SC-O or HFD-O) during lactation until
weaning (d18). (A) Weight during lactation (n = 30 per group). (B) Lee Index during
lactation (n = 30 per group). (C) Adiposity corrected by weight at day 18 (n =14 per group)
(eWAT, epididymal white adipose tissue; rWAT, retroperitoneal white adipose tissue; BAT,
brown adipose tissue). (D) Fasting glucose at day 18 (n = 16 per group). (E) Serum
cholesterol at day 18, (F) serum triglycerides at day 18 and (G) serum TNF-α at day 18 (n =
5-6 per group). (H) Milk production at day 16 (n = 20 per group). Values are means ± SEM,
*p < 0.05; *SC-O x HFD-O.
37
Figure 5. Inflammatory marker and protein content of autophagy markers in hypothalamus
and liver of male offspring (SC-O or HFD-O) at weaning (d18). (A) and (D) Hypothalamus and
liver, respectively, mRNA to TNF-α. Representative western blotting of hypothalamus on d18
(B) p62/β-actin. (C) LC3-II/LC3- I. Representative western blotting of liver (E) p62/β-actin. (F)
LC3-II/LC3- I. Values are means ± SEM, n = 4–6 pups per group. *p < 0.05; *SC-O x HFD-O.
38
Figure 6. Metabolic characterization of male offspring at adulthood (d82). (A) Weight of OC-C
and OH-C mice. (B) Food Intake corrected by weight of OC-C and OH-C mice. (C) Fasting
glucose of OC-C and OH-C mice. (D) Adiposity correct by weight (eWAT, epididymal white
adipose tissue; rWAT, retroperitoneal white adipose tissue; BAT, brown adipose tissue) of OC-C
and OH-C mice. (E) Weight of OC-H and OH-H mice. (F) Food Intake corrected by weight of
OC-H and OH-H mice. (G) Fasting glucose of OC-H and OH-H mice. (H) Adiposity correct by
weight of OC-H and OH-H mice. Values are means ± SEM, n = 5–15 pups per group. *p < 0.05;
*OC-C x OH-C or *OC-H x OH-H.
39
Figure 7. Protein content of autophagy markers in hypothalamus and liver of male
offspring (OC-C or OH-C) at adulthood (d82). Representative western blotting of
hypothalamus. (A) p62/β-actin. (B) LC3-II/LC3-I. Representative western blotting of
liver. (C) p62/β-actin. (D) LC3II/LC3I. Values are means ± SEM, n = 4–6 pups per
group. *p < 0.05; *OC-C x OH-C.
40
Figure 8. Protein content of autophagy markers in hypothalamus and liver of male
offspring (OC-H or OH-H) at adulthood (d82). Representative western blotting of
hypothalamus. (A) p62/Tubulin. (B) LC3-II/LC3-I. Representative western blotting of
liver. (C) p62/β-actin. (D) LC3-II/LC3-I. Values are means ± SEM, n = 4–6 pups per
group. *p < 0.05; *OC-H x OH-H.
41
Supplementary 01. Indirect Calorimetry of animals at weaning (d18). (A) VO2
corrected by weight. (B) VC02 corrected by weight. (C) Energy expenditure corrected
by weight. (D) Respiratory Quotient. Values are means ± SEM, n = 4 pups per group.
*p < 0.05; *OC-H x OH-H.
42
Supplementary 2. Protein content of autophagy markers in hypothalamus and liver of
male offspring ten days after weaning (d28). Representative western blotting of
hypothalamus. (A) p62/β-actin. (B) LC3-II/LC3-I. Representative western blotting of
liver. (C) p62/β-actin. (D) LC3-II/LC3-I. Values are means ± SEM, n = 4 pups per
group. *p < 0.05; *OC-H x OH-H
43
Supplementary 3. Metabolic parameters and protein content of autophagy markers in
hypothalamus and liver of male offspring at 42 days. (A) Weight of SC-O and HFD-O
mice. (B) Adiposity correct by weight (eWAT, epididymal white adipose tissue; rWAT,
retroperitoneal white adipose tissue). (C) Food Intake corrected by weight of SC-O and
HFD-O mice. (D) Fasting glucose of SC-O and HFD-O mice. Representative western
blotting of hypothalamus. (E) p62/β-actin. (F) LC3-II/LC3-I. Representative western
blotting of liver. (G) p62/β-actin. Values are means ± SEM, n = 4 pups per group (WB)
and 4-8 pups per group (metabolic parameters). *p < 0.05; *OC-H x OH-H
44
3. DISCUSSÃO E CONCLUSÃO
A autofagia celular é essencial para diferentes funções fisiológicas do
organismo como, por exemplo, resposta adaptativa à inanição e consequente
fornecimento de energia à célula; controle de qualidade celular devido à eliminação de
agregados proteicos, organelas senescentes e patógenos invasores; além da supressão
da formação de tumores e apresentação de antígenos (Levine & Kroemer, 2008;
Mizushima et al. 2008).
Em patologias como a obesidade, alguns estudos prévios demonstraram
que a autofagia está frequentemente comprometida tanto no sistema nervoso central
(Meng & Cai, 2011) quanto em tecidos periféricos (Liu et al. 2009; Yang et al. 2010)
provavelmente contribuindo para a progressão e piora do quadro clínico dessa doença.
Frente a esse contexto, este estudo teve como objetivo avaliar a modulação de autofagia
na prole de animais submetidos a um ambiente de desenvolvimento adverso
proporcionado pelo uso de DH durante a gestação e lactação bem como o impacto na
modulação de autofagia nesses animais na vida adulta após reexposição à DH.
Em condições fisiológicas durante o desenvolvimento embrionário a
autofagia é super-regulada após a fertilização (Tsukamoto, 2008) sendo essencial para a
fase pré-implantação devido à capacidade em direcionar rápidas modificações celulares
que favorecem a diferenciação celular (Mizushima & Levine, 2010). No entanto, quando
a autofagia está comprometida nesses períodos, é possível encontrar algumas
anormalidades em organismos como fungos (Tsukad et al, 1993), protozoários (Alvarez
et al, 2008) e insetos (Juhász et al, 2003).
Similarmente a dados previamente publicados (Melo et al, 2014;
Reynolds et al, 2014), os primeiros resultados mostrados revelaram que a prole de mãe
obesa ao nascer apresentou menor massa corporal bem como diminuição no índice de
Lee, apesar de nenhuma outra alteração nos parâmetros metabólicos avaliados.
Sabe-se que durante a gestação os nutrientes necessários ao
desenvolvimento neonatal são ofertados pela placenta, porém ao nascer esse
suprimento é interrompido o que faz com que o neonato vivencie um período de inanição
até a ingestão do leite materno (Kuma et al. 2004). Assim, embora ainda não seja claro o
45
motivo pelo qual os animais tenham apresentado menor massa corporal ao nascimento,
acreditamos que a função placentária de transporte de nutrientes possa estar
comprometida em modelos experimentais de obesidade, o que possivelmente impactou
de modo negativo no fenótipo de nosso modelo experimental.
De fato, segundo Zhou e colaboradores (2015), o prejuízo na função da
placenta está dentre as maiores causas de doenças fetais. Particularmente, o consumo
de DH, independente da obesidade materna, foi responsável por aumentar a expressão
de citocinas pró- inflamatórias e a expressão de TLR4 (toll-like receptor 4) na placenta de
primatas não humanos. Isso foi correlacionado com a diminuição de fluxo sanguíneo
intrauterino nos animais DH e com aumento na frequência de fetos natimortos (Frias et
al. 2011).
Em outro estudo, foram utilizadas fêmeas de camundongo knockout
para o receptor de insulina no fígado, o que foi responsável por desencadear
hiperinsulinemia. Sabe-se que a insulina não atravessa a barreira transplacentária, mas o
excesso desse hormônio na circulação materna pode alterar o crescimento e
desenvolvimento da placenta devido a modificações na expressão de receptores de
insulina, assim, a prole destes animais também apresentou menor massa corporal ao
nascer quando comparada ao controle (Karaman, 2014).
A homeostase na atividade de autofagia celular também é outra condição
essencial ao neonato. Importantes marcadores de autofagia, como Atg5 e Atg7, ao serem
deletados em modelos experimentais, induzem a morte de camundongos com
aproximadamente 13 horas enquanto que os animais controle morrem após um período
de 21 horas (Kuma et al. 2004; Komatsu et al. 2005). Os dados mostraram
comprometimento do conteúdo proteico de marcadores de autofagia no fígado da prole
de mãe obesa induzida por DH (tabela 01- anexo) ao nascer, embora sem nenhuma
alteração na atividade de autofagia hipotalâmica. Devido ao comprometimento presente
no fígado, acreditamos que a avalição da taxa de sobrevivência neonatal da prole de
mãe obesa comparada a prole de mãe controle, se caracterize como importante alvo
para futuros estudos.
Adicionalmente, Hung e colaboradores (2013) demonstraram que a
autofagia está presente durante o desenvolvimento da placenta humana sendo que a
46
obesidade materna parece proporcionar uma super-regulação em tipos específicos do
transporte de aminoácidos resultando na ativação da via de sinalização de mTOR
(Jansson et al. 2013), sendo a mTORC1 um importante regulador negativo da autofagia
(Yang et al, 2010), o que poderia explicar, pelo menos em parte, a modulação dos
marcadores de autofagia no fígado da prole ao nascer. Por outro lado, acredita-se
também que a modulação de autofagia no hipotálamo sofra influência direta do estágio
de maturação das conexões hipotalâmicas, as quais em roedores se dão após o
nascimento durante as duas primeiras semanas de vida (Bouret et al, 2009).
Corroborando tais ideias, após o desmame, foi encontrado
comprometimento dos parâmetros metabólicos mensurados sendo que a autofagia
apresentou-se comprometida tanto no hipotálamo quanto no fígado. De fato, o período
da lactação em roedores é altamente sensível frente às adversidades desencadeadas
pela ingestão DH materna (Sun et al. 2012) com efeitos negativos, por exemplo, no
desenvolvimento das projeções neuronais e consequente prejuízo na homeostase da
glicose e ingestão alimentar (Voght et al. 2014). Copé e colaboradores (2012)
descreveram que a homeostase na autofagia também é essencial ao desenvolvimento
das projeções neuronais já que a deleção de Atg7 em neurônios POMC levou ao
aumento na massa corporal, adiposidade e redução na densidade das fibras neuronais
nos modelo experimental após o desmame.
Durante a lactação a prole de mãe obesa (HFD-O) apresentou aumento
na massa corporal sem nenhuma diferença na calorimetria indireta quando comparada à
prole de mãe controle (SC-O), levando-nos a acreditar que esse fenótipo pode ser
explicado possivelmente pelo aumento na ingestão alimentar. No entanto, destacamos
que outras técnicas de avaliação direta do consumo de leite materno deveriam ser
exploradas para a confirmação deste dado. Adicionalmente, seria interessante avaliar o
perfil lipídico do leite materno no nosso modelo experimental, tendo em vista que em
ratos, já foram reportados que as fontes de lipídeos da dieta materna afetam diretamente
a composição do leite materno bem como o perfil de ácidos graxos circulantes na prole
(Priego et al. 2013).
Além de outras interações, o perfil de lipídeos circulantes pode afetar
diretamente propriedades físico-químicas da bicamada lipídica interferindo na fluidez e
47
no remodelamento da membrana celular (Koga et al. 2010; Dall'Armi et al. 2013). Tal
conhecimento intensifica a discussão a respeito da presença de um importante crosstalk
entre autofagia e a quantidade e qualidade de lipídeos na célula. Assim, ainda que pouco
estudado, sugere-se que os lipídeos influenciem nas várias etapas da autofagia incluindo
a iniciação, a biogênese da membrana autofagossomo e sua maturação. Acreditamos
que as possíveis alterações na composição da membrana lipídica frente à ingestão de
DH materna possam também resultar em prejuízos na autofagia, sendo que, por
exemplo, a etapa de fusão do autofagossomo com o lisossomo de nosso modelo
experimental, torna-se outro alvo importante para futuros estudos (Dall Armi, Carlsonn,
Koga).
O experimento adicional feito nos animais aos 28 dias de vida, quando os
mesmos receberam dieta controle durante o período de 10 dias após o desmame,
demonstrou que os animais apresentaram aumento na atividade de autofagia
hipotalâmica (Figura Suplementar 02). Destacamos que a autofagia é um processo
altamente dinâmico, o qual pode ser ativado em situações como estresse de retículo
endoplasmático (ERE) severo (Ogata et al., 2006). Acredita-se que a autofagia atue
como um mecanismo de sobrevivência frente ao acúmulo de proteínas incorretamente
dobradas e/ou que excederam a capacidade do retículo endoplasmático (Ogata et al.,
2006). Interessantemente, Melo e colaboradores, 2014 ao utilizar o mesmo modelo
experimental de nosso estudo, encontraram aumento no conteúdo proteico de
marcadores do ERE em hipotálamo, o que poderia estar relacionado aos nossos
resultados de marcadores de autofagia neste tecido.
Entretanto, apesar do também aumento de marcadores do ERE no
fígado, houve diminuição da autofagia, assim como ao desmame. Nota-se que outros
estudos já apontaram que a diminuição de autofagia também pode implicar em ERE
(Zhang et al, 2015) devido ao acúmulo de proteínas ubiquitinadas, sendo que os
mecanismos relacionados ao crosstalk entre essas duas vias celulares ainda
permanecem pouco compreendidos.
Com o mesmo modelo experimental aos 28 dias de vida, Benatti e
colaboradores (2014) demonstraram que o consumo materno de DH foi responsável por
induzir esteatose hepática acompanhada por alterações na expressão gênica de genes
48
relacionados à β-oxidação e alteração na expressão de microRNA-122. Sabendo que a
autofagia atua no metabolismo hepático de lipídios, acreditamos que o prejuízo na
autofagia hepática encontrado na prole de mãe obesa tanto ao nascer como após a
lactação podem contribuir negativamente para o fenótipo obeso bem como para as
alterações metabólicas relacionadas ao metabolismo de lipídeos.
Em acordo com essa hipótese citada acima, temos que a autofagia atua
no desenvolvimento e progressão de doença hepática gordurosa não alcoólica (DHGNA).
Por exemplo, animais com deleção específica de Atg7 que foram alimentados com DH
desenvolveram aumento no conteúdo de triglicerídeos e colesterol hepático indicando
que prejuízos na autofagia hepática podem promover quadros de esteatose (Singh et al.
2009; Yang et al. 2010). Outro estudo retratou que uso de rapamicina, um importante
indutor de autofagia, resultou em diminuição no conteúdo de triglicerídeos nos
hepatócitos, sugerindo que a indução de autofagia pode proteger contra a lipotoxicidade
induzida por DH e que a autofagia nesse tecido pode ser um importante alvo terapêutico
para doenças hepáticas associadas à obesidade (Mei et al, 2011).
Algumas citocinas regulam a resposta imune celular e a atividade de
autofagia por mecanismos ainda não totalmente esclarecidos. Sabendo que alguns tipos
de citocinas aumentam a autofagia, enquanto que outros a inibem, nós avaliamos a
expressão gênica de TNF-α bem como o seu conteúdo no soro e plasma dos animais ao
nascer e após a lactação. Similarmente a dados previamente publicados por nosso grupo
(Melo et al. 2014; Benatti et al. 2014), em grande parte das análises, não encontramos
nenhuma correlação com a atividade de autofagia. Assim, parece que a baixa
sensibilidade de nossos métodos em detectar pequenas modificações entre os grupos,
explique, pelo menos em parte, os nossos resultados referentes a esta citocina.
Ao caracterizar a atividade de autofagia na prole aos 42 dias de vida,
antes de receberem a reexposição à DH, encontramos que apensar do
comprometimento em parâmetros metabólicos como maior massa corpórea, adiposidade
e glicemia de jejum, somente o fígado apresentou acúmulo da proteína p62 (Figura
Suplementar 03). Assim, temos a hipótese de que a renovação na composição da
membrana lipídica possa interferir na modulação dos marcadores de autofagia nos
tecidos avaliados.
49
Aos 82 dias de vida, os grupos com dieta controle ou reexpostos à DH
ainda exibiram importantes alterações nos parâmetros metabólicos, reproduzindo dados
já publicados em literatura. Por exemplo, a obesidade materna e o uso de DH aumentou
a enzima ácido graxo sintase e diminuiu a enzima superóxido dismutase na prole ao
nascer (Bringhenti et al. 2014). Na vida adulta, a prole de ratos apresentou intolerância a
glicose, aumento na sinalização de NPY e resistência à leptina no hipotálamo (Chen et
al, 2009). Adicionalmente, Ashino e colaboradores (2009) revelaram que na vida adulta o
fígado da prole de mãe obesa apresentou aumento na modulação p-JNK acompanhado
por resistência à ação da insulina e aumento no conteúdo de triglicérides hepático.
Em relação à atividade de autofagia, temos que a comparação entre os
grupos que receberam dieta controle na vida adulta (OCC x OHC) demonstrou que a
obesidade materna induzida por DH durante a gestação e lactação pareceu não ser
suficiente para modular negativamente o conteúdo proteico de marcadores de autofagia
nessa faixa etária. Com isso, nos suspeitamos que a DH durante a vida adulta seja
responsável por potencializar as possíveis alterações epigenéticas no nosso modelo
experimental. No entanto, estudos adicionais como a avaliação de microRNAs que são
capazes de modular a autofagia celular e a metilação de genes essenciais a via, devem
ser conduzidos para confirmar tais ideias. Acreditamos também o comprometimento da
autofagia pode contribuir para o desenvolvimento do fenótipo obeso do nosso modelo
experimental.
Em resumo, os resultados deste estudo demonstraram que a prole de
mães obesas apresentou comprometimento no conteúdo proteico de proteínas da
autofagia no fígado ao nascer. Após a lactação ambos os tecidos estudados (hipotálamo
e fígado) apresentaram prejuízos nos marcadores de autofagia. De modo interessante, a
prole de mãe obesa na vida adulta ao receber dieta controle não teve comprometimento
da autofagia em nenhum tecido analisado. Por outro lado, a reexposição aos lipídios
pareceu ser essencial ao prejuízo na modulação negativa de proteínas da autofagia em
nosso modelo experimental. No entanto, destacamos a importância de outros estudos
que utilizem técnicas adicionais para a avaliação da autofagia celular, especialmente nos
tecidos aqui estudados.
50
4. REFERÊNCIAS
ACOG- American College of Obstetricians and Gynecologists. ACOG Committee opinion
no. 549: obesity in pregnancy. Obstet Gynecol. 2013; 121(1):213-7.
Alvarez VE, Kosec G, Sant'Anna C, Turk V, Cazzulo JJ, Turk B.
Autophagy is involved in nutritional stress response and differentiation in Trypanosoma cr
uzi. J Biol Chem. 2008; 283(6):3454-64.
Ameeta K. Autophagy. New York Academy of Sciences (Ann. N.Y. Acad. Sci). 2005; 1066:
259–271.
Araújo EP, Torsoni MA, Velloso LA. Hypothalamic Inflammation and Obesity. Vitamins &
Hormenes.2010; 82: 129-43.
Arsham AM, Neufeld TP. Thinking globally and acting locally with TOR. Curr Opin Cell
Biol. 2006; 18(6):589-97.
Ashino NG, Saito KN, Souza FD, Nakutz FS, Roman EA, Velloso LA, Torsoni AS, Torsoni
MA. Maternal high-fat feeding through pregnancy and lactation predisposes mouse
offspring to molecular insulin resistance and fatty liver. J. Nutr. Biochem. 2012; 23: 341–
348.
Behrend SC, Sowa ME, Gygi SP et al. Network organization of the human autophagy
system. Nature. 2010; (1): 68-76.
Benatti RO, Melo AM, Borges FO, Ignacio-Souza LM, Simino LA, Milanski M, Velloso
LA, Torsoni MA, Torsoni AS. Maternal high-fat diet consumption modulates hepatic lipid
metabolism and microRNA-122 (miR-122) and microRNA-370 (miR-370) expression in
offspring. Br J Nutr. 2014;111(12):2112-22.
51
Bouret SG, Draper SJ, Simerly RB.
Trophic action of leptin on hypothalamic neurons that regulate feeding. Science. 2004;
304(5667):108-10.
Bouret SG. Early life origins of obesity: role of hypothalamic programming. J Pediatr
Gastroenterol Nutr. 2009; 48. Suppl 1:S31-8.
BRASIL. Pesquisa de Orçamentos Familiares 2008-2009- Antropometria e estado
nutricional de crianças, adolescentes e adultos no Brasil. Instituto Brasileiro de Geografia
e Estatística – IBGE. Rio de Janeiro. 2010.
BRASIL. Vigitel Brasil 2013: vigilância de fatores de risco e proteção para doenças
crônicas por inquérito telefônico. Ministério da Saúde, Secretaria de Vigilância em Saúde.
– Brasília: Ministério da Saúde, 2014. Disponível em:
<http://www.prefeitura.sp.gov.br/cidade/secretarias/upload/saude/arquivos/morbidade/Vigi
tel-2013.pdf>. Acesso em 03 de outubro de 2014.
Bringhenti I, Ornellas F, Martins MA, Mandarim-de-Lacerda CA, Aguila MB. Early hepatic insult in the offspring of obese maternal mice. Nutr Res. 2015 Feb;35(2):136-45
Caballero B. The global epidemic of obesity: an overview. Epidemiol Rev. 2007; 29:1-5.
Calle EE & Kaaks R. Overweight, obesity and cancer: epidemiological evidence and
proposed mechanisms. Nat Rev Cancer. 2004; 4(8):579-91.
Chen H, Simar D, Morris MJ. Hypothalamic neuroendocrine circuitry is programmed by maternal obesity: interaction with postnatal nutritional environment. PLoS One. 2009; 4(7):e6259.
Considine RV, Sinha MK, Heiman ML, Kriauciunas A, Stephens TW, Nyce MR, et al.
Serum immunoreactive leptin concentrations in normal-weight and obese humans. N Engl
J Med. 1996; 334: 292-5.
52
Coupé B, Ishii Y, Dietrich MO, Komatsu M, Horvath TL, Bouret SG.
Loss of autophagy in pro-
opiomelanocortin neurons perturbs axon growth and causes metabolic dysregulation. Cell
Metab. 2012; 15(2):247-55.
Czaja MJ, Ding WX, Donohue TM Jr, Friedman SL, Kim JS, Komatsu M, Lemasters
JJ, Lemoine A, Lin JD, Ou JH, Perlmutter DH, Randall G, Ray RB, Tsung A, Yin XM.
Functions of autophagy in normal and diseased liver. Autophagy. 2013; 9(8):1131-58.
Dall'Armi C, Devereaux KA, Di Paolo G. The role of lipids in the control of autophagy.
Curr Biol. 2013 Jan 7;23(1):R33-45.
Davidowa H, Plagemann A. Insulin resistance of hypothalamic arcuate neurons in
neonatally overfed rats. Neuroreport. 2007;18:521–4.
De Duve C. Lysosomes revisited. Eur J Biochem. 1983 Dec 15;137(3):391-7.
De Souza CT, Araujo EP, Bordin S, Ashimine R, Zollner RL, Boschero AC, Saad MJ,
Velloso LA. Consumption of a fat-rich diet activates a proinflammatory response and
induces insulin resistance in the hypothalamus. Endocrinology.2005; 146:4192-4199.
Elmquist JK, Coppari R, Balthasar N, Ichinose M, Lowell BB. Identifying hypothalamic
pathways controlling food intake, body weight, and glucose homeostasis. The Journal
Comparative Neurology. 2005; 493(1):63-71.
Ezaki J, Matsumoto N, Takeda-Ezaki M, Komatsu M, Takahashi K, Hiraoka Y, et al. Liver
autophagy contributes to the maintenance of blood glucose and amino acid
levels. Autophagy. 2011;7:727–36.
Farooqi S & O’Rahilly S. Genetics of obesity in humans. Endocr Rev. 2006; 27(7):710-
18.
53
Fimia GM, Stoykova A, Romagnoli A, Giunta L, Di Bartolomeo S, Nardacci R, Corazzari
M, Fuoco C, Ucar A, Schwartz P, Gruss P, Piacentini M, Chowdhury K,Cecconi F.
Ambra1 regulates autophagy and development of the nervous system. Nature. 2007;
447(7148):1121-5.
Flenady V, Koopmans L, Middleton P, Frøen JF, Smith GC, Gibbons K, Coory M, Gordon
A, Ellwood D, McIntyre HD, Fretts R, Ezzati M. Major risk factors for stillbirth in high-
income countries: a systematic review and meta-analysis. Lancet. 2011; 377(9774):1331-
40.
Flier JS. Obesity wars: molecular progress confronts an expanding epidemic. Cell. 2004;
116: 2004.
Fonseca-Alaniz MH, Takada J, Alonso-Vale MIC, et al. O tecido adiposo como centro
regulador do metabolismo. Arq Bras Endocrinol Metabol. 2006; 50(2).
Frias A.E., T.K. Morgan, A.E. Evans, J. Rasanen, K.Y. Oh, K.L. Thornburg, et al. Maternal
high-fat diet disturbs uteroplacental hemodynamics and increases the frequency of
stillbirth in a nonhuman primate model of excess nutrition Endocrinology, 152 (2011), pp.
2456–2464
Friedman JM & Halaas JL. Leptin and the regulation of body weight in mammals. Nature.
1998; 395(6704):763-70.
Fujita N, Itoh T, Omori H, Fukuda M, Noda T, Yoshimori T. The Atg16L complex specifies
the site of LC3 lipidation for membrane biogenesis in autophagy. Mol Biol Cell. 2008
May;19(5):2092-100.
Galgani J & Ravussin E. Energy metabolism, fuel selection and body weight regulation.
Int J Obes. 2008; 7: 109–S119.
54
Glick D, Barth S, Macleod KF. Autophagy: cellular and molecular mechanisms. The
Journal of Pathology. 2010; 221(1): 3-12.
Godfrey KM, Barker DJP. Fetal programming and adult health. Public Health Nutr. 2001;
4(2B):611-24.
Godfrey KM, Barker DJP. Fetal programming and adult health. Public Health Nutr. 2001;
4(2B):611-24.
Guelinckx I, Devlieger R, Beckers K, Vansant G: Maternal obesity: pregnancy
complications, gestational weight gain and nutrition. Obes Rev. 2008; 9(2):140-50.
Guilherme A, Virbasius JV, Puri V, Czech MP: Adipocyte dysfunctions linking obesity to
insulin resistance and type 2 diabetes. Nat Rev Mol Cell Biol 2008;9:367–377.
Guo F, Jen KL. High-fat feeding during pregnancy and lactation affects offspring
metabolism in rats. Physiol Behav.. 1995; 57(4):681-6.
Hales CN, Barker DJ. The thrifty phenotype hypothesis. Br Med Bull. 2001; 60:5-20.
Hung TH, Hsieh TT, Chen SF, Li MJ, Yeh YL. Autophagy in the
human placenta throughout gestation. PLoS One. 2013; 8(12):e83475
Jansson N, Rosario FJ, Gaccioli F, Lager S, Jones HN, Roos S, Jansson T, Powell TL.
Activation of placental mTOR signaling and amino acid transporters in obese women
giving birth to large babies. J Clin Endocrinol Metab. 2013 Jan;98(1):105-13.
Jansson N, Rosario FJ, Gaccioli F, Lager S, Jones HN, Roos S, Jansson T, Powell TL.
Activation of placental mTOR signaling and amino acid transporters in obese women
giving birth to large babies. J Clin Endocrinol Metab. 2013;98(1):105-13.
55
Jones AP, Dayries M. Maternal hormone manipulations and
the development of obesity in rats. Physiol Behav. 1990; 47(6):1107-10.
.
Jones HN, Woollett LA, Barbour N, Prasad PD, Powell TL, Jansson T. High-fat diet before
and during pregnancy causes marked up-regulation of placental nutrient transport and
fetal overgrowth in C57/BL6 mice. FASEB J. 2009; 23(1):271-8.
Juhász G, Csikós G, Sinka R, Erdélyi M, Sass M.
The Drosophila homolog of Aut1 is essential for autophagy and development. FEBS
Lett. 2003; 543(1-3):154-8.
Kahraman S, Dirice E, De Jesus DF, Hu J, Kulkarni RN.
Maternal insulin resistance and transient hyperglycemia impact the metabolic and endocri
ne phenotypes ofoffspring. Am J Physiol Endocrinol Metab. 2014; 307(10):E906-18
Kaushik S, Rodriguez-Navarro JA, Arias E, Kiffin R, Sahu S, Schwartz GJ, Cuervo
AM, Singh R. Autophagy in hypothalamic AgRP neurons regulates food intake and
energy balance. Cell Metab. 2011; 14(2):173-83.
Kim KH & Lee MS. Autophagy--a key player in cellular and body metabolism. Nat Rev
Endocrinol. 2014; 10(6):322-37.
Klionsky, D.J. The molecular machinery of autophagy: unanswered questions. Journal of
Cell Science. 2005; 118: 7-18.
Koga H, Kaushik S, Cuervo AM.
Altered lipid content inhibits autophagic vesicular fusion. Faseb J. 2010; 24(8): 3052-65.
Komatsu M, Waguri S, Ueno T, Iwata J, Murata S, Tanida I, Ezaki J, Mizushima
56
N, Ohsumi Y, Uchiyama Y, Kominami E, Tanaka K, Chiba T. Impairment of starvation-
induced and constitutive autophagy in Atg7-deficient mice. J Cell Biol. 2005;169(3):425-
34.
Kuma A, Hatano M, Matsui M, Yamamoto A, Nakaya H, Yoshimori T, Ohsumi Y, Tokuhisa
T, Mizushima N. The role of autophagy during the early neonatal starvation period.
Nature. 2004;432(7020):1032-6.
Latorraca MQ, Carneiro EM, Boschero AC, Mello MAR. Protein deficiency during
pregnancy and lactation impairs glucose-induced insulin secretion but increases the
sensitivity to insulin in weaned rats. British Journal of Nutrition (1998), 80, 291–297.
Lavallard VJ, Gual P. Autophagy and non-alcoholic fatty liver disease. Biomed Res
Int. 2014; 2014:120179.
Lee SE, Hwang KC, Sun SC, Xu YN, Kim NH. Modulation
of autophagy influences development and apoptosis in mouse embryos developing in
vitro. Mol Reprod Dev. 2011; 78(7):498-509
Levin BE. Metabolic imprinting: critical impact of the perinatal environment on the
regulation of energy homeostasis. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2006;
361(1471):1107-21.
Levine B, Kroemer G. Autophagy in the pathogenesis of disease. Cell. 2008;132(1):27-
42.
Levine B. Eating oneself and uninvited guests: autophagy-related pathways in cellular
defense. Cell. 2005; 120(2):159-62.
Liu HY, Han J, Cao SY, Hong T, Zhuo D, Shi J, Liu Z, Cao W.
Hepatic autophagy is suppressed in
57
the presence of insulin resistance and hyperinsulinemia: inhibition of FoxO1-dependent
expression of key autophagy genes by insulin. J Biol Chem. 2009;284(45):31484-92.
Makiko Yamada M, Wolfe D, Han G, French SW, Ross MG, and Desai M. Early onset of
fatty liver in growth-restricted rat fetuses and newborns. Congenital Anomalies 2011; 51,
167–173.
Maloney CA, Gosby AK, Phuyal JL, Denyer GS, Bryson JM & Caterson ID Site-specific
changes in the expression of fat-partitioning genes in weanling rats exposed to a low-
protein diet in utero. Obesity Research. 2003; 11: 461–468.
Martin-Gronert S, Ozanne E. Early life programming of obesity. Med Wieku Rozwoj. 2013;
17(1):7-12.
Mei S, Ni HM, Manley S, Bockus A, Kassel KM, Luyendyk JP, Copple BL, Ding WX.
Differential roles of unsaturated and saturated fatty acids on autophagy and apoptosis in
hepatocytes. J Pharmacol Exp Ther. 2011; 339(2):487-98.
Melo AM, Benatti RO, Ignacio-Souza LM, Okino C, Torsoni AS, Milanski M, Velloso
LA, Torsoni MA. Hypothalamic endoplasmic reticulum stress and insulin resistance in
offspring of mice dams fed high-fat diet during pregnancy and lactation.
Metabolism. 2014; 63(5):682-92.
Meng Q & Cai D. Defective hypothalamic autophagy directs the central pathogenesis of
obesity via the IkappaB kinase beta (IKKbeta)/NF-kappaB pathway. J Biol Chem. 2011;
286(37):32324-32.
Mizushima N, Komatsu M. Autophagy: renovation of cells and tissues. Cell. 2011 Nov
11;147(4):728-41.
Mizushima N, Levine B, Cuervo AM, Klionsky DJ.
Autophagy fights disease through cellular self-digestion. Nature. 2008;451(7182):1069-
58
75.
Mizushima N, Levine B. Autophagy in mammalian development and differentiation. Nat
Cell Biol. 2010; 12(9):823-30.
Monteiro CA, Conde WL, Popkin BM. The burden of disease due to under- and over-
nutrition in countries undergoing rapid nutrition transition: a view from Brazil. Am J Public
Health. 2004; 94:3.
Ogata M, Hino S, Saito A, Morikawa K, Kondo S, Kanemoto S, Murakami T, Taniguchi
M, Tanii I, Yoshinaga K, Shiosaka S, Hammarback JA, Urano F, Imaizumi K. Autophagy is
activated for cell survival after endoplasmic reticulum stress. Mol Cell Biol. 2006
Dec;26(24):9220-31. Epub 2006 Oct 9.
Ozanne SE. Metabolic programming—knowns, unknowns and possibilities. Nat. Rev.
Endocrinol. 2015; 11: 67–68 APUD Waddington, C. H. Organizers and Genes (Cambridge
University Press, 1940.
Ozanne SE, Hales CN. The long term consequences of intra-uterine protein malnutrition
on glucose metabolism. Proc Nutr Soc. 1999; 58: 615–9.
Priego T, Sánchez J, García AP, Palou A, Picó C.
Maternal dietary fat affects milk fatty acid profile and impacts on weight gain and thermog
enic capacity ofsuckling rats. Lipids. 2013; 48(5):481-95.
Portovedo M, Ignacio-Souza L, Bombassaro B, Coope A, Reginato A, Razolli D.N,
Torsoni MA, Torsoni AS, Leal RF, Velloso LA, Milanski M. Saturated fatty acids modulate
autophagy’s proteins in the hypothalamus. PLoS One. 2015 Mar 18;10(3):e0119850. doi:
10.1371/journal.pone.0119850
Quan W, Kim HK, Moon EY, Kim SS, Choi CS, Komatsu M, Jeong YT, Lee MK, Kim
59
KW, Kim MS, Lee MS. Role of hypothalamic proopiomelanocortin neuron autophagy in
the control of appetite and leptin response. Endocrinology. 2012 Apr;153(4):1817-26.
Reynolds CM, Vickers MH, Harrison CJ, Segovia SA, Gray C. High fat and/or high salt
intake during pregnancy alters maternal meta-inflammation and offspring growth
andmetabolic profiles. Physiol Rep. 2014; 2(8): e12110.
Roseboom T, de Rooij S, Painter R. The Dutch famine and its long-
term consequences for adult health. Early Hum Dev. 2006;82(8):485-91.
Roseboom TJ, Van der Meulen JH, Ravelli AC, Osmond C, Barker DJ, Bleker
OP.Effects of prenatal exposure tothe Dutch famine on adult disease in later life:
an overview. Twin Res. 2001;4(5):293-8.
Samuelsson AM, Matthews PA, Argenton M, Christie MR, McConnell JM, Jansen
EH, Piersma AH, Ozanne SE, Twinn DF, Remacle C, Rowlerson A, Poston L,Taylor PD.
Diet induced obesity in female mice leads to offspring hyperphagia, adiposity,
hypertension, and insulin resistance: a novel murine model of developmental
programming. Hypertension. 2008; 51(2):383-92.
Schwartz MV. Staying slim with insulin in mind. Science. 2000; 289: 2066-7.
Singh R, Kaushik S, Wang Y, Xiang Y, Novak I, Komatsu M, et al. Autophagy regulates
lipid metabolism. Nature. 2009;458:1131–5.
Sowers JR: Obesity as a cardiovascular risk factor. Am J Med 2003;115(suppl 8A):37S–
41S.
Steculorum SM, Bouret SG. Maternal diabetes compromises the organization of
hypothalamic feeding circuits and impairs leptin sensitivity in offspring.
Endocrinology. 2011; 152(11):4171-9.
60
Sun, B., Purcell, R.H., Terrillion, C.E., Yan, J., Moran, T.H., and Tamashiro, K.L. Maternal
high-fat diet during gestation or suckling differentially affects offspring leptin sensitivity
and obesity. Diabetes. 2012; 61:2833–2841.
Swinburn BA, Sacks G, Hall KD, McPherson K, Finegood DT, Moodie ML et al. The global
obesity pandemic: shaped by global drivers and local environments. Lancet. 2011; 378
(9793): 804-14.
Tanida I, Sou YS, Ezaki J, Minematsu-Ikeguchi N, Ueno T, Kominami E.
HsAtg4B/HsApg4B/autophagin1 cleaves the carboxyl termini of three human Atg8 homolo
gues and delipidatesmicrotubule-associated protein light chain 3- and GABAA receptor-
associated protein-phospholipid conjugates. J Biol Chem. 2004; 279(35):36268-76.
Triunfo S & Lanzone A. Impact of overweight and obesity on obstrtic outcomes. J
Endocrinol Invest. 2014; 37(4): 323-329.
Tsukada M, Ohsumi, Y. Isolation and characterization of autophagy-defective mutants of
Saccharomyces cerevisiae. FEBS Lett. 1993;333(1-2):169-74.
Tsukamoto S, Kuma A, Murakami M, Kishi C, Yamamoto A, Mizushima N.
Autophagy is essential for preimplantation development of mouse embryos.
Science. 2008; 321(5885):117-20.
Vaiserman, A. M. Epigenetic Programming by Early-Life Stress: Evidence from Human
Populations. Developmental Dynamics 00:000–000, 2014
Velloso LA. The brain is the conductor: diet-induced inflammation overlapping
physiological control of body mass and metabolismo. Arquivos Brasileiros de
Endocrinologia & Metabologia. 2009; 53(2): 151-8.
Verdich C, Toubro S, Buemann B, Lysgård Madsen J, Juul Holst J, Astrup A. The role of
61
postprandial releases of insulin and incretin hormones in meal-induced satiety--effect of
obesity and weight reduction. Int J Obes Relat Metab Disord. 2001; 25(8):1206-14.
Vogt MC, Paeger L, Hess S, Steculorum SM, Awazawa M, Hampel B, Neupert S, Nicholls
HT, Mauer J, Hausen AC, Predel R, Kloppenburg P, Horvath TL, Brüning
JC.Neonatal insulin action impairs hypothalamic neurocircuit formation in response to mat
ernal high-fat feeding. Cell. 2014 Jan 30;156(3):495-509. doi: 10.1016/j.cell.2014.01.008.
WHO- World Health Organization. Obesity: preventing and managing the global
epidemic. Report of a WHO Consultation. World Health Organization Tech Rep Ser. 2000;
894:i-xii: 1-253.
WHO, World Health Organization. World Health Statistics 2012. Report of a WHO
Consultation on Obesity. Geneva: WHO; 2012.
Williams L, Seki Y, Vuguin PM, Charron MJ. Animal models of in utero exposure to a high
fat diet: a review. Biochim Biophys Acta. 2014; 1842(3):507-19.
Woods SC, Seeley RJ, Porte JRD. Signals that regulate food intake and energy
homeostasis. Science 1998; 280: 1378-83.
Yang Z, Klionsky DJ.
Mammalian autophagy: core molecular machinery and signaling regulation. Curr Opin
Cell Biol. 2010; 22(2):124-31.
Yang L, Li P, Fu S, Calay ES, Hotamisligil GS. Defective hepatic autophagy in obesity
promotes ER stress and causes insulin resistance. Cell Metab. 2010;11(6):467-78.
Yogev Y, Catalano PM. Pregnancy and obesity. Obstet Gynecol Clin North Am. 2009;
36:285–300.
62
Yordy B, Tal MC, Hayashi K, Arojo O, Iwasaki A. Autophagy and selective deployment of
Atg proteins in antiviral defense. International Immunology. 2012; 25(1); 1-10.
Yorimitsu T, Klionsky DJ. Autophagy: molecular machinery for self-eating. Cell Death
Differ. 2005 Nov;12 Suppl 2:1542-52.
Yue, Z., Jin, S., Yang, C., Levine, A. J. & Heintz, N. Beclin 1, an autophagy gene essential
for early embryonic development, is a haploinsufficient tumor suppressor. Proc. Natl
Acad. Sci. USA. 2003; 100:15077–15082.
Zhang N, Cao MM, Liu H, Xie GY, Li YB. Autophagy regulates insulin resistance following
endoplasmic reticulum stress in diabetes. Autophagy regulates insulin resistance
following endoplasmic reticulum stress in diabetes. J Physiol Biochem. 2015 Jan 30.
Zhou D, Pan YX. Pathophysiological basis for compromised health beyond generations:
role of maternal high-fat diet and low-grade chronic inflammation. J Nutr Biochem. 2015
Jan;26(1):1-8.
63
6. Anexos:
A) Tabela 01. Composição Nutricional da Dieta Hiperlipídica (DH).
Ingrediente
CRESCIMENTO MANUTENÇÃO
Quantidade Kcal % do total
calórico Quantidade Kcal
% do total
calórico
Amido 95 380
35,53
167,1 668,4
41,61
Maltodextrina 125 500 125 500
Sacarose 201 804 201 804
Caseína 233 932 19,66 167 668 14,09
Óleo de soja 40 360
45,57
40 360
45,57
Banha 200 1800 200 1800
Minerais 35 0 35 0
Vitaminas 10 0 10 0
Fibras 55,5 0 50 0
L-cistina 3 0 2,4 0
Butirato de
colina 2,5 0 2,5 0
TOTAL 1000 4776 100,76 1000 4800,4 101,27
64
B) Comitê de Ética.
65
C) Comprovante de submissão.