ANKARA ÜNİVERSİTESİ
FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
YÜKSEK LİSANS TEZİ
PATLICAN (Solanum melongena) TOHUMLARINDA BAKIR (Cu) STRESİ İLE
OLUŞAN DNA DEĞİŞİKLİKLERİNİN BELİRLENMESİ
Didem AKSOY
BİYOLOJİ ANABİLİM DALI
ANKARA
2009
Her hakkı saklıdır
TEZ ONAYI
Didem AKSOY tarafından hazırlanan ‘Patlıcan (Solanum melongena) Tohumlarında
Bakır (Cu) Stresi ile Oluşan DNA Değişikliklerinin Belirlenmesi’ adlı tez çalışması
20.02.2006 tarihinde aşağıdaki jüri tarafından oy birliği ile Ankara Üniversitesi Fen
Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dalı’nda YÜKSEK LİSANS TEZİ olarak kabul
edilmiştir.
Danışman : Doç. Dr. Sümer ARAS
Jüri Üyeleri :
Başkan : Doç. Dr. Özlem YILDIRIM
Ankara Üniversitesi, Biyoloji Anabilim Dalı
Üye : Doç. Dr. E. Sümer ARAS
Ankara Üniversitesi, Biyoloji Anabilim Dalı
Üye : Doç. Dr. Emel EMREGÜL
Ankara Üniversitesi, Kimya Anabilim Dalı
Yukarıdaki sonucu onaylarım.
Prof. Dr. Orhan ATAKOL
Enstitü Müdürü
ÖZET
Yüksek Lisans Tezi
PATLICAN (Solanum melongena) TOHUMLARINDA BAKIR (Cu) STRESİ İLE
OLUŞAN DNA DEĞİŞİKLİKLERİNİN BELİRLENMESİ
Didem AKSOY
Ankara Üniversitesi
Fen Bilimleri Enstitüsü
Biyoloji Anabilim Dalı
Danışman: Doç. Dr. E. Sümer ARAS
Ağır metal kontaminasyonu dünyada önemli bir çevresel problemdir. Yüksek konsantrasyonlardaki ağır metaller hücrelerde ve dokularda toksik hasarlara neden olur. Bu çalışmada, bakır (Cu) kontaminasyonuna maruz kalan patlıcan (Solanum melongena L.) tohumlarında meydana gelen etkilerin moleküler ve populasyon seviyelerinde belirlenmesi amaçlanmıştır. Artan Cu konsantrasyonuyla patlıcan tohumlarının kökünde büyümenin engellendiği ayrıca kuru ağırlık ve toplam çözünür protein içeriğinde azalma belirlenmiştir. Ekotoksikolojide, RAPD analizi bitkiler için uygun bir biobelirteç olarak kabul edilmektedir. RAPD analizi için, 9 RAPD primerinin özgün polimorfik bant paterni gösterdiği bulunmuştur ve bunu takiben patlıcan tohumlarının kontrollerinin köklerinde belirlenen toplam 80 bant kullanılmıştır. Cu kontaminasyonundan sonra kontrol tohumlarına göre RAPD profilindeki değişiklikler çeşitli bant kazancı ve/veya kaybı içermiştir. Bu sonuçlar belirtmiştir çeşitli bakır konsantrasyonlarında RAPD profiline göre genomik kalıp stabilitesi değişmiştir ve bu sonuç, kuru ağırlık, toplam çözünür protein ile karşılaştırılmıştır. Moleküler ve populasyon seviyelerindeki parametrelerin ölçümü ağır metallerin etkilerinin araştırılması için önemlidir.
Şubat 2009, 44 sayfa
Anahtar Kelimeler: Patlıcan, ağır metal, RAPD, toplam çözünür protein
i
ABSTRACT
Master Thesis
IDENTIFICATION OF DNA CHANGES IN EGGPLANT (AUBERGINE) (Solanum melongena)
SEEDLINGS INDUCED BY COPPER STRESS
Didem AKSOY
Ankara University
Graduate School of Natural and Applied Sciences
Department of Biology
Supervisor: Assoc. Prof. Dr. E. Sümer ARAS
Heavy-metal contamination is an important environmental problem in the world. High concentrations of heavy metals cause toxic damages to cells and tissues. In this study the effects occuring at molecular and population levels in eggplant (Solanum melongena L.) seedlings exposed to copper (Cu) contamination was aimed to be determined. Inhibition of root growth, reduction in dry weight and total soluble protein content in root of aubergine seedlings were observed with the ascending Cu concentrations. In ecotoxicology, RAPD analysis was applied as a suitable biomarker for plants. For the RAPD analyses, 9 RAPD primers were found to produce unique polymorphic band patterns and subsequently were used to produce a total of 80 bands in the control root of eggplant seedlings. The changes in RAPD profiles of root after Cu contamination was included variations as gain and/or loss of bands compared with the control seedlings. These results were suggested that genomic template stability changed in RAPD profiles and this result was compared with the growth, dry weight and total soluble protein at various Cu concentrations. The measurements of parameters at molecular and population levels are valuable for investigating the effects of heavy metals.
February 2009, 44 pages
Key Words: Eggplant, heavy metal, RAPD, total soluble protein
ii
TEŞEKKÜR
Bu tezin hazırlanmasında her konuda yardımcı olan Ankara Üniversitesi Fen Fakültesi
Biyoloji Bölümü ve değerli hocam Doç. Dr. E. Sümer ARAS’a içtenlikle teşekkür ederim.
Hiçbir zaman yardım ve desteklerini esirgemeyen aileme, Dr. Mehlika BENLİ, Dr. Ayşegül
ERSAYIN YAŞINOK, D.Sinan KÖRPE, Dr. Demet CANSARAN DUMAN, Zeynep
KILIÇ ve arkadaşlarıma teşekkür ederim.
Didem AKSOY
Ankara, Şubat 2009
iii
İÇİNDEKİLER
ÖZET…………………………………………………………………………………….......i
ABSTRACT…………………………………………………………………………….......ii
TEŞEKKÜR……………………………………………………………………………….iii
SİMGELER DİZİNİ………………………………………………………………………vi
ŞEKİLLER LİSTESİ…………………………………………………………………......vii
ÇİZEGELER LİSTESİ………………………………………………………………….viii
1. GİRİŞ…………………………………………………………………………………….1
1.1 Çevre Kirliliği ve Etkileri……………………………………………………………...1
2. KURAMSAL TEMELLER……………………………………………………………..8
2.1 Moleküler Belirteçler………………………………………………………………......8
2.1.1 Hibridizasyona dayalı DNA belirteçleri…………………………………………….9
2.1.1.1 RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism – Restriksiyon
Parça Uzunluk Farklılığı)………………………………………………………….9
2.1.2 PCR (Polimeraz Zincir Reaksiyonu)’a Dayalı DNA Belirteçleri…………….......10
2.1.2.1 AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism – Çoğaltılmış
Parça Uzunluk Farklılığı)……………………………………………...................10
2.1.2.2 SSR (Simple Sequence Repeat – Basit Dizi Tekrarları)……………………......11
2.1.2.3 SCAR (Sequence Characterized Amplified Region – Dizin
Karakterli Çoğaltılmış Bölge)……………………………………………………12
2.1.2.4 RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA – Rastgele Çoğaltılmış
DNA Farklılığı)…………………………………………………………………...12
3. MATERYAL VE YÖNTEM………………………………………………………......14
3.1 Materyal……………………………………………………………………………….14
3.2 Yöntem………………………………………………………………………………...14
3.2.1 Tohum yüzey sterilizasyonu……………………………………………………......14
3.2.2 Çimlendirme yöntemi………………………………………………………………14
iv
3.2.3 Ölçüm ve analizler…………………………………………………………………..15
3.2.3.1 Bitki kök boyu ve kuru ağırlık tayini……………………………………………15
3.2.3.2 Toplam çözünür protein içeriğinin belirlenmesi……………………………......15
3.2.3.3 DNA izolasyonu………………………………………….......................................16
3.2.3.4 RAPD uygulamaları………………………………………………………………17
3.2.3.4.1 RAPD bileşenleri ve koşulları………………………………………………….18
3.2.3.4.2 Agaroz jel elektroforezi………………………………………………………...19
3.2.3.5 Veri analizleri…………………………………………………………………......19
3.2.3.5.1 İstatistiksel analizler……………………………………………………………19
3.2.3.5.2 Genomik Kalıp Stabilitesi (GKS)……………………………………………...19
4. BULGULAR……………………………………………………………………………20
4.1 Erken Fide Gelişim Evresinde Patlıcan Bitkisinin Kök Büyümesi Üzerine
Bakır Stresinin Etkisi…………………………………………………………………20
4.2 Erken Fide Gelişim Evresinde Patlıcan Bitkisinin Kök Kuru Ağırlığı Üzerine
Bakır Stresinin Etkisi…………………………………………………………………21
4.3 Bakır Stresinin Patlıcan Bitkisinin Protein Miktarına Etkisi………………….......23
4.4 Bakır Stresinin Patlıcan Bitkisinde RAPD-PCR Sonuçlarına Etkisi……………...23
4.5 Bakır stresine maruz kalmış örneklerin populasyon Parametrelerinin
istatistiksel analizi…………………………………………………………………….30
4.6 RAPD profili ve kök uzunluğu, kuru ağırlığı, toplam çözünür protein
miktarının karşılaştırılması…………………………………………………………..32
5. TARTIŞMA VE SONUÇ………………………………………………………………33
KAYNAKLAR…………………………………………………………………………….38
EK Toplam Çözünür Protein Standardı…………………………………………….......43
ÖZGEÇMİŞ……………………………………………………………………………….44
v
SİMGELER DİZİNİ
AFLP Çoğaltılmış Parça Uzunluk Polimorfizmi (Amplified Fragment Lenght
Polymorphism)
BSA Bovine Serum Albumin
CTAB Setil Trimetil Amonyum Bromür
dNTP Deoksinukleotid trifosfat
EDTA Etilen Daimin Tetraasetik Asit
GKS Genomik Kalıp Stabilitesi
PCR Polimeraz Zincir Reaksiyonu (Polymerase Chain Reaction)
PVPP Polivinil Polipirolidon
RAPD Rastgele Çoğaltılmış Polimorfik DNA (Random
Amplified Polymorphic DNA)
RFLP Restriksiyon Parça Uzunluk Polimorfizmi (Restriction Fragment
Lenght Polymorphism)
SCAR Dizin Karakterli Çoğaltılmış Bölge (Sequence Characterized
Amplified Region)
SSR Basit Dizi Tekrarları (Simple Sequence Repeats)
TBE Tris Borat EDTA
TE Tris EDTA
vi
ŞEKİLLER LİSTESİ
Şekil 1.1 Hidroksil radikalinin oluşumu ve etkileri…………………………………………3
Şekil 1.2 Hidroksil radikalinin hücreye etkileri…………………………………………......4
Şekil 4.1 Oda sıcaklığında, üç hafta, farklı bakır konsantrasyonlarında gelişen örneklere
ait kök uzunlukları………………………..………………………………………20
Şekil 4.2 Oda sıcaklığında, üç hafta, farklı bakır konsantrasyonlarında gelişen örneklere
bakır metalinin kök uzunluğuna etki oranları……………………………………21
Şekil 4.3 Oda sıcaklığında, üç hafta, farklı bakır konsantrasyonlarında gelişen örneklere
ait kök kuru ağırlıkları……………………………………………………………21
Şekil 4.4 Oda sıcaklığında, üç hafta, farklı bakır konsantrasyonlarında gelişen örneklere
bakır metalinin kök kuru ağırlığına etki oranları………………………………...22
Şekil 4.5 Oda sıcaklığında, üç hafta, farklı bakır konsantrasyonlarında gelişen örneklere
ait kök toplam çözünür protein miktarı…………………………………………..22
Şekil 4.6 Oda sıcaklığında, üç hafta, farklı bakır konsantrasyonlarında gelişen
örneklere bakır metalinin kök toplam çözünür protein miktarına etki oranları….23
Şekil 4.7 Oda sıcaklığında, üç hafta, farklı bakır konsantrasyonlarında gelişen örneklere
ait polimorfizm oranları………………………………………………………….24
Şekil 4.8 Tube A 07 primeri……………………………………………………………….26
Şekil 4.9 Tube A 09 primeri……………………………………………………………….26
Şekil 4.10 Tube A 11 primeri……………………………………………………………...27
Şekil 4.11 Tube A 12 primeri……………………………………………………………...27
Şekil 4.12 Tube A 16 primeri……………………………………………………………...28
Şekil 4.13 Tube A 17 primeri……………………………………………………………...28
Şekil 4.14 Tube A 18 primeri……………………………………………………………...29
Şekil 4.15 Tube A 20 primeri……………………………………………………………...29
Şekil 4.16 Tube C 01 primeri……………………………………………………………...30
Şekil 4.17 Örneklere RAPD profili ve kök uzunluğu, kuru ağırlığı, toplam çözünür
protein miktarının karşılaştırılması……………………………………………..32
vii
ÇİZGELER LİSTESİ
Çizelge 1.1 Ağır metallerin çevreye yayınımında en etkin olan endüstriyel faaliyetler…….1
Çizelge 3.1 Nanodrop sonuçları……………………………………………………………16
Çizelge 3.2 Çalışmada kullanılan primerler ve dizi bilgileri………………………………18
Çizelge 4.1 Örneklere ait bant farklılıkları………………………………………………...25
Çizelge 4.2 Populasyon parametrelerinin istatistiksel analizi……………………………...31
viii
1
1. GİRİŞ
1.1 Çevre Kirliliği ve Etkileri
Günümüzde sanayileşme, hızlı nüfus artışı ile oluşan su ve toprak kirliliği ciddi boyutlarda
tehlike oluşturmaktadır. ABD Çevre Koruma Ajansı (EPA)’nın hazırladığı 129 tane
öncelikli çevre kirleticileri arasında yer alan ağır metaller, en önemli çevre kirletici
gruplardan birini oluşturmaktadır.
Volkanik faaliyetler, maden eritme ve işleme tesislerinin katı atıkları, fabrika ve termik
santrallerin bacasından çıkan uçucu küller, atık su arıtma çamurları, otoyollarda araçlardan
salınan benzin, balata ve lastik kökenli atıklar, tarım ilaçları ve gübreler, pil vb. endüstri
ürünlerinin gelişi güzel atılması ağır metal kirliliğinin nedenleri arasında yer alır.
Çizelge 1.1 Ağır metallerin çevreye yayınımında en etkin olan endüstriyel faaliyetler (Kalamak 2006)
Endüstriyel atık sularla sulanan tarım alanlarında yetişen bitkilerde ürün kayıpları, hasarlar
görülmektedir; bu tarım ekonomisine ve besin zinciri yoluyla insan sağlığına zarar
vermektedir.
Yoğunluğu 5 g/cm3’ten büyük olan veya atom ağırlığı 50 ve daha büyük olan elementlere
ağır metal denir. Ağır metallerden demir, bakır, çinko, mangan, molibden, kobalt bitkiler
için gerekli elementlerdir ve esansiyel elementler denir. Esansiyel elementler kofaktör
olarak birçok enzim sistemi için gereklidir, biyomoleküllerin yapısal stabilizasyonuna
katkıda bulunurlar (Yu 2005).
2
Bakır bitkilerin büyümesi ve gelişimi için önemli bir mikro elementtir. Fotosentez ve
besinlerin metabolizmada kullanılabilir enerji kaynakları haline dönüştürülmesi için
gereklidir, katalizör olarak işlev görür.
Bakır fazlalığı bitkilerde kök hücrelerine zarar verdiğinden kök uzamasını engellemektdir,
lipid peroksidasyonuna ve dolayısıyla membranların parçalanmasına yol açtığından
klorozise ve (Keller and Hammer 2004), demir eksikliğine neden olmaktadır (Ouzounidou
et al. 1998).
Bakır, hem esansiyel hem de toksik bir elementtir. Yüksek dozlarda iz element olmayan
kadmiyuma göre daha toksiktir (Ralph and Burchett 1998, Mediouni et al. 2006). Bu
durum, bakırın iz element olmasından dolayı reaktif oksijen türlerine (süperoksit radikali
(O2.-), hidrojen peroksit (H2O2), hidroksil radikali (OH·) direk etki etmesiyle
açıklanmaktadır. Bakır ve demir geçiş metalleri oksidoredüksiyon reaksiyonlarında görev
aldığından reaktif oksijen türlerinin oluşumlarını hızlandıran katalizör vazifesi
görmektedirler. Reaktif oksijen türlerinden en zarar verici olan hidroksil radikalinin (OH·)
en önemli sentez kaynağı metaller tarafından katalizlenen Haber-Weiss döngüsüdür
(Nikookar et al. 2005).
Haber-Weiss reaksiyonu iki kimyasal reaksiyona ayrılabilir:
İlk reaksiyonda süperoksit molekülü Cu+2 veya Fe+3 ile reaksiyona girerek Cu+ veya Fe+2 ve
O2 oluşturur.
I. Cu+2 veya Fe+3 + O2.- Cu+ veya Fe+2 + O2
İkinci reaksiyon ise Fenton reaksiyonu olarak bilinir.
II. Cu+ veya Fe+2 + H2O2 Cu+2 veya Fe+3 + OH· + OH-
Net reaksiyon: O2.- + H2O2 O2 + OH· + OH
-
3
Bakır membran proteinlerinin sülfidril gruplarına bağlanarak (Olson et al. 1978, Doncheva
et al.1996) ve reaktif oksijen radikaleri ile reaksiyona girerek lipid peroksidayonunu
artırmakta ve membran permeabilitesini bozmaktadır.
Şekil 1.1 Hidroksil radikalinin oluşumu ve etkileri (www.biozentrum.uni- frankfurt.de/Pharmakologie/index.html, 2008)
Pozitif yüklü metal iyonlarının, DNA’nın her iki zincirinde bulanan fosfat gruplarındaki
negatif yüklü oksijen atomları ve bazların azot ve oksijen gibi elektron donörü olan
atomları ile reaksiyona girebileceği bildirilmiştir (Anastassopoulou 2003). Buna göre
metaller DNA’daki olası bölgelere direk veya dolaylı olarak sıkıca bağlanabilmektedirler
(Anastassopoulou 2003). Metallerin DNA’ya bağlanması genellikle baz eşleşmesini
sağlayan hidrojen bağlarının kırılmasına ve çift zincirli yapının kararlılığının bozulmasına
4
sebep olmaktadır, nükleik aistlerin konformasyonunda oluşan değişimler metal iyonunun
çeşidine bağlıdır (Theophanides 1981, Yang and Wang 1996).
Şekil 1.2 Hidroksil radikalinin hücreye etkileri (www.mustafaaltinisik.org.uk/21-adsem-01s.pdf, 2008)
Bitkiler, ortamın kirliliğinin giderilmesinde ve kirlilik seviyesi hakkında bilgi sağlamak
amacıyla da kullanılmaktadır. Dolayısıyla organizmadaki değişimlerin gözlenmesi ve
ölçülmesi ile kirletici, kirliliği oluşturan kaynaklar ve kirliliğin yoğunluğu arasında bir
bağlantı kurulabilmektedir.
Kirleticilere duyarlı organizmalar vasıtasıyla çevresel kirlilik seviyelerininin belirlenmesi
var olan ve gittikçe gelişen bir çalışma alanıdır. 1950lerden beri yüksek yapılı bitkilerin
yaprakları biyolojik monitör olarak kullanılmaktadır (Al-Shayeb et al. 1995). Bütün
araştırmaların temelinde organizmaların çevrelerinde bulunan farklı tipteki uyarıcılara karşı
duyarlı olmaları ve çeşitli biçimlerde reaksiyon vermeleri vardır. Organizmaların bu
5
özellikleri onların içinde bulundukları ortamın kirlilik seviyesi hakkında kalitatif bilgi
sağlamak amacıyla kullanılmaktadır.
Ülkemizde çevre kirliliğinin biyolojik monitörler aracılığıyla tespit edilmesi amacıyla
endüstri bölgelerinden, otoyol kenarlarından ve şehir merkezlerinden bitki ve toprak
materyalleri toplanarak ağır metal içerikleri belirlenmiştir (Aksoy vd. 1998, Çelik vd.
2005).
Mengoni et al. (2000) araştırmasında, ağır metal kirliliğinin olduğu farklı bölgelerden
toplanan Silene paradoxa L. populasyonlarına ait bitki örneklerinin RAPD analizi yapılarak
toleranslı populasyon belirlenmiştir.
Kirlilik tespitinde ve kirliliğin giderilmesinde bitkilerin kullanılmasının pek çok avantajı
vardır:
� Hızlı gelişirler.
� Kolay kontamine olmazlar.
� Çalışma materyali doğadan alındığı ve geniş alanlara uygulanabildiği için
maliyeti düşüktür.
� Farklı biyolojik çalışma disiplinleri ile kombine edilebilir.
Tez kapsamında model bitki olarak seçilen patlıcan (Solanum melongena L.) Solanacea
familyasına ait olup ülkemizde en fazla yetiştiriciliği yapılan yazlık sebze türlerinden birini
oluşturmaktadır. Türkiye’de yıllık patlıcan üretimi 800-850 bin ton arasında değişmektedir.
Üretim özellikle Ege, Akdeniz, Güneydoğu Anadolu ve Marmara bölgelerine dağılmış olup
bu bölgelerin Türkiye toplam üretimindeki payları sırasıyla %30, %25, %15, %10’dur.
Yetiştirilen ürünün büyük bir bölümü iç pazarda taze olarak tüketilmekte, az bir kısmı ihraç
edilmektedir. Sera yetiştiriciliğinde patlıcan, domates, hıyar ve biberden sonra yaklaşık
%10’luk bir oranla dördüncü sırada yer almaktadır (Abak 1993). 2000 yılına ait FAO
istatistikleri incelendiğinde Türkiye’nin geçtiğimiz yıl 850.000 ton’luk üretim değeri ve
6
32.600 ha’lık üretim alanıyla dünyadaki patlıcan üreticisi ülkeler arasında önemli bir
yerinin olduğu görülmektedir.
Ağır metallerin patlıcan (Solanum melongena L.) bitkisi üzerine etkileri :
Khan and Khan (1983), gerçekleştirdikleri çalışmada kurşun ve kadmiyumun farklı
konsantrasyonlarının domates ve patlıcan tohumları üzerine etkilerini incelemişlerdir.
Patlıcan bitkisinde toksik etki yaratmak için 150 ppm kurşunun, 3 ppm kadmiyumun yeterli
olduğunu tespit etmişlerdir.
Al-Nakshabandi et al. (1997), atık su ile sulamanın patlıcan bitkisi üzerine etkisini
araştırmış ve ürün miktarında iki kat artış olduğunu gözlemiştir. Bu durum, azot, fosfor,
potasyum gibi besin maddelerinin bol olması ile açıklanmış fakat patojenik
mikroorganizmalarca da zengin bu suların kullanımının sağlık açısından riskli olduğu
belirtilmiştir.
Bletsos et al. (1999), çalışmalarında atık su ile sulanan patlıcan bitkisinin meyvelerinde ağır
metal seviyesini sınırın altında tespit etmiş ve atık suyun kullanılabilirliği belirtilmişlerdir.
Neelima and Reddy (2003), civa (5-50 ppm) ve kadmiyumun (50-9000 ppm) patlıcan
tohumları üzerine etkisini incelemiş ve yüksek konsantrasyonların toksisiteye neden
olduğunu belirtmişlerdir.
Sierra et al. (2008), madencilik endüstrisi sonucu cıva birikiminin (14.16 mg/kg (ppm))
olduğu bir bölgede (Almaden) toprağın patlıcan bitkisinin fidelenme, çiçeklenme ve
olgunlaşma dönemleri üzerine etkisini kök ve gövde uzunluğu, yaş ve kuru ağırlık
ölçümleri, organlardaki metal seviyesi belirlenerek incelenmiştir. Bitkide herhangi bir
toksik etki belirlenmemiştir, bitkinin normal gelişimini sürdürdüğü kaydedilmiştir.
7
Ağır metallerin patlcan bitkisi üzerine etkileri ile ilgili literatürde sınırlı sayıda araştırma
vardır.
Ağır metallerin DNA üzerindeki etkilerini belirlemek için birçok araştırmacı RAPD
tekniğini uygulamıştır (Conte et al. 1998, Mengoni et al. 2000, Atienzar et al. 2000, 2001,
Lui et al. 2005, 2007, 2009). Yapılan çalışmalara göre ağır metallerin konsantrasyon
artışına paralel olarak PCR ürünlerindeki polimorfizm oranın arttığı tespit edilmiştir.
Bu tez çalışmasında, günümüzde önemli bir çevresel problem olan ağır metal stresine karşı
patlıcan (Solanum melongena L.) tohumlarında meydana gelen etkilerin populasyon
parametrelerinden kök uzunluğu, kuru ağırlığı ve toplam çözünür protein seviyeleri ile ve
moleküler parametrelerden RAPD analizi ile incelenmesi amaçlanmıştır. Böylelikle bu
biyobelirteçlerin (populasyon ve moleküler parametreler) kullanılabilirliği, biyoindikatör
olarak kullanılan organizma ile kirliliğin biyolojik etkisi ve ortamın kirlilik seviyesi
hakkında bilgi edinilebilir.
8
2. KURAMSAL TEMELLER
2.1 Moleküler Belirteçler
Protein ya da DNA’da bulunan polimorfizimlere dayanan ‘moleküler belirteçler’in
geliştirilmesi; taksonomi, filogeni, genetik, bitki ıslahı ve ekoloji gibi bilim dallarına
büyük oranda katkı sağlamıştır.
Protein belirteçler arasında en yaygın kullanılanı izoenzimdir. İzoenzim; yapısal
karakterleri farklı fakat aynı reaksiyonu katalizleyen, farklı genlerce kodlanmış enzim
formlarıdır. İzoenzim analizleri, farklı dokularda ve gelişimin farklı evrelerinde
regülasyonunun izlenebilmesi için kullanılabilir. Kodominant belirteç olarak genetik bilgi
sağlayabilir. Ancak, izozim lokuslarının azlığı ve translasyon sonrası değişimlere açık
olmaları kullanım olanaklarını sınırlamaktadır (Staub et al. 1982, Bernatzky and Tanksley
1989).
DNA belirteçleri stabildir, tüm dokulardan elde edilebilir, ekolojik koşullardan etkilenmez
(Williams et al. 1990).
Bitki dokularında moleküler belirteçler ile yapılan çalışmalarda DNA profillerinin
çıkarılması ve spesifik DNA parmakizlerinin elde edilmesi şu şekilde sıralanabilir;
• Bitkisel materyalin temin edilmesi
• Bitkisel materyalden DNA izole edilmesi
• Uygulanacak yönteme göre genetik materyalin polimeraz zincir reaksiyonu
(PCR) ile çoğaltılması
• Bireyler arasındaki polimorfizmin farklı moleküler belirteç teknikleri ile tespit
edilmesi (RAPD, RFLP, AFLP, SCAR, SSCP vs.)
• DNA bant profillerinin analizi
9
DNA belirteçleri, hibridizasyona dayalı ve PCR’a dayalı belirteçler olmak üzere ikiye ayrılabilir.
2.1.1 Hibridizasyona dayalı DNA belirteçleri 2.1.1.1 RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism – Restriksiyon Parça
Uzunluk Farklılığı)
RFLP tekniğinde genomik DNA’nın restriksiyon enzimleri kullanılarak spesifik
bölgelerden kesilmesi sağlanır ve çok sayıda DNA fragmentleri elde edilebilir. DNA
fragmentleri agaroz jel elektroforezi ile ayrıldıktan sonra Southern Blot tekniği ile
nitroselüloz veya naylon membrana transfer edilir. Radyoaktif işaretlenmiş bir prob ile
hibridizasyon yapılır. Radyoaktif DNA hibritleri otoradyografi ile gözlenebilir (Botstein et
al.1980).
RFLP tekniğinin avantajları:
• Güvenilirdir. Farklı laboratuarlarda, farklı araştırıcılar tarafından aynı sonuçlara
ulaşılabilmektedir.
• Kodominant özellikte olduklarından heterozigotların belirlenmesinde ve
karakterizasyonunda kullanılmaktadır.
RFLP tekniğinin dezavantajları:
• Analizleri pahalı, fazla zaman ve iş gücü gerektirmektedir.
• Yaygın olarak radyoaktif etiketleme yöntemi kullanılmaktadır.
• Yüksek kalitede ve fazla miktarda DNA’ya ihtiyaç vardır (10-20 µg).
10
2.1.2 PCR (Polimeraz Zincir Reaksiyonu)’a dayalı DNA belirteçleri
Polimeraz zincir reaksiyonu belirli bir DNA bölgesinin in vitro şartlarda primerler
tarafından yönlendirilerek, enzimatik olarak çoğaltılması işlemidir. PCR, Kary Mullis (K.B.
Mullis, U.S. patent 4 683 195, Temmuz, 1987) tarafından geliştirilmiş olup, moleküler
biyolojinin hızlı bir şekilde gelişmesinde katalizör olmuştur (Steffan and Atlas, 1991). PCR
tekniği, genetik yapısı değiştirilen bitki veya mikroorganizmaların tespiti, moleküler
klonlama, DNA baz dizilişlerinin belirlenmesi, genetik akrabalık ve adli tıp vakalarının
tespitinde kullanılmaktadır.
PCR’ın çalışma prensibi ard arda tekrarlanan üç basamaktan oluşmaktadır:
1. DNA’nın çift iplikçiğinin sıcaklıkla ayrılması
2. Oligonükleotid primerlerin oluşturulan tek zincirli DNA molekülünde hedef
bölgelere bağlanması
3. dNTPlerin varlığında DNA polimerazın primerlerle uzatılması
PCR tekniğinin uygulanması thermocycler içinde in vitro koşullarda gerçekleştirilmekte
olup, gerekli reaksiyon karışımı kalıp DNA’yı, nükleotid karışımını (dNTPs), bir ya da bir
çift oligonükleotid primeri, DNA polimeraz enzimini, tampon çözeltisini ve MgCl2’ü içerir.
2.1.2.1 AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism – Çoğaltılmış Parça Uzunluk Farklılığı)
AFLP tekniğinde genomik DNA, restriksiyon enzimleri (EcoRI / MseI) ile kesilir, biyotin
ve radyoaktivite ile işaretlenmiş iki adaptör yardımıyla restriksiyon fragmentleri uygun bir
DNA ligaz ile birleştirilir. Birleştirilen bu adaptörlere uygun primerler ile restriksiyon
fragmentlerin pre-amplifikasyonu yapılır. Oluşturulan fragmentlerin radyoaktif işaretli özel
primerlerle selektif amplifikasyonları sağlanır. Elde edilen ürünler poliakrilamid jel
üzerinde yürütülür ve gümüş boyama ya da radyoaktivite ile görüntülenir (Ergül 2000).
11
AFLP’nin avantajları
• Laboratuarlar arası cihaz farklılığı sonucu etkilemez.
AFLP’nin dezavantajları
• Radyoaktif işaretleme yapılır.
• Dominant belirteçlerdir.
2.1.2.2 SSR (Simple Sequence Repeat – Basit Dizi Tekrarları)
Ardışık tekrarlanan 2-6 nükleotitli gruplara mikrosatellit denir. Mikrosatellitlerin varlığı
birçok organizmada gösterildikten sonra DNA zincirindeki değişiklikleri belirleyen bir
metot kullanılmaya başlanmıştır. Bu metot, SSR lokusuna bağlanan primerlerin PCR
yardımıyla farklı uzunlukta parça çoğaltması esasına dayanmaktadır ve ard arda tekrarlanan
zincir elemanlarının sayısındaki değişiklikler sonucunda oluşan SSRler bireyler arasındaki
farklılıkları belirler. SSRleri çevreleyen korunmuş DNA dizileri primer olarak kullanılarak
PCR tekniği sayesinde bir lokustaki farklı alleller tespit edilebilir.
SSR tekniğinin avantajları
• Oldukça polimorfiktir; bundan dolayı yüksek oranda bilgi vermektedir.
• Bitki genomunda fazla bulunup düzenli bir dağılım gösterirler. Örneğin; buğday
genomu her 704 kb da bir (GT)n grubu ve her 440 kb da bir (GA)n grubu içerir.
• Kodominant belirteçlerdir.
SSR tekniğinin dezavantajları
• Fazla iş gücü gerektirir.
• Maliyeti yüksektir.
12
2.1.2.3 SCAR (Sequence Characterized Amplified Region – Dizin Karakterli Çoğaltılmış Bölge)
Bir gen bölgesine ait belirli büyüklükteki RAPD bandının klonlanıp, uç bölgelerinden
dizileri belirlendikten sonra, bu fragmana yönelik RAPD primerlerini içeren primer çiftleri
ile geliştirilen bir tekniktir (Paran and Michelmore 1993).
SCAR tekniğin avantajları
• Kodominant belirteçlerdir.
• RAPD belirteçlerde istenmeyen amplifikasyon ürünleri elde edilirken SCAR
belirteçler spesifiklik gösterir.
SCAR tekniğinin dezavantajları
• Uzun zaman alır ve işçiliği fazladır.
2.1.2.4 RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA – Rastgele Çoğaltılmış DNA Farklılığı)
Diğer PCR uygulamalarının aksine iki yerine bir primer kullanılır. Bu primerler 9-10 baz
çiftlik rastgele primerlerdir. Primer kalıp DNA üzerinde komplementeri olan, birbirine
yakın iki bölgeye bağlanarak arada kalan DNA bölgesinin amplifikasyonunu sağlar. Bu
şekilde çoğaltılan DNA dizileri için agaroz jel üzerinde elektroforez uygulanır ve bazı
dizilerin çoğaldığı, bazılarının ise çoğalmadığı gözlenir. Bu gözlem polimorfizmin
göstergesidir (Welsh and Mcclelland 1990).
RAPD tekniğinin avantajları
• Evrensel primer seti kullanılır.
• Hızlı sonuç alınır, ucuzdur ve az iş gücü gerektirir.
• Az miktarda DNA yeterlidir.
13
RAPD tekniğinin dezavantajları
• Güvenilirliği sınırlıdır, farklı laboratuarlarda farklı sonuçlar hatta bir ısı döngü
cihazından diğerine farklı sonuç verebilir
• Dominant belirteçlerdir.
14
3. MATERYAL VE YÖNTEM
3.1 Materyal
Bu çalışmada, İzmir Tarım ve Köy İşleri Bakanlığı İdari ve Mali İşler Dairesi Başkanlığı,
Ege Tarımsal Araştırma Enstitüsünden alınan topan çeşidi patlıcan (Solanum melongena
L.) tohumları kullanılmıştır.
3.2 Yöntem 3.2.1 Tohum yüzey sterilizasyonu
Tohumlar, yüzey sterilizasyonunu sağlamak amacıyla %30’luk teknik sodyum hipoklorit
(NaOCl) çözeltisis ile 20 dakika muamele edilmiş ve daha sonra distile su ile 3 kere
yıkanmıştır.
3.2.2 Çimlendirme yöntemi
Deney iki aşamadan oluşmaktadır. Birinci kısımda, distile suda 2 mm uzunluğa gelen
tohumlar oda sıcaklığında, farklı konsantrasyonlarda ağır metal çözeltilerine üç hafta maruz
bırakılmışlardır, bu kısımdaki örnekler ds-30, ds-60, ds-120, ds-240 olarak adlandırılmıştır.
İkinci kısımda, tohumlar oda sıcaklığında, direk ağır metal çözeltilerine üç hafta maruz
bırakılmıştır, buradakiler de 30, 60, 120, 240 olarak adlandırılmıştır. Kontrol olarak distile
suda, oda sıcaklığında, üç hafta gelişen tohumlar kullanılmıştır, K ile ifade edilmiştir.
Her petriye 20 tohum yerleştirilerek deney üç tekrarlı olarak yapılmıştır. Tohumlara
CuCl2·2H20 çözeltisi 30, 60, 120, 240 mg/l konsantrasyonlarında uygulanmıştır.
15
3.2.3 Ölçüm ve analizler 3.2.3.1 Bitki kök boyu ve kuru ağırlık tayini
Ağır metal stresinin bitkiler üzerine etkilerini belirlemek amacıyla üç haftanın sonunda bazı
büyüme parametrelerinden kök uzunluğu (mm/tohum) ve kuru ağırlık ölçümleri (g/tohum)
70ºC’ye ayarlanmış etüvde 48 saat kurutularak belirlenmiştir.
3.2.3.2 Toplam çözünür protein içeriğinin belirlenmesi
0.08g tartılan kontrol ve muamele kök örnekleri sıvı azotla havanda ezilerek 700 µl fosfat
tamponu (0.2 M, pH 7.0) ile homojenize edilmiş, 27000 g’de 20 dk. santrifüj edilerek
süpernatantlar yeni tüplere alınmıştır (Omran 1980). Örneklerin toplam çözünür protein
konsantrasyonları, Bradford metoduna (Bradford 1976) göre belirlenmiştir. Bu yönteme
göre; 100 µl örnek çözeltisi ile 400 µl deiyonize su karıştırıldıktan sonra 5 ml 1XBradford
çözeltisine eklenmiştir. Blank olarak 500 µl deiyonize ve 5 ml 1X Bradford karışımı
kullanılmıştır. Bu karışımlar ~10 saniye vortekslenerek karıştırıldıktan sonra 10 dakika oda
sıcaklığında bekletilmiş ve absorbans değerleri 595 nm dalga boyunda spektrofotometrede
(Hitachi U-1800) paralelli olarak blanke karşı okunmuştur. Standart BSA (Bovin Serum
Albumin) ile hazırlanmıştır (Ek 1).
Örneklerin Toplam Çözünür Protein Konsantrasyonunun Hesaplanması:
Spektrofotometrede okunan değer X Dilüsyon faktörü
Standart eğrinin eğimi
Bradford çözeltisi; 0.5 g Coomassie Blue G’nin 50 ml suda çözülmesi, 250 ml %95’lik
etanol ve 500 ml %85’lik fosforik asit eklenip karıştırılarak 1 L’ye tamamlanması ile
5X’lik solusyon elde edilmiştir. Çözelti +4ºC’de karanlıkta tutulmuştur.
16
3.2.3.3 DNA izolasyonu
RAPD analizlerini gerçekleştirmek üzere patlıcan tohumu örneklerinden DNA izolasyonu,
Aras ve Cansaran (2006) tarafından optimize edilmiş protokole göre yapılmıştır. İzolasyon
sonucunda 760 - 2194 ng/µl aralığında değişen miktarlarda ve 1.9 – 2.03 aralığında saflık
gösteren DNA elde edilmiş (A260/280 absorpsiyon oranı) (NanoDrop ND-1000
Spectrophotometer) (Çizelge 3.1), ayrıca DNA kalitesi etidyum bromür varlığında agaroz
jelde de gösterilmiştir.
Çizelge 3.1 Nanodrop sonuçları
örnek ng/ul A260 A280 260/280 260/230
K 1823.25 36.465 18.771 1.94 1.4
ds-30 2389.68 47.794 24.256 1.97 1.62
ds-60 1699.47 33.989 17.898 1.90 1.21
ds-120 717.74 14.355 7.534 1.91 0.41
ds-240 1124.93 22.499 11.078 2.03 0.29
30 859.77 17.195 8.848 1.94 0.32
60 968.09 19.362 10.152 1.91 1.12
120 1500.07 30.001 15.65 1.92 1.24
240 1301.38 26.028 13.261 1.96 1.34
DNA izolasyonu aşağıdaki protokolle gerçekleştirilmiştir;
• Bitki materyali (0.1 g) toz haline gelinceye kadar sıvı azotta ezilir.
• Önceden ısıtılmış DNA ekstraksiyon tamponundan [50 mM Tris-HCl (pH 8), 50
mM EDTA, 10 ml LiCl (4 M), %1 CTAB, %2 PVPP] her örneğe 1 ml eklenerek
örnekler kısa bir süre tamponda ezilir.
• Örnekler 1.5 ml Eppendorf tüplerine alınır ve üzerlerine %0.2 β-merkapto etanol
eklenir.
• Tüplerdeki solüsyonlar 65°C’da 15 dakika inkübe edilir.
17
• İnkübasyon süresinin sonunda örneklerin oda sıcaklığına soğuması beklenir, tüplere
0.5 ml kloroform/izoamil alkol (24:1 [v/v]) eklenir ve vorteks kullanılmadan iyice
karıştırılır.
• Daha sonra örnekler 17,000 x g’de (14,000 rpm) 2 dakika santrifüj edilir ve
süpernatant (~0.8 ml) yeni tüplere aktarılır.
• Süpernatanta eşit hacimde izopropanol eklenir ve karışım birkaç defa hafifçe ters
düz edilerek karıştırılır. DNA eldesinin etkinliğini arttırmak için örnekler buz
üzerinde 15 dakika inkübe edilebilir.
• Daha sonra örnekler 17,000 x g’de (14,000 rpm) 2 dakika santrifüj edilir.
• Süpernatant atılır ve üzerine 1 ml %70’lik etanol eklenir.
• Örnekler tekrar 17,000 x g’de (14,000 rpm) 1 dakika santrifüj edilir.
• Elde edilen pellet etanol tamamen uçana kadar oda sıcaklığında kurutulur.
• Daha sonra pellet üzerine uygun miktarda (30-60 µl) TE tamponu [10 mM Tris-HCl
(pH: 8), 1 mM EDTA] eklenerek çözdürülür.
• Çözeltinin üzerine 1 µl ribonükleaz (RNaz, 10 mg/ml) eklenir, örnekler kullanılana
kadar –20 °C’da saklanır.
3.2.3.4 RAPD uygulamaları
Dokuz farklı primer kullanılarak gerçekleştirilen (primerlerin isimleri ve dizileri çizelge 3.2
de belirtilmiştir) RAPD uygulamalarında, tüm işlemler (PCR döngü şartları, ısı döngü
cihazı, kullanılan Taq polimeraz ve diğer PCR bileşenlerinin markası ve konsantrasyonları,
elektroforez şartları ve jel konsantrasyonları, tampon ve diğer çözeltiler için kullanılan
kimyasalların tür ve markası vb.) Williams et al. (1990)’ a göre optimize edilmiş şartlar
altında gerçekleştirilmiş, kontaminasyondan korunmak için steril ekipmanlar kullanılmış ve
her RAPD işlemi için DNA örneği içermeyen negatif kontrol kullanılmıştır.
18
Çizelge 3.2 Çalışmada kullanılan primerler ve dizi bilgileri
Primer Nukleotid Dizisi (5´ → 3´)
TUBE A 07
G A A A C G G G T G
TUBE A 09
G G G T A A C G C C
TUBE A 12
T C G G C G A T A G
TUBE A 13
A A T C G G G C T G
TUBE A 16
A G C C A G C G A A
TUBE A 17
G A C C G C T T G T
TUBE A 18
A G G T G A C C G T
TUBE A 20
G T T G C G A T C C
TUBE C 01
T T C G A G C C A G
3.2.3.4.1 RAPD bileşenleri ve koşulları
RAPD tekniğinde her örnek için toplam 25µl’lik reaksiyon gerçekleştirilmiş, aşağıdaki
bileşenlere standart hacime ulaşacak şekilde ultra distile su eklenmiştir.
o 200 ng genomik DNA,
o 2.5 µl 10x reaksiyon tamponu,
o 2.5 mM MgCl2,
o 20 µM dNTPs,
o 0.2 µM primer,
o 0.5 ünite Taq polimeraz (Bioron).
19
PCR döngü şartları;
� 94°C de 2 dakika ön denatürasyon
� 94°C de 30 saniye (denatürasyon)
� 36ºC de 1 dakika (bağlanma)
� 72°C de 1,45 dakika (uzama)
� 72°C de 8 dakika (son uzama)
şeklinde Techne ısı döngü cihazında gerçekleştirilmiştir.
3.2.3.4.2 Agaroz jel elektroforezi
PCR ürünleri ve DNA belirteçleri (marker) (DNA Ladder Plus, Promega, 100 bp) % 1.6
agaroz konsantrasyonu ve 0,5 µl/ml etidyum bromür içeren jellerde, 1xTBE (Tris Borat
EDTA) tamponu içerisinde 5 V/cm olacak şekilde yaklaşık 4 saat ayrıma tabii tutulmuştur.
Jel görüntüleme sisteminde görüntülenmiş (Gene Genius, Syngene) ve fotoğrafları
çekilmiştir (GyneSnap Software, Synoptics Ltd.).
3.2.3.5 Veri Analizleri
3.2.3.5.1 İstatistiksel analizler
Populasyon parametrelerinden elde edilen verilere SPSS (Statistic Program for Social
Sciences 15.0) paket programı kullanılarak varyans analizi (ANOVA) yapılmıştır.
3.2.3.5.2 Genomik Kalıp Stabilitesi (GKS)
RAPD profilindeki polimorfizm ortalamalarından belirlenir.
GKS = (1- a/n) x 100
a : her örnekteki ortalama polimorfik bant sayısı
n : kontroldeki toplam bant sayısı
35 döngü
20
4. BULGULAR 4.1 Erken Fide Gelişim Evresinde Patlıcan Bitkisinin Kök Büyümesi Üzerine Bakır Stresinin Etkisi
Farklı konsantrasyonlarda uygulanan Cu stresinin 21 günlük patlıcan bitkisinin kök
uzunluğuna etkisi incelendiğinde; Cu konsantrasyonunun artışına bağlı olarak kök
uzunluğu önemli derecede azalmıştır (Şekil 4.1). Şekil 4.2’ de bu azalışın etki oranları
belirtilmektedir. ds-240 ile 120 aynı oranda etkilenmiştir.
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
K ds-30 ds-60 ds-120 ds-240 30 60 120 240
Örnekler
Kök uzunluğu (mm/tohum)
Şekil 4.1 Oda sıcaklığında, üç hafta, farklı bakır konsantrasyonlarında gelişen örneklere ait kök uzunlukları
21
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
K ds-30 ds-60 ds-120 ds-240 30 60 120 240
Örnekler
Cu Etki Oranı %
Şekil 4.2 Oda sıcaklığında, üç hafta, farklı bakır konsantrasyonlarında gelişen örneklere bakır metalinin kök uzunluğuna etki oranları
4.2 Erken Fide Gelişim Evresinde Patlıcan Bitkisinin Kök Kuru Ağırlığı Üzerine Bakır Stresinin Etkisi
Farklı konsantrasyonlarda uygulanan Cu çözeltisinin kök kuru ağırlığı üzerinde etkisi
incelendiğinde artan bakır konsantrasyonuna bağlı olarak kök kuru ağırlığında azalış
gözlenmektedir (Şekil 4.3). Etki oranları şekil 4.4’de gösterilmiştir. İkinci grubun bakır
stresinden daha fazla etkilendiği gözlenmektedir.
0
0,0001
0,0002
0,0003
0,0004
0,0005
0,0006
K ds-30 ds-60 ds-120 ds-240 30 60 120 240
Örnekler
Kök kuru ağırlık (g/tohum)
Şekil 4.3 Oda sıcaklığında, üç hafta, farklı bakır konsantrasyonlarında gelişen örneklere ait kök kuru ağırlıkları
22
Şekil 4.4 Oda sıcaklığında, üç hafta, farklı bakır konsantrasyonlarında gelişen örneklere bakır metalinin kök kuru ağırlığına etki oranları
4.3 Bakır Stresinin Patlıcan Bitkisinde Toplam Çözünür Protein Miktarına Etkisi
Farklı konsantrasyonlarda uygulanan Cu çözeltisinin kök toplam çözünür protein miktarı
üzerine etkisi incelendiğinde artan bakır konsantrasyonuna bağlı olarak kök toplam çözünür
protein miktarı azalış göstermektedir (Şekil 4.5). Etki oranları şekil 4.6’de gösterilmiştir.
Bakır stresinin ikinci grubu daha fazla etkilediği tespit edilmiştir.
0
2
4
6
8
10
12
14
K ds-30 ds-60 ds-120 ds-240 30 60 120 240
Örnekler
Toplam çözünür protein
miktarları (mg/g)
Şekil 4.5 Oda sıcaklığında, üç hafta, farklı bakır konsantrasyonlarında gelişen örneklere ait kök toplam çözünür protein miktarı
0
10
20
30
40
50
60
70
80
K ds-30 ds-60 ds-120 ds-240 30 60 120 240
Örnekler
Cu Etki Oranı %
23
0
10
20
30
40
50
60
70
K ds-30 ds-60 ds-120 ds-240 30 60 120 240
Örnekler
Cu Etki Oranı %
Şekil 4.6 Oda sıcaklığında, üç hafta, farklı bakır konsantrasyonlarında gelişen örneklere bakır metalinin kök toplam çözünür protein miktarına etki oranları
4.4 Bakır Stresinin Patlıcan Bitkisinde RAPD Sonuçlarına Etkisi
Deneyde kullanılan onbir primerden dokuz primer net ve tekrar edilebilir sonuç vermiştir
(Şekil 4.8-4.16). Her primer için polimorfizm hesaplamaları örneklerin bant paternleri
kontrolün bant paternleriyle karşılaştırılarak yapılmıştır. Kontrolde bulunup örneklerde
bulunmayan ve kontrole göre yeni oluşan bantlar polimorfik olarak değerlendirilmiştir.
Polimorfizm yüzdeleri polimorfik bant sayısına toplam bant sayıları oranlanarak
hesaplanmıştır (Şekil 4.7). Çizelge 4.1 de a; kontrole göre yeni ortaya çıkan bantları
belirtmek için, b; kaybolan kontrol bantlarını belirtmek için kullanılmıştır. Artan metal
konsantrasyonuna bağlı olarak polimorfizm oranının artığı görülmüştür.
24
0
10
20
30
40
50
60
ds30
ds60
ds120
ds240
30 60 120
240
Örnekler
Polimorfizm oranı %
Şekil 4.7 Oda sıcaklığında, üç hafta, farklı bakır konsantrasyonlarında gelişen örneklere ait polimorfizm oranları
25
Çizelge 4.1 Örneklere ait bant farklılıkları
K ds-30 a/b
ds-60 a/b
ds-120 a/b
ds-240 a/b
30 a/b
60 a/b
120 a/b
240 a/b
Tube A 07
8 0 / 0 0 / 0 0 / 0 0 / 2 0 / 0 0 / 0 1 / 1 0 / 2
Tube A 09
10 0 / 0 0 / 0 0 / 0 1 / 2 0 / 0 0 / 0 2 / 3 3 / 2
Tube A 11
10 0 / 2 0 / 2 0 / 2 0 / 4 0 / 2 0 / 2 5 / 2 1 / 8
Tube A 12
12 0 / 0 0 / 1 2 / 2 3 / 7 0 / 0 0 / 4 4 / 4 1 / 7
Tube A 16
9 1 / 0 1 / 0 1 / 0 0 / 3 1 / 0 1 / 0 1 / 2 0 / 4
Tube A 17
7 0 / 0 0 / 0 0 / 0 0 / 2 0 / 0 0 / 0 0 / 0 0 / 2
Tube A 18
4 0 / 0 0 / 0 0 / 0 1 / 2 0 / 0 0 / 1 2 / 1 0 / 2
Tube A 20
8 0 / 0 0 / 1 0 / 1 0 / 1 0 / 1 0 / 4 0 / 1 0 / 2
Tube C 01
12 0 / 2 1 / 5 2 / 3 2 / 3 2 / 2 1 / 5 3 / 5 1 / 8
Total 80 5 11 13 33 8 18 37 43
K: kontrol (a/b) a : kontrole göre yeni oluşan bant b : kontrole göre kaybolan bant
26
Şekil 4.8 Tube A 07 primeri M: Marker K: Kontrol
Şekil 4.9 Tube A 09 primeri N: Negatif M: Marker K: Kontrol
27
Şekil 4.10 Tube A 11 primeri M: Marker K: Kontrol N: Negatif
Şekil 4.11 Tube A12 primeri M: Marker K: Kontrol
28
Şekil 4.12 Tube A 16 primeri M: Marker K: Kontrol N: Negatif
Şekil 4.13 Tube A 17 primeri N: Negatif M: Marker K: Kontrol
29
Şekil 4.14 Tube A 18 primeri N: Negatif K: Kontrol M: Marker
Şekil 4.15 Tube A 20 primeri N: Negatif M: Marker K: Kontrol
30
Şekil 4.16 Tube C 01 primeri M: Marker K: Kontrol N: Negatif
4.5 Bakır Stresine Maruz Kalmış Örneklerin Populasyon Parametrelerinin İstatistiksel Analizi
İstatiksel analizler için SPSS paket programı uygulanmıştır. Her bir populasyon parametresi
(kök uzunluğu, kuru ağırlığı, toplam çözünür protein miktarı) için farklı konsantrasyonlarda
ve şartlarda metale maruz bırakılan örnekler arasındaki farklılıkları değerlendirmek için
Duncan’s testi yapılmıştır.
Çizelge 4.2’e göre kök uzunlukları incelendiğinde, ds-120, ds-240, 120, 240 örnekleri
benzer, ds, ds-30, ds-60, 30 ve 60 örnekleri farklı bulunmuştur. Kök kuru ağırlıkları
bakımından ds-60 ile 30 ve 120 ile 240 örneklerinin benzer, ds, ds-30, ds-120 ve 60
örneklerinin farklı oldukları tespit edilmiştir. Kök toplam çözünür protein miktarları
incelendiğinde ds-60 ile 30 ve ds-120 ile ds-240 ayrıca 120 ve 240 örneklerinin benzer, ds,
ds-30 ve 60 örneklerinin farklı oldukları görülmüştür.
31
Çizelge 4.2 Populasyon parametrelerinin istatistiksel analizi Kök uzunluğu
Mean ± SE Kök kuru ağırlığı Mean ± SE
Kök toplam çözünür protein
Mean ± SE
K 43.20 ± 0.8082904 (a)
0.000520 ± 0.0000115 (a)
12.270 ± 0.1558846 (a)
ds-30 16.00 ± 0.4618802 (b)
0.000468 ± 0.0000081 (b)
10.560 ± 0.1847521 (b)
ds-60 11.40 ± 0.2886751 (c)
0.000427 ± 0.0000075 (c)
6.660 ± 0.1212436 (c)
ds-120 5.00 ± 0.2886751 (d)
0.000330 ± 0.0000115 (d)
5.730 ± 0.981495 (d)
ds-240 4.00 ± 0.1154701 (d)
0.000280 ± 0.0000173 (e)
5.580 ± 0.1212436 (d)
30 13.60 ± 0. 9237604 (e)
0.000431 ± 0.0000058 (c)
6.860 ± 0.0750555 (c)
60 8.40 ± 0.3464102 (f)
0.000370 ± 0.0000115 (f)
6.100 ± 0.0577350 (e)
120 4.00 ± 0.4618802 (d)
0.000170 ± 0.0000127 (g)
5.180 ± 0.1039230 (f)
240 3.60 ± 0.2309401 (d)
0.000160 ± 0.0000046 (g)
4.860 ± 0.0577350 (f)
*Aynı sütunda farklı harfi alan değerler arasındaki farklılıklar önemlidir. (P < 0.05)
32
4.6 RAPD Profili ve Kök Uzunluğu, Kuru Ağırlığı, Toplam Çözünür Protein Miktarının Karşılaştırılması RAPD profili ve kantitatif ölçümlerle belirlenen değişimler artan metal konsantrasyonuna
bağlı olarak kalıbın stabilitesinin azaldığını göstermektedir (Şekil 4.17). Bakır stresinden
ikinci grup daha fazla olumsuz etkilenmiştir.
0
15
30
45
60
75
90
105
120
kök uzunluğu
kök kuru ağırlığı
kök toplam çözünür protein
RAPD profili
RAPD profili ve kök uzunluğu, kuru ağırlığı,
toplam çözünür protein miktarının
karşılaştırması (%)
K ds30 ds60 ds120 ds240 30 60 120 240
Şekil 4.17 Örneklerde RAPD profili ve kök uzunluğu, kuru ağırlığı, toplam çözünür protein miktarının karşılaştırılması
33
5. TARTIŞMA VE SONUÇ
Ağır metaller, yabancı otlar ve tarım zararlarına karşı geliştirilen tarım ilaçlarında
kullanılmaktadır. Örneğin bakır, mangan ve çinko fungisit, kurşun ve arsenik ise
meyvelerdeki böcek zararlılarına karşı geliştirilen ilaçlarda kullanılmaktadır.
Toprak ve doğal su kaynaklarının toksik metallerle kirlenmesi sonucunda bu bölgelerde
yaşayan organizmalarda ciddi zararlar oluşmaktadır. Bitkilerde ağır metal toksisitesi
fotosentez (Baron et al. 1995), lipid metabolizması (Ouariti et al. 1997), nükleik asit
biyosentezi (Doncheva et al. 1996) gibi çeşitli büyüme ve gelişme işlevlerinde hasarlara
neden olmaktadır.
Bakır ve demir gibi geçiş metalleri serbest radikaller ile yürütülen lipid peroksidasyonu
reaksiyonlarının çoğunun başlatılmasında rol alırlar. Lipid peroksidasyonu hücre
membranındaki doymamış yağ asitlerinin serbest radikallerle birleşerek bir seri reaksiyon
sonucu bozulmaları ve lipid hidroperoksitlerin oluşmasıdır. Peroksidasyon sonucu oluşan
malondialdehit ve 4-hidroksi-nonenal gibi aldehitlerin biyolojik aktiviteleri DNA ve
proteinlerle çapraz bağlanarak moleküllerin faaliyetini değiştirmeleri şeklindedir (Griffiths
et al. 2002). Lipid peroksidayonunun etkileri membran akışkanlığının azalması, membranın
normal koşullarda geçirimsiz olduğu maddelere karşı (Ca+2 gibi) zayıflığının artması ve
membrana bağlı enzimlerin inaktivasyonudur (Doğan 2005).
Ağır metallerin toksik etkilerini populasyon ve moleküler parametrelerle tespit etmek
mümkündür. Populasyon seviyesinde bitki boyu, biomass, toplam çözünür protein, prolin
ve anti-oksidatif enzimlerin miktar değişimleri ile; moleküler seviyede ise SSR, AFLP,
RFLP ve RAPD analizleri ile belirlemek mümkündür.
Tez kapsamında farklı konsantrasyonlar ve farklı şartlar uygulanan patlıcan tohumları
üzerine bakır metalinin etkileri populasyon parametrelerinden kök uzunluğu, kuru ağırlığı
ve toplam çözünür protein; moleküler parametrelerden RAPD-PCR ile incelenmiştir.
34
RAPD profili birçok canlıda genotoksisitenin belirlenmesinde kullanılmaktadır (Liu et al.
2005, 2009). DNA hasarının tespitinde RAPD tekniğinin kullanılmasının pek çok avantajı
vardır; radyoaktif değildir, az miktarda DNA yeterlidir, aynı anda birçok örnekle çalışmak
mümkündür, hızlı bir tekniktir.
Bitkilerin ağır metal stresine karşı çeşitli direnç mekanizmaları geliştirdiği, bunlardan bir
tanesinin de metalin köklerde tutulması ve gövdeye dağılımının engellenmesi olduğu
belirtilmiştir (Fernandes and Henriques 1991). Metallerin köklerde tutulup biriktirilmesi
köklerin yapısını ve büyümesini diğer organlara göre çok daha fazla etkilemesine neden
olmaktadır.
Toksinlerin kökte yaptığı etkilerden biri büyümesini engellemektir. Bu çalışmada
beklenildiği gibi metal konsantrasyonunun artışıyla parallel olarak kök boyunda azalma
tespit edilmiştir. Farklı konsantrasyonlarda bakır stresine maruz bırakılan örnekler, kontrole
göre % 62-91 oranlarında azalmaya sebep olmuştur. 120 ve 240 ppm Cu konsantrasyonları
her iki grupta da benzer etkiler yaratmıştır (P<0.05). Her iki deney düzeneğinde de 30 ve 60
ppm Cu konsantrasyonlarına maruz bırakılan bitkilerde farklı oranlarda etkiler görülmüştür
(P<0.05). Bakırın Phaseolus vulgaris L. (Zengin ve Muzuroğlu 2004), Lolium perenne
(Wong and Bradshaw 1982) bitkilerinde de kök ve gövde uzunluğunu azalttığı tespit
edilmiştir. Alüminyumun buğday kök hücrelerinde DNA replikasyonunu ve hücre
bölünmesini azalttığı ve dolayısıyla kök büyümesini engellediği belirtilmiştir (Zhengua et
al. 1993).
Ayrıca; yüksek konsantrasyonlarda (120, 240 ppm) her iki grupta da kökte
kahverengileşmelerin meydana geldiği gözlenmiştir. Kahverengileşmenin suberin
miktarının artmasıyla oluştuğu, bu durumun da su alımını sınırladığı belirtilmiştir (Barcelo
and Poschenrieder 1990).
Bakırın kök kuru ağırlığı birinci grupta (ds-30, ds-60, ds-120, ds-240) %10 – 46, ikinci
grupta (30, 60, 120, 240) %17- 69 azalmaya sebep olmuştur. Etki oranı ikinci grubun 120
35
ve 240 ppm konsantrasyonlarında daha fazla görülmüştür, sırasıyla % 67.3 – 69.2’dir. ds-
60 ile 30 ve 120 ile 240 örneklerinde benzer etkiler tespit edilmiştir (P<0.05). Mediouni et
al.(2006) ağırlıktaki azalışı ağır metalin etkisiyle hücrelerin bölünmesinin engellenmesi ile
açıklamıştır.
Kök kuru ağırlığında gözlendiği gibi toplam çözünür protein profiline baktığımızda da
artan metal konsantrasyonuyla ters yönde bir ilişki tespit edilmiştir. Birinci grupta %13 –
54, ikinci grupta % 44 – 60 azalış belirlenmiştir. ds-60 ile 30, ds-120 ile ds-240 ve 120 ile
240 örneklerinde benzer etkiler tespit edilmiştir (P<0.05). Bakırın domates bitkisi
çeşitlerinde (Mazhoudi et al. 1997), kadmiyumun Hordeum vulgare (Liu et al. 2005)
bitkisinde toplam çözünür protein üzerine olumsuz etkileri belirtilmiştir.
Kök kuru ağırlığında ve toplam çözünür protein miktarında belirtildiği gibi ikinci gruplarda
tespit edilen azalma oranlarının daha fazla olması metallerin bitkiler üzerine etkileri
araştırılırken bitkinin ne şekilde (distile suda çimlendirilerek metal çözeltisinde
geliştirilmesi ve metal çözeltisinde çimlendirilerek geliştirilmesi) metale maruz
bırakıldığının önemli olduğunun bir göstergesidir.
Genotoksik ajanların DNA üzerinde meydana getirdiği hasarları DNA üzerinden parmakizi
yöntemleri ile inceleyen çok sayıda çalışma yapılmıştır. Çoğu parmakizi ile bakterilerden
çiçekli bitkilere kadar hemen her organizma sınıfı için kullanılabilir ve eş zamanlı olarak
çok sayıda örnek incelenebilir. Bu yönüyle parmakizi yöntemleri, konsantrasyon ve maruz
kalma süresi gibi, genotoksik ajanın değişik faktörlerle olan etkileşimini birden fazla örnek
üzerinde incelemeye olanak tanır. RAPD gibi parmak izi yöntemlerinin yüksek donanımlı
biyolojik laboratuarlar gerektirmemesi de önemli bir avantaj sağlar (Sava 2000,
Theodorakis et al. 2001, Atienzar et al. 2002).
Birçok çalışmada RAPD parmak izi yöntemi kullanılarak farklı organizmalarda çeşitli
genotoksik ajanların etkileri araştırılmıştır. Bu çalışmaların bir kısmında genotoksik ajanlar
laboratuar koşullarında kontrollü olarak uygulanmış, bir kısmında genotoksik ajanlara
36
doğal yaşam alanlarında maruz kalan organizmalar incelenmiştir. Liu et al. (2007) pirinç
(Oryza sativa L.) ile gerçekleştirdiği çalışmada, pirinç tohumlarına çeşitli
konsantrasyonlarda kadmiyum çözeltisi (CdCl2.2H2O) uygulamış ve yüksek
konsantrasyonlu çözeltilere maruz kalan örneklerin kontrol örneklere göre RAPD bant
paternlerinin değiştiğini belirlemiştir. Diğer tüm koşullar sabit tutulduğunda kontrolün
sahip olduğu bant paterninin ağır metale maruz kalmış örneklerde değişmesi, bu değişimin
genotoksik ajanın (Cd) mutasyonel etkisiyle oluştuğu düşüncesini ortaya çıkarmıştır.
RAPD analizinde kontrole göre farklı bant profillerinin gözlenmesinin nedenleri kalıp DNA
üzerinde, primerlerin bağlanma bölgelerinde meydana gelmiş mutasyonlardır. Mutasyonlar
primerlerin bu bölgeler ile eşleşmesini engelleyecek ve bu fragmanlar çoğaltılamayacaktır.
Ayrıca; primer bağlanma bölgeleri arasında oluşmuş tek ya da çift zincirdeki kırıklar bu
fragmanın çoğaltılmasını engelleyecektir. Kalıp DNA üzerinde meydana gelen baz
mutasyonları primerler için yeni bağlanma bölgeleri de oluşturabilir.
Tez kapsamında patlıcan (Solanum melongena L.) örneklerinde ağır metal kirliliğinin
neden olmuş olabileceği etkiler populasyon ve moleküler parametrelerden RAPD ile
incelenmiştir. RAPD primerlerinde kullanılan rastgele primerlerin örneklere ait kalıp
DNAlar üzerinde bağlanma bölgelerinde değişimler (yeni bağlanma bölgelerinin
oluşturulması, varolan bağlanma bölgelerinin yok olması) meydana getirmesi örneklerin
bant profillerinde polimorfizme sebep olmuştur. Polimorfizm oranları birinci grupta %6 –
41, ikinci grupta %10 – 53 tespit edilmiştir. En fazla polimorfizm ikinci grubun 120 ve 240
ppm bakıra maruz kalmış örnelerinde görülmektedir, sırasıyla % 46.25, 53.75’dir. Bant
paternlerindeki farklılıklar en fazla tube C01 primerinde görülmektedir.
RAPD profili ile belirlenen GKS ve populasyon parametreleri GKS ile karşılaştırıldığında,
ikinci grupun daha fazla etkilendiği gözlenmektedir. Bu da toksik ajana maruz kalma
şeklinin önemini belirtmektedir.
37
Bu çalışmada, populasyon ve moleküler biomarkerların birlikte kullanılabilirliği
gösterilmiştir. Biyoindikatör olarak kullanılan organizma ile kirliliğin biyolojik etkisi
kantitatif olarak tespit edilmiştir.
38
KAYNAKLAR
Abak, K. 1993. Yazlık sebzeler ve örtü altı yetiştiriciliği raporu (Solanaceae,
Cucurbitaceae, Leguminaceae ve Compositae) Türkiye bahçe bitkileri alt sektörünün gözden geçirilmesi projesi, hazırlık çalışması: Bahçe bitkileri üretiminin bölgesel özellikleri. Adana, 23s.
Aksoy, A., Dixon, J.M. and Hale, W.H.G. 1998. Biological Flora of British Isles: Capsella
bursa-pastoris (L.) Medikus. Journal of Ecology, 86; 171-186.
Al-Nakshabandi, G.A., Saqqar, M.M., Shatanawi, M.R., Fayyad, M.and Al-Horani, H. 1997. Some environmental problems associated with the use of treated wastewater for irrigation in Jordan. Agricultural Water Management, 34; 81-94.
Al-Shayeb, S.M., Al-Rajhi M.A. and. Seaward, M.R.D. 1995. The date palm (Phoenix
dactyliferaL.) as a biomonitor of lead and other elements in arid environments. Science of theTotal Environment, 168; 1-10.
Anastassopoulou, J. 2003. Metal–DNA interactions. Journal of Molecular Structure, 651/653; 19–26. Anonim 2008 Web sitesi: www.mustafaaltinisik.org.uk/21-adsem-01s.pdf Erişim tarihi:
04.09.2008 Anonymous 2008 Web sitesi: www.biozentrum.uni-frankfurt.de/Pharmakologie/index.html
Erişim tarihi: 04.09.2008 Aras, S. and Cansaran, D. 2006. Isolation of DNA for sequence analysis from herbarium material of some lichen species. Turkish Journal of Botany, 30; 449- 453. Atienzar, F.A., Cheung, V.V., Jha, A.N. and Depledge, M.H. 2001. Fitness parameters and
DNA effects are sensitive indicators of copper-induced toxicity in Daphnia manga. Toxicological Sciences, 59; 241-250.
Atienzar, F.A., Cordi, B., Donkin, M.E., Evenden, A.J., Jha, A.N. and Depledge, M.H.
2000. Comparison of ultraviolet-induced genotoxicity detected by random amplified polymorphic DNA with chlorophyll flurescence and growth in a marine macroalgae, Palmaria palmata. Aquatic Toxicology, 50; 1-12.
Atienzar, F.A., Venier, P., Jha, A.N. and Depledge, M.H. 2002. Evaluation of the random
amplified polymorphic DNA (RAPD) assay for the detection of DNA damage and mutations. Mutation Research, 521; 151–163.
39
Barcelo, J. and Poschenrieder, C. 1990. Plant water relations as effected by heavy metal stres. Journal of Plant Nutrition, 13; 1-37.
Baron, M., Arellano, J.B. and Gerge, L. 1995. Copper and photosystem ll: a controversial
relationship. Physiologia Plantarum, 94; 174-180. Bernatzky, R. and Tanksley, S.D. 1989. Restriction fragments as molecular markers for
germplasm analysis and utilization. in: Brown A.D.H., Marshall, D.R., Frankel, O.H. Williams J. T (eds). The Use of Plant Genetic Resources, Cambridge University Press, pp. 353-362, Cambridge.
Bletsos, F.A., Gantidis, N.D. and Tsialtas, J.T. 1999. Heavy metal content of eggplant fruits
grown on different levels of sewage sludge. International Symposium on Composting of Organic Matter 549.
Botstein, D., White, R., Skolnick, M. and Davis, R.W. 1980. Construction of a genetic
linkage map in man using restriction fragmenth length polymorphisms, The American Journal of Human Genetics, 32; 314-331.
Bradford, M.M. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram
quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry, 72; 254-284.
Çelik, A., Kartal, A.A., Akdoğan, A. ve Kaska, Y. 2005. Determining the heavy metal
pollution in Denizli (Turkey) by using Robinio pseudo-acacia L. Environment International, 31(1); 105-112.
Doğan, M. 2005. Ceratophyllum demersum L.’de kadmiyum klorür, sodyum klorür ve
bunların kombinasyonlarının fizyolojik ve morfolojik etkileri. Doktora tezi. Çukurova Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Biyoloji Anabilim Dalı, 23-27.
Doncheva, S., Nikolov, B. and Ogneva, V. 1996. Effect of excess copper on the
morphology of the nucleus in maize root meristem cells. Physiologia Plantarum, 96 (1); 118-122.
Ergül, A. 2000. Asmalarda (Vitis vinifera L. cvs.) Genomik DNA Parmakizi Analizleri ile
Moleküler Karakterizasyon. Doktora Tezi, Ankara Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Bahçe Bitkileri Anabilim Dalı, 159-160.
Fernandes, J.C. and Henriques, F.S. 1991. Biochemical, physiological and structural effect
off excess copper in plants. The Botanical Review, 57; 246-273. Griffiths, H.R., Moller, L., Bartosz, G., Bast, A., Bentoni-Freddari, C., Collins, A., Cooke,
M., Coolen, S., Haenen, G., Hoberg, A.M., Loft, S., Lunec, J., Olinski, R., Parry, J.,
40
Pompella, A., Poulsen, H., Verhagen, H. and Astley, A.B. 2002. Biomarkers. Molecular Aspects of Medicine, 23; 101-208.
Kamalak, F.2006. Kahramanmaraş Bölgesindeki Akarsu ve Kaynak Sularındaki Kurşun,
Kadmiyum ve Bakırın Birlikte Çöktürme/Önzenginleştirme ve Alev Atomik Absorpsiyon Spektrometresiyle Tayini. Yüksek Lisans Tezi. Kahramanmaraş Sütçü İmam Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Kimya Anabilim Dalı, 16.
Khan, S. and Khan, N.N. 1983. Influence of lead and cadmium on the growth and nutrient
concentration of tomato (Lycopersicum esculentum) and egg-plant (Solanum
melongena). Plant and Soil, 74; 387-394. Keller, C. and Hammer, D. 2004. Metal availability and soil toxicity after repeated
croppings of Thlapsi caerulescens in metal contaminated soils. Environmental Pollution, 131; 243-254.
Liu, W., Li, P.J., Qi, X.M., Zhou, Q.X., Zheng, L., Sun, T.H. and Yang, Y.S. 2005. DNA changes in barley (Hordeum vulgare) seedlings induced by cadmium pollution using RAPD analysis. Chemosphere, 61; 158-167. Liu, W., Yang, Y.S., Zhou, Q. X., Xie, L.J., Li, P.J. and Sun, T.H. 2007. Impact assessment
of cadmium contamination on rice (Oryza sativa L.) seedlings at molecular and population levels using multiple biomarkers. Chemosphere, 67; 1155-1163.
Liu, W., Yang, Y.S., Li, P.J., Zhou, Q.X., Xie, L.J. and Han, Y.P. 2009. Risk assessment of
cadmium-contaminated soil on plant DNA damage using RAPD and physiological indices. Journal of Hazardous Material. 161; 878-883.
Mazhoudi, S., Chaoui, A., Habil Ghorbal, M. and El Ferjani, E. 1997. Response of
antioxidant enzymes to excess copper in tomato (Lycopersicon esculentum, Mill.). Plant Science, 127(2); 129-137.
Mediouni, C., Benzarti, O., Tray, B., Mohamed, H.G. and Jemal, F. 2006. Cadmium and
copper toxicity for tomato seedlings. Argonomy for Sustainable Development, 26; 227-232.
Mengoni, A., Gonnelli, C., Galardi, F., Gabbrielli, R. and Bazzicalupo, M. 2000. Genetic
diversity and heavy metal tolerance in populations of Silene paradoxa L. (Caryophyllaceae): a random amplified polymorphic DNA analysis. Molecular Ecology, 9; 1319-1324.
Nikookar, K., Moradshahi, A. and Hosseini, L. 2005. Physiological responses of Dunaliella
salina and Dunaliella tertiolecta to copper toxicity. Biomolecular Engineering, 22 (4); 141-146.
41
Neelima, P. and Reddy, K.J. 2003. Differential effect of cadmium and mercury on growth and metabolism of Solanum melongena L. seedlings. Journal of Environmental Biology, 24(14); 453-460.
Olson, K.R., Squibb, K.S. and Cousins, R.J. 1978. Tissue uptake, subcellular distribution,
and metabolism of 14CH3HgCl and CH3(203)HgCl by rainbow trout, Salmo
Gardneri. Journal of the fisheries research board of Canada, 35 (4); 381-390. Omran, R.G. (1980) Peroxide Levels and the Activities of Catalase, Peroxidase, and
Indoleacetic Acid Oxidase during and after Chilling Cucumber Seedlings. Plant Physiology,65: 407-408.
Ouariti, O., Boussama, N. and Zarrouk, M. 1997. Cadmium- and copper-induced changes
in tomato membran lipids. Photochemistry, 45(7); 1343-1350. Ouzounidou, G., Ilias, I., Tranopoulou, H. and Karataglis, S. 1998. Amelioration of copper
toxicity by iron on spinach physiology. Journal of Plant Nutrition, 21; 2089-2101. Paran, I. and Michelmore, R.W. 1993. Development of reliable PCR based markers linked to downy mildew resistance genes in lettuce. Theoretical and Applied Genetics, 85; 985–993. Ralph, P.J. and Burchett, M.D. 1998. Photosynthetic response of Halophila ovalis to heavy
metal stres. Environmental Pollution, 103; 91-101. Savva, D. 2000. The use of arbitrarily primed PCR (AP-PCR) fingerprinting to detect exposure to genotoxic chemicals. Ecotoxicology, 9; 341–353. Sierra, M.J., Millán, R. and Esteban, E. 2008. Potensial use of Solanum melongena in
agricultural areas with high mercury background concentrations. Food and Chemical Toxicology, 46; 2143-2149.
Steffan, R.J. and Atlas, R. M., 1991, Polymerase Chain reaction: Applications in
Environmental Microbiology, Annual Review of Microbiology, 15; 137-161. Staub, J.E., Kuhns, L.J., May, B. and Grun, P. 1982. Stability of potato tuber isozymes
under different storage regimes. Jouranl of the American Society for Horticultural Science, 107; 428-432.
Theodorakis, C.W., Bickham, J.W. and Lamb, T. 2001. Integration of genotoxicity and population genetic analyses in kangaroo rats (Dipodomys merriami) exposed to radionuclide contamination at the Nevada test site, USA. Environmental Toxicology and Chemistry, 20; 317-326.
42
Theophanides, T. 1981. Fourier transform infrared spectra of calf thymus DNA and its reactions with the anticancer drug cisplatin. Applied Spectroscopy, 35; 461-465. Williams, J.G.K., Kubelik, A.R., Livak, K.J., Rafalski, J.A. and Tingey, S.V. 1990. DNA
Polimorphisms Amplified by Arbitrary Primers are Useful as Genetic Markers. Nucleic Acids Research, 18, 6531-6535.
Welsh, J. and McClelland, M. 1990. Fingerprinting Menomes using PCR with Arbitrary
Primers. Nucleic Acids Research, 18; 7213-7218. Wong, M.H. and Bradshaw, A.D. 1982. A comparison of the toxicity of heavy metals,
using root elongation of ryegrass, Lolium perenne. New Phytologist, 91; 255-261. Yang, D. and Wang, A.H.-J. 1996. The structural studies of interactions between anticancer
platinum drugs and DNA. Progress in Biophysics and Molecular Biology, 66; 81-111.
Yu, M.H. 2005. Environmental toxicology: biological and health effects of pollutants. CRC
press, Boca Raton. Zengin, F.K. ve Munzuroğlu, Ö. 2004. Effect of lead (Pb++) and copper (Cu++) on the
growth of root, shoot and leaf of bean (Phaseolus vulgaris L.) seedlings. G.Ü.Fen Bilimleri Dergisi, 17(3); 1-10.
Zhengua, S., Wang, J. and Guan, H. 1993. Effect of aluminum and calcium on growth of
wheat seedlings and germination of seeds. Journal of the Plant Nutrition, 16; 2135-2148.
43
EK
EK1 Toplam çözünür protein standardı
y = 3,7112x
R2 = 0,9955
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0 0,05 0,1 0,15 0,2
mg/ml BSA
Spektrometrede okunan değerler
44
ÖZGEÇMİŞ
Adı Soyadı : Didem AKSOY
Doğum Yeri : Giresun
Doğum Tarihi : 03.03.1984
Medeni Hali : Bekar
Yabancı Dili : İngilizce
Eğitim Durumu (Kurum ve Yıl)
Lise : Hamdi Bozbağ Anadolu Lisesi (1999-2002)
Lisans : Ankara Üniversitesi Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü
(2002-2006)
Yüksek Lisans : Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü
Biyoloji Anabilim Dalı (2007-2009)
Çalıştığı Kurum ve Yıl
Başkent Üniversitesi Transplantasyon ve Gen Bilimleri Enstitüsü (2008- …)