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• Inhibitoren der Transkription:Rifampicin, Actinomycinα-Amanitin
• Inhibitoren der Translation:Puromycin, Streptomycin, Tetracycline, ChloramphenicolDiphterie-Toxin
Antibiotika sind oft Inhibitoren der Genexpression
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Rifamycin & Rifampicin inhibieren prokaryotische, aber nicht
eukaryotische RNA-Polymerasen
Rifampicin ist ein halbsynthetisches Derivat von Rifamycin B,das von Streptomyces mediterranei produziert wird.
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• aus Streptomyces antibioticus• inhibiert DNA- und RNA-Polymerasen• interkaliert zwischen Basenpaare der
dsDNA
Actinomycin D
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α-Amanitin (Amatoxine)
• aus Amanita phalloides (Grüner Knollenblätterpilz)
• Inhibiert v.a. eukaryotische RNA-Polymerase II u. III, aber nicht I, und nicht prokaryot. RNA-Polymerasen
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Puromycin(inhibiert die Translation)
Bindet ohne EF-Tu die A-Stelle im Ribosom und es wird ein Peptidylpuromycin gebildet.
Eine weiter Transpeptidierung kann nicht stattfinden.
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Bindet an die grosse Untereinheit und inhibiert die Peptidyltransferase Aktivität von prokaryotischen Ribosomen
Chloramphenicol
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Binden an die kleine Untereinheit prokaryotischer Ribosomen und verhindert die Bindung von Aminoacyl-tRNAs.
Tetracycline
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Streptomycin und andere Amino-glycoside inhibieren die Initiation (bei hoher Konzentration) und verursachen bereits bei niedriger Konzentration Fehleinbau
Streptomycin
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Diphterie-Toxin(inhibiert die Translation)
Diptherie-Toxin ist ein Protein ausCorynebacterium diphteriae,das in der infizierten Zelle inzwei Fragmente gespalten wird.
Ein Fragment ist ein Enzym, dasADP-Ribose auf ein modifiziertesHistidin im EF-2 überträgt und dadurch EF-2 inaktiviert.
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Methoden zur Analyse und Manipulation von DNA
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Techniken der Protein- und Nukleinsäure-Biochemie
Klonierungin einen
Expressions-Vektor
Bestimmungder DNA-Sequenz
Transformation vonE.coli oder andere
Zellen
Präparation vonsynthetischen
Peptiden
Herstellung von spezifischenAntikörpern
Gen odercDNA
Protein
Protein
Bestimmungder Amino-
säuresequenz
SynthetischeOligonukleotide
als Sonden
Analyse einer cDNA Bank mit
Southern blotting
Herstellung spezifischerAntikörper
Expression einer DNALibrary und Analyse
durch Western blottingGen oder
cDNA
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Klonierung von DNA
1.) Rekombinante DNA Techniken beruhen auf der Fähigkeit große Mengen an identischen DNA Molekülen (Klone) herzustellen.
2) Durch Einbau von DNA Stücken in Vektoren, die in eine Wirtszelle eingeführt werden, können Klone erzeugt werden.
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3) Durch die Replikation des Vektors wird auch das DNA-Stück von Interesse vervielfältigt.
4) Die am häufigsten verwendeten Vektoren sind E.coli Plasmid Vektoren und λ Bakteriophagen Vektoren.
Eine Gen für eine Antibiotika-Resistenzerlaubt einfache Selektionder transformierten Zellen Ampicillin-Resistenz
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Klonierung von DNA mit Plasmid Vektoren
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Restriktionsendonucleasen schneiden dsDNA an spezifischen Sequenzen
Schnittstelle
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Methylierte Basen an der Schnittstelle schützen die DNA vor dem Restriktionsenzym
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Restriktionsenzyme aus verschiedenen Bakterien
schneiden unterschiedliche DNA-Sequenzen.
Diese Sequenzen sind meistens Palindrome.
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7.1 Selected restriction enzymes
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Restriktionsenzyme schneiden DNA in definierte Stücke
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Figure 7-7
Restriktionsfragmente mit komplementären ‘sticky ends’ können leicht verknüpft werden
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Modifizierte Plasmid Vektoren enthalten Polylinker, die eine Klonierungen mit unterschiedlichen
Restriktionsenzymen ermöglichen.
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Figure 7-24
Durch Mehrfach-Restriktionsanalyse können DNA Fragmente identifziert werden
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Restriktionsfragmente können durch Gel-Elektrophorese getrennt werden (Agarose Gel)
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Visualisierung der DNA-Fragmente erfolgt durch Ethidiumbromid oder
radioaktive Markierung
Ethidium-bromid
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DNA-Sequenzierung mit der Dideoxy- Methode
(oder Sanger- oder Kettenabbruch-Methode)
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Es werden 4 getrennte DNA-Polymerase Reaktionen durchgefuehrt (jeweils mit einem der 4 Dideoxy-NTPs)
Die Sanger Methode
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Die Sanger Methode (II)
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Fluoreszenzfarbstoff-markierte Nucleotide werden für moderne DNA-Sequenziergeräte verwendet
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Chemische Synthese von DNA Molekülen: Festphasen-Synthese
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![Page 31: Antibiotika sind oft Inhibitoren der Genexpression · Tetracycline, Chloramphenicol Diphterie-Toxin Antibiotika sind oft Inhibitoren der Genexpression. Rifamycin & Rifampicin inhibieren](https://reader030.vdocuments.pub/reader030/viewer/2022041207/5d612f1188c993c05a8bb82a/html5/thumbnails/31.jpg)
Chemische DNA Synthese
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Synthetische Peptide werden auch durch eine Festphasen-
Methode hergestellt(Bruce Merrifield)
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Kopplung der C-terminalen Aminosäure an das Säulenmaterial
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Abspaltung der Schutzgruppe am Aminoende
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Kopplung mit der nächsten Aminosäure
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Ablösen des fertigen Peptids
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![Page 38: Antibiotika sind oft Inhibitoren der Genexpression · Tetracycline, Chloramphenicol Diphterie-Toxin Antibiotika sind oft Inhibitoren der Genexpression. Rifamycin & Rifampicin inhibieren](https://reader030.vdocuments.pub/reader030/viewer/2022041207/5d612f1188c993c05a8bb82a/html5/thumbnails/38.jpg)
DNA wird durch ‘Southern blotting’spezifisch nachgewiesen
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mRNAs werden durch ‘Northern blotting’spezifisch nachgewiesen
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Mit Hilfe der PCR kann eine bestimmte DNA Sequenz (z.B. Gen) durch Vervielfältigung aus einer großen Ansammlung von vielen unterschiedlichen DNA Sequenzen isoliert werden.
Allerdings muss zumindest eine kurzes Stück der DNA Sequenz am Anfang und am Ende des gewünschten Gens bekannt sein.
PCR (Polymerase Chain Reaction)
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PCR (polymerase chain reaction)
![Page 42: Antibiotika sind oft Inhibitoren der Genexpression · Tetracycline, Chloramphenicol Diphterie-Toxin Antibiotika sind oft Inhibitoren der Genexpression. Rifamycin & Rifampicin inhibieren](https://reader030.vdocuments.pub/reader030/viewer/2022041207/5d612f1188c993c05a8bb82a/html5/thumbnails/42.jpg)
PCR (polymerase chain reaction)
![Page 43: Antibiotika sind oft Inhibitoren der Genexpression · Tetracycline, Chloramphenicol Diphterie-Toxin Antibiotika sind oft Inhibitoren der Genexpression. Rifamycin & Rifampicin inhibieren](https://reader030.vdocuments.pub/reader030/viewer/2022041207/5d612f1188c993c05a8bb82a/html5/thumbnails/43.jpg)
PCR (polymerase chain reaction)
![Page 44: Antibiotika sind oft Inhibitoren der Genexpression · Tetracycline, Chloramphenicol Diphterie-Toxin Antibiotika sind oft Inhibitoren der Genexpression. Rifamycin & Rifampicin inhibieren](https://reader030.vdocuments.pub/reader030/viewer/2022041207/5d612f1188c993c05a8bb82a/html5/thumbnails/44.jpg)
Herstellung rekombinanter Proteine
Überexpression eines Gensoder cDNA in
- E. coli- S. cerevisiae- Insektenzellen (Bacculovirus-System)
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Industrielle Produktion rekombinanter Proteine
KleinwuchsWachstumshormonVirushüllproteineImpfstoffeAnämie (Erythozytenprodukt.)ErythropoietinDiagnostikMonoklonale AntikörperHIV, Krebs, ImmunschwächeInterleukineVirusinfektionen, KrebsIntereferoneFaktor VIII (Hämophilie)GerinnungsfaktorenDiabetesInsulinBeispeil /AnwendungProtein
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in vitro Mutagenese
• DeletionenN- oder C-terminale VerkürzungEntfernen von Domänen
• SubstitutionenGerichtete Mutagenese
• InsertionenCassetten Mutagenese
• Designer Gene
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Gerichtete Mutagenese (site-directed mutagenesis)
mit Hilfe der PCR
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Cassetten Mutagenese
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Gezielter Genaustausch