Download - Ap8 - Imunofluorescencia
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Aula 8
Trabalho realizado pelos acadêmicos de Medicina da UFBA Adriana Campos, Nivaldo Cardozo Filho, Sabrina Oliveira e
Silvana Asfora, sob orientação dos Professores Roberto Meyer, Ivana Nascimento, Robert
Schaer, Cláudia Brodskyn, Songelí Freire e Denise Lemaire, do Laboratório de Imunologia do Instituto de Ciências da Saúde da UFBA.
Atualizado em julho de 2003
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Princípio da técnica:
Anticorpos ou antígenos são conjugados (ligados de modo
covalente) a uma substância (fluorocromo), que, quando
excitada por radiações UV, emite luz no espectro visível.
Assim, como a ligação Ag-Ac é específica, um anticorpo
conjugado pode ser usado para detectar um determinado
antígeno e vice-versa. A reação é feita em lâminas de mi-
croscopia (um pouco mais finas que as comuns) e a obser-
vação tem lugar num microcópio com luz UV (microscópio
de fluorescência).
Principais fluorocromos: fluoresceína (isotiocianato de fluo-
resceína – FITC) e rodamina (isotiocianato de tetrametil
rodamina – TRICT).
Principais modalidades: Imunofluorescência direta e indireta
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Microscópio de fluorescência com epiluminação
(modificado de Stites, Terr e Parslow, 2000)
luz UV atinge o ma- terial examinado
fluorescência emitida chega ao observador
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Tecido ou esfregaço(com Ag)
Imunofluorescência Direta
Lavagem para retirada dos conjugados não fixados:
Tecido ou esfregaço (com Ag)
Adição de anticorpos (em geral monoclonais), conju- gados com um fluo- rocromo.
lâmina
Montagem da lâmina e observação microscópica
Utilização da técnica: muito usada para a detecção direta de mi-crorganismos em secreções, na urina, nas fezes, em cortes de
tecidos etc. Também bastante utilizada na fenotipagem de célulastumorais
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Imunofluorescência Indireta
Tecido ou esfregaço (com Ag)
Lavagem para retirada de anticorpos não fixados:
Adição de anti-Ac conjugado com fluorocromo:
Tecido ou esfregaço (com Ag)
Adição de soro teste, contendo anticorpos específicos contra o Ag em questão.
REAÇÃO POSITIVA
A lâmina usada possuicírculos impressos no vidro,em geral conforme o esque-ma acima, onde estão os an-tígenos. Neles são coloca-dos os controles (positivo enegativo) e os soros testes devidamente diluídos (di-luição seriada).
Lâmina
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Lavagem para retirada do conjugado não fixado:
Tecido ou esfregaço (com Ag)
Montagem da lâmina e observação emmicroscópio de imunofluorescência
de uma reação positiva.
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REAÇÃO NEGATIVA
Tecido ou esfregaço (com Ag)
Adição de soro teste que não contem anticorpos específicos para o antígeno em questão
Lavagem para retirada de anticorpos não fixados:
Adição de anti-Ac conjugado com fluorocromo:
Tecido ou esfregaço (com Ag)
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Lavagem para retirada dos conjugados não fixados:
Montagem da lâmina e observação microscópica
Tecido ou esfregaço (com Ag)
de uma reação negativa
Utilização da técnica: a imunofluorescência indireta é muito usada para o diagnóstico sorológico de várias doenças infecciosas como a Doença de Chagas, a SIDA/AIDS, as hepatites etc. É uma técnica onde se consegue alta sensibilidade e especificidade. Apesar de poder detectar anticorpos IgM espe- cíficos, ela é muito útil para o diagnóstico de doenças crônicas, onde a de- tecção de anticorpos IgG ou IgA confirma a suspeita clínica, como na refe- rida Doença de Chagas. Tem como maior desvantagem o uso do microscó- pio de imunofluorescência, cuja a luz é UV, além do fato de ser um teste qualitativo ou semi-quantitativo e nunca quantitativo (quem detecta a reação é o olho humano).
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Visualização pela imunofluorescência
Larvas de S. mansoni após reação de imuno- fluorescência direta
imunofluorescência com FITC
fotografia preto–e-branco de uma cercária,contra a qual se dirigiu anticorpos fluores- ceinados
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Ac contra Ag tecidual conjugado com rodamina (TRICT)
Ac contra Ag tecidual, conjugadocom fluoresceína ( FITC )
Anticorpos contra antígenos teciduais conjugados comrodamina e com fluoresceína (obviamente dirigidoscontra antígenos diferentes).
Mais algumas fotos de imunofluorescência:
FIM