Aplicaciones de la ingeniería genética a la cría
y salud animal.
Aplicaciones de la ingeniería genética a la cría
y salud animal.Bases fundamentales de la terapia génica. Aplicaciones en salud animal.
-Formas de actuación mediante terapia génica.
-Mecanismos de introducción del gen terapéutico. Terapia génica “in vivo” y “ex vivo”. Ingenieria Tisular.
- Enfermedades candidatas para un tratamiento con terapia génica.
Bases fundamentales de la terapia génica. Aplicaciones en salud animal.
-Formas de actuación mediante terapia génica.
-Mecanismos de introducción del gen terapéutico. Terapia génica “in vivo” y “ex vivo”. Ingenieria Tisular.
- Enfermedades candidatas para un tratamiento con terapia génica.
¿QUÉ es la Terapia génica?¿QUÉ es la Terapia génica?
“Proceso por el cual un nuevo gen es introducido en células de un individuo
para producir un efecto terapéutico.”
DNA como medicamento o Curar con genes
¿QUÉ es Gene Marking?¿QUÉ es Gene Marking?
“Proceso que utiliza técnicas comunes a la
Terapia Génica pero sin buscar un efecto
terapéutico.”Ej. Seguir la pista a determinadascélulas en el organismo.
““Suprimir función”Suprimir función”
““Añadir función”Añadir función”
Terapia GénicaTerapia Génica
““Añadir función”Añadir función”
Terapia GénicaTerapia Génica
•Sustitución del gen deseado.Sustitución del gen deseado.
•Reparación de una mutación. Reparación de una mutación. •Añadir un genAñadir un gen
Añadir funciónAñadir funciónAñadir funciónAñadir función
•Recombinación homológa Recombinación homológa (sustitución o reparación puntual)(sustitución o reparación puntual)
• Introducción del transgen Introducción del transgen al azar al azar
(añadir un gen)(añadir un gen)
Añadir funciónAñadir funciónAñadir funciónAñadir función
““Suprimir función”Suprimir función”
Terapia GénicaTerapia Génica
•Muerte celular (suicidio Muerte celular (suicidio de las células) de las células)
•Oligonucleótidos Oligonucleótidos antisentido (expresión).antisentido (expresión).
•Ribozimas (Ruptura). Ribozimas (Ruptura).
Suprimir funciónSuprimir funciónSuprimir funciónSuprimir función
OLIGONUCLEÓTIDOS ANTISENTIDOiRNA: RNA de interferencia
MODOS DE INTRODUCCIÓN
MODOS DE INTRODUCCIÓN
““Ex vivo”Ex vivo”
““In vivo”In vivo”
Terapia GénicaTerapia Génica
DIRECTAMENTE EN EL INDIVIDUO ADULTO REALIZABLES EN CULTIVOS CELULARESDIRECTAMENTE EN EL INDIVIDUO ADULTO REALIZABLES EN CULTIVOS CELULARES
IN VIVO/EX VIVOIN VIVO/EX VIVOIN VIVO/EX VIVOIN VIVO/EX VIVO
EX VIVOEX VIVOEX VIVOEX VIVO
SOLO EN CULTIVOS CELULARESSOLO EN CULTIVOS CELULARES
EX VIVOEX VIVOEX VIVOEX VIVO
•DIRECTOS•DIRECTOSDNA desnudoDNA desnudo
IN VIVO/EX VIVOIN VIVO/EX VIVOIN VIVO/EX VIVOIN VIVO/EX VIVO
• Inyección de la molécula de DNA.Inyección de la molécula de DNA.• Músculo , Piel, Mucosas y Timo.Músculo , Piel, Mucosas y Timo.• Introducción por “nuclear pore Introducción por “nuclear pore
complex”.complex”.
- Talla ILIMITADA.Talla ILIMITADA.- Bajo porcentaje de transfecciónBajo porcentaje de transfección- No hay integración en el genoma.No hay integración en el genoma.- No hay amplificación del DNA.No hay amplificación del DNA.
DNA desnudoDNA desnudoDNA desnudoDNA desnudo
EX VIVOEX VIVOEX VIVOEX VIVO
•INDIRECTOS•INDIRECTOS--
•DIRECTOS•DIRECTOSDNA desnudoDNA desnudo
IN VIVO/EX VIVOIN VIVO/EX VIVOIN VIVO/EX VIVOIN VIVO/EX VIVO
Mediados por vectoresMediados por vectores
• ““Son sistemas que ayudan en Son sistemas que ayudan en el proceso de transferencia de el proceso de transferencia de
un gen exógeno a la célula, un gen exógeno a la célula, facilitando la entrega, facilitando la entrega,
biodisponibilidad intracelular biodisponibilidad intracelular del mismo de modo que pueda del mismo de modo que pueda
funcionar correctamente”funcionar correctamente”
¿Qué es un vector?¿Qué es un vector?¿Qué es un vector?¿Qué es un vector?
• EspecificidadEspecificidad de órgano o tejido. de órgano o tejido.• ProtecciónProtección del DNA. del DNA.• Elevada Elevada disponibilidad.disponibilidad.• ExpresiónExpresión eficaz. eficaz.• No inmunógeno/sin repuestas No inmunógeno/sin repuestas
inflamatorias.inflamatorias.• SeguroSeguro paciente/entorno. paciente/entorno.
Características del vector idealCaracterísticas del vector idealCaracterísticas del vector idealCaracterísticas del vector ideal
EX VIVOEX VIVOEX VIVOEX VIVO
•INDIRECTOS•INDIRECTOS
- Retrovirus
-Adenovirus
- Adenovirus asociados
- Liposomas
- Fragmentos
específicos
- Retrovirus
-Adenovirus
- Adenovirus asociados
- Liposomas
- Fragmentos
específicos
•DIRECTOS•DIRECTOSDNA desnudoDNA desnudo
IN VIVO/EX VIVOIN VIVO/EX VIVOIN VIVO/EX VIVOIN VIVO/EX VIVO
• Una cadena de RNA.Una cadena de RNA.• Protegidos por una cápside.Protegidos por una cápside.• Talla de 80 a 130 nm.Talla de 80 a 130 nm.• Tres genes importantes:Tres genes importantes:
– gag: gag: proteínas de la cápsideproteínas de la cápside
– pol: pol: transcriptasa inversa e integrasatranscriptasa inversa e integrasa
– Env: Env: proteínas de envoltura y reconocimiento de proteínas de envoltura y reconocimiento de receptorreceptor
– Zonas LTR: Zonas LTR: Long Terminal RepeatLong Terminal Repeat
VECTORES RETROVIRALESVECTORES RETROVIRALESVECTORES RETROVIRALESVECTORES RETROVIRALES
Construcción RetroviralConstrucción RetroviralConstrucción RetroviralConstrucción Retroviral
MMLV: Moloney Murine Leukemia VirusMMLV: Moloney Murine Leukemia Virus
CÉLULAS CÉLULAS EMPAQUETADORAS EMPAQUETADORAS
(helper free)(helper free)
RNA
Producción de Producción de vectores retroviralesvectores retrovirales
Producción de Producción de vectores retroviralesvectores retrovirales
CÉLULAS EMPAQUETADORAS CÉLULAS EMPAQUETADORAS (helper free) (helper free)
Retrovirus Recombinantes
Producción de Producción de vectores retroviralesvectores retrovirales
Producción de Producción de vectores retroviralesvectores retrovirales
• Alta eficacia de transducción.Alta eficacia de transducción.• Tamaño del inserto 8Kb.Tamaño del inserto 8Kb.• Alta expresión una vez introducido en el Alta expresión una vez introducido en el
genoma.genoma.• Sistema muy bien estudiado.Sistema muy bien estudiado.• Proteínas del vector no se expresan en el Proteínas del vector no se expresan en el
huésped.huésped.• Necesita células en división.Necesita células en división.• Se consiguen títulos muy bajos de virus.Se consiguen títulos muy bajos de virus.• Integración al azar en el genoma.Integración al azar en el genoma.• Transducción “in vivo” poco efectiva.Transducción “in vivo” poco efectiva.
Características de los Características de los vectores retroviralesvectores retroviralesCaracterísticas de los Características de los vectores retroviralesvectores retrovirales
EX VIVOEX VIVOEX VIVOEX VIVO
•INDIRECTOS•INDIRECTOS
- Retrovirus
-Adenovirus
- Adenovirus asociados
- Liposomas
- Fragmentos
específicos
- Retrovirus
-Adenovirus
- Adenovirus asociados
- Liposomas
- Fragmentos
específicos
•DIRECTOS•DIRECTOSDNA desnudoDNA desnudo
IN VIVO/EX VIVOIN VIVO/EX VIVOIN VIVO/EX VIVOIN VIVO/EX VIVO
• DNA lineal de cadena doble.DNA lineal de cadena doble.• Más complejos que los Más complejos que los
retrovirus.retrovirus.• Tres genes importantes:Tres genes importantes:
– E1: E1: rescata células de la quiescencia.rescata células de la quiescencia.
– E2: E2: proteínas relacionadas con la replicación del DNA.proteínas relacionadas con la replicación del DNA.
– E3: E3: defensa ante el sistema inmunitario.defensa ante el sistema inmunitario.
– E4: E4: regulación de la transcripción.regulación de la transcripción.
VECTORES ADENOVIRALESVECTORES ADENOVIRALESVECTORES ADENOVIRALESVECTORES ADENOVIRALES
VIRUS RECOMBINANTES E1 Y E3 ELIMINADOS
• Eficaces a la hora de transferir el gen Eficaces a la hora de transferir el gen episomal a una gran cantidad de células.episomal a una gran cantidad de células.
• Fácil producción en el laboratorio.Fácil producción en el laboratorio.
• Gran respuesta inmunitaria.Gran respuesta inmunitaria.
• Dificultad para repetir la inyección de Dificultad para repetir la inyección de virus.virus.
Características de los Características de los vectores adenoviralesvectores adenoviralesCaracterísticas de los Características de los vectores adenoviralesvectores adenovirales
EX VIVOEX VIVOEX VIVOEX VIVO
•INDIRECTOS•INDIRECTOS
- Retrovirus
-Adenovirus
- Adenovirus asociados
- Liposomas
- Fragmentos
específicos
- Retrovirus
-Adenovirus
- Adenovirus asociados
- Liposomas
- Fragmentos
específicos
•DIRECTOS•DIRECTOSDNA desnudoDNA desnudo
IN VIVO/EX VIVOIN VIVO/EX VIVOIN VIVO/EX VIVOIN VIVO/EX VIVO
• DNA lineal de cadena doble.DNA lineal de cadena doble.• Se insertan en el genoma.Se insertan en el genoma.• Dos genes :Dos genes :
– rep: rep: replicación e integración del virus.replicación e integración del virus.
– cap: cap: tres proteínas estructurales víricas.tres proteínas estructurales víricas.
– TR: TR: repeticiones terminales-145 nucleótidos.repeticiones terminales-145 nucleótidos.
VECT. ADENOASOCIADOSVECT. ADENOASOCIADOSVECT. ADENOASOCIADOSVECT. ADENOASOCIADOS
VIRUS RECOMBINANTES SOLO CONTIENEN TRCélulas que poseen los genes rep y cap.
• Expresión a largo plazo.Expresión a largo plazo.
• No hay respuesta inmunitaria.No hay respuesta inmunitaria.
• Talla limitada del gen a introducir (aprox Talla limitada del gen a introducir (aprox 5 Kb).5 Kb).
• Dificultad para obtener grandes Dificultad para obtener grandes cantidades.cantidades.
Características de los Características de los vectores adeno-asociadosvectores adeno-asociadosCaracterísticas de los Características de los vectores adeno-asociadosvectores adeno-asociados
http://140.116.60.1/mdlai/Handout/cancer-gene-therapy/sld014.htm
EX VIVOEX VIVOEX VIVOEX VIVO
•INDIRECTOS•INDIRECTOS
- Retrovirus
-Adenovirus
- Adenovirus asociados
- Liposomas
- Fragmentos
específicos
- Retrovirus
-Adenovirus
- Adenovirus asociados
- Liposomas
- Fragmentos
específicos
•DIRECTOS•DIRECTOSDNA desnudoDNA desnudo
IN VIVO/EX VIVOIN VIVO/EX VIVOIN VIVO/EX VIVOIN VIVO/EX VIVO
• CATIÓNICOSCATIÓNICOS– Su carga positiva reacciona con la
negativa del DNA formando un complejo.
• pH SENSIBLE O ANIÓNICOpH SENSIBLE O ANIÓNICO– Mediante una desestabilización por
bajo pH el DNA entra en “núcleo del liposoma”.
LIPOSOMASLIPOSOMASLIPOSOMASLIPOSOMAS
POSIBILIDAD DE UNIR RECEPTORES ESPECÍFICOS
– Protegen al DNA– No hay limite de tamaño– Enviar a lugares específicos.– Baja eficacia – Expresión transitoria.– Toxicidad celular– Inhibición por componentes
séricos.
Características de los liposomasCaracterísticas de los liposomasCaracterísticas de los liposomasCaracterísticas de los liposomas
EX VIVOEX VIVOEX VIVOEX VIVO
•INDIRECTOS•INDIRECTOS
- Retrovirus
-Adenovirus
- Adenovirus asociados
- Liposomas
- Fragmentos
específicos
- Retrovirus
-Adenovirus
- Adenovirus asociados
- Liposomas
- Fragmentos
específicos
•DIRECTOS•DIRECTOS
•QUIMICOS•QUIMICOS
•FISICOS•FISICOS
Precipitación con fosfato de calcioPrecipitación con fosfato de calcio
ElectroporaciónElectroporación
DNA desnudoDNA desnudo
IN VIVO/EX VIVOIN VIVO/EX VIVOIN VIVO/EX VIVOIN VIVO/EX VIVO
MÉTODOS “EX VIVO”MÉTODOS “EX VIVO”(Cultivos celulares)(Cultivos celulares)
MÉTODOS “EX VIVO”MÉTODOS “EX VIVO”(Cultivos celulares)(Cultivos celulares)
Las células modificadas Las células modificadas genéticamente deberán genéticamente deberán
ser introducidas ser introducidas posteriormente en el posteriormente en el
enfermoenfermo
MECANISMO “EX VIVO”MECANISMO “EX VIVO”MECANISMO “EX VIVO”MECANISMO “EX VIVO”
MODO DE INTRODUCCIÓNMODO DE INTRODUCCIÓN
•Enfermedades Enfermedades monogénicas. monogénicas.
•Cancer.Cancer.•Enfermedades infecciosas o Enfermedades infecciosas o
parasitarias. parasitarias. •Enfermedades Enfermedades
neurodegenerativasneurodegenerativas
Algunas...Algunas...Algunas...Algunas...
Enfermedades Monogénicas
- Conocidas por la mayoría como las únicas candidatas para el tratamiento.
- Aporte de la proteína/enzima
deficitaria.
- Posibilidad de realizar terapia
génica germinal..
Algunas...Algunas...Algunas...Algunas...
Deficiencia Inmune Severa CombinadaDeficiencia Inmune Severa Combinada ligada al cromosoma XFibrosis Quística Enfermedades lisosomales (Gaucher, etc.)
Deficiencia Inmune Severa Combinada
- Deficiencia en la enzima Adenosin Desaminasa.
- 1/100.000 (25% de
mortalidad).
- Fragilidad de los linfocitos T..
INMUNOSUPRESION
David "niño burbuja",
(Fuente: M.R. Cummings. Herencia humana (3ª ed.), Interamericana (1995)
Tratamientos
- Aportación de la enzima recombinante:
ADAPEG-ADA
- Transplante de médula osea.
1ª Experiencia de Terapia génica: Deficiencia Inmune Severa
Combinada
- 1990. Dr Blaese (EEUU)Dr. Bordignon (Italia)
-1995 Demuestran la eficacia del tratamiento
Ashanti de Silva tratada a los cuatro años de edad.(Fuentes: W.F. Anderson, Scient. Amer., 273(3):96-98(1995).
X-SCI Imunodeficiencia Severa combinada
-Mutación en el Cromosoma X
- Deficiencia en la cadena del
receptor para la interleukina
IL2RG
- Hospital Necker de Paris (11
niños)
X-SCI Imunodeficiencia Severa combinada
-3 de los niños sufrieron una leucemia.- ¿Por qué?
-Efecto posición (LMO2)-2003-Efecto sobreexpresión- 2006
Fibrosis Quística
- Deficiencia en el CTFR (Cystic factor transmembrane receptor).
- 1/2.800 (Muerte a los 29).
- No hay tratamiento.
Problemas para clonar el
CTFR
2.-Tumores
- - Muerte celular- Genes supresores de tumores.- Producción de linfoquinas- Inmuno Terapia con antígenos MHC
Los más tratados:Melanoma.Leucemias GlioblastomaTumores de pulmón, hígado, etc.
3.- INFECCIOSAS Y/O PARASITARIAS
- - Estimular el sistema inmunitario.- Vacunas de DNA desnudo con
antígenos.- Linfocitos recombinantes para los
anticuerpos que actuan contra el virus.
Algunos ejemplos:SIDAVacunas de DNA desnudo en animales.
4.- Enfermedades neurodegenerativas
- - Inhibición de apoptosis neuronal.- Producción de L-dopa o factores
neurotróficos en cerebro.
Algunos ejemplos:Enfermedades de la motoneurona(E.L.A. Y E.M.)Parkinson y Alzheimer.
ENFERMEDADES TRATADASENFERMEDADES TRATADAS
¿FASES?¿FASES?
¿Dónde se están tratando?¿Dónde se están tratando?
CIFRAS POR PAISESCIFRAS POR PAISES
CIFRAS POR CONTINENTESCIFRAS POR CONTINENTES