Download - Apresentação da Tese do Mauro Cafundó
Dormir bem
Atividade físicaDieta
“An ounce of prevention is worth a pound of cure” – Benjamin Franklyn
Prevenção
Rastreamento de substâncias naturais ou sintéticas para a quimioprevenção
do câncer
Programa de pós-graduação em Biociências e Biotecnologia
aplicadas à Farmácia Faculdade de Ciências
Farmacêuticas de Araraquara UNESP
Candidato: Mauro C. Cafundó de MoraisOrientadora: Profa. Dra. Christiane P. Soares
Produtos naturais e sintéticos para tratamento e prevenção do câncer
A quimioprevenção do câncer envolve prevenção, atraso ou reversão do processo
de carcinogênese através da ingestão de compostos na dieta ou fármacos.
Sporn et al., Carcinogenesis, 2000, 21(3), 525
N C S
SO
CH3
OH
HO
OH
Vitis spp.
Brassica spp.
trans-resveratrol
sulforafano
Enzimas de fase 1
Enzimas de fase 2
Indutores bifuncionais
Indutores monofuncionais
Enzimas e Indutores
4’-bromoflavona
Song et al., Cancer Res., 1999, 59(3), 578
β-naftoflavona
O
O
Br
O
O
Keap1 Nrf2
SH SH
Indutor
Keap1
S
Indu
tor
S
Indu
tor
+
+ Nrf2
Nrf2Nrf2
Genes de fase 2ARE
Small Maf Núcleo
Citoplasma
TGACnnnGC
Dinkova-Kostova et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2002, 99(18), 11908
O fator NF-κB e a oncogênese Fator de transcrição nuclear responsável por vários genes
Dímeros relacionados por domínios homólogos altamente
conservados (RH)
Gilmore, Oncogene, 2006, 25(51), 6680
IκB
TNFα
PNF-κB
IκB
IKK
U Proteassomo 26S
NF-κB
+
IκB P
UU
NF-κB
P
U
NF-κBP
PKA
c-IAP1 & 2Traf 1 & 2A1/Bfl-1Bcl-xL
DNA
Núcleo
Intracelular
Extracelular
NF-κBP
GenesAnti-
apoptóticos
Baldwin, J. Clin. Invest., 2001, 107, 241
O papel da inflamação no câncer O uso regular de anti-inflamatórios reduz significativamente o
aparecimento de câncer Enzima óxido nítrico sintase induzida (iNOS) é expressa em
diversos tipos de câncer Óxido nítrico (NO), produto de iNOS, exerce efeitos pró-
carcinogênicos
SINGH et al., Cancer Chemotherapy and Pharmacology, 2011, 67(6), 1211
L-Arginine
Inibição da aromatase Enzima do complexo citocromo P450 (CYP19)
Biossíntese de hormônios estrogênios
↑ estrogênios » ↑ chance de câncer de mama
O
H
OH
HH
3O2 3H2O
3NADPH 3NADP+
H
OH
HH
HO
Testosterona EstradiolAromatase
+ HCO2H
Endringer et al., J. Nat. Prod., 2008, 71(6), 1082
Morte celular – apoptose e necrose
Genotoxicidade
Moller, Basic Clin. Pharmacol. Toxicol., 2005, 96, 1
O acúmulo de mutações está relacionado com o
desenvolvimento da maioria dos tumores malignos e desordens
degenerativas
Identificar agentes genotóxicos e diminuir exposição a eles, e
aumentar a exposição a agentes antigenotóxicos
Biodiversidade
Áreas de prioridade para restauração da biodiversidade em SP
Mercado mundial de fármacos de origem vegetal: US$ 12,4 bilhões (2006)25% do faturamento da Indústria farmacêutica
Joly et al., Science, 2010, 328(5984), 1358
Plantas do cerrado com propriedades medicinais
Pterogyne nitens T.Fabaceae
Alchornea glandulosa P. & E. Euphorbiaceae
Lorenzi, Árvorez Brasileiras, 2000, v.2, 3ed.
2. Objetivo geral
O presente estudo teve como objetivo fazer um rastreamento de substâncias puras isoladas ou sintéticas, avaliando sua atividade citotóxica. Definir um perfil genotóxico, e avaliar a indução de apoptose ou potencial quimiopreventivo dessas substâncias.
Objetivos específicosI. Avaliar a citotoxicidade de substâncias isoladas ou sintéticas através de
ensaio de MTT em linhagem HepG2 e ensaio de SRB em linhagem MCF-7 e MDA-MB-231 e determinar a concentração inibitória de 50% das células (IC50).
II. Avaliar a genotoxicidade do AG e G1 das substâncias através do ensaio do cometa.
III. Avaliar o efeito de indução de apoptose de alcalóides guanidínicos (NTA e NTB) e bioisostero (NTT) através do ensaio de coloração com Hoechst 33342 e iodeto de propídio.
IV. Avaliar o efeito de quimioprevenção da coleção de substâncias, através do ensaio de inibição do fator de transcrição NF-κB, inibição da produção de nitrito, inibição de aromatase e indução de quinona-redutase.
V. Avaliar o efeito inibitório de 2OICh sobre a expressão de produtos do fator de transcrição NF-κB (iNOS e COX-2) em níveis de mRNA e proteína por RT-PCR e western blot.
3. Metodologias Substâncias avaliadas nos ensaios (70 substâncias – 6 grupos) Cultura de células (HepG2, Hepa 1c1c7, MCF-7, MDA-MB-231,
HEK293/luc, RAW 264.7) Citotoxicidade (MTT e SRB) Ensaio do cometa (Eletroforese) Ensaio de apoptose (Hoechst e iodeto de propídio) Ensaio de indução de QR (Redução de MTT) Inibição da aromatase (in vitro) Ensaio de NF-κB/Luciferase (gene relator luc) Ensaio de inibição da produção de nitrito (estímulo com LPS) Análise de expressão de iNOS e COX2 (RT-PCR e western blot) Análise estatística
4. Resultados e discussão
O O
O OH
OH O
O
OH
HO
OH
NH2
OCl
NH
S O
O
O
O
Br
O
OH
OOH
OHO
OH
NH2
NHNH2
N
DOXMCF-7 IC50 = 0,5 ± 0,07 µM
4BFCD = 0,01 µM
NARIC50 = 2,0 ± 0,5 µM
TPCKIC50 = 5,1 ± 1,5 µM
L-NMMAIC50 = 29,5 ± 1,2 µM
Grupos de substânciasO
OH
OH
O RO
OH
OH
O R
OH
OH
O
NH
R
R
R
R
R
R
O
O OH
OH
R
R
R
O
O
R
R
R
R R
R
Derivados do ácido gálico (GA) e ácido protocatecuíco (PA)
Derivados do ácido fenâmico
O
R
R
Derivados da xantona
Derivados da flavona (Fla) e chalcona (Ch)
O
Derivados da (+)-carvona (C+)
N NR
X
R
R
R
alcalóidesguanidínicose bioisóstero
Atividade de substâncias derivadas do ácido gálico e ácido protocatecuíco
Análogos da xantona avaliados nos ensaios:Citotoxicidade por SRB em células MCF-7 e MDA-MB231Inibição de NF-κBInibição do NOInibição de aromataseIndução de QR
OH
OH
OHO
OHOH
OHOH
O
ácido gálico (GA) ácido protocatecuíco (PA)
Atividade de substâncias derivadas do ácido gálico e ácido protocatecuíco
1,1 3,3 10,0 30,0 90,00
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100G4
G5
NAR *
concentração (M)
inib
ição
de
CY
P19
(%
)
Inibição in vitro da enzima aromatase (CYP19) pelas substâncias G4 ( ), ▲ G5 ( ) e ■ NAR (●). Os dados referem-se às médias de dois experimentos independentes e erro padrão (M ± EP); * P<0,05 em relação ao controle (DMSO 0,5%), One-way ANOVA.
O O
OH
OHHO
R
Esterificação foi crucial para atividade
inibitória da aromatase
Lipofilia interfere nessa atividade
↑ da cadeia » ↓ viabilidade celular
Hidroxilas livres não foram essenciaisHidroxilas nas posições 3, 4 e 5 foram essenciais
OH
OH
OHO
OOH
OH
OHO
O
galato de butila (G4)CYP19 IC50 = 34,6 µM
galato de pentila (G5)CYP19 IC50 = 28,1 µM
Relação estrutura atividade inibição de CYP19
1,5 4,4 13,3 40 1200
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100GA
G1
G2
*
*
concentração (M)
inib
ição
de
NF-
B
(%
)
Inibição da atividade de NF-κB ativado por TNFα 50 ng/mL em células HEK293/Luciferase em relação ao controle (DMSO 0,5%), por GA ( ), ▲ G1 ( ) e ■ G2 (●). Os resultados estão expressos como média ± erro padrão (M ± SE) de dois experimentos independentes; * P<0,05 em relação ao controle, One-way ANOVA.
LPS 0,6 1,8 5,6 16,7 50,00.0
2.5
5.0
7.5
10.0LPS
G4
G3
*
*
*
*
*
**
concentração (M)
Co
nce
ntr
ação
de
nit
rito
(
M)
Inibição da produção de NO estimulado por LPS 1 µg/mL, em células RAW 264.7 em relação ao controle (DMSO 0,5%) por G3 e G4. Os resultados estão expressos como média ± erro padrão (M ± SE) de três experimentos independentes; * P<0,05 em relação ao estímulo (LPS 1 µg/mL), One-way ANOVA e pós teste de Tukey
Genotoxicidade do ácido gálico e galato de metila
Ctrl H2O2 0,15 0,45 1,35 4 12 40 0,07 0,22 0,67 2 8 250
50
100
150
GAG1
ácido gálico galato de metila
*
*
concentração (M)
Tai
l mo
me
nt *
Genotoxicidade do ácido gálico (GA) e galato de metila (G1) pelo ensaio do cometa em células HepG2 tratadas por 24h. Ctrl: controle (DMSO 1%); H2O2: peróxido de hidrogênio 100 µM. Os dados referem-se à média da contagem de 50 nucleóides ± erro padrão (M±EP), * P<0,05 em relação ao controle, Kruskal-Wallis com pós-teste de Dunn.
Atividade de substâncias derivadas do ácido fenâmico
OH
O
NH
ácido fenâmico
Análogos da xantona avaliados nos ensaios:Citotoxicidade por SRB em células MCF-7 e MDA-MB231Inibição de NF-κBInibição do NOInibição de aromataseIndução de QR
Atividade de substâncias derivadas do ácido fenâmico
OH
O
NH
O
O
O
AB4inibição de NF-κB: 73,0 ± 5,2%
OH
O
NH
O
O
OO
OAB5inibição de NF-κB: 72,6 ± 1,6%inibição de NO (IC50): 28,2 ± 3,1 µM
Atividade de análogos da xantona
O
O OH
OH
benzoxantona (X9)CD = 41,0 ± 6,1 µM
Análogos da xantona avaliados nos ensaios:Citotoxicidade por SRB em células MCF-7 e MDA-MB231Inibição de NF-κBInibição do NOInibição de aromataseIndução de QR
O
O
xantona
Atividade de (+)-carvona e análogos
Análogos da xantona avaliados nos ensaios:Citotoxicidade por SRB em células MCF-7 e MDA-MB231Inibição de NF-κBInibição do NOInibição de aromataseIndução de QR
(+)-carvona
IR = 1,1O
Atividade de (+)-carvona e análogos
(+)-carvona66,8±4,3%
(-)-carvona61,4±6,1%
epoxido carvona69,7±7,1%
(+)-hidroxicarvona56,4±9,9% (-)-hidroxicarvona
0,0±7,9%
Inibição de NF-κB (%) a 50 µMO O
OO
OO
Atividade de produtos naturais e análogos prenilados
Análogos da xantona avaliados nos ensaios:Citotoxicidade por SRB em células MCF-7 e MDA-MB231Inibição de NF-κBInibição do NOInibição de aromataseIndução de QR O
ONH
N NR
4
R3
R2
R1
Atividade de produtos naturais e análogos prenilados
O
O
OH
Hidroxila livre essencial para indução de QR
6-hidroxiflavona (6Fla )CD = 6,5 ± 0,8 µM
O
O
OH
OH
O
OH
OH
pedalitina (PED)inibição de CYP19
IC50 = 0,3 ± 0,01 µM
Alcalóides guanidínicos de P. nitens e análogo sintético
10 20 30 40 500
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100NTA *
NTB *
NTT *
DOX *
Concentração (M)
cels
. viv
as (
%)
Ensaio de viabilidade celular por MTT em células de HepG2 tratadas por 24h com NTA ( ), ▲NTB ( ), ■ NTT (●) e DOX ( ). Os dados referem-se às médias de três experimentos ♦
independentes e erro padrão (M±EP); * P<0,05 em relação ao controle (DMSO 0,5%), One-way ANOVA e pós-teste de Tukey.
4BF Ctrl 0,6 1,7 5 15 450
1
2
3
4
0
25
50
75
100
125*
concentração de NTT (M)
IR (
trat
ame
nto
/ co
ntr
ole
)ce
lls. vivas
(%)
Indução da enzima quinona-redutase em células Hepa 1c1c7 pela substância NTT (tratamento / controle) e relação com sobrevivência celular (%) pelo ensaio de violeta cristal (●) tratadas por 48h. Os dados referem-se às médias de três experimentos independentes e erro padrão (M ± EP); * P<0,05 em relação ao controle (Ctrl)(DMSO 0,5%), One-way ANOVA e pós-teste de Tukey.
X
NNH
R2 R1
NH > S
R1 = H ou geranila não foi crucial para atividade inibitória da aromatase
bioisósteros
Inibição de CYP19NTA: 67,0 ± 6,7%NTB: 68,2 ± 5,1%
Relação estrutura atividade inibição de CYP19
Indução de apoptose por alcalóides guanidínicos
Ctrl DOX NTA NTB NTT0
10
20
30
40
50
Apoptose total
Necrose
*
*
A
% d
e c
els
. (tr
atam
en
to /
tota
l de
ce
ls.)
Ctrl DOX NTA NTB NTT0
10
20
30
40
50
Apoptose inicial
Apoptose tardia*
B
% d
e c
els
. (tr
atam
en
to /
tota
l de
ce
ls.)
Apoptose pelo ensaio de HO/IP em células HepG2 após tratamento com NTA, NTB e NTT por 24 h. A: Comparação entre apoptose total e necrose. B: Comparação entre apoptose inicial e apoptose tardia. Ctrl: controle (DMSO 0,5%); DOX: doxorrubicina 50 µg/mL. Resultados estão expressos como média de três experimentos independentes ± erro padrão (M±EP). * P<0,05 em relação ao controle, one-way ANOVA e pós-teste de Tukey.
Atividade de chalconas e derivados prenilados
Análogos da xantona avaliados nos ensaios:Citotoxicidade por SRB em células MCF-7 e MDA-MB231Inibição de NF-κBInibição do NOInibição de aromataseIndução de QR
O
R1
R2
Ch: R1 = H, R2 = H2OICh: R1 = O-isoprenila, R2 = H3OFCh: R1 = H, R2 = O-farnesila2OFCh: R1 = O-farnesila, R2 = H
R1 = O-isoprenila pode ↑ efeito indutor de QR
Indução de QR (CD)Ch: N.S.3OFCh: N.S.2OICh: 1,3 µM2OFCh: 14,6 µM
Inibição do NO (CI50)Ch: 50,6% a 50 µM3OFCh: 17,6 µM2OICh: 7,9 µM2OFCh: 7,2 µM
Inibição do NF-κBCh: 22,8 µM3OFCh: 16,2 µM2OICh: 10,8 µM2OFCh: 9,3 µM
O
R1
R2
Ch: R1 = H, R2 = H3OFCh: R1 = H, R2 = O-farnesila2OICh: R1 = O-isoprenila, R2 = H2OFCh: R1 = O-farnesila, R2 = H
Atividade de chalconas e derivados prenilados
LPS 0,6 1,8 5,6 16,7 500
2
4
6
8
10 3OFCh
2OICh
2OFCh
*
*
* *
*
*
concentração (M)
con
cen
traç
ão d
e n
itri
to (
M)
Inibição da produção de NO estimulado por LPS 1 µg/mL, em células RAW 264.7 em relação ao controle (DMSO 0,5%) por 3OFCh, 2OICh e 2OFCh. Os resultados estão expressos como média ± erro padrão (M ± SE) de três experimentos independentes; * P<0,05 em relação ao estímulo (LPS 1 µg/mL), One-way ANOVA e pós teste de Tukey.
5016.75.61.80.60.20
20
40
60
80
100
3OFCh *
2OICh *
2OFCh *
concentração (M)
inib
ição
de
NF-
B
(%
)
Inibição da atividade de NF-κB ativado por TNFα 50 ng/mL em células HEK293/Luciferase em relação ao controle (DMSO 0,5%), por 3OFCh ( ), ▲ 2OICh ( ) e ■ 2OFCh (●). Os resultados estão expressos como média ± erro padrão (M ± SE) de três experimentos independentes; * P<0,05 em relação ao controle, One-way ANOVA e pós-teste de Tukey.
Estudo do mecanismo de ação da 2-O-I-chalcona
iNOS (130 kDa)
COX2(72 kDa)
β-actina (43 kDa)
2OICh (µM)
LPS 1 µg/mL
1.8 5.6 16.7 0 0
++ + + –
Efeito inibitório de 2OICh na expressão de proteína iNOS e COX2 após 20 horas de tratamento.
Conclusões Produtos naturais são uma fonte de moléculas bioativas e
pequenas alterações me suas estruturas podem aumentar consideravelmente a atividade.
↑ cadeia lateral de derivados de GA e PA » ↓ proliferação celular.
GA exerce efeito genotóxico a 12 µM e 40 µM. O G1 não apresenta efeito genotóxico nas concentrações
testadas. G4 apresenta efeito de inibição da aromatase e produção de
nitrito. Supressão da atividade de NF-κB por ésteres de GA pode
desempenhar um papel quimiopreventivo no câncer.
AB4 e AB5, com metoxilas nas posições 4’, 5’ e 6’, apresentam atividade de quimioprevenção do câncer por inibição de NF-κB.
benzoxantona (X9) possui atividade quimiopreventiva induzindo enzima QR em células Hepa 1c1c7.
Alcalóides guanidínicos (NTA e NTB) e bioisóstero (NTT) apresentaram efeito citotóxico em todos os modelos celulares.
NTT induz QR de maneira bifuncional. NTB apresentou indução de apoptose tardia em células
HepG2 após tratamento de 24 horas. Chalconas preniladas possuem efeito de quimioprevenção por
inibição da produção de NO em células estimuladas por LPS e inibição do fator de transcrição nuclear NF-κB ativado.
2-O-isoprenilchalcona é capaz de mediar um grande número de atividades biológicas relevantes para a saúde humana.
Agradecimentos Laboratório de Citologia
• Profa. Dra. Christiane P. Soares• Profa. Dra. Valéria Valente• Roberta A. Duarte, Ph.D.• Maísa Giocondo, M.Sc.• Isabel C. Silva, M.Sc.• Tarsia Giabardo, M.Sc.• Thaís O. R. Falcoski, M.Sc.• Elaine Mello, M.Sc.• Juliana M. Sorbo, M.Sc.• Aline Miranda• Camila Araki• Daniele Agustoni• Felipe O. Souza• Flávio Monteiro• Maria Isabel Feliciano
Instituto de Química de Araraquara (NuBBE)• Profa. Dra. Dulce H. S. Silva• Profa. Dra. Vanderlan S. Bolzani• Luis Octávio Regasini, Ph.D.• Fernando P. Maiello• Maicon S. Petrônio
Laboratório de Farmacognosia• Prof. Dr. André G. Santos• Gabrielle Alexandre
UH Hilo, College of Pharmacy• John M. Pezzuto, Ph.D.• Tamara P. Kondratyuk, Ph.D.• Eun-Jung Park, Ph.D.• Suaib Luqman, Ph.D.• Laura Marler• Beau Rostama• NooJa Acharavadee• Talysa O. Hoover• Elizabeth Ryan
Agencias de fomento à pesquisa• FAPESP (processo n. 2010/12579-5)• CAPES (PDEE n. 0087-11-4)
Mahalo nui loa!