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UNIVERSIDAD VERECRUZANAFACULTAD DE CIENCIAS QUIMICASAPUNTES DE CROMATOGRAFIA
La cromatografía puede definirse como una técnica que separa una mezcla de
solutos basada en la velocidad de desplazamiento diferencial de los mismos
que se establece al ser arrastrados por una fase móvil (líquida o gaseosa) a
través de un lecho cromatográfico que contiene la fase estacionaria, la cual
puede ser líquida o sólida. Las propiedades de los componentes de una mezcla
determinan su movilidad entre sí y con respecto a la fase móvil. La base de la
separación cromatográfica será, por tanto, la diferencia en la migración de los
mismos.
Principios La palabra Cromatografía significa Escribir en Colores, porque cuando fue
desarrollada los componentes separados eran colorantes. Se define como una
técnica o método físico de separación basado en las diferentes velocidades con
que se mueven los solutos disueltos en un disolvente llamado eluente (fase
móvil) a través de un medio estacionario o fijo. Los componentes a separar se
distribuyen entre la fase estacionaria y la fase móvil o fluido que pasa a través
o a lo largo de la fase estacionaria. Como los componentes de la mezcla
presentan diferente tendencia a permanecer en cualquiera de las fases, la
separación se da por el movimiento de la fase móvil en relación con la
estacionaria y de la distribución de las sustancias entre las dos fases. Las
moléculas que "prefieren disolverse" en la fase móvil serán eluídas más rápido
que las que son preferencialmente solubles en la fase estacionaria y que
tienden a quedar retenidas. En resumen se
fundamenta en la separación entre la fase
estacionaria sólida o liquida y la fase móvil liquida o
gaseosa
Los fenómenos rectores del proceso de retención y
separación son la adsorción y la absorción.
El primero queda delimitado a la superficie
interfacial es decir se refiere a la fijación o retención
de la sustancia entre la superficie de las dos fases; se relaciona con fuerzas
químicas y físicas que dependen de la naturaleza de la sustancia absorbida,
temperatura, naturaleza del absorbente y concentración. El segundo fenómeno
determina la retención de una especie química por parte de una masa y
depende de la tendencia que tiene ésta a formar mezcla o reaccionar
químicamente con la misma.
Clasificación de la Cromatografía
Existen muchas maneras de clasificar los métodos cromatográficos, según su
fase móvil se clasifica en Cromatografía de gases que puede ser a través de
dos sistemas, gas- líquido y gas-sólido y Cromatografía líquida donde el
eluente es un líquido y puede ser líquido-liquido, liquido-sólido. Por el
mecanismo de retención-separación, es decir el tipo de equilibrio implicado en
la transferencia de los solutos entre las fases se encuentra la Cromatografía de
reparto, de adsorción y de exclusión. Según la forma de contacto entre las
fases se denomina de columna o superficie plana. También se puede clasificar
teniendo en cuenta la fase estacionaria, la dimensionalidad, escala física y
gradientes.
Técnicas cromatográficas
Según el dispositivo utilizado para conseguir el contacto entre la fase móvil y la
estacionaria, se distinguen dos técnicas:
Columna Se usa un tubo cilíndrico
Plana: El soporte es una placa plana o
los intersticios de un papel
Capa fina
Papel (partición)
Cromatografía en capa fina.
Por este método se pueden analizar mezclas de aminoácidos. La muestra para
análisis se aplica por medio de un tubo capilar en la superficie de una capa fina
adsorbente en forma de banda, punto o mancha y es adsorbida en la superficie
por la acción de fuerzas electrostáticas (Fuerzas de Van der. Waals, puentes
de hidrogeno, efectos inductivos, etc). Los adsorbentes más utilizados son gel
de silica, alumina, tierra silícea, celulosa y poliamidas. Como soportes del
adsorbente se utilizan laminas o placas de vidrio, plásticas o metálicas, algunas
placas tienen indicador de fluorescencia : f254 ó f366.
La placa seca se coloca en el tanque
cromatográfico o cámara, en el cual debe
encontrarse saturado el eluente (Fase Móvil
líquida).El eluente ascenderá o desplazara
por capilaridad en la placa y arrastrará los
componentes a lo largo de ésta produciendo
“manchas” que representan a los
componentes, la separación se da por
migración diferencial, es decir que la fase
móvil arrastra a las substancias apolares y
aquellas más polares son retenidas por la
fase estacionaria dando lugar a la separación.
Posteriormente se evapora el eluente y la placa se analiza por medio de
métodos químicos en el que por inmersión o rociado se obtienen derivados
coloreados o fluorescentes (Adición de Ninhidrina a aminas, Ácido sulfúrico
para carbonizar compuestos orgánicos, etc), o por medio de métodos físicos
ópticos utilizando radiación UV o luz visible.
El análisis es de tipo cualitativo, semicuantitativo o cuantitativo. En el primero
se hacen comparaciones visuales de color e intensidad y propiedades UV entre
otras. En el semicuantitativo se observa diámetro y comparación visual e
intensidad del color de la mancha contra manchas patrones de concentración
conocida. Y en la forma cuantitativa se pueden realizar medidas de transmisión
a través de la sustancia y medidas de emisión o medida de luz reflejada desde
la sustancia, y espectrofotometría por fluorescencia.
Cromatografía en papel. El proceso es básicamente el mismo, solo que se usan tiras de
papel cromatográfico en el tanque cromatográfico.
Cromatografía en Columna.
Se utilizan columnas de vidrio rellenas de Alúmina (Al2O3), Sílica u Oxido de
Magnesio. La fase estacionaria esta constituida por un sólido poroso, el cual
queda soportado en el interior de una columna generalmente fabricada en
plástico o vidrio. La fase móvil se encuentra formada por la solución que
lentamente va atravesando la fase estacionaria. La solución que sale al final de
la columna se reemplaza constantemente por nueva solución que se suministra
desde un contenedor por la parte superior de la columna.
La migración de las sustancias de la mezcla a través de la columna se
encuentra retardada en diferente grado por las interacciones diferenciales que
cada una de ellas pueda ejercer con la fase estacionaria. Las sustancias se
separan gradualmente formando bandas dentro de la banda total, la
separación, y por tanto la resolución, aumenta con la longitud de la columna. La
banda individual de cada sustancia puede ensancharse con el tiempo debido a
procesos difusiónales, disminuyendo por tanto la resolución.
Cromatografía de gases. Se utiliza para la separación de sustancias gaseosas. La Fase Móvil es un Gas
(llamado Gas Portador) y la Fase Estacionaria puede ser un sólido
(Cromatografía Gas-Sólido) o una Película de líquido de alto punto de ebullición
(Generalmente Polietilén-Glicol o Silicón) recubriendo un sólido inerte
(Cromatografía Gas-Líquido). El cromatógrafo de gases esta constituido
normalmente por un suministro y una entrada del gas portador, un puerto de
inyección, una columna normalmente localizada en el interior de una cámara
termostatizada (horno), un detector y un sistema computarizado para analizar,
registrar e imprimir el cromatógrama.
La muestra se introduce a través del sistema de
inyección dentro de la columna que es el sitio donde
ocurre la separación. La columna de aluminio,
acero inoxidable, vidrio o teflón contiene la fase
estacionaria sólida o líquida y esta sujeta a la
superficie por un soporte que es generalmente de
sílice. La fase móvil o gas portador transporta los
componentes de la muestra a través de la columna,
por esta razón debe ser inerte para evitar interacciones con la muestra o la fase
estacionaria, y ser capaz de minimizar la difusión gaseosa. Al final de la
columna existe el detector que permite la detección y cuantificación de las
sustancias, midiendo conductividad térmica y electronegatividad de las
sustancias eluídas. Se produce una señal tipo eléctrico, que posteriormente se
amplifica por un registrador grafico o un integrador permitiendo indicar el
momento en que salen de la columna los componentes. La salida de la
sustancia se registra en un cromatógrama en forma de picos y se determinan
medidas como la altura y el área del pico.
Cromatografía Liquida de alta eficiencia o rendimiento (HPLC).Es una Cromatografía de alta presión es
decir se aplica el flujo a presión (entre 1500
a 2200 psi). El tamaño de partícula es entre
3 y 10 micras, la longitud de la columna es
entre 5 y 25 cm. y requiere de equipo
sofisticado. Se pueden analizar muestras
proteicas. La reducción del tiempo en que la sustancia se encuentra en el
interior de la columna, limita el ensanchamiento por difusión de las bandas,
aumentando por tanto la resolución.
El sistema HPLC requiere una mezcladora de solventes, un inyector, y una
bomba que inyecte el líquido a la columna. Generalmente las columnas de
sílica requieren alta presión para que el flujo de líquido sea adecuado, la
mezcladora se requiere para variar la proporción de solvente en la fase móvil y
el inyector permite la aplicación de la muestra. A la salida de la columna se
coloca un detector generalmente de absorción ultravioleta o de fluorescencia y
si se desea recuperar las moléculas que eluyen de la columna, se requiere un
colector.
En los sistemas modernos el análisis de la información obtenida se realizan
mediante una computadora acoplada al equipo; lo que permite estandarizar la
cromatografía, identificar la naturaleza los picos eluídos y cuantificar su
contenido. Los picos se relacionan según su "tiempo de retención" con
estándares, que permiten identificar los aminoácidos presentes en la mezcla.
La cantidad relativa de cada uno de ellos se determina calculando el área la
curva del pico correspondiente.
Cromatografía de intercambio iónico.
La Fase Estacionaria es
una resina de intercambio
iónico que contiene grupos
cargados, teniendo la
propiedad de separar
especies ionizadas
(Cationes o Aniones); la
Fase Móvil es
generalmente una solución amortiguadora de pH. En proteínas la cromatografía
de intercambio iónico se basa en las diferencias en signo y magnitud de la
carga eléctrica neta de las proteínas a un valor de pH determinado. La afinidad
de cada proteína a los grupos cargados de la columna esta influenciada por el
pH y por la concentración de iones en solución (concentración salina) que
compiten con la proteína en la interacción con la matriz. La separación de la
proteína de la matriz cargada puede obtenerse gradualmente cambiando el pH
y/o la concentración salina de la fase móvil, de tal forma que se genere un
gradiente de concentración.
Cromatografía por Permeabilidad en Gel.Es útil para la separación de proteínas.
La Cromatografía de exclusión molecular, también llamada de filtración en gel,
separa en función de su tamaño. La matriz de la columna esta formada por un
polímero entrecruzado con poros de tamaños determinados. Las proteínas de
mayor tamaño migran más deprisa a lo largo de la columna que las de pequeño
tamaño, debido a que son demasiado grandes para introducirse en los poros
de las bolas de polímero y por tanto siguen una ruta más corta y directa a lo
largo de la longitud de la columna. Las proteínas de menor tamaño, entran en
los poros y su marcha a lo largo de la columna es más lenta.
Cromatografía de Afinidad. La Cromatografía de Afinidad permite la separación de mezclas proteicas por
su afinidad o capacidad de unión a un determinado ligando. En este caso, las
proteínas que se retienen en la columna son aquellas que se unen
específicamente a un ligando que previamente
se ha unido covalentemente a la matriz de la
columna. Después de que las proteínas que no
se unen al ligando son lavadas o eluidas a
través de la columna, la proteína de interés que
ha quedado retenida en la columna se eluye o
libera mediante el empleo de una solución que
contiene bien ligando libre u otro compuesto que
rompa la interacción entre el ligando y la
proteína.
Cromatografía de afinidad
Se trata de un tipo especial de cromatografía de adsorción sólido-líquido en la
que la sustancia de naturaleza bioquímica (anticuerpos, cofactores, inhibidores
enzimáticos, lectinas y otras moléculas) denominadas ligandos de afinidad y
enlazados químicamente en soportes sólidos adecuados, retienen a los solutos
(analitos), también de naturaleza bioquímica, de manera reversible y selectiva.
Las separaciones se basan en el acoplamiento ¨llave-cerradura¨ típico de la
biología molecular.
Fundamento de la cromatografía de afinidad
En la figura se muestra de forma esquemática el fundamento de las
separaciones mediante cromatografía de afinidad. Un volumen no
excesivamente grande de muestra de naturaleza biológica se introduce en la
columna que contienen un soporte polimérico inerte que retienen a la sustancia
activa enlazado covalentemente y que se denomina ligando de afinidad. Sólo
existe interacción específica entre este ligando y un soluto-analito (proteína) de
la muestra insertada que queda retenido (adsorbido). Se procede a la elución
de los demás componentes de la muestra mediante una primera fase móvil que
no influye en el acoplamiento. A continuación se introduce una nueva fase
movil que desactiva el acoplamiento por alteración reversible de los sitios
activos del inhibidor-ligando, del soluto (proteína) o de ambos; generalmente se
utiliza un cambio de pH que modifica las características de los sitios activos; se
eluye así el soluto de interés. Una vez finalizada la separación, se procede a la
regeneración de la columna, lo que generalmente se hace mediante el empleo
de la primera fase móvil y constituye una etapa rápida.
La cromatografía de afinidad tiene una serie de características generales que la
distinguen de otros tipos de cromatografía líquidas
Alta selectividad en el mecanismo de retención
Campo de aplicación restringido
Separación de un solo soluto analito
Empleo de sistema de baja presión
Columnas cortas de escasa eficacia cromatográfica
Ligandos de afinidad
Son las moléculas bioquímicas que se encuentran ancladas químicamente sobre el
soporte sólido inerte, y son las responsables de la adsorción específica de los solutos-
analitos. Pueden considerarse dos clasificaciones de los mismos: Según su naturaleza,
pueden ser macromoléculas biológicas o bien moleculas de bajo peso molecular de
biomoléculas pequeñas o macromoléculas bioquímicas, respectivamente. Y según su
actuación. Que se fundamenta en la selectividad en la retención que condiciona las
características de la cromatografía de afinidad; se distinguen dos grandes grupos:
Ligandos específicos , como los anticuerpos , que se enlazan reversiblemente a un solo
soluto, y los ligandos generales enlazados con un determinado grupo de compuestos
bioquímicos, como las lectinas y nucleótidos.
Tipos de cromatografía
Naturaleza de fase estacionaria
Naturaleza de fase
estacionaria
Sólido Adsorción
Exclusión
Cambio iónico
Afinidad
Líquido Partición
Naturaleza de fase
móvil
Liquido Líquido-líquido ((partición)
Líquido-sólido)adsorción, cambio iónico,
exclusión, Afinidad.
Gas Gas-líquido (CGL)
Gas-sólido (CGS)
Esquema de un cromatograma de afinidad.
Soportes El material sobre cuya superficie activada se establece el enlace covalente con
el ligando de afinidad. Debe poseer propiedades como tener una gran
superficie, tamaño del grano controlable, porosidad controlable, carácter
suficientemente hidrofílico para evitar adsorciones no específicas de proteínas
u otras moléculas, estabilidad mecánica, en especial para trabajar a alta
presión.
El material utilizado generalmente para el soporte son geles orgánicos
derivados de los polisacáridos como la agarosa (sepharosa), polímeros de
acrilamida, fractogel TSK y sílices CPG.
Inmovilización de ligandos
La inmovilización de los ligandos de afinidad es un proceso complejo que en
cada caso tiene connotaciones específicas.
El general, los ligandos de afinidad se inmovilizan mediante el establecimiento
de enlaces químicos covalente con el soporte sólido activado y un grupo
reactivo del ligando que esté lo más lejos posible de la zona activa de
bioadsorción.
El objetivo de la inmovilización consiste en obtener una capa estable y densa
del ligando bioquímico que conserve su actividad específica con plenitud.
La inmovización del ligando de afinidad se realiza en general mediante dos
etapas secuenciales:
Activación del soporte, que consiste en el ataque químico con diferentes
reactivos de la superficie de los soportes antes mencionados, que
secaracterizan por poseer grupos hidroxilos superficiales. De la gran variedad
de procedimientos el más común es el ataque con bromuro de cianógeno sobre
la matriz de polisacárido. Según el pito de matriz se originan grupos diferentes:
ésteres cianato en agarosa e imidocarbonatos en dextranos, según reacciones
uno o dos grupos hidroxilos de la matriz. Esta etapa produce en un disolvente
orgánico o en mezclas con agua. Luego sigue el anclaje químico del ligando
que se da mediante la reacción de grupos amino del mismo, fundamentalmente
con el soporte activado.
Metodos de elusiónSegún la naturaleza de los ligandos de afinidad y la de los solutos-analitos, y
teniendo en cuanta la forma de eliminar los solutos de la columna, cave
distinguir los procedimientos generales de elución como: Elución bioespecífica:
La fase móvil desplazante contiene a un modificador (generalmente llamado
inhibidor) que en realidad se trata de un ligando de afinidad no ligado de bajo
peso molecular que interacciona con el sitio activo de la macromolécula
biológica que puede ser soluto-analito o bien el ligando de afinidad para solutos
de bajo peso molecular, produciéndose en todos los casos una elución por
desplazamiento o competencia entre los componentes de bajo peso molecular
ligados o no, con el sitio activo de la macromolécula biológica ligada o libre. Se
distinguen 2 tipos de elución bioespecífica la normal y la invertida.
La elución normal se basa en la interacción inhibidor-analito, que es la situación
más frecuente. El analito es una biosustancia macromolecular que es retenida
por un ligando de afinidad de bajo peso molecular, y eluida con un inhibidor que
es también de bajo peso molecular y que tiene preferencia por el sitio activo del
analito, por lo que es retirada del sólido y eluida. Ejemplo, la purificación de la
lectina.
La elución invertida, se basa en la interacción inhibidor-ligando de afinidad. El
cual es una biomacromolécula que retienen específicamente el analito. La
presencia del inhibidor en la fase móvil provoca un desplazamiento análogo al
anterior y se eluye el analito. Se usa lectina para purificar glucoproteína.
En la elución no bioespecífica, la fase móvil provoca la denaturación del ligando
inmovilizado, del soluto-analito o de ambos mediante el cambio suave y
reversible de los correspondientes sitios activo, de tal manera que se
interrumpe la adsorción bioespecífica mediante eliminación de una o varias de
las causas que la provocan.
NOMENCLATURA IUPAC PARA CROMATOGRAFIA TERMINO
Cromatografía. La cromatografía es un método físico de separación en el que
los componentes a separar se distribuyen entre dos fases, una de las cuales
está en reposo (fase estacionaria) mientras que la otra (fase móvil) se mueve
en una dirección definida.
Cromatógrafo. El instrumento empleado para realizar una separación
cromatográfica.
Cromatógrama. Una gráfica u otro tipo de presentación de la respuesta de un
detector, la concentración de un analito en el efluente u otra magnitud usada
como medida de la concentración en el efluente, frente al volumen de efluente
o al tiempo. En la cromatografía plana, "cromatógrama" puede referirse al papel
o capa con las zonas separadas.
Fase Ligada. Una fase estacionaria que está unida de forma covalente a las
partículas de soporte o a la pared interior de la columna.
Fase Inmovilizada. Una fase estacionaria que está inmovilizada sobre las
partículas del soporte o sobre la pared interior de la columna, por ejemplo por
polimerización in situ (entrecruzamiento químico) tras un recubrimiento.
Fase Móvil. Fluido que se filtra a través o a lo largo del lecho estacionario, en
una dirección definida. Puede ser un líquido (Cromatografía Líquida), un gas
(Cromatografía de Gases) o un fluido supercrítico (Cromatografía con Fluido
Supercrítico). En la cromatografía de gases se uede usar la expresión Gas
Portador para la fase móvil. En la cromatografía de elución se usa también para
la fase móvil la expresión Eluyente.
Eluir. Aplicar la cromatografía de elución. El proceso de elución se puede
detener mientras todos los componentes de la muestra están aún en el lecho
cromatográfico, o continuarse hasta que lo hayan abandonado. Nota: Se
prefiere el término "Eluir" a "Desarrollar", término usado en nomenclaturas
anteriores de cromatografía plana.
Efluente. La fase móvil que abandona la columna.
Muestra. Mezcla consistente en cierto número de componentes, cuya
separación se pretende en el lecho cromatográfico al ser arrastrados o eluidos
por la fase móvil.
Componentes de la Muestra. Los constituyentes químicamente puros de la
muestra. Pueden no ser retenidos por la fase estacionaria (es decir, no
retardados), retenidos parcialmente (es decir, eluidos a tiempos diferentes) o
retenidos permanentemente. Se aceptan también los términos Eluito y Analito
para un componente de la muestra
Métodos principales
Cromatografía Frontal: Procedimiento en el que la muestra (líquida o gaseosa)
se alimenta de forma continua al lecho cromatográfico. No se utiliza ninguna
fase móvil adicional
Cromatografía de Desplazamiento: Procedimiento en el cual la fase móvil
contiene un compuesto (el desplazarte) que es retenido más fuertemente que
los componentes de la muestra analizada. La muestra se alimenta al sistema
en forma discreta, como una pequeña cantidad en un intervalo breve.
Cromatografía de Elusión: Procedimiento en el que la fase móvil se pasa de
forma continua a través o a lo largo del lecho cromatográfico y la muestra se
suministra al sistema de forma discreta, como una pequeña cantidad en un
tiempo breve.
Clasificación de acuerdo al lecho cromatografico
Cromatografía en Columna: Técnica de separación en la que el lecho
estacionario está contenido dentro de un tubo. Las partículas de fase
estacionaria sólida, o de soporte recubierto con una fase estacionaria líquida,
pueden llenar por completo el tubo (Columna Empaquetada) o estar
concentradas sobre o a lo largo de su pared interna, dejando una ruta abierta,
no restringida, para el paso de la fase móvil por el centro del tubo (Columna
Tubular Abierta).
Cromatografía plana: Técnica de separación en la que la fase estacionaria está
en forma de plano o sobre un plano. Éste puede ser un papel, que sirva como
tal o que esté impregnado con una sustancia que actúe de fase estacionaria
(Cromatografía en Papel), o una capa de partículas sólidas extendida sobre un
soporte, tal como una placa de vidrio (Cromatografía en Capa Fina, TLC). A
veces a la cromatografía plana se la llama también Cromatografía de Lecho
Abierto.
Literatura recomendada
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