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Astride Euridice Correia Rodrigues

Desenvolvimento de um Mtodo Voltamtrico

para a Avaliao do Crescimento Microbiano

Universidade do Minho Braga, 2002

Astride Euridice Correia Rodrigues

Desenvolvimento de um mtodo voltamtrico

para a avaliao do crescimento microbiano

Dissertao apresentada para a

obteno do grau de Mestre em

Cincias pela Universidade do Minho

Universidade do Minho

Braga, 2002

ndice

ndice

Agradecimentos v

Sumrio vii

Abstract ix

Objectivo xi

Smbolos e abreviaturas xiii

Captulo I Introduo

1. Consideraes gerais sobre electroqumica 3

1.1. Caractersticas dos microelctrodos 4

1.1.1.Transporte de massa 5

1.1.2. Queda hmica 6

1.1.3. Corrente capacitiva 8

1.2. Tcnicas electroqumicas 9

1.2.1. Voltametria de varrimento linear em estado estacionrio 9

1.2.2. Voltametria de onda quadrada 13

1.2.3. Aplicaes das tcnicas voltamtricas com microelctrodos 16

1.3. Reduo electroqumica de cidos fracos 18

2. Consideraes gerais sobre microrganismos 21

2.1. Fundamentos do crescimento microbiano: cintica do crescimento em

sistema fechado

26

2.2. Tcnicas para a avaliao do crescimento microbiano 29

Captulo II Parte Experimental

1. Instrumentao 33

2. Estudos electroqumicos 35

2.1. Material de vidro: descrio e limpeza 35

2.1.1. Clulas 35

Desenvolvimento de um Mtodo Electroqumico para a Avaliao do Crescimento Microbiano

i

ndice

2.1.2. Limpeza do material de vidro 36

2.2. Elctrodos 36

2.2.1. Elctrodos de referncia 36

a) Elctrodo de calomelanos saturado 37

b) Elctrodo de prata-cloreto de prata 38

2.2.2. Microelctrodos 39

a) Construo 39

b) Calibrao 41

c) Limpeza 41

2.3. Procedimento experimental 42

2.3.1. Voltametria de varrimento linear em estado estacionrio 42

2.3.2. Voltametria de onda quadrada 43

2.4. Estimativa das incertezas experimentais 43 3. Estudos microbiolgicos 47

3.1. Microrganismos 47

3.2. Meios de cultura 47

3.2.1. Meio de manuteno 47

3.2.2. Meio de crescimento 47

3.3. Condies de crescimento 49

3.4. Avaliao do crescimento por turbidimetria 50

3.5. Anlise electroqumica de culturas de clulas 50

3.6. Estudo de suspenses de clulas 50

4. Estudos cromatogrficos 53

4.1. Instrumentao 53

4.2. Preparao da fase mvel 53

4.3. Preparao das amostras 54

4.4. Condies experimentais 54

4.5. Mtodo analtico

54

Desenvolvimento de um Mtodo Electroqumico para a Avaliao do Crescimento Microbiano ii

ndice

Captulo III Apresentao e Discusso dos Resultados

1. Respostas voltamtricas em diferentes meios de cultura e em suspenses de

clulas

59

1.1. Caracterizao dos meios de cultura 59

1.2. Linearidade e limite de quantificao dos mtodos 64

1.2.1. Meio K 64

1.2.2. Meio contendo 0,5 % de etanol 71

1.2.3. Meio contendo 0,5 % de cido lctico 73

1.3. Anlise comparativa dos resultados 77

1.3.1. Efeito da dimenso do microelctrodo 77

1.3.2. Voltametria de varrimento linear versus voltametria de onda

quadrada

81

1.3.3. Mtodos voltamtricos versus mtodo turbidimtrico 84

2. Anlise voltamtrica da cultura de clulas ao longo do tempo 89

2.1. Meio K 89

2.2. Meio contendo 0,5% de etanol 103

2.3. Meio contendo 0,5% de cido lctico 110

3. Anlise Cromatogrfica 117

3.1. Anlise de nutrientes e possveis metabolitos celulares por HPLC 117

3.2. Determinao de nutrientes e metabolitos celulares nas culturas de

leveduras

119

3.2.1. Meio K 119

3.2.2. Meio contendo 0,5 % de etanol 125

3.2.3. Meio contendo 0,5% de cido lctico 128

Captulo IV Concluso

135

Captulo V Bibliografia 139


iii

Agradecimentos

Agradecimentos

O trabalho experimental desenvolvido e do qual resultou esta tese foi realizado nos

Departamentos de Qumica e de Biologia da Universidade do Minho. Ao finalizar este trabalho

so muitas as pessoas a quem quero agradecer por, directa ou indirectamente, me terem apoiado

nesta tarefa.

s Doutoras Dulce Geraldo e Ftima Bento que sempre me acompanharam, desejo

expressar a minha gratido pelo empenho com que sempre estiveram envolvidas neste trabalho,

orientando-me e dando-me sugestes que em muito contriburam para o meu enriquecimento.

Agradeo ainda o carinho, apoio e incentivo que sempre me deram. Muito obrigado por tudo

Professoras.

Doutora Fernanda Cssio do Departamento de Biologia agradeo a orientao, o

interesse, o empenho e o carinho sempre demonstrados no decorrer de todo o trabalho.

A todos os elementos do grupo da Doutora Fernanda agradeo a ajuda indispensvel na

parte experimental que envolvia o manuseamento dos microorganismos, uma rea nova para

mim.

Ftima agradeo todo o apoio e as palavras amigas que me incentivaram em

momentos mais difceis.

s meninas do laboratrio agradeo a pacincia que tiveram para me ouvir em

momentos menos bons, o carinho e a boa disposio sempre demonstrados. Quero ainda

agradecer de uma forma especial Carla Rodrigues que me acompanhou em muitas madrugadas

no laboratrio, a sua disponibilidade, o carinho e o apoio que sempre me deu.

A todos os meus colegas do Mestrado, e de uma forma muito especial Romi, Anabela e

Carla Canhoto agradeo o auxlio e a amizade.

Aos Docentes e funcionrios do Departamento de Qumica quero agradecer o apoio

sempre prestados.

A toda a minha famlia e de uma forma especial minha av agradeo todo o apoio que me deram. A ti Ismael, obrigada pela pacincia e compreenso que tiveste, principalmente na fase

final deste trabalho.

A vocs, meus pais, que sempre confiaram em mim e estiveram sempre presentes

obrigado por tudo.


v

Sumrio

Sumrio

O crescimento microbiano ocorre com o consumo das fontes de energia presentes

no meio e a libertao de metabolitos para o meio extracelular. A variao da

concentrao destas espcies serviu de base para o desenvolvimento de um mtodo

electroqumico de avaliao do crescimento de leveduras.

As espcies utilizadas neste estudo foram a Candida utilis e Saccharomyces

cerevisiae em meios contendo diferentes fontes de carbono e energia: glucose, etanol e

cido lctico.

Os voltamogramas registados nos diferentes meios de cultura apresentaram sinais

bem definidos cujas intensidades de corrente variaram ao longo do tempo. Os resultados

obtidos por voltametria de varrimento linear (LSV) e voltametria de onda quadrada

(SWV), foram semelhantes. Os valores de intensidade de corrente corrente de pico (para

SWV) e corrente limite (para LSV) nas culturas de clulas foram comparveis aos

correspondentes valores de densidade ptica, em termos da sua variao ao longo do

tempo. Estes resultados apresentam uma tendncia similar quando so representados

como curvas de crescimento. Com base no mtodo proposto foi possvel estimar taxas de

crescimento comparveis s obtidas por turbidimetria.

O mtodo proposto foi caracterizado tendo em vista o estabelecimento do

intervalo de aplicabilidade, e os efeitos da variao da dimenso do microelctrodo e da

tcnica voltamtrica.

A anlise por cromatografia de HPLC das solues sobrenadantes permitiu o

estabelecimento de correlaes entre as concentraes de nutrientes e a intensidade de

corrente medida ao longo do tempo.


vii

Abstract

Abstract

Microbial growth is accomplished by the consumption of nutrients and by the

release of metabolites into the extracellular media. Based on changes in the concentration

of electroactive species, an electrochemical method is proposed to evaluate microbial

growth.

The yeasts Candida utilis and Saccharomyces cerevisae grown in liquid media

containing either glucose, ethanol or lactic acid as carbon and energy sources were used. The voltammograms obtained in the different growth media displayed well-

developed responses which current intensity varies along time. Similar results were

reached with either linear sweep voltammetry (LSV) or sqware wave voltammetry

(SWV). The current intensity values peak current (for SWV) and limiting current (for

LSV) in the growing cultures were comparable to the corresponding optical densities, in

terms of their variation along time. These data displayed similar trends when plotted as

growing curves. For both yeast species, the growth rates estimated with the

electrochemical method were similar to those obtained by the optical method.

The proposed method was characterized by evaluating the applicability range and

the effects of the microelectrode dimension and the voltammetric technique. During the growth of the yeasts, samples of the spent growth media were analysed

by HPLC and the nutrient/ metabolite concentrations were related to the intensity

currents.


ix

Objectivo

Objectivo

A turbidimetria figura entre os mtodos mais amplamente utilizados para a

avaliao do crescimento microbiano em meio lquido. No entanto, a utilizao deste

mtodo est restrita a populaes de clulas que se desenvolvem formando suspenses

homogneas. No caso de espcies microbianas que formam filamentos ou agregados

celulares, tal como os fungos filamentosos, necessrio desenvolver mtodos igualmente

expeditos que permitam avaliar o crescimento das populaes. A utilizao de mtodos electroqumicos recorrendo a microelctrodos permite

detectar e quantificar espcies electroactivas num vasto conjunto de condies

experimentais, nomeadamente em meios complexos como os normalmente utilizados para

o cultivo de microrganismos.

Durante o crescimento microbiano ocorre o consumo dos nutrientes presentes no

meio e a excreo de compostos resultantes do metabolismo dos microrganismos. Se a

concentrao dessas espcies ao longo do crescimento microbiano se relacionar com a

biomassa celular presente, a quantificao dessas espcies poder servir de base ao

desenvolvimento de um mtodo alternativo que possibilite a avaliao do crescimento

microbiano, independentemente do grau de homogeneidade da cultura. Pretende-se com este mtodo que as anlises nas culturas sejam rpidas, de

simples manipulao e isentas de qualquer tipo de tratamento prvio das amostras. A validao deste mtodo ser efectuada com base em estudos de crescimento de

leveduras que metabolizam a fonte de carbono e energia atravs de mecanismos

diferentes respirao e fermentao em meios contendo, como fonte de carbono e

energia, espcies de natureza qumica diferente glucose, etanol e cido lctico.


xi

Smbolos e Abreviaturas

Smbolos e Abreviaturas Smbolos Romanos Smbolo Significado / Unidade usual

A rea ou absorvncia

a ordenada na origem da recta de calibrao Aa rea do pico relativa arabinose AN absorvncia normalizada AP rea do pico relativa soluo padro b declive da recta de calibrao Cd capacidade da dupla camada CHA concentrao analtica do cido molecular (M) CP concentrao analtica da soluo padro (M) Cpi concentrao da soluo de padro interno (M) CO concentrao inicial da espcie O (M)

'OC concentrao da espcie O no seio da soluo (M)

D coeficiente de difuso (cm2s-1) DH+ coeficiente de difuso do io hidrognio (cm2s-1) DHA coeficiente de difuso do cido molecular (cm2s-1) DO coeficiente de difuso da espcie O (cm

2s-1) DR coeficiente de difuso da espcie R (cm

2s-1) E potencial aplicado (V) Ef potencial final (V) Ei potencial inicial (V)


xiii

Smbolos e abreviaturas

E0 potencial padro de reduo (V)

E1/4 potencial para qual a intensidade de corrente da intensidade de

corrente mxima (V) E3/4 potencial para qual a intensidade de corrente da intensidade de

corrente mxima (V) ESW meia amplitude de patamar em patamar em SWV (mV) f frequncia (s-1) F constante de Faraday (96 480 C mol-1) fd factor de diluio fP factor de resposta da soluo padro fPi factor de resposta da soluo de padro interno g factor de convergncia I intensidade de corrente (A) Ic intensidade de corrente capacitiva (A) Id intensidade de corrente directa ou

intensidade de corrente de difuso (A) If intensidade de corrente faradaica (A) i intensidade de corrente inversa (A) L intensidade de corrente limite (A) LN intensidade de corrente limite normalizada (A m-1) p intensidade de corrente de pico (A) pN intensidade de corrente de pico normalizada I intensidade de corrente diferencial ou

variao da intensidade de corrente relativamente ao valor de referncia (A)

pI variao da intensidade de corrente de pico (A)


xiv


IN variao da intensidade de corrente relativamente ao valor de referncia normalizada

Es incremento em potencial em tcnicas de impulso (V) k coeficiente turbidimtrico (cm-1 M-1) kc taxa especfica do crescimento (h-1) kd constante de velocidade heterognea da reaco directa (cm s-1) ki constante de velocidade heterognea da reaco inversa (cm s-1) l percurso ptico (cm) m nmero de rplicas do sinal medido numa amostra n nmero de rplicas ou

nmero de pontos experimentais nas rectas O espcie oxidada OS espcie O junto superfcie do elctrodo O espcie O no seio da soluo q carga da dupla camada r distncia medida desde o centro de uma esfera ou

coeficiente de correlao linear R resistncia da soluo ou

espcie reduzida ra distncia entre um elctrodo de trabalho de disco e um elctrodo de

referncia rd raio do microdisco re raio do elctrodo esfrico ou hemisfrico RS concentrao da espcie R junto superfcie do elctrodo R concentrao da espcie R no seio da soluo s desvio padro


xv

Smbolos e abreviaturas

sa desvio padro da ordenada na origem da recta de regresso linear sb desvio padro do declive da recta de regresso linear sy/x desvio padro dos pontos experimentais y recta de regresso

0xs desvio padro relativo s concentraes determinadas por interpolao numa recta de calibrao

S turbidncia t tempo (s) ou parmetro t na distribuio de student T transmitncia tD tempo de duplicao da densidade populacional (h) tm instante em que se efectua a medio (s) tp largura de cada impulso (s) tr tempo de reteno (min.) v velocidade de varrimento X densidade populacional Xt densidade populacional no tempo t X0 densidade populacional no tempo zero xi valor da rplica i x mdia aritmtica


xvi


Smbolos Gregos Smbolo Significado / Unidade usual

parmetro adimensional dado por DO/re2 parmetro adimensional constante na equao 1.18 parmetro adimensional constante na equao 1.20 condutividade da soluo (S cm-1) perodo de onda (s-1)

Abreviaturas Smbolo Significado

ECS elctrodo de calomelanos saturado l.d.d limite de deteco l.d.l limite de linearidade l.d.q limite de quantificao LSV voltametria de varrimento linear SWV voltametria de onda quadrada


xvii

Captulo I

Introduo

Introduo Captulo I

1. Consideraes gerais sobre electroqumica

A Qumica uma cincia central estabelecendo interfaces com a Biologia, a

Fsica, a Geologia, a Matemtica entre outras. Destas interfaces desenvolveram-se reas

de conhecimento de grande importncia tais como a Bioqumica, a Qumica-Fsica, a

Qumica Inorgnica, a Qumica Terica e a Qumica Analtica. O presente trabalho

insere-se na rea de Qumica Analtica, mais precisamente na aplicao da electroanlise

em sistemas biolgicos.

A electroqumica estuda fenmenos associados a processos de separao de

cargas que conduzem, na maior parte dos casos, transferncia de carga que podem

ocorrer numa nica fase (transferncia homognea) e entre diferentes fases (transferncia

heterognea).

As tcnicas electroqumicas podem classificar-se em dois grupos. No primeiro, a

intensidade de corrente nula e corresponde s tcnicas potenciomtricas. No segundo, a

intensidade de corrente pode variar durante a experincia, ou mesmo ser constante, como

por exemplo, a amperometria e a coulometria. No trabalho experimental realizado foram

utilizadas tcnicas amperomtricas, nomeadamente, a voltametria de varrimento linear e a

voltametria de onda quadrada.

Nas tcnicas voltamtricas registada a intensidade de corrente em funo do

potencial aplicado, obtendo-se voltamogramas a partir dos quais possvel identificar as

espcies electroactivas e determinar as suas concentraes. O potencial aplicado a um

elctrodo de trabalho de dimenses reduzidas e a intensidade de corrente registada

normalmente baixa, na ordem dos A. As duas tcnicas voltamtricas utilizadas sero referidas nas seces 1.2.1 e 1.2.2.


3

Captulo I Introduo

A utilizao de elctrodos com reduzidas dimenses designados na literatura por

microelctrodos ou ultramicroelctrodos, confere s tcnicas electroqumicas diversas

vantagens, tais como elevada sensibilidade e baixos limites de deteco.

1.1. Caractersticas dos microelctrodos

A denominao de microelctrodos est associada sua pequena dimenso, sendo

no entanto difcil estabelecer limites numricos, na prtica estes devero apresentar uma

dimenso que varie entre 0,1 a 50 m. Os microelctrodos apresentam uma resposta voltamtrica estacionria quando

sujeitos a perturbaes elctricas suficientemente longas, isto , respostas que so

independentes do tempo. Este estado estacionrio que teoricamente nunca atingido, na

prtica pode ser obtido com microelctrodos. Em estado estacionrio as concentraes na

vizinhana do elctrodo no variam com o tempo, devido ao transporte de massa ser

muito efectivo [1]. Quando se utilizam microelctrodos em solues contendo uma concentrao

elevada de electrlito suporte, o transporte das espcies electroactivas para a sua

superfcie assegurado pela difuso convergente e a intensidade de corrente

directamente proporcional menor dimenso do elctrodo. A camada de difuso de

estado estacionrio semelhante em termos de grandeza fsica s dimenses do

microelctrodo que por sua vez dever ser inferior espessura da camada estagnante, para

que as concentraes no sejam significativamente afectadas pela conveco natural [2].

Os microelctrodos podem apresentar geometrias diferentes tais como esfrica,

hemisfrica, de disco, de anel e de fio (figura 1.1), e por conseguinte obter-se geometrias

de difuso diferente [3].

Desenvolvimento de um Mtodo Electroqumico para a Avaliao do Crescimento Microbiano 4

Introduo Captulo I

Elctrodo planar semi - infinito

Elctrodo hemisfrico Elctrodo de disco

Elctrodo de anel

Elctrodo esfrico

Elctrodo de fio

Figura 1.1 Representao esquemtica de microelctrodos com geometrias mais usuais e respectivos fluxos difusionais

As caractersticas anteriormente enumeradas que valorizam a utilizao dos

microelctrodos em Qumica Analtica, so consequncias das suas propriedades

intrnsecas de transporte de massa, queda hmica e intensidade de corrente capacitiva,

que so apresentadas em seguida.

1.1.1. Transporte de massa

Numa voltametria, processo durante o qual ocorre uma electrlise, verifica-se um

gradiente de concentrao junto ao elctrodo, provocado pelo consumo de espcies

electroactivas. Ainda que exista uma agitao mecnica muito forte na soluo, junto ao

elctrodo existe sempre uma camada em que a soluo no homognea. A difuso

ocorre como resultado do gradiente de concentrao tendendo a elimin-lo.

A difuso o processo de transporte de massa mais importante, podendo no

entanto ocorrer associado a este, outros tais como a conveco e a migrao.

A conveco pode ocorrer naturalmente devido temperatura na soluo,

ocorrncia de vibraes e a gradientes de densidade associados reduo electroqumica.

Este processo est associado ao movimento de volumes reduzidos de soluo, que

transportam os ies ou as molculas das espcies activas, assim como dos electrlitos. Os

fluxos devidos conveco predominam no seio da soluo e tendem para zero

superfcie do elctrodo.


5

Captulo I Introduo

A migrao o movimento de partculas carregadas, devido existncia de um

campo elctrico. Pode-se minimizar a migrao das espcies electroactivas atravs da

adio de um excesso de electrlito que assegura a electroneutralidade junto do elctrodo

onde ocorre a reaco de reduo ou oxidao.

Numa experincia de cronoamperometria em condies de controlo por difuso,

isto , quando a concentrao das espcies que sofrem electrlises nula superfcie do

microelctrodo, a intensidade de corrente pode ser calculada com base na segunda lei de

Fick nas coordenadas mais adequadas geometria do elctrodo.

Para tempos elevados de perturbao a difuso para a periferia dos

microelctrodos tende a ser mais significativa, estando na origem das elevadas densidades

de corrente observadas nos microelctrodos comparativamente s relativas aos elctrodos

de maiores dimenses.

1.1.2. Queda hmica

A queda hmica um processo que resulta da utilizao de uma fraco RI do

potencial aplicado por qualquer corrente que flui numa clula, em que I a intensidade de

corrente e R a resistncia da clula. Como consequncia deste processo as respostas

experimentais so normalmente distorcidas, sendo importante usar condies em que o

factor RI seja normalmente inferior a 1 mV. Este facto significa que experincias

realizadas em intervalos de tempo curtos, em solues cuja concentrao de espcie

electroactiva elevada ou em meios resistivos originam respostas distorcidas no

permitindo uma anlise correcta dos resultados.

Quando so usados microelctrodos a queda hmica reduzida devido s baixas

intensidades de corrente medidas (na ordem dos nanoamperes), mesmo em solues de

elevada concentrao de espcie electroactiva.

Com microelctrodos normalmente usa-se uma clula de dois elctrodos. A

distribuio primria de corrente numa clula em que ambos os elctrodos so de disco

cilndrica [4], neste caso a resistncia da soluo contida entre os dois elctrodos dada

por:


Introduo Captulo I

= ae r

1r1

41R (1.1)

onde a condutividade da soluo, o raio do elctrodo de trabalho e a

distncia que separa os dois elctrodos. Quando os elctrodos de trabalho utilizados so

microelctrodos,

Captulo I Introduo

directamente atravs de um gerador de ondas, sendo a funo do elctrodo secundrio

desempenhada pelo de referncia.

1.1.3. Corrente capacitiva

Nos processos electroqumicos, a intensidade de corrente total deve-se no s a

fenmenos faradaicos mas tambm a capacitivos. Estes ltimos so originados pela

transferncia de carga associada formao da dupla camada elctrica. [7].

Cd

R

Rs

Figura 1.2 Circuito equivalente numa interface simples. Cd, R e Rs representam a capacidade da dupla camada, a resistncia faradaica e a resistncia da soluo, respectivamente.

O comportamento da interface entre um elctrodo idealmente polarizvel e a

soluo pode ser traduzido pelo circuito equivalente representado na figura 1.2 [8]. A

capacidade de dupla camada elctrica, Cd depende da carga elctrica acumulada, q, e do

potencial aplicado:

EqCd= (1.4)

Considerando uma variao linear de potencial (E = Ei + vt) a resposta em

corrente deste circuito pode traduzir-se por:

+=

dd

idc RC

texpCvRE

CvI (1.5)

em que Ic a intensidade de corrente capacitiva, v a velocidade de varrimento do

potencial, Ei o potencial inicial e t o tempo da perturbao. Esta intensidade de corrente

que adicionada corrente faradaica, pode ser considervel em situaes de baixa

concentrao de espcie electroactiva ou em escalas de tempo reduzidas, distorcendo as


Introduo Captulo I

respostas obtidas. Geralmente o que se procura obter uma razo elevada entre a

intensidade de corrente faradaica, If, e a intensidade de corrente capacitiva, Ic. Em

condies de difuso planar prev-se que a dimenso do elctrodo no tenha qualquer

efeito sobre esta razo. No entanto, em regime de estado estacionrio em que a

intensidade de corrente de difuso proporcional ao raio do elctrodo e a intensidade de

corrente capacitiva proporcional sua rea, esta razo inversamente proporcional ao

raio do microelctrodo, como se pode verificar pela seguinte expresso:

e2e

ecIfI

r1

rr = (1.6)

A expresso 1.6 mostra que a interferncia da intensidade de corrente capacitiva

menos significativa em microelctrodos elctrodos de menores dimenses.

1.2. Tcnicas electroqumicas

Nesta seco apresenta-se uma breve descrio das tcnicas electroqumicas

utilizadas, nomeadamente a voltametria simples de varrimento linear e a voltametria de

onda quadrada. Na abordagem efectuada apresenta-se essencialmente as caractersticas

das respostas obtidas em ambas as tcnicas em que a intensidade de corrente controlada

por difuso.

1.2.1. Voltametria de varrimento linear em estado estacionrio

A voltametria simples de varrimento linear uma tcnica simplificada da

voltametria cclica de varrimento linear. Nestas tcnicas o potencial aplicado ao elctrodo

de trabalho variado linearmente com o tempo. Na voltametria cclica a variao de

potencial efectuada nos dois sentidos, enquanto que na voltametria simples unicamente

se aplica um dos varrimentos.

Em regime estacionrio as respostas voltamtricas so independentes do sentido

do varrimento de potencial, pelo que normalmente efectuado apenas um dos

varrimentos.


9

Captulo I Introduo

Os parmetros experimentais a ter em conta nesta tcnica so o potencial inicial,

Ei, o final, Ef, e a velocidade de varrimento. O potencial aplicado em cada instante

funo da velocidade de varrimento, v, e do tempo, t, [9] como apresentado na seguinte

expresso:

E (t) = Ei - vt (1.7)

A voltametria de estado estacionrio uma tcnica electroqumica que apresenta,

uma vantagem, que a dependncia linear com D, permitindo calcular rigorosamente os

coeficientes de difuso.

Como resultado do potencial aplicado, superfcie do elctrodo podem ocorrer

processos de natureza variada, que contribuem para a intensidade de corrente medida, tais

como a estruturao da dupla camada elctrica, a adsoro especfica e reaces de

oxidao/reduo. Por outro lado a intensidade de corrente faradaica depende das

velocidades relativas dos diferentes processos associados transferncia electrnica,

nomeadamente, a difuso das espcies electroactivas e a ocorrncia de reaces qumicas

homogneas. Na ausncia destas, o processo global pode traduzir-se pela equao 1.8 e

pelo esquema na figura 1.3.

O ' D O O S + n e

k d

k i RS D R R'

(1.8)

O e R representam as concentraes de O e R no seio da soluo, Os e Rs representam

as concentraes de O e R junto da superfcie do elctrodo, kd e ki so as constantes de

velocidade heterognea da reaco directa e inversa, DO e DR so os coeficientes de

difuso das espcies O e R, que so respectivamente as espcies oxidadas e reduzidas.


Introduo Captulo I

Interior da soluo

Elctrodo R'

O'

kd

DO

Rs

Os

ki

DR

Camada de difuso

Figura 1.3 Esquema simplificado de uma reaco de oxidao - reduo na superfcie de uma elctrodo na ausncia de reaces qumicas acopladas

A resposta em corrente de um elctrodo hemisfrico sujeito a uma perturbao de

potencial, suficientemente negativo para que a concentrao de O seja nula, pode ser

obtida a partir da resoluo da 2 lei de Fick em coordenadas esfricas:

+

=

rc

r2

2r

c2ODt

c (1.9)

onde DO o coeficiente de difuso da espcie electroactiva O, r a distncia ao centro da

esfera, c a concentrao da espcie electroactiva O, que uma funo da distncia ao

elctrodo e do tempo t.

Aplicando a transformada de Laplace expresso 1.9 e considerando as condies

iniciais e de fronteira:

t = 0, r = re, CO = 'OC

(1.10)

t = t, r = re, CO = 0 (1.11)

em que re o raio do microelctrodo, a concentrao da espcie electroactiva no

seio da soluo, obtm-se:

'OC


11

Captulo I Introduo

2/1O

2/1O

2e

OOe )t(cnFDr4

cnFDr4I += (1.12)

onde F a constante de Faraday.

Esta equao apresenta duas situaes limites, dependendo da escala de tempo da

experincia caracterizada pelo parmetro adimensional ( 2eO rtD= ). Para valores de pequenos a equao 1.12 simplifica-se devido predominncia do segundo termo, obtendo-se a equao de Cottrell. A outra situao limite corresponde a

valores de elevados conduzindo seguinte expresso:

'OOed cDFrn4I = (1.13)

onde Id a intensidade de corrente de difuso e o raio da hemisfera. er

A expresso equivalente para microelctrodos de disco pode ser obtida atravs da

resoluo da segunda lei de Fick em coordenadas cilndricas:

d'OOd rcnFD4I = (1.14)

onde rd o raio do microdisco.

A forma dos voltamogramas obtidos por voltametria simples de varrimento linear

(LSV) depende da reversibilidade do processo do elctrodo. Quando o processo

reversvel o voltamograma traduz-se por:

( )

+

=0EERTnFexpRDOD1

dII (1.15)

onde E0 corresponde ao potencial de reduo padro e Id a intensidade de corrente de

difuso. O potencial de meia onda que corresponde ao valor de potencial medido para Id/2

relaciona-se com o potencial de reduo padro:

+=

O

R02/1 D

Dln

nFRTEE (1.16)


Introduo Captulo I

A anlise da reversibilidade pode ser efectuada a partir de uma curva I-E,

representando um grfico de E versus log [(Id-I)/I]. Para uma temperatura de 298 K o

declive da recta dever ser igual a 59/n mV.

A reversibilidade pode tambm ser diagnosticada recorrendo ao critrio de

Thomes, atravs dos valores de potencial medidos a 1/4 e a 3/4 de Id. Para um processo

reversvel tem-se:

9lnnFRTEE 4/34/1 |=| (1.17)

este valor igual a 56,4/n mV, para uma temperatura de 298 K.

1.2.2. Voltametria de onda quadrada

Esta tcnica caracteriza-se pela aplicao, ao elctrodo de trabalho, de um perfil

de potencial com impulsos. Em cada impulso o potencial varia instantaneamente de um

potencial inicial (Ei) para um potencial final (Ef).

A voltametria de onda quadrada desenvolvida por Barker, em 1952, foi pouco

usada devido a inmeras dificuldades electrnicas que foram ultrapassadas graas aos

progressos na instrumentao, sendo actualmente muito utilizada em Qumica Analtica.

uma tcnica de elevada rapidez de resposta que permite obter limites de

deteco baixos devido discriminao da corrente capacitiva. A resposta que se obtm

em forma de pico, facilitando a identificao de espcies electroactivas em soluo. A

possibilidade de separar as respostas relativas a processos que ocorram em potenciais

prximos, faz com que a reduo do oxignio nas amostras no altere as respostas

caractersticas das espcies analisadas. A sua versatilidade faz com que seja uma tcnica

muito utilizada quer em estudos analticos quer em mecansticos.

O perfil de potencial da voltametria de onda quadrada (SWV), consiste numa

onda quadrada simtrica b), cuja meia amplitude de patamar a patamar representada por

ESW, sobreposta a uma onda em escada a), originando o perfil c), como representado na

figura 1.4.


13

Captulo I Introduo

Nos instantes iniciais de cada impulso, a intensidade de corrente capacitiva

apresenta um valor elevado, pois a carga da dupla camada proporcional a e-t/RC, em que

t o tempo aps a aplicao da perturbao, Cd a capacidade da dupla camada e R a

resistncia da soluo. Como a intensidade de corrente capacitiva decresce com o tempo

mais rapidamente que a corrente faradaica (que proporcional a 1/t1/2) deve-se escolher

adequadamente o instante em que se efectua a medio (tm) e geralmente tem um valor

elevado (2-200 ms) de modo a minimizar o efeito da intensidade de corrente capacitiva.

Es

tempo

Potencial

Esw

a

b

c

Esw

Figura 1.4 Representao esquemtica do perfil do potencial em forma de escada (a), de onda quadrada (b), resultante da soma do perfil de potencial em forma de escada e de uma onda quadrada (c). Os instantes em que se efectuam as medies de intensidade de corrente esto assinalados por ().

Os parmetros caractersticos desta tcnica so o potencial de meia amplitude de

patamar em patamar da onda quadrada (ESW), o perodo da onda em escada, que

idntico ao da onda quadrada (), o incremento em potencial da onda quadrada Es, a largura de cada impulso (tp) que o tempo caracterstico da cada experincia e a

frequncia (f).

A intensidade de corrente medida na parte final de cada meio ciclo

correspondente ao intervalo de tempo tm, obtendo assim, a intensidade de corrente directa


Introduo Captulo I

(Id) e a intensidade de corrente inversa (Ii). A diferena entre estas duas intensidades de

corrente fornece o valor da intensidade de corrente diferencial (I). A representao de I em funo do potencial de onda em escada origina um voltamograma em forma de pico,

como se apresenta na figura1.5.

Figura 1.5 Representao esquemtica das intensidades de corrente directa (Id) e inversa (Ii) e o diferencial resultante (I).

Esta tcnica de voltametria apresenta a vantagem da intensidade de corrente

diferencial ser pouco afectada pela intensidade de corrente capacitiva.

Geralmente a intensidade de corrente diferencial comparada teoricamente com

uma intensidade de corrente adimensional (). As intensidades de corrente experimental (I) e adimensional () so relacionadas

com o factor de Cottrell para o tempo caracterstico (tp) desta tcnica:

= 2/1p2/1

O'O

)t(DnFAc

I (1.18)

A intensidade de corrente adimensional de pico () para nEsw = 50 mV e nEs = 10 mV dada pela seguinte expresso:


15

Captulo I Introduo

++=1,130,177exp0,750

0,846

p (1.19)

em que 2/1pDt2r=

(1.20)

A intensidade de corrente de pico, ou seja, a corrente diferencial mxima,

traduzida na seguinte equao:

pp

2/1O'

Op tDnFAcI = (1.21)

Analisando a equao (1.21), observa-se que a intensidade de corrente varia

linearmente com a concentrao, permitindo que esta tcnica seja aplicada para fins

analticos. Outras vantagens da SWV a sua rapidez, obtendo-se para valores de ES entre 10 e 30 mV, velocidades de varrimento de (0,3 / n) a (60 / n) V s-1. de salientar

que esta tcnica apresenta uma elevada insensibilidade presena de oxignio, o que

permite que muitas experincias no necessitem de desarejamento prvio, facto muito

importante para a realizao de estudos in vivo.

1.2.3. Aplicaes das tcnicas voltamtricas com microelctrodos

Na literatura so descritos inmeras aplicaes dos microelctrodos no domnio da

Qumica Analtica, devido s suas caractersticas fundamentais.

Na realidade, o aparecimento e caracterizao dos microelctrodos resultaram da

necessidade de se realizarem estudos in vivo, onde era crucial a dimenso ser reduzida.

Algumas das aplicaes relevantes descritas na literatura, incluem a determinao de

metais [10], de compostos biolgicos [11-13], de neurotransmissores em fatias de crebro

[14]. As suas reduzidas dimenses permite posiciona-los em posies bem determinadas,

pelo que foi possvel determinar nquel numa nica clula biolgica [15], assim como

analisar o citoplasma de uma nica clula [16]. Foram efectuadas determinaes de

diversos compostos biolgicos e neurotransmissores em crebros de rato anestesiados, de

chumbo em sangue [17], de cido rico em urina [18]. A determinao de amino-cidos


Introduo Captulo I

em urina tambm tem sido realizada por tcnicas voltamtricas com elctrodos de cobre e

ouro [19].

O estudo do comportamento de medicamentos anti HIV foi tambm efectuado

com microelctrodos de platina [20]

Outros trabalhos referem o comportamento voltamtrico em suspenses de clulas

vivas de T. shanghaiensis [21] assim como em suspenses de clulas vivas de

Saccharomyces cerevisiae [22].

A insensibilidade dos microelctrodos ao efeito da queda hmica permite realizar

estudos em que a concentrao das espcies electroactivas elevada [23]. Esta

caracterstica inerente aos microelctrodos simplifica o processo de determinaes

analticas, permitindo a realizao de experincias sem adio de electrlito suporte que

para alm de ser uma fonte de impurezas pode reagir com as espcies em estudo [24, 25].

A determinao de metais na ausncia de electrlito minimiza os erros associados

contaminao associada alterao da forma em que as espcies se encontram em

soluo.

A voltametria de varrimento linear em estado estacionrio foi utilizada em

sistemas resistivos como por exemplo, a determinao de clorobenzeno em solues de

elevada concentrao [26] e em estudos de compostos biolgicos [27, 28]. Esta tcnica

foi tambm utilizada em amostras de produtos lcteos [29] e em leos lubrificantes [30,

31]. A utilizao de solventes de baixa constante dielctrica ainda pouco explorada,

existindo no entanto estudos [32] que demonstram a possibilidade de determinar

quantidades vestigiais de metais (chumbo, cdmio e zinco) em acetonitrilo, metanol e

etilenoglicol. Por voltametria de varrimento linear foi possvel quantificar o antraceno em

clorobenzeno presente como impureza em fenantreno comercial [26].

O transporte de massa muito elevado e a obteno de respostas de elevada

qualidade em tempos muito reduzidos, so factores que possibilitam obteno de dados

cinticos de processos muito rpidos [33, 34].

Alguns trabalhos realizados no domnio das aplicaes alimentares compreendem

a determinao de cido ascrbico em alimentos tais como batatas, molhos e morangos,

sem recorrer a tratamento prvio da amostra [35, 36]. Por voltametria de onda quadrada e

com microelctrodos cilndricos foram determinadas algumas espcies electroactivas tais


17

Captulo I Introduo

como oxignio, o cido ascrbico [37] e alguns anti-oxidantes alimentares em flocos de

pur de batata [38].

1.3. Reduo electroqumica de cidos fracos

Em regime estacionrio, o transporte de massa verificado com a utilizao de

microelctrodos permite a visualizao de um sinal electroqumico em solues de

cidos. A reduo electroqumica destes ocorre com a formao de hidrognio molecular.

A sua difuso para o seio da soluo impede a formao de bolhas de gs superfcie do

elctrodo, o que impossibilita a obteno de um sinal electroqumico bem definido em

solues de cidos fracos e fortes em estado no estacionrio.

A reaco de evoluo do hidrognio envolvendo a descarga de ies hidrognio a

partir de solues de cidos fortes e fracos, nomeadamente, cido actico, perclrico,

ntrico, foi analisada por voltametria de varrimento linear com micoelctrodos de platina.

O mecanismo proposto na literatura [39] para a reduo de cidos fracos

apresentado em seguida:

HA H+ + A- (1.22)

2H+ + 2e- H2 (1.23)

Este processo caracteriza-se por uma reaco qumica em fase homognea,

seguida a reaco de transferncia de carga, com o envolvimento de dois electres. A

intensidade de corrente limite depende dos coeficientes de difuso do cido molecular

(DHA) e do io hidrognio (DH+), da concentrao do io hidrognio em equilbrio no seio

da soluo ([H+]b) e da concentrao analtica do cido fraco no dissociado (CHA) [40]:

( ) [ ][ ]HAHAbHHAHdL CDDD4nFrI += ++ (1.24) Podem considerar-se duas situaes limite. Quando a concentrao de cido

elevada, a sua ionizao pouco extensa, i.e., CHA [H+]b:

HAHAdL CDI 4nFr=

(1.25)


Introduo Captulo I

A outra situao correspondente a solues muito diludas em que o cido est praticamente todo ionizado, podendo considerar-se [H+]b CHA, assim:

( ) [ ]bHHAHdL DD4nFrI ++ = (1.26) Quando se considera um intervalo de concentraes de cido mais ou menos

extenso, deve-se considerar no s estas duas situaes limite, como tambm a intermdia em que a intensidade de corrente controlada por ambos os coeficientes de difuso

(equao 1.24). DH + e DHA Foram efectuados estudos com microelctrodos em solues tampo de cidos

mono e poliprticos por voltametria de varrimento linear [39] em que foi comparado o sinal electroqumico obtido numa soluo de cido fraco tamponizada com o obtido na mesma soluo sem tampo. Foi verificado que a intensidade de corrente limite obtida inferior na primeira, o que comprova o mecanismo acima proposto [40]. Neste trabalho foram ainda descritas as diferenas verificadas nos potenciais de meia onda, caractersticos das espcies electroactivas em anlise, nas duas solues de cidos fracos.


19

Introduo Captulo I

2. Consideraes gerais sobre microrganismos

A microbiologia estuda organismos cujas dimenses so demasiado reduzidas para

serem percebidos vista desarmada e que se denominam microrganismos.

A vida neste planeta comeou 4 mil milhes de anos com microrganismos e

provavelmente estes sero os ltimos sobreviventes. Estes so actualmente a maioria dos

seres vivos e tm uma extensa distribuio taxonmica, incluindo alguns animais

protozorios, muitas algas e fungos, bactrias e vrus [41].

Como j se referiu o objectivo deste trabalho o desenvolvimento de um mtodo

electroqumico para a avaliao do crescimento microbiano com o intuito de ultrapassar

algumas restries apresentadas pelos mtodos clssicos para este fim. Essas restries

manifestam-se principalmente na avaliao do crescimento de fungos filamentosos que,

em meio lquido, no formam suspenses homogneas e por isso o seu crescimento no

pode ser avaliado por turbidimetria (mtodo mais usual, descrito na seco 2.2). No

entanto neste trabalho os microrganismos estudados foram leveduras, as quais se

diferenciam dos fungos por se apresentarem, usual e predominantemente sob a forma

unicelular e em meio lquido formarem suspenses homogneas. As leveduras

diferenciam-se das algas pois no efectuam a fotossntese e dos protozorios porque

possuem uma parede celular rgida. So tambm facilmente diferenciadas das bactrias

devido a apresentarem dimenses maiores e propriedades morfolgicas diferentes [42].

As leveduras so seres eucariticos, unicelulares, no mveis, sem clorofila,

quimiossintetizantes e capazes de se reproduzirem sexuada e assexuadamente, sendo a

forma mais comum de diviso celular por gemulao ou fisso. Na fisso, a clula divide-

se simetricamente dando origem a duas clulas semelhantes, pelo contrrio a diviso por

gemulao visivelmente assimtrica. Neste ltimo caso, a clula parental produz um

broto que vai crescendo durante o ciclo celular at finalmente separar-se da clula


21

Captulo I Introduo

original. Na reproduo sexuada as leveduras reproduzem-se por esporos endgenos

(ascsporos), contidos no interior da clula me.

As leveduras no constituem um grupo de microrganismos com significado

taxonmico sendo diferenciadas de acordo com as suas caractersticas morfolgicas e

fisiolgicas. A morfologia das leveduras muito varivel como se pode ver na figura 1.6.

DC

BA

Figura 1.6 Representao de diferentes morfologias de leveduras: A - Saccharomyces cerevisiae; B - Saccharomyces ludwigii, C - Geotrichum candium; D Pichia membranaefaciens

As leveduras so um grupo de microrganismos bem conhecido pelos seus

contributos para a indstria alimentar. A produo de alimentos como o po, bebidas

alcolicas (vinho, cerveja, champanhe, sidra, etc.) deve-se sem dvida a algumas espcies

de leveduras. No entanto, existem outras espcies de leveduras que podem deteriorar

produtos que em escala industrial pode conduzir a grandes perdas econmicas [43]. A

deteriorao de alimentos e bebidas conduzida por microrganismos essencialmente um

processo competitivo que decorre entre leveduras, bactrias e fungos filamentosos. Essa

deteriorao ocorre com frequncia em locais domsticos como por exemplo garrafas de

polpa de tomate, molhos, geleias e xaropes abertas e armazenadas h algum tempo podem

fermentar ocasionalmente. Em fatias de bacon, sumos de fruta empacotados e abertos

durante muito tempo desenvolvem-se populaes significativas de leveduras superfcie.

No presente trabalho foram utilizadas duas espcies de leveduras a Candida utilis

e a Saccharomyces cerevisiae (figura 1.7).


22

Introduo Captulo I

BA

Figura 1.7 Imagem da levedura Candida utilis (A) e Saccharomyces cerevisiae (B)

Estudos recentes mostram a importncia de algumas espcies de leveduras no

meio ambiente e na agricultura. Nomeadamente, Arnold e seus colaboradores

investigaram a possibilidade de culturas de diferentes espcies de leveduras crescerem e

serem utilizadas para o tratamento de efluentes poludos por fertilizantes e verificou que a

Candida utilis e Galactomyces geotrichum so eficazes na reduo da poluio dos

efluentes [44].

Diferentes estirpes da levedura Candida utilis so utilizadas para a produo de

biomassa, de cido actico e de acetato de etilo a partir do etanol. Existem alguns estudos

que demonstram a maior capacidade de determinadas estirpes de Candida utilis na

degradao do etanol e converso em biomassa, cido actico e acetato de etilo [45].

As indstrias alimentares so responsveis por 45 % da poluio orgnica total.

Um processo que inclui um reactor anaerbio acidognico e um reactor de leveduras em

srie proposto para o tratamento de elevadas concentraes de efluentes da indstria

alimentar. A Candida utilis utilizada em reactores de banhos contnuos com cido

actico, cido propinico, ou cido butrico ou uma mistura dos trs com um pH de 3,5

para minimizar a contaminao bacteriolgica [46].

Os resultados obtidos em estudos efectuados por Christen e colaboradores sobre a

eliminao do etanol mostram a possibilidade deste composto voltil ser eliminado com

biofiltrao do bagao inoculado com uma cultura pura de Candida utilis [47].

Num trabalho realizado por Olesen e Stahnke verificou-se a influncia de culturas

de leveduras e Candida utilis no aroma de carnes e salsichas. Foi demonstrado que a

Candida utilis devido sua actividade metablica produz uma maior quantidade de


23

Captulo I Introduo

compostos volteis do que a Debaryomyces hansenii, importantes para o aroma das

carnes e salsichas [48].

Como se pode verificar a Candida utilis uma levedura de grande interesse

econmico na indstria alimentar e agrcola, principalmente.

No que respeita Saccharomyces cerevisiae uma levedura muito conhecida

pelo seu papel na fermentao do po e de algumas bebidas alcolicas como a cerveja e

os vinhos. Alm disso algumas espcies de Saccharomyces cerevisiae podem aumentar a

produo das enzimas digestivas e at mesmo diminuir efeitos colaterais gastro-instetinais

de antibiticos. Pesquisas recentes comprovam um aumento da Imunoglobina A na

mucosa intestinal com o uso do frmaco (Bonatropheen) que contm esta levedura. As

vitaminas de sua frmula melhoram notavelmente a aparncia e a sade da pele, cabelos e

unhas [49].

Um modelo experimental de Saccharomyces cerevisiae foi desenvolvido para a

anlise molecular do processo de envelhecimento. A manipulao da ingesto nutricional

destas leveduras pode aumentar o perodo de vida, fornecendo um modelo til para a

anlise molecular da restrio calrica. Segundo Jazwinski a elucidao de tais

mecanismos, permitiria desenvolver intervenes relativamente simples que aliviariam os

danos do processo de envelhecimento, melhorando a qualidade de vida das pessoas mais

idosas [50].

Foram realizadas algumas investigaes dos efeitos da levedura Saccharomyces

cerevisiae presente na dieta de vacas em lactao. Verificou-se que a incluso desta

levedura na dieta provocava um aumento quer na produo do leite quer de gordura e

protena [51].

Todos os organismos requerem uma fonte de energia e de carbono. Os

microrganismos podem ser divididos em dois grandes grupos com base nas suas

exigncias nutritivas, os fototrficos e os quimiotrficos, os primeiros utilizam energia

radiante e os ltimos dependem de compostos qumicos para a obteno de energia. Estes

dois grupos so subdivididos de acordo com a sua principal fonte de energia utilizada

para o crescimento. As duas espcies de leveduras estudadas utilizam um composto

orgnico como fonte de carbono para o seu crescimento e a energia obtida pela oxidao

desse composto.


24

Introduo Captulo I

Contudo, no processo respiratrio, h diferenas quanto aos compostos que podem

ser assimilados pelas diferentes espcies de leveduras. Algumas podem utilizar pentoses

(D-xilose, D-ribose), polissacardeos (amido), alcois (matinol, sorbitol, etanol), cidos

orgnicos (cido lctico, actico, ctrico) e outros substratos orgnicos.

Em seguida descreve-se resumidamente o metabolismo para microrganismos que

utilizam a glucose como fonte de carbono e obtm a energia necessria para o seu

crescimento a partir da oxidao deste composto orgnico.

O processo metablico das leveduras varia para diferentes espcies podendo

ocorrer por via aerbia (respirao) ou anaerbia (fermentao). O processo mais

caracterstico a fermentao alcolica que conduz formao de etanol e presente nas

bebidas alcolicas utilizadas h milhes de anos e o dixido de carbono responsvel pelo

aumento de volume da massa do po.

C6H12O6 2 C2H5OH + 2 CO2 (1.27)

A fermentao alcolica um processo puramente qumico que pode ocorrer fora

das clulas vivas e que envolve etapas qumicas de degradao da glucose comuns a

outros tipos de fermentao. Os produtos finais obtidos noutros tipos de fermentao so

os que as diferenciam da fermentao alcolica [52].

No metabolismo aerbio, na respirao, a oxidao completa da glucose, pelo

oxignio do ar, fornece dixido de carbono e gua.

C6H12O6 + 6O2 6CO2 + 6H2O + energia (1.28) Em microrganismos, plantas e animais a via central do catabolismo da glucose

conhecida como via glicoltica (figura 1.8) em que se forma o piruvato. O metabolismo

difere de um organismo para outro, dependendo da forma como velocidade daquele

regulada e do destino metablico do piruvato formado. Nos organismos aerbios o

piruvato oxidado, com a perda do seu grupo carboxilo na forma de CO2, formando o

grupo acetilo da acetil coenzima A. Este grupo acetilo , ento, oxidado completamente

na mitocndria a CO2 e H2O pelo ciclo do cido ctrico, com a participao de oxignio


25

Captulo I Introduo

molecular. Em condies em que h falta de oxignio o piruvato convertido em lactato

ou etanol, fermentao lctica e alcolica respectivamente. Em termos energticos, a via

glicoltica fornece duas molculas de ATP por molcula cada de glucose degradada.

O resultado da oxidao completa da glucose a produo de 36 moles de ATP

por cada mole de glucose.

Figura 1.8 Representao esquemtica do catabolismo da glucose

2.1. Fundamentos do crescimento microbiano: cintica do crescimento em sistema fechado

Nos microrganismos, dadas as suas reduzidas dimenses, o crescimento

encarado a nvel de populaes, e no de indivduos, como se verifica nos seres

pluricelulares [53]. Uma populao microbiana a crescer num meio de cultura, ao qual

est perfeitamente adaptada, encontra-se no designado "estado de crescimento

equilibrado", caracterizado pelo aumento ordenado de todos os seus componentes

qumicos. Assim, a duplicao da biomassa est associada duplicao de todas as outras

propriedades mensurveis da populao como, por exemplo, das protenas, dos cidos

nucleicos, etc. Portanto, em condies de "crescimento equilibrado" o aumento da

populao (dX) num intervalo de tempo infinitamente pequeno (dt) proporcional

biomassa presente nesse intervalo de tempo, ou seja:


26

Introduo Captulo I

dXdt

= kc X (1.29)

onde X representa a densidade populacional, dX/dt a taxa de crescimento da populao em

cada instante e kc a taxa especfica do crescimento, expressa em unidades do inverso do

tempo (t-1).

Integrando a equao 1.29, obtm-se:

Xt = X0ekct (1.30)

onde Xt e X0 so as densidades populacionais, respectivamente, nos tempos t e zero.

Logaritmizando a equao anterior obtm-se a expresso linear:

ln Xt ln X0 = kct (1.31)

Se se representar graficamente, em papel semilogartmico, os valores da densidade

populacional em funo do tempo obtm-se uma relao linear cujo declive permite

estimar a taxa especfica do crescimento.

A velocidade do crescimento de leveduras depende de factores qumicos e fsico-

qumicos, tais como a concentrao de nutrientes, a temperatura, o pH, etc. As leveduras

crescem numa ampla gama de variao trmica, de 0 a 47 C, algumas no se

desenvolvem acima de 15 C, enquanto que outras no se desenvolvem abaixo desta

temperatura. A temperatura ptima para a maioria das leveduras de 20 a 30 C.

Relativamente aos valores de pH, em geral, as leveduras crescem melhor em

meios cidos, entre 3,5 e 3,8, inibindo o desenvolvimento da maior parte das bactrias.

No entanto, os limites de tolerncia variam num intervalo de 2,2 a 8,0 de acordo com os

vrios tipos de espcies de leveduras [54].

Quando uma populao de clulas microbianas colocada em sistema fechado

(sistema em que no h livre troca de nutrientes com o meio) num meio de cultura

lquido, com composio qumica e condies fsico-qumicas favorveis ao seu


27

Captulo I Introduo

crescimento, nomeadamente, de arejamento, temperatura e pH, o crescimento da

populao pode ser traduzido graficamente pela designada "curva de crescimento" (figura

1.9) que a seguir se descrever mais pormenorizadamente. Aps um perodo de latncia, de

durao varivel, em que as clulas se esto a adaptar ao meio, segue-se o incio da

multiplicao celular. A populao entra na chamada fase de acelerao, onde kc aumenta

de zero at ao seu valor mximo (kcmx), atingindo-se a fase exponencial do

crescimento. A durao desta fase depende fundamentalmente da concentrao inicial dos

nutrientes limitantes para o crescimento. Quando um ou mais nutrientes se tornam

limitantes e/ou ocorre a acumulao no meio de metabolitos inibidores do crescimento,

segue-se a fase de desacelerao em que kc diminui do seu valor mximo at zero.

Atinge-se ento a fase estacionria em que kc=0, correspondente ao esgotamento de um

ou mais nutrientes essenciais e, finalmente, a fase de declnio, devido ocorrncia de

autlise celular.

Tempo

1 2

3

4 5 6

Ln (p

opul

ao

vi

vel)

Figura 1.9 Curva de crescimento microbiano em sistema fechado. 1) fase de latncia; 2) fase de acelerao; 3) fase exponencial; 4) fase de desacelerao; 5) fase estacionria; 6) fase de declneo.

Por vezes til exprimir o crescimento exponencial pelo parmetro "tempo de

duplicao" (tD). Este exprime, tal como o nome indica, o tempo necessrio para que a

populao em crescimento duplique e facilmente deduzido a partir da equao 1.31.

Assim, se tD o tempo necessrio para que a densidade populacional, X, seja igual a 2X0

tem-se:


28

Introduo Captulo I

Dc00 tklnXln2X += (1.32)e,

cD k

ln2t = (1.33)

O parmetro tD tem as dimenses de um tempo.

O "tempo de duplicao", tal como a taxa especfica de crescimento, constituem

parmetros biolgicos, cujos valores dependem da estirpe microbiana e so fortemente

influenciados pelas condies fsicas (pH, actividade da gua, tenso de oxignio,

presena de inibidores), qumicas (particularmente a natureza e concentrao da fonte de

carbono e energia) do meio e ainda pela temperatura.

2.2.Tcnicas para a avaliao do crescimento microbiano

As diferentes metodologias descritas na literatura para a avaliao do crescimento microbiano [55] so facilmente aplicveis a microrganismos unicelulares, que so capazes

de formar suspenses homogneas, como as leveduras. Alguns desses mtodos so

brevemente descritos em seguida:

a) Turbidimetria permite medir o aumento da biomassa em funo da luz dispersa por

uma suspenso de clulas. O aumento de turvao verificado ao longo do crescimento

pode ser determinado a partir de medies de densidades pticas num

espectrofotmetro de ultra violeta /visvel a um comprimento de onda que

corresponde absoro mxima.

b) Contagem de colnias em placa permite determinar o nmero de clulas viveis

aps espalhamento de uma suspenso em meio de cultura slido em placa de Petri.

c) Contagem atravs do microscpio ptico do nmero de clulas totais este mtodo

permite contar ao microscpio numa cmara de contagem (cmara de Neubauer) o

nmero de clulas contidas num volume conhecido de suspenso de cultura, quando

se coloca esta numa lmina de vidro com um volume conhecido.


29

Captulo I Introduo

d) Determinao de peso seco o nico mtodo que permite medir directamente a

biomassa (massa celular) de uma cultura em suspenso. Para tal coloca-se um

determinado volume de uma suspenso de clulas num filtro de papel previamente

pesado e aps a sua secagem procede-se novamente pesagem. A diferena de

massas obtida corresponde ao aumento da biomassa.

e) Doseamento de um componente este mtodo permite avaliar o crescimento

determinando a quantidade de um substrato consumido (glucose, protenas) ou

produto formado (DNA, ATP, etc.) ao longo do crescimento de uma cultura de

clulas.

De todos os mtodos atrs referidos, o turbidimtrico o referido na literatura [54,

55] como o mais expedito para medir a massa celular dos microrganismos unicelulares.

No entanto, a tcnica turbidimtrica no vivel para avaliar o crescimento de espcies

de microrganismos que formam agregados celulares ou filamentos como por exemplo, os

fungos filamentosos. Como nas tcnicas electroqumicas no estritamente necessrio

que as solues em anlise sejam homogneas, estas tcnicas podero ser implementadas

para a avaliao do crescimento de microrganismos em meios lquidos independente do

grau de homogeneidade das culturas. Neste trabalho iniciou-se por implementar e

desenvolver o mtodo electroqumico para a avaliao do crescimento de leveduras

(Candida utilis, Saccharomyces cerevisiae). A turbidimetria foi o mtodo utilizado como

de referncia e comparativo. As suspenses de clulas recolhidas ao longo do tempo

foram sujeitas a anlise voltamtricas e turbidimtricas.


30

Captulo II

Parte experimental

Parte Experimental Captulo II

1. Instrumentao

Nesta seco do captulo II so descritos os equipamentos utilizados no decorrer

deste trabalho experimental. Na tabela 2.1 apresenta-se de uma forma breve a

instrumentao e o modelo de cada equipamento, assim como a preciso associada s

leituras, no caso dos instrumentos de medida.

Tabela 2.1 Descrio dos equipamentos, modelos e incerteza associada a cada medio.

Descrio Instrumentao Marca, Modelo Incerteza

Voltametria Potenciostato/Galvanostato

Computador

Impressora

Autolab, PGSTAT 30

Tsunami, Celeron 333 MHz

Hewlet Packard, Deskjet 695

0,001 V; 0,001 nA

Potenciometria Medidor de pH Hanna Instruments, 8417 0,01

Pesagem Balana analtica Precisa 40Sm-200A 0,00001 g Autoclavagem Autoclave Uniclave, 88

Polimento Polideira Buehler, Ecomet 3

Limpeza Banho de ultra-sons Struers, Metason 60

Tratamento de

gua Purificador Barnstead, E-Pure

Turbidimetria Espectofotmetro Bausch e Lomb Spectronic 21 T ( 0,5%) Incubao Incubadora Gallenkamp, orbital incubater

Centrifugao Centrifuga Sigma 2K15

Cromatografia Cromatgrafo

Bomba

Detector de ndice de

refraco

Coluna 300 78 mm

Gilson, mod. 712

Gilson, mod. 307

Gilson, mod. 132

HyperezH+Carbohydrate.


33


2. Estudos electroqumicos

Neste sub-captulo so apresentados em primeiro lugar os materiais e os

procedimentos experimentais relativos aos ensaios electroanalticos. Posteriormente na

parte 3 e 4 deste captulo descrevem-se os procedimentos experimentais seguidos nos

estudos microbiolgicos e determinaes cromatogrficas, respectivamente.

2.1. Material de vidro: descrio e limpeza 2.1.1. Clulas

As clulas usadas apresentam uma forma de pra e de parede simples, como se

pode ver na figura 2.1. Esta clula apresenta trs entradas: onde pode ser introduzida um

fluxo de gs inerte (argon) para o desarejamento das solues e as duas restantes para a

introduo dos elctrodos de trabalho e de referncia/auxiliar.

Figura 2.1 Representao esquemtica da clula de parede simples com trs entradas para utilizao com dois elctrodos.


35


2.1.2. Limpeza do material de vidro

A limpeza do material de vidro foi efectuada antes de cada experincia, por

imerso numa soluo aquosa de detergente em banho de ultra-sons, durante

aproximadamente cinco minutos. Seguidamente, o material foi enxaguado com gua de

abastecimento, enxaguado e imerso em gua desionizada, sendo submetido novamente a

um banho de ultra-sons. Finalmente, quando se retirou do ultra-sons enxaguou-se

novamente com gua desionizada e levou-se estufa a 60 C.

2.2. Elctrodos

Os elctrodos utilizados nas tcnicas voltamtricas foram elctrodos de referncia

e microelctrodos como elctrodos de trabalho como se refere nos pontos 2.2.1 e 2.2.2.

Nas medies de pH foi utilizado um elctrodo de vidro combinado Hanna HI 1131.

2.2.1. Elctrodos de referncia

Tal como o prprio nome indica estes elctrodos tm um valor de potencial bem

estabelecido, sendo os valores de potencial de outros elctrodos registados como uma

diferena relativamente a esse valor de referncia. Para que estes elctrodos

desempenhem a sua funo ao longo do tempo num processo de anlise o seu potencial

deve-se manter constante ainda que seja sujeito a pequenas variaes de temperatura ou

devido passagem de pequenas intensidades de corrente [56].

No decorrer do trabalho experimental foram utilizados dois tipos diferentes de

elctrodos de referncia, o elctrodo de calomelanos e o de prata/cloreto de prata. O

primeiro foi utilizado em quase todo o procedimento experimental, tendo o ltimo sido

utilizado em apenas alguns ensaios.


36


a) Elctrodo de calomelanos saturado

O elctrodo de calomelanos pode ser representado da seguinte forma:

HgHg2Cl2 (s), KCl(xM), em que x representa a concentrao de KCl na soluo. Estes elctrodos encontram-se geralmente disponveis comercialmente com concentraes de

KCl de 0,1 M, 1 M e saturado (aproximadamente igual a 4,6 M). O elctrodo mais

utilizado o saturado devido facilidade de preparao e manuteno. O potencial do

elctrodo calomelanos saturado de 0,248 V a 20 C. A reaco do elctrodo calomelanos

traduzida pela seguinte equao qumica:

Hg2Cl2(s) + 2e- 2Hg(l) + 2 Cl- (aq) (2.1)

O elctrodo de calomelanos saturado, apresentado na figura 2.2, constitudo por

um tubo de vidro com comprimento entre 5 a 15 cm e o dimetro pode variar entre 0,5 a

1,0 cm. No seu interior encontra-se um tubo mais fino que contm uma pasta de

mercrio/cloreto de mercrio em cloreto de potssio saturado que est em contacto com a

soluo de cloreto de potssio do tubo externo atravs de uma pequena abertura. O

contacto com a soluo a analisar faz-se atravs de um disco poroso selado ao extremo

que preenche o tubo externo. A principal desvantagem deste elctrodo a sua

dependncia com a temperatura devido variao da solubilidade do KCl. Existem

tambm problemas de toxicidade devido utilizao do mercrio. Relativamente

primeira desvantagem apresentada, esta problemtica quando durante numa anlise

existem grandes variaes da temperatura. Um dos cuidados que se deve ter com este

elctrodo verificar se este est saturado com cloreto de potssio antes e durante a

realizao da experincia e durante toda a anlise, para alm de se verificar se a soluo

onde fica imerso, quando armazenado, est tambm saturada.


37


Figura 2.2 Diagrama de um elctrodo de calomelanos saturado, comercial.

b) Elctrodo de prata-cloreto de prata

Contrariamente ao elctrodo de calomelanos, o elctrodo de prata-cloreto de prata

apresenta uma grande estabilidade relativamente temperatura que permite a sua

utilizao at 275 C, representando-se esquematicamente por AgAgCl (s), KCl (xM). O potencial deste elctrodo 0,208 V a 20 C e a reaco de reduo :

AgCl (s) + e- Ag(s) + Cl-(aq) (2.2)

A preparao deste elctrodo faz-se a partir da deposio de uma camada de

cloreto de prata num fio ou folha de prata e mergulhando numa soluo saturada de

cloreto de potssio e cloreto de prata.


38


2.2.2. Microelctrodos

No decorrer deste trabalho foram utilizados microelctrodos de disco de platina

construdos no laboratrio.

a) Construo

Os microelctrodos utilizados foram preparados a partir da seco transversal de

fios de platina com dimetros apropriados. Inicialmente cortou-se um segmento de fio de

platina de aproximadamente 3 cm. A microfibra foi colada a um fio condutor de niquel-

crmio de maior expessura. A cola utilizada foi uma cola condutora de prata (lcolit

340) resistente a elevadas temperaturas. Em seguida, os fios colados foram colocados

numa estufa a 60 C para efectuar a secagem da cola durante aproximadamente 12 horas. Os fios, aps prvio arrefecimento ao ar, foram introduzidos num suporte de vidro,

semelhante a uma pipeta de Pasteur. Este tubo foi previamente submetido a uma limpeza

e secagem recorrendo-se ao procedimento descrito em 2.1.2. A introduo fez-se atravs

da abertura mais apertada do tubo de vidro para que a microfibra ficasse nesta

extremidade e o ponto de colagem ficasse na parte em que o tubo comea a alargar (figura

2.3).

c)

a)

b)

Figura 2.3 Representao esquemtica do conjunto a) de um microfio de platina, b) do fio condutor de

nquel crmio, c) inserido no tubo de vidro.


39


A selagem do microelctrodo foi efectuada num forno constitudo por um fio

condutor em nquel crmio em forma de hlice, ligado a um gerador de corrente. A

extremidade do tubo em vidro que se pretende selar foi inserida cuidadosamente no

interior da hlice. A temperatura do forno controlada pela diferena de potencial

aplicada entre as duas extremidades. Por efeito de Joule, a selagem da fibra na

extremidade do tubo ocorre como consequncia da dilatao do vidro. A posio do tubo

foi ajustada continuamente de modo a selar este microfibra num comprimento mais ou

menos 1 mm. A intensidade de corrente foi diminuda lentamente at se desligar o

gerador. Aps arrefecimento do tubo de vidro, este foi retirado cuidadosamente da hlice.

A extremidade superior do fio condutor de nquel crmio foi fixada na abertura superior

do tubo de vidro com silicone. Seguidamente, a extremidade selada do tubo lixada numa

lixa de gua de modo a expor a extremidade da microfibra e se obter uma superfcie plana

transversal a esta. Por ltimo efectuam-se sucessivos polimentos em camuras

(Microcloth) e com alumina de polimento (Micropolish), com granulometria decrescente:

3,0, 0,3 e 0,05 m. Depois de polir devidamente o microelctrodo, este foi submetido a uma anlise

cuidadosa utilizando-se uma lupa estereoscpica (Olimpus, VMZ 1 - 4), tendo em ateno os seguintes parmetros:

- ligao entre a microfibra e o fio de ligao; este contacto pode-se descolar quando se

introduz o conjunto no suporte de vidro ou por aco do calor a que fica submetido na

fase de selagem.

- bolhas de ar ao longo da microfibra; a existncia de bolhas de ar na zona de selagem

entre a microfibra e o vidro deve ser verificada j que a sua presena faz com que a rea

do microelctrodo seja diferente da seco recta da microfibra e a superfcie exposta no

seja um disco, no sendo possvel determinar este dimetro.

- superfcie do microelctrodo; esta deve ser observada de modo a verificar a

existncia de bolhas de ar. Ainda que estas existam, pode-se recuperar o microelctrodo,

lixando a parte onde estas esto presentes.


40


b) Calibrao

Durante o trabalho experimental foram utilizados dois microelctrodos de platina,

de dimetros diferentes. O dimetro dos microelctrodos foi determinado a partir da

intensidade de corrente de difuso dos voltamogramas de estado estacionrio obtidos com

uma soluo padro de hexacianoferrato de potssio (4,02 10-3 M) utilizando-se o cloreto de potssio como electrlito suporte (KCl, Merck, p.a., MM = 74,56 g/mol) de

concentrao 0,10 M. Os ensaios foram realizados temperatura ambiente.

A equao qumica que traduz a reaco electroqumica a seguinte:

Fe(CN)64- Fe(CN)63- + e- (2.3)

Considerando o coeficiente de difuso do hexacianoferrato de potssio (D = 7,6 10-6 cm2s-1 [57]), determinou-se o valor do raio dos elctrodos, pela expresso 1.14 da

Introduo Terica.

Tabela 2.2 Valores dos raios e dimetros dos microelctrodos e desvios associados.

Microelctrodo Raio (m)

(m)

1 12,2 0,7 24 1 2 24,91 0,02 49,82 0,04

c) Limpeza

Os microelctrodos foram polidos, antes de se efectuar cada um dos ensaios, numa

polideira Buehler, utilizando uma camura para polimento, Microcloth, e alumina (xido

de alumnio) para polimento, Micropolish, de 0,05 m. Seguidamente foram lavados com gua desionizada e secos com papel absorvente. Numa primeira etapa deste trabalho

foram feitos alguns ensaios para se verificar a necessidade de efectuar este polimento


41


antes de se iniciar cada um dos ensaios. Como se verificou que a reprodutibilidade

melhorava com este tratamento, este foi sempre efectuado.

2.3. Procedimento experimental

A clula electroqumica foi colocada numa caixa de Faraday. O elctrodo de

referncia e o microelctrodo previamente limpos (2.2.1 e 2.2.2) foram colocados na

clula e ligados ao Potenciostato/Galvanostato, Autolab, e terra. Os sinais

electroqumicos foram adquiridos no computador atravs de software adequado (GPES

4.6), figura 2.4.

Figura 2.4 Potenciostato/Galvanostato Autolab acoplado a um computador similar ao utilizado no decorrer do trabalho.

A voltametria de varrimento linear (LSV) e a voltametria de onda quadrada

(SWV) foram as tcnicas utilizadas na anlise de culturas e suspenses de clulas das

duas espcies de leveduras estudadas. A primeira tcnica foi tambm utilizada na

calibrao dos microelctrodos (2.2.2 b)).

2.3.1. Voltametria de varrimento linear em estado estacionrio

O valor da velocidade de varrimento foi determinado atravs da realizao de

ensaios prvios nos quais se verificaram que o valor mais adequado para este parmetro

de 50 mV/s para os microelctrodos utilizados. Para velocidades de varrimento prximas


42


e inferiores a esta, a resposta voltamtrica parece ser independente da base de tempo da

experincia, isto , da velocidade de varrimento.

2.3.2. Voltametria de onda quadrada

A determinao dos parmetros experimentais caractersticos desta tcnica foi

efectuada a partir de alguns ensaios preliminares nos quais se variou a frequncia, o

potencial de patamar a patamar e a amplitude, avaliando a reprodutibilidade e a forma das

respostas obtidas. Os parmetros escolhidos foram, para a frequncia 8 Hz, um

incremento de potencial 5 mV e amplitude de patamar a patamar de 25 mV.

2.4. Estimativa das incertezas experimentais

Na anlise voltamtrica de suspenses de clulas e de culturas ao longo do tempo

foram registados pelo menos 5 determinaes em cada experincia. Nos ensaios

cromatogrficos apenas se realizaram duas rplicas.

Os resultados das determinaes experimentais so apresentados com o erro

associado, expresso em termos de desvio padro.

A mdia aritmtica, x , calculada pela seguinte forma:

nxx i= (2.4)

onde xi o valor da rplica i e n o numero de rplicas.

A disperso dos resultados avaliada atravs do desvio padro (s):

( )1n

xxs i

i

=

(2.5)

Embora as tcnicas utilizadas conduzissem a valores reprodutveis, em alguns

casos foi necessrio desprezar algum resultado que no se apresentava concordncia com

os restantes.

A rejeio de valores foi baseada no teste Q, de acordo com a seguinte expresso:


43


menorvalormaiorvalorsuspeitodoprximomaisvalorsuspeitovalorQ

= (2.6)

O valor suspeito era rejeitado nos casos em que o Q calculado pela expresso 2.6

era superior ao valor Q tabelado, para uma probabilidade de 90 %.

As incertezas associadas s concentraes e factores de diluio foram

determinadas considerando a propagao das incertezas aleatrias:

2

n

n2

2

22

1

1xx

.......xx

xx

CC

++

+

= (2.7)

onde C a concentrao analtica ou outra varivel que se relaciona com esta (tal como o

factor de diluio) e x1, x2 e xn so variveis experimentais utilizadas no clculo de C que

esto afectadas de incertezas aleatrias x1, x2 e xn.As equaes das rectas apresentadas foram obtidas pelo mtodo dos mnimos

quadrados. Os desvios padro da ordenada na origem e do declive foram determinados de

modo a obter-se os intervalos de confiana destes parmetros.

Os parmetros de cada uma das rectas foram calculados pelas seguintes

expresses:

[ ]

=i

2i

iii

)xx(

)yy)(xx(b

(2.8)

xbya = (2.9)

onde b o declive da recta e a a ordenada na origem, x e y so os valores mdios de x e

y, isto , das grandezas representadas nas ordenadas e nas abcissas.

A qualidade do ajuste obtido quantificada atravs do valor do coeficiente de

correlao, r.


44


( )( )[ ]( ) ( )

=

2

ii

2

ii

iii

yyxx

yyxxr (2.10)

O desvio padro da ordenada na origem, sa, pode ser calculado pela seguinte

expresso:

( )

=

i

2i

i

2i

x/yaxx(n

xss (2.11)

onde sy/x a estimativa do desvio padro dos pontos experimentais y recta de regresso,

dado por:

2n

yys

i

2

i^

i

x/y

=

(2.12)

onde a estimativa de y, dada pela recta de regresso. ^y

O desvio padro do declive da recta, sb dado por:

( ) =i

2i

x/yb

xx(

ss (2.13)

Os valores de sa e de sb podem ser utilizados para estimar os intervalos de

confiana para o declive e a ordenada na origem:

b t sb e a t sa (2.14)

onde o valor de t o correspondente ao nvel de confiana desejado para n-2 graus de

liberdade.


45


Limites de deteco e quantificao

O limite de deteco, corresponde quantidade mnima que possvel detectar

pelo mtodo, ou seja, a concentrao para a qual o sinal obtido significativamente

diferente do branco, pode ser calculado para o mtodo da curva de calibrao pela

seguinte expresso:

bas3d.d.l a = (2.15)

O limite de quantificao corresponde concentrao mnima para a qual a

medida tem significado quantitativo, e para o mtodo da curva de calibrao,

normalmente calculado pela seguinte expresso:

bas10q.d.l a = (2.16)

Para determinao das concentraes das espcies detectadas nas amostras de

sobrenadantes, por interpolao em rectas de calibrao, a incerteza associada foi

determinada atravs da seguinte expresso:

2i

i

2

20x/y

x)xx(b

)yy(n1

m1

bs

s0

++=

(2.17)

onde n o nmero de pontos experimentais utilizados na definio da recta de calibrao e

m o nmero de rplicas do sinal medido, y0, na soluo a analisar.


46


3. Estudos microbiolgicos

3.1.Microrganismos

Nas experincias realizadas utilizou-se como material biolgico as leveduras

Saccharomyces cerevisiae e Pichia jadinii sendo esta ltima mais conhecida por Candida

utilis, no seu estado anamrfico.

3.2. Meios de cultura 3.2.1. Meio de manuteno

As leveduras foram mantidas a 25 C em meio de cultura, cuja composio foi a

seguinte: glucose 2% (p/v), peptona 1% (p/v), extracto de levedura 0,5% (p/v), agar 2%

(p/v) e gua desionizada q.b.. O meio foi liquefeito no microndas durante 5 minutos e

depois distribudo em tubos de ensaio ( 5 mL/tubo). Seguidamente, procedeu-se esterilizao do meio em autoclave durante 20 minutos a 1 atm e foi deixado a solidificar,

inclinando os tubos de ensaio cerca de 10. A repicagem das leveduras foi feita com uma

periodicidade de 48 horas com uma ansa esterilizada.

3.2.2. Meio de crescimento

As clulas de cada uma das leveduras, com um crescimento de 48 horas em meio

de manuteno, foram inoculadas nos meios lquidos utilizados, meio K, meio contendo

cido lctico 0,5 % e meio contendo etanol 0,5%. Os trs meios eram constitudos por um

meio mineral, uma fonte de carbono e energia e suplementados com vitaminas e


47


oligoelementos. A constituio do meio mineral est indicada na tabela 2.3 e foi a mesma

nos trs meios variando apenas a fonte de energia e carbono.

Tabela 2.3 Concentraes dos componentes do meio base e erros associados (C (% p/v)).

Componentes C (% p/v) MM g/mol

Marca

Sulfato de amnio (NH4)2SO4 0,5000 0,0002 132,06 Dihidrogenofosfato de potssio KH2PO4 0,5000 0,0002 136,06 Merck Sulfato de magnsio MgSO4.7H2O 0,05000 0,00002 246,48 Cloreto de clcio CaCl2.2H2O 0,013240 0,000005 147,02

A glucose, o cido lctico e o etanol foram as fontes de carbono e energia

constituintes respectivamente do meio K, meio com cido lctico e meio com etanol.

Para a preparao de um litro de meio K foram dissolvidos, em 700 mL de gua

desionizada, os reagentes correspondentes preparao de um litro de meio mineral e nos

restantes 300 mL de gua dissolveu-se a quantidade de glucose necessria para obter a

concentrao final de 2,000 0,0008 % (p/v). As solues foram esterilizadas por calor hmido num autoclave durante 20 minutos a 1 atm e antes de serem utilizadas, foram

misturadas, assepticamente.

Na preparao dos outros dois meios dissolveu-se com os reagentes constituintes

do meio mineral a quantidade necessria de cido lctico ou de etanol para se obter uma

concentrao final de 0,500 0,002 % (v/v) em 1 L de soluo. O meio contendo cido lctico foi esterilizado aps a adio do cido lctico enquanto que no meio contendo

etanol, este s foi adicionado assepticamente depois da esterilizao do meio mineral.

Quando foi necessrio acertar o pH do meio de cultura, procedeu-se ao ajuste do

pH do meio mineral, com NaOH 10 M ou HCl 1 M. No caso do meio contendo cido

lctico, o pH da soluo do mesmo era ajustado ao valor do pH de crescimento antes de

proceder esterilizao do mesmo.

Nos trs meios de cultura, por cada litro adicionou-se, tambm assepticamente, 0,5

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