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Ministrio da SadeFundao Oswaldo CruzInstituto Ren Rachou
ASPECTOS IMUNOLGICOS CELULARES E HUMORAIS NA
FASE CRNICA DA DOENA DE CHAGAS
Ps-graduao em Cincias da Sade
Biologia Celular e Molecular
TESE DE DOUTORADO
Danielle Marquete Vitelli Avelar
Laboratrio de Biomarcadores de Diagnstico e Monitorao - IRR/FIOCRUZ
Belo Horizonte
Maro de 2008
Orientador: Dr. Olindo Assis Martins Filho
Co-orientadora: Dra. Silvana Maria Eli Santos
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DANIELLE MARQUETE VITELLI AVELAR
ASPECTOS IMUNOLGICOS CELULARES E HUMORAIS NA
FASE CRNICA DA DOENA DE CHAGAS
Orientador: Dr. Olindo Assis Martins Filho
Co-orientadora: Dra. Silvana Maria Eli Santos
Belo Horizonte, 26 de Maro de 2008.
Ps-graduao em Cincias da Sade
Biologia Celular e Molecular
EXAMINADORES
Dr. Paulo Renato Zuquim Antas IOC/FIOCRUZ
Dra. Walderez Ornelas Dutra ICB/UFMG
Dra. Juliana de Assis Silva Gomes Estanislau IRR/FIOCRUZ
Dr. Marco Antnio da Silva Campos IRR/FIOCRUZ
Dra. Cristiana Toscano Fonseca IRR/FIOCRUZ (suplente)
Ministrio da SadeFundao Oswaldo CruzInstituto Ren Rachou
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Catalogao-na-fonte Rede de Bibliotecas da FIOCRUZ Biblioteca do CPqRR Segemar Oliveira Magalhes CRB/6 1975 V841a 2008
Vitelli-Avelar, Danielle Marquete. Aspectos imunolgicos celulares e humorais na fase
crnica da doena de Chagas, ou, Humoral and Cellular immunological aspects of chronic Chagas disease / Danielle Marquete Vitelli-Avelar. Belo Horizonte, 2008. xiv, 145 f: il.; 210 x 297mm. Bibliografia: f. 130 - 140 Tese (doutorado) Tese para obteno do ttulo de
Doutora em Cincias pelo Programa de Ps-Graduao em Cincias da Sade do Centro de Pesquisas Ren Rachou. rea de concentrao: Biologia Celular e Molecular. 1. Doena de Chagas/imunologia 2. Citometria de
Fluxo/mtodos 3. Citocinas/imunologia I. Ttulo. II. Martins-Filho, Olindo Assis (Orientao). III. Eli-Santos, Silvana Maria (Co-orientao)
CDD 22. ed. 616.936 3
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LOCAL DE DESENVOLVIMENTO DA TESE
Laboratrio de Biomarcadores de Diagnstico e Monitorao do Instituto Ren
Rachou/FIOCRUZ.
COLABORADORES
LABORATRIO DE TRIATOMNEOS IRR/ FIOCRUZ
Dr. Joo Carlos Pinto Dias
LABORATRIO DE BIOMARCADORES DE DIAGNSTICO E MONITORAO IRR/
FIOCRUZ
Renato Sathler Avelar, Andra Teixeira de Carvalho, Ana Paula Barbosa Wendling e Paula
Souza Lage
POSTO AVANADO DE PESQUISAS EMANUEL DIAS BAMBU
Dr. Joo Soares Moreira Magalhes e Paulo Lamunier
UNIVERSIDADE FEDERAL DO TRINGULO MINEIRO UBERABA/MG
Prof. Aluzio Prata
UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO Ouro Preto/MG
Profa. Marta de Lana
RGOS FINANCIADORES
CPqRR/FIOCRUZ, CNPq (no: 4758058-2003 e 481097-2004) e UNICEF/UNDP/World
Bank/WHO Special Program for Research and Training in Tropical Disease (TDR) (no: A30451).
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DDDDedico este trabalho aos meus maiores
incentivadores: meus pais, minha irm e ao
meu marido Renato. Muito obrigada por
tanta dedicao, compreenso e acima de
tudo pelo amor.
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AGRADECIMENTOS
A Deus, sempre, por ter iluminado as minhas escolhas e ter colocado pessoas especiais no meu
caminho.
Ao Dr. Olindo Assis Martins Filho pelo apoio incondicional desde a iniciao cientfica, por sua
incansvel atuao - crticas, correes de contedo e forma, sugestes, suporte tcnico e
literatura cientfica, capacitando-me a desenvolver reflexes crticas para responder aos desafios
e exigncias de um futuro acadmico. Obrigada por incentivar-me a fazer o melhor, sempre.
Dra. Silvana Maria Eli Santos pela colaborao na interpretao dos resultados, correo
desta tese e pelas constantes palavras de apoio e incentivo.
Ao Dr. Joo Carlos Pinto Dias pelo empenho na seleo de pacientes, no envio das amostras de
sangue e por compartilhar seus valiosos conhecimentos sobre a doena de Chagas.
Ao Paulo Lamunier pela coleta do sangue dos pacientes.
Aos doadores de sangue cuja participao foi imprescindvel para a realizao deste trabalho.
s estudantes e amigas Andra Teixeira, Roberta Dias, Vanessa Pascoal e Ariane Massine pelos
ensinamentos cientficos, principalmente de citometria de fluxo e pela torcida. Admiro o trabalho
de vocs.
Aos amigos do Laboratrio de Biomarcadores de Diagnstico e Monitorao e do Laboratrio de
Imunologia Celular e Molecular pela rica convivncia.
Paula Souza Lage pelo auxlio nas anlises dos dados de citometria, pelo empenho e dedicao
em aprender e pelo convvio.
Natlia velin Martins que em seu primeiro contato com a cincia demonstrou astcia e
entusiasmo me enchendo de orgulho.
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Lisiane, Fabiana, Cntia, Eliandra e Bia pelo apoio tcnico de qualidade e amizade.
Roberta Flix e Clari Gandra pela eficincia e amizade.
Ao Paulo, Neide, Andra e Cris da Secretaria da Ps-graduao.
Anna Carolina da estatstica pelo esforo em me ajudar na escolha dos melhores testes.
Ao Segemar pela presteza.
E em especial a Cristiano Lara Massara que tornou realidade o meu sonho - sem ele nada disso
teria sido possvel.
Aos professores da Ps-graduao do Centro de Pesquisas Ren Rachou pelos ensinamentos.
Aos doutores lvaro Jos Romanha e Rodrigo Corra Oliveira, diretores do Centro de Pesquisa
Ren Rachou.
Aos funcionrios do Centro de Pesquisas Ren Rachou.
Jane e John por acreditarem e investirem nos potenciais meu e do Renato.
So muitas as pessoas e instituies que merecem os meus agradecimentos e eu, mesmo que
fizesse a mais longa lista, correria o risco de cometer injustias.
Finalmente, minha famlia e amigos, por estarem presentes nos momentos de alegria, de
desespero e lgrimas, sempre torcendo pelo meu sucesso.
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"Todo o interesse na doena e na morte apenas
uma outra forma de interesse pela vida
Thomas Mann (1875-1955)
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RESUMO
Diversos estudos que avaliam os mecanismos imunolgicos associados manifestao de
diferentes formas clnicas da doena de Chagas tm sugerido eventos multifatoriais. Com esse
estudo, nosso objetivo foi adicionar novos elementos complexa rede imunolgica que envolve a
interao parasita-hospedeiro e as distintas manifestaes clnicas da doena de Chagas crnica,
indeterminada (IND), cardaca (CARD) e digestiva (DIG). Para esse objetivo, realizamos uma
anlise detalhada de caractersticas fenotpicas da resposta imune com nfase na anlise
imunofenotpica de clulas mononucleares do sangue perifrico, no perfil de citocinas
intracitoplasmticas de leuccitos circulantes bem como na magnitude da resposta de IgG anti-
Trypanosoma cruzi. Nossos principais achados demonstraram elevadas freqncias de clulas
reguladoras CD4+CD25high e NKT, associadas com nveis aumentados de clulas NK citotxicas
circulantes em IND, enquanto percentuais aumentados de linfcitos T CD8+HLA-DR+ foram
observados em CARD e DIG. Adicionalmente, nossos dados demonstraram valores aumentados
de clulas pr-NK, alm de elevados valores de moncitos pr-inflamatrios e linfcitos B
ativados, contrastando com a ativao diminuda de clulas T e diminuio da freqncia de
clulas T reguladoras CD4+CD25high marcos do estgio recente (E-IND) da doena de Chagas
crnica. Anlise comparativa transversal entre E-IND, IND e CARD ainda sugeriu que uma
mudana em direo a altos valores de macrfagos-like e nveis basais de moncitos pr-
inflamatrios alm de elevados valores de clulas NK maduras, NKT e CD4+CD25high podem
resultar na forma clnica IND. Por outro lado, altos nveis de clulas CD8+HLA-DR+ paralelo a
nveis basais de clulas NK maduras, NKT e CD4+CD25high podem levar a doena cardaca. Alm
disso, freqncia aumentada de linfcitos totais alto-produtores de IL-4, IL-10 e IL-13 e um
perfil misto de citocinas derivadas de NK e neutrfilos foram marcos do grupo IND, enquanto
freqncias aumentadas de moncitos alto-produtores de TNF- e baixas freqncias de
linfcitos T CD8+IL-10+ foram as principais caractersticas de CARD. A avaliao do perfil de
citocinas de leuccitos circulantes aplicando a estratgia de viso panormica demonstrou que
enquanto a maioria dos IND apresentam um perfil de citocinas reguladoras, a maioria dos CARD
apresentam um micro-ambiente de citocinas inflamatrias. Apesar dos nossos achados
corroborarem com relatos prvios de perfis distintos de anticorpos IgG anti-T. cruzi entre IND e
CARD, eles indicaram que marcadores da resposta imune humoral so, sem dvida, mais
aplicveis para diagnstico sorolgico e monitorao de critrio de cura. Em suma, nossos dados
demonstram que, mais que uma mudana em direo a um padro polarizado, um fino balano
relevante para direcionar os mecanismos imuno-mediados essenciais para a definio da doena
de Chagas.
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ABSTRACT
Studies on immunological mechanisms associated with different clinical forms of Chagas disease
have suggested multifactorial events for the disease development. Herein, we intended to add
new elements to the complex immunological network underlying the parasite-host relationship
and the distinct clinical outcome of chronic Chagas disease, referred as indeterminate (IND),
cardiac (CARD) and digestive (DIG) clinical forms. For this purpose, we have performed a
detailed analysis of phenotypic features of the immune response emphasizing the ex vivo
immunophenotype of peripheral blood mononuclear cells, the intracitoplasmatic cytokine profile
of circulating leukocyte subsets as well as the magnitude of anti-Trypanosoma cruzi IgG immune
response. Our major findings demonstrated that higher frequency of both CD4+CD25high and
NKT regulatory cells, associated with increased levels of circulating cytotoxic NK cells was
observed in IND whereas increased percentage of CD8+HLA-DR+ T-lymphocytes subset was
exclusively associated with CARD and DIG. Additionally, our data demonstrated that increased
values of pre-NK-cells besides higher values of proinflammatory monocytes and activated B
lymphocytes contrasting with the impaired T- lymphocytes activation and decreased frequency of
CD4+CD25high regulatory T lymphocytes was the hallmark of early stage (E-IND) of chronic
Chagas disease. Comparative cross-sectional analysis among E-IND, IND and CARD further
suggested that a shift toward high values of macrophage-like cells and basal levels of
proinflammatory monocytes besides high values of mature NK cells, NKT and regulatory T cells
may account for IND clinical form outcome. On the other hand, the upsurge of high levels of
CD8+HLA-DR+ cells parallel with basal levels of mature NK cells, NKT and CD4+CD25high cells
might lead to cardiac disease. Moreover, enhanced frequency of total lymphocytes high
producers of IL-4, IL-10 and IL-13 besides a mixed pattern of NK and neutrophil-derived
cytokines was the hallmark of IND, whereas enhanced frequency of TNF- producing monocytes
and lower frequency of IL-10 producing CD8+ T-cells was the major features of CARD. The
assessment of the cytokine profile of circulating leukocytes applying the panoramic overview
strategy demonstrated that while most IND presented a regulatory cytokine profile, the majority
of CARD displayed a particular inflammatory cytokine milieu. Despite our findings corroborate
previous reports of distinct profiles of anti-T. cruzi IgG between IND and CARD, they indicated
that the humoral immune response biomarkers are indeed more applicable to the serological
diagnosis and cure criteria monitoring. Altogether, our data demonstrated that more than shift
toward a polarized pattern, a fine balance is relevant to drive the resultant immune-mediated
mechanisms underlying the chronic Chagas disease outcome.
-
SUMRIO
LISTA DE TABELA................................................................................................................ i
LISTA DE FIGURAS.............................................................................................................. ii
LISTA DE ABREVIATURAS................................................................................................ iii
1. INTRODUO.................................................................................................................... 1
2. OBJETIVOS......................................................................................................................... 17
2.1. Objetivo Geral................................................................................................................... 18
2.2. Objetivos Especficos......................................................................................................... 18
2.3. Tpicos de Investigao.................................................................................................... 19
3. MATERIAL E MTODOS................................................................................................. 20
3.1. Populao de estudo.......................................................................................................... 21
3.2. Anlise do fentipo celular dos leuccitos do sangue perifrico................................... 26
3.2.1. Protocolo de imunofenotipagem celular por citometria de fluxo............................ 26
3.2.2. Estratgias para anlises imunofenotpicas de leuccitos circulantes................... 28
3.2.2.1. Anlise convencional.................................................................................. 28
3.2.2.2. Anlise de clulas T reguladoras................................................................ 29
3.2.2.3. Anlise do marcador CD56 em subpopulaes de clulas CD3-CD16+..... 30
3.2.2.4. Anlise de subpopulaes de clulas CD3-CD56+..................................... 31
3.2.2.5. Anlise de clulas NKT.............................................................................. 33
3.2.2.6. Anlise combinada gated........................................................................ 34
3.2.2.7. Anlise de moncitos pr-inflamatrios..................................................... 35
3.3. Avaliao do padro de produo de citocinas citoplasmticas em leuccitos
circulantes..................................................................................................................................
36
3.3.1. Obteno do antgeno solvel de formas tripomastigotas do T. cruzi.................... 36
3.3.1.1. Cultivo de formas tripomastigotas do T. cruzi........................................... 36
3.3.1.2. Preparo do antgeno solvel de formas tripomastigotas do T. cruzi........... 37
3.3.2. Protocolo de cultura de curta durao in vitro empregando amostras de sangue
total.................................................................................................................................... 38
-
3.3.3. Protocolo de marcao de citocinas intracitoplasmticas em leuccitos do
sangue perifrico aps cultura de curta durao in vitro.................................................
39
3.3.4. Aquisio de dados para avaliao do perfil de expresso de citocinas
intracelulares.....................................................................................................................
41
3.3.5. Estratgias de anlises de citocinas intracitoplasmticas em subpopulaes de
leuccitos circulantes........................................................................................................
42
3.3.5.1. Anlise de citocinas intracitoplasmticas em moncitos............................ 42
3.3.5.2. Anlise de citocinas intracitoplasmticas em neutrfilos........................... 43
3.3.5.3. Anlise de citocinas intracitoplasmticas em clulas NK.......................... 44
3.3.5.4. Anlise de citocinas intracitoplasmticas em linfcitos totais................... 45
3.3.5.5. Anlise de citocinas intracitoplasmticas em subpopulaes de linfcitos
T e por linfcitos B..................................................................................................
45
3.3.5.6. Anlise de citocinas intracitoplasmticas em clulas B1........................... 46
3.3.6. Modelo panormico de anlise imunofenotpica por citometria de fluxo............... 47
3.4. Estudo da reatividade de IgG total anti-EPI (FC-AFEA) e IgG1 anti-TRIPO (FC-
ALTA) por citometria de fluxo................................................................................................
48
3.4.1. Obteno de preparaes antignicas do T. cruzi.................................................. 48
3.4.1.2. Cultivo de formas epimastigotas do T. cruzi.............................................. 48
3.4.1.3. Cultivo de formas tripomastigotas do T. cruzi........................................... 48
3.3.2. Protocolo de imunofluorescncia indireta por citometria de fluxo............... 49
3.3.3. Estratgias de anlises dos resultados.......................................................... 50
3.5. Anlise estatstica............................................................................................................... 52
4. ARTIGOS.............................................................................................................................. 55
4.1- Artigo 1: Chagasic patients with indeterminate clinical form of the disease have
high frequencies of circulating CD3+CD16-CD56+ natural killer T cells and
CD4+CD25High regulatory T lymphocytes..............................................................................
56
4.2- Artigo 2: Are increased frequency of macrophage-like and natural killer (NK)
cells, together with high levels of NKT and CD4+CD25high T cells balancing activated
CD8+ T cells, the key to control Chagas' disease morbidity?...............................................
68
4.3- Artigo 3: New strategy to assess the overall cytokine profile of circulating
leukocytes and decode distinct clinical status of human Chagas disease............................
-
leukocytes and decode distinct clinical status of human Chagas disease............................ 81
4.4- Artigo 4: Non-conventional flow cytometry approaches to detect anti-Trypanosoma
cruzi immunoglobulin G in the clinical laboratory...............................................................
109
CONSIDERAES FINAIS................................................................................................... 121
REFERNCIA BIBLIOGRFICA........................................................................................ 130
ANEXO...................................................................................................................................... 141
-
i
LISTA DE TABELA
Tabela 1: Populao de estudo.................................................................................................. 25
Tabela 2: Anticorpos monoclonais marcados com fluorocromos utilizados para anlise de
populaes, subpopulaes celulares e molculas de superfcie................................................
27
Tabela 3: Anticorpos monoclonais marcados com fluorocromos utilizados para anlise de
populaes e subpopulaes de leuccitos do sangue perifrico...............................................
41
Tabela 4: Anticorpos monoclonais utilizados para identificao de citocinas intracelulares
em leuccitos do sangue perifrico.............................................................................................
41
-
ii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Seqncia de procedimentos utilizados para as anlises dos percentuais de
populaes celulares por citometria de fluxo.............................................................................
29
Figura 2: Seqncia de procedimentos utilizados para as anlises dos percentuais de clulas
T reguladoras (CD4+CD25HIGH) por citometria de fluxo............................................................
30
Figura 3: Seqncia de procedimentos utilizados para as anlises dos percentuais das
subpopulaes de clulas NK: pr-NK (CD3-CD16+CD56-) e NK madura (CD3-
CD16+CD56+) por citometria de fluxo.......................................................................................
31
Figura 4: Seqncia de procedimentos utilizados para as anlises dos percentuais das
subpopulaes CD3-CD56DIMCD16-/+ e CD3-CD56BRIGHTCD16-/+ por citometria de fluxo.....
32
Figura 5: Sequncia de procediementos utilizados para as anlises dos percentuais das
subpopulaes NKT1 (CD3+CD16+CD56-), NKT2 (CD3+CD16-CD56+) e NKT3
(CD3+CD16+CD56+) por citometria de fluxo.............................................................................
34
Figura 6: Seqncia de passos utilizados para as anlises de subpopulaes de clulas T
CD4+ ou CD8+ ativadas (HLA-DR+) por citometria de fluxo....................................................
35
Figura 7: Seqncia de procedimentos utilizados para as anlises dos percentuais de
moncitos pr-inflamatrios (CD14+CD16+HLA-DR++) por citometria de fluxo.....................
36
Figura 8: Anlise da produo de citocinas citoplasmticas por moncitos do sangue
perifrico por citometria de fluxo...............................................................................................
43
Figura 9: Anlise da produo de citocinas citoplasmticas por neutrfilos do sangue
perifrico por citometria de fluxo...............................................................................................
43
Figura 10: Anlise da produo de citocinas citoplasmticas por clulas NK do sangue
perifrico por citometria de fluxo...............................................................................................
44
Figura 11: Anlise da produo de citocinas citoplasmticas por linfcitos totais do sangue
perifrico por citometria de fluxo ..............................................................................................
45
Figura 12: Anlise da produo de citocinas citoplasmticas por clulas T-CD4+ do sangue
perifrico por citometria de fluxo...............................................................................................
46
Figura 13: Anlise da produo de citocinas citoplasmticas por clulas B1 do sangue
perifrico por citometria de fluxo...............................................................................................
46
Figura 14: Seqncia de passos utilizados para as anlises da reatividade de IgG anti-EPI e
IgG1 anti-TRIPO do T. cruzi por citometria de fluxo................................................................
51
-
iii
LISTA DE ABREVIATURAS
ADCC Citotoxicidade celular dependente de anticorpos
AL Anticorpos lticos
APCs Clulas apresentadoras de antgenos (antigen presenting cells)
ASC Anticorpos da sorologia convencional
B1 Linfcitos B CD5+
BSA Albumina srica bovina
CARD Indivduos portadores da forma clnica cardaca
CD14 Molcula expressa na superfcie de moncitos
CD16 Molcula expressa em clulas Natural Killer e moncitos
CD19 Molcula expressa em linfcitos B
CD25 Cadeia do receptor para a citocina IL-2
CD3 Molcula expressa em linfcitos T
CD4 Molcula expressa em linfcitos T auxiliares
CD5 Molcula expressa em linfcitos B1
CD8 Molcula expressa em linfcitos T citotxicos
CD56 Molcula de adeso presente em clulas Natural Killer
DIG Indivduos portadores da forma clnica digestiva
ECG Eletrocardiograma
EDTA Etilenodiaminotetractico
EPI Formas epimastigotas do Trypanosoma cruzi
FITC Isotiocianato de fluorescena
FL Fluorescncia
FSC Tamanho (forward scatter)
HAI Reao de hemaglutinao indireta
HLA Antgeno Leucocitrio Humano
Id Anticorpo anti-idiotipo
IFI Imunofluorescncia indireta
IFN- Interferon gama
Ig Imunoglobulina
-
iv
IgG Imunoglobulina G
IL Interleucina
IMF Intensidade Mdia de Fluorescncia
IND Indivduos portadores da forma clnica indeterminada
LIT Meio de cultivo para formas epimastigotas do Trypanosoma cruzi (Liver Infusion
Tryptose)
MFF Soluo Fixadora
MHC Complexo principal de histocompatibilidade
NI Grupo no infectado
NK Clulas Natural Killer
NKT Subpopulao de clulas T que expressa em sua superfcie receptores de clulas NK
NO xido Ntrico
PBS Tampo Fosfato Salnico
PBS-P PBS-W a 0,5% de saponina
PBS-W PBS a 0,5% de albumina srica bovina
PE Ficoeritrina
PPFP Percentual de Parasitos Fluorescentes Positivos
RPMI Meio de cultura (Rosweel Park Memorial Institute)
SBF Soro bovino fetal
SES Secretaria de Estado de Sade de Minas Gerais
SSC Granulosidade (side scatter)
TCR Receptor de clula T
TGF- Fator de Crescimento Transformante beta
TNF- Fator de Necrose Tumoral alfa
WHO Organizao Mundial da Sade (World Health Organization)
-
1. INTRODUO
-
Introduo
_________________________________________________________________________________________________________________________________
2
Carlos Chagas, mdico brasileiro, descobriu a doena de Chagas a aproximadamente
um sculo atrs e publicou sua primeira descrio em 1909. A descoberta dessa doena
consistiu em uma das mais importantes conquistas mdicas do Brasil. Carlos Chagas
descreveu tanto aspectos da biologia do agente etiolgico, o Trypanosoma cruzi, como da
clnica, epidemiologia e patogenia da doena (CHAGAS, 1909). Entretanto, apesar do avano
nos estudos da doena de Chagas nas ltimas dcadas, questionamentos ainda permanecem
relativos interao parasito-hospedeiro, progresso clnica da infeco e mecanismos
indutores de proteo e patologia.
Como parte das comemoraes do centenrio da descoberta da doena de Chagas, a
FIOCRUZ criou o Programa Integrado de Doena de Chagas-PIDC que tem como pilares (1)
estimular a cooperao intra-FIOCRUZ visando dar retorno sociedade quanto aos desafios
atuais da doena de Chagas; (2) assegurar contribuio efetiva da FIOCRUZ para o controle
da doena de Chagas no sculo XXI, estabelecendo metas de pesquisa e desenvolvimento
tecnolgico para 2009; (3) possibilitar a retomada de liderana da FIOCRUZ no campo da
pesquisa e interveno em doena de Chagas no seu segundo centenrio, fortalecendo as
interaes extramuros da FIOCRUZ; (4) articular projetos visando o estabelecimento de
compromissos de gerao de inovao na pesquisa em doena de Chagas e a captao de
financiamentos. Esse estudo, alm de outros desenvolvidos no Instituto Ren Rachou, vem
contribuir com os ideais do PIDC, uma vez que investiga mecanismos imunolgicos
envolvidos no estabelecimento/manuteno de diferentes formas clnicas da doena de
Chagas.
A doena de Chagas ocorre em reas rurais e peri-urbanas do Mxico, Amrica
Central e Amrica do Sul. Dados da Organizao Mundial da Sade mostram a ocorrncia de
vinte e uma mil mortes e a incidncia de duzentos mil novos casos ao ano na Amrica Latina
-
Introduo
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3
(WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2002), com 12 a 14 milhes de pessoas infectadas na
Amrica Latina (DIAS, 2007).
No Brasil, a doena de Chagas a quarta causa de morte entre as doenas infecto-
parasitrias, ocorrendo em uma rea de trs milhes de quilmetros quadrados. So cerca de
2.450 municpios, envolvendo uma populao de mais de 28 milhes de pessoas expostas ao
risco de contaminao e uma populao de aproximadamente cinco milhes de indivduos
infectados (DIAS et al., 1997). Nos ltimos 5 anos foram notificados mais de 470 casos de
infeco aguda, quase 90% deles ocorreram na Amaznia Legal, sendo 75% no Par
(BRASIL, s.d.).
Em regies onde os programas de controle do triatomneo, inseto vetor da doena, so
ineficazes, a infeco se d principalmente pelo contato da pele ou mucosa do hospedeiro
vertebrado com fezes e/ou urina do triatomneo contaminado pelo protozorio T. cruzi. Os
vetores se infectam quando formas tripomastigotas sangneas so ingeridas durante a suco
do sangue do hospedeiro vertebrado infectado. Uma vez no intestino posterior do inseto, as
formas tripomastigotas se transformam em formas epimastigotas, que se multiplicam por
diviso binria e, posteriormente, passam por alteraes morfolgicas e fisiolgicas
transformando-se em tripomastigotas metacclicos no reto do inseto, estando, ento aptas a
penetrar em clulas do hospedeiro mamfero. Essas formas, aps o repasto sangneo, so
eliminadas juntamente com as fezes do vetor, penetrando na pele lesada pela picada ou em
mucosas ntegras. Na regio de penetrao do parasito, ocorre a infeco de clulas
principalmente do sistema fagoctico - mononuclear e/ou do prprio tegumento. Aps ciclo
focal de poucos dias, o parasito se difunde por via hematognica e linftica, com
multiplicao em vrios rgos e tecidos, ocorrendo como caracterstica fundamental uma
intensa parasitemia, detectvel por exames parasitolgicos diretos. No interior de clulas, as
formas tripomastigotas se transformam em amastigotas, que conseguem escapar do vacolo
-
Introduo
_________________________________________________________________________________________________________________________________
4
parasitfago para o citoplasma, onde se inicia um processo de diviso binria. Aps a
multiplicao, as formas amastigotas transformam-se em tripomastigotas que rompem a clula
e, uma vez na circulao sangnea, podem infectar novas clulas ou serem ingeridas por
outro inseto vetor, dando continuidade ao ciclo biolgico do parasito (BRENER et al., 1973;
GARCIA et al., 1991; DIAS, 2000).
Quando se estudam os mecanismos de transmisso, observa-se que, alm da
transmisso vetorial, casos de transmisso alternativos, como a via transfusional (YOUNG et
al., 2007), congnita (DORN et al., 2007; GRTLER et al., 2003), por transplantes de rgos
(CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION, 2006) e acidentes
laboratoriais podem ser identificados. A via transfusional considerada a segunda via mais
freqente de infeco, tendo especial importncia epidemiolgica, uma vez que pode levar a
doena para reas sem transmisso natural (WENDEL, 1997; SCHOFIELD & DIAS 1999;
VINHAES & DIAS, 2000). Alm disso, em regies como na Amaznia, existem mecanismos
excepcionais de transmisso (vetorial domiciliar sem colonizao, vetorial extradomiciliar) e
a ocorrncia de surtos episdicos de transmisso oral (BRASIL, 2005a, COURA, 2006).
Recentemente, ocorreram surtos de doena de Chagas com forma aguda e morte por ingesto
de formas tripomastigotas dissolvidas em bebidas, como suco de cana e aa, em que os
insetos vetores silvestres, provavelmente, foram triturados durante o preparo ou suas fezes
contaminaram o alimento, conforme divulgado amplamente na mdia e no Guia de Vigilncia
Epidemiolgica do Ministrio da Sade (BRASIL, 2005b).
A anlise clnica e laboratorial de pacientes portadores da doena de Chagas permite
classificar a infeco em duas fases: aguda e crnica. A fase aguda caracteriza-se por
alteraes teciduais degenerativas e inflamatrias focais, devido a uma intensa multiplicao
local do parasito. Manifestaes sistmicas, como febre, mal estar, astenia, edema subcutneo,
linfadenomegalia, esplenomegalia e hepatomegalia, podem tambm ser observadas
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(LARANJA, 1953; REZENDE & RASSI, 1994; BRASIL, 2004). Entretanto, em geral, esses
sinais so atenuados e a fase inicial da doena passa desapercebida, confundindo-se com uma
"gripe" ou "mal estar" passageiro.
A evoluo da fase aguda para a fase crnica, que pode durar de poucas semanas a
meses, acompanhada pelo gradativo desaparecimento das manifestaes clnicas,
diminuio da parasitemia e elevao de anticorpos especficos da classe IgG. Os indivduos
portadores da infeco crnica podem ser classificados do ponto de vista clnico, como
pertencentes s formas indeterminada (IND), cardaca (CARD), digestiva (DIG) e
cardiodigestiva. A imensa maioria dos pacientes evolui para uma forma crnica
indeterminada, caracterizada pela sorologia positiva, ausncia de sinais, sintomas da doena e
eletrocardiograma-ECG e raio-X (corao, esfago e clon) normais. Os pacientes
apresentam de forma geral, bom estado de sade, desconhecendo, muitas vezes, a presena da
infeco. Estima-se que cerca de 50-60% dos indivduos infectados apresentam essa forma
clnica. Embora reconhecendo que o prognstico favorvel, sabe-se que, anualmente, cerca
de 2 a 5% desses indivduos evoluem para formas sintomticas da doena. Aps 20-30 anos
de infeco, cerca de 20-30% dos indivduos portadores da forma clnica IND desenvolvem a
forma CARD, resultante de danos progressivos do miocrdio, secundrios miocardite
fibrosante (DIAS, 1989; PRATA, 2001). A infeco chagsica pode levar ainda a dilataes
do esfago e clon, principais manifestaes da forma clnica DIG. Essa forma clnica ocorre
em menos de 10% dos indivduos portadores da doena, sendo resultado, principalmente, da
formao de fibrose e da destruio dos neurnios do sistema nervoso autnomo do trato
gastrointestinal (KOEBERLE & NADOR, 1955; DIAS, 1989; DA SILVEIRA et al.,
2007a,b). Pessoas infectadas pelo T. cruzi com o sistema imune debilitado (AIDS,
quimioterapia, terapias imunossupressoras) podem reativar a doena de Chagas com
abundante parasitemia sangunea e tecidual. Devido longa durao da forma assintomtica
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da infeco, a doena de Chagas considerada uma doena matadora silenciosa
(MAGUIRE, 2006), esse constitui um dos vrios motivos pelos quais a doena no atrai a
ateno da mdia (TARLETON et al., 2007).
O benzonidazol o composto disponvel para o tratamento da doena de Chagas no
Brasil. Esse composto apresenta srios efeitos colaterais, requer administrao por longos
perodos de tempo sob superviso mdica e h grande variao na susceptibilidade de isolados
do parasito ao dessa droga, sendo recomendado o tratamento de pacientes agudos e
crnicos recentes, nos quais se observam resultados positivos, principalmente em crianas
menores de 15 anos (URBINA & DOCAMPO, 2003). Apesar da maioria dos estudos
revelarem uma baixa eficincia desse frmaco durante a terapia de pacientes crnicos,
avaliaes recentes tm sugerido o tratamento de modo a retardar, ou mesmo evitar, a
evoluo da doena crnica (ANDRADE et al., 2004; DE CASTRO et al., 2006; VIOTTI et
al., 2006).
Uma questo chave que envolve a doena de Chagas o diagnstico. Sem um
diagnstico correto, indivduos infectados no podem ser identificados, conseqentemente,
tratados e a eficincia do tratamento no pode ser corretamente avaliada. O efeito de
campanhas de controle no pode ser avaliado sem ferramentas de diagnstico competentes.
Na fase crnica, os nveis de parasitemia encontram-se baixos e assim o diagnstico se baseia
na deteco da resposta sorolgica do hospedeiro. A maioria dos testes sorolgicos
disponveis emprega preparaes de antgeno bruto de formas epimastigotas do T. cruzi, nica
forma do ciclo de vida do parasito que no encontrada no hospedeiro vertebrado, podendo
ser responsvel pelos resultados falso-positivos. A especificidade desses ensaios tem sido
questionada devido freqncia de infeces com outros tripanosomatdeos que circulam na
mesma rea geogrfica do T. cruzi (Leishmania spp e Trypanosoma rangeli) e so
responsveis pela antigenicidade cruzada e resultados falso-positivos. A ausncia de um teste
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padro-ouro torna difcil a avaliao da sensibilidade de testes sorolgicos que podem ser
teis na avaliao rpida da eficcia do tratamento, do diagnstico de infeco congnita ou
para determinar o impacto de mtodos de controle de transmisso, compondo base para o
avano de todos os campos de pesquisa na doena de Chagas (TARLETON et al., 2007).
Os mecanismos especficos envolvidos com o estabelecimento/manuteno das
diferentes formas clnicas da doena de Chagas so complexos. No se sabe explicar como
alguns indivduos infectados desenvolvem formas graves da doena e nem o fato das
manifestaes clnicas serem to heterogneas. Acredita-se que as manifestaes patolgicas
tanto na fase aguda, quanto na fase crnica da doena de Chagas sejam conseqncia de
mecanismos multifatoriais relacionados tanto ao parasito quanto ao hospedeiro vertebrado.
Dentre os fatores relacionados ao parasito, anlises em camundongos revelaram que a
variabilidade das cepas, o tropismo, a antigenicidade e o tamanho do inculo so aspectos
relevantes (VAGO, 2000). Quanto ao hospedeiro, importante ressaltar o estado nutricional,
a faixa etria, o sexo e, especialmente, as caractersticas genticas e imunolgicas (DIAS,
2000; ARANTES et al.; 2007; CAMPBELL et al., 2004).
A resposta imune durante a infeco humana inicial pelo T. cruzi (aguda recente,
aguda tardia e crnica recente) no completamente entendida, apesar da sua funo crucial
no direcionamento das diferentes formas clnicas da infeco crnica. Estudos demonstram
que o T. cruzi induz uma forte ativao do sistema imune durante a infeco aguda e que os
diferentes mecanismos imunes induzidos durante estgios iniciais da fase crnica
indeterminada da infeco representam componentes essenciais da atividade imune presente
na fase crnica tardia (ANDRADE, 1991; BRENER & GAZZINELLI, 1997; MARINHO et
al., 1999; SATHLER-AVELAR et al., 2003; GOLGHER & GAZZINELLI, 2004). Na busca
de identificar diferenas na resposta imune relacionadas com o estabelecimento/manuteno
das distintas formas clnicas da fase crnica tardia da doena de Chagas, de suma
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importncia caracterizar subpopulaes leucocitrias majoritrias e minoritrias do sangue
perifrico de indivduos durante os eventos iniciais da infeco, assim como comparar com as
alteraes observadas em indivduos na fase crnica tardia da doena. Estudo fenotpico
realizado durante a infeco recente pelo T. cruzi, aps classificao com base na sorologia,
descreveu no grupo agudo recente uma supresso da atividade de linfcitos T, ativao de
linfcitos B e o favorecimento da migrao de moncitos para o foco inflamatrio. Na fase
aguda tardia, foi observada a ativao de clulas NK independente de clulas T e na fase
crnica recente foi encontrado um aumento na populao de linfcitos B ao lado de um
aumento na populao dos moncitos pr-inflamatrios sugerindo uma natureza independente
de linfcitos T (SATHLER-AVELAR et al., 2003). Esses autores acreditam que a imunidade
mediada por clulas T durante a forma clnica indeterminada recente da doena de Chagas
pode representar um fenmeno restrito aos focos inflamatrios, considerando relatos prvios
da presena de clulas T, principalmente linfcitos T CD8+, no infiltrado inflamatrio do
tecido cardaco de indivduos infectados pelo T. cruzi (FUENMAYOUR et al., 2005). Estudo
realizado em modelo experimental murino para a infeco pelo T. cruzi demonstrou que o
aparecimento no corao de clulas T produtoras de citocinas est correlacionado com o
aumento local da expresso de molculas de adeso celular, o que seria consistente com a
migrao de linfcitos T para o foco inflamatrio (FUENMAYOUR et al., 2005). Nesse
estudo, os autores propem que a inflamao crnica no corao chagsico altamente ativa e
est relacionada com um padro imunolgico estvel que se estende desde a fase aguda
recente at estgios tardios da fase crnica.
HIGUCHI et al. (1993a) utilizando tcnicas de imunohistoqumica estabeleceram uma
associao entre a presena de antgenos do T. cruzi e a formao de infiltrados inflamatrios
no tecido cardaco de pacientes com miocardite chagsica. Esse mesmo grupo avaliou o
fentipo das clulas do infiltrado inflamatrio, encontrando um predomnio de clulas T CD8+
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(HIGUCHI et al., 1993a,b). Estudos desenvolvidos por REIS et al. (1993) mostram ainda que
estas clulas CD8+ expressavam granzima A, um marcador para linfcitos T citolticos. Esses
autores atribuem clula T CD8+ e a seus produtos, a fibrose e a citlise observadas no tecido
cardaco nos pacientes portadores de miocardite chagsica.
No contexto da forma clnica DIG, os estudos que avaliam os elementos envolvidos
nos mecanismos imunopatolgicos no tubo digestivo so ainda escassos. LEMOS et al.,
(1998), em estudo pioneiro, demonstraram um predomnio de linfcitos CD4+ no infiltrado
inflamatrio do esfago e do clon de pacientes chagsicos portadores de mega decorrentes
da forma DIG. DA SILVEIRA et al. (2007a,b) demonstram ainda que o desenvolvimento de
megaclon aps a infeco aguda pelo T. cruzi est associado com a manuteno da invaso
de gnglios entricos por linfcitos T citotxicos e perda da inervao de msculos.
Devido a limitaes ticas de se estudar o perfil fenotpico do infiltrado inflamatrio e
leses teciduais decorrentes da infeco crnica da doena de Chagas, vrios pesquisadores
tm utilizado o sangue perifrico como estratgia para avaliar a resposta imunolgica
desencadeada durante a fase crnica da doena. O estudo do sangue perifrico de pacientes na
fase crnica da doena de Chagas demonstra grande nmero de linfcitos T ativados e B
circulantes, alm de diminuio significativa no percentual de linfcitos T CD3+. Linfcitos B
CD5+ esto presentes em alto percentual na circulao destes pacientes (DUTRA et al., 1994).
Aps estimulao in vitro por antgenos do T. cruzi ou por anticorpos humanos anti-
epimastigotas, atravs de estimulao idiotpica, observa-se proliferao diferenciada das
populaes celulares. Dessa forma, a estimulao por antgenos de T. cruzi leva expanso
preferencial de linfcitos T ativados, enquanto a estimulao idiotpica estimula
preferencialmente linfcitos B CD5+ e linfcitos T CD8+ (DUTRA et al., 2000). Na forma
clnica DIG, inverso da razo CD4/CD8 foi descrita contrastando com resultados em CARD
nos quais a razo normal. Ainda em pacientes da forma DIG reduo do percentual de
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clulas CD4+CD28+ e um aumento na expresso de linfcitos T ativados (HLA-DR+) foram
observados (LEMOS et al., 1998).
Considerando a complexidade das interaes imunolgicas desencadeadas durante a
infeco pelo T. cruzi, ainda so necessrios esclarecimentos mais detalhados a respeito das
populaes e subpopulaes celulares diretamente envolvidas nos mecanismos de resistncia
e morbidade da doena. A deteco de molculas expressas na superfcie de clulas, atravs
da citometria de fluxo, empregando sistemas de anlises mais elaborados e protocolos
experimentais atuais, que permitem a anlise simultnea de um maior nmero de molculas
por superfcie celular, trouxe a possibilidade de identificar e/ou caracterizar novas sub-
populaes, trazendo assim, informaes adicionais que podem enriquecer os conhecimentos
acerca das diferentes formas clnicas da doena de Chagas.
Ao analisar macrfagos, seja em humanos seja em camundongos, observam-se duas
populaes fenotipicamente distintas: CD14++CD16- e CD14+CD16+. Em indivduos
saudveis, as clulas CD14+CD16+ correspondem aproximadamente a 10% da populao de
moncitos. Entretanto, em indivduos com infeces graves, o nmero de moncitos
CD14+CD16+ encontra-se consideravelmente aumentado (NOCKHER et al., 1998;
SKRZECZYSKA et al., 2002). Tais moncitos expressam altos nveis da molcula HLA-
DR em sua superfcie, sintetizam elevados nveis de TNF- e quantidades basais de citocinas
reguladoras como IL-10, sendo denominados moncitos pr-inflamatrios (BELGE et al.,
2002). Os altos nveis de TNF- provavelmente decorrem da elevada expresso de receptores
dirigidos a componentes estruturais dos agentes infecciosos, como exemplo temos o LPS
atuando sobre os receptores Toll-like 4 (TLR-4) em clulas dendrticas ativadas (THOMA-
USZYNSKI et al., 2000). CAMPOS et al. (2001) demonstraram que glicoprotenas (GPIs) e
glicolipdios (GIPLs) derivados de T. cruzi podem se ligar ao receptor Toll-like 2 de
moncitos e induzir a sntese de IL-12, TNF- e xido ntrico (NO). OLIVEIRA et al. (2004),
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estudando a funo de TLR-4 na doena de Chagas, constataram que camundongos
deficientes para este receptor so altamente susceptveis infeco pelo T. cruzi, com elevada
parasitemia e taxa de mortalidade. Isso se deve falha na interao de GIPLs do parasita com
os receptores TLR-4 presentes em moncitos, indicando sua importncia na ativao da
resposta imune protetora. Atualmente, ateno especial tem sido dada aos TLR devido ao seu
papel na ativao de clulas NK durante infeces bacterianas e por protozorios. LAUZON
et al. (2003) demonstraram que antgenos derivados de Leishmania sp. ao se ligarem aos
receptores TLR-2 aumentam a produo das citocinas IFN- e TNF- e a translocao nuclear
de NF-B pelas clulas NK. Esse mesmo grupo, recentemente, verificou que as clulas NK
possuem diversos TLRs, que esto diretamente relacionados com o aumento da produo de
citocinas e citotoxicidade celular (LAUZON et al., 2006). No contexto da doena de Chagas,
pouco se sabe sobre a interao de antgenos do T. cruzi e os TLRs presentes em NK, mas
pertinente sugerir que a interao desses antgenos com esses receptores pode ser importante
na ativao de clulas NK na fase aguda e crnica da doena de Chagas.
bem aceito que a ausncia de patologia em indivduos infectados pelo T. cruzi est
associada com a capacidade do indivduo em regular a resposta anti-T. cruzi, responsvel pelo
controle da parasitemia persistente e do dano inflamatrio tecidual, caractersticos da doena
de Chagas (BRENER et al., 1997). Certamente, o dano tecidual frente inflamao deve ser
mais grave na ausncia de mecanismos reguladores que envolvem tanto a resposta imune
inata eficaz quanto a adaptativa. Estudos tm demonstrado que existem vrios tipos de clulas
com funo reguladora, algumas induzidas em resposta a um estmulo infeccioso e outras
consideradas reguladoras naturais (BLUESTONE & ABBAS, 2003; PICCIRILLO &
SHEVACH, 2004; BELKAID & ROUSE, 2005). As clulas T reguladoras foram descritas
como uma populao nica CD4+CD25+ que regulam respostas imunes inata e adaptativa e
que possuem a capacidade de controlar respostas imunes efetoras excessivas ou mal
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direcionadas, incluindo respostas contra patgenos ou antgenos prprios (MALOY &
POWRIE, 2001; GAVIN et al., 2001; SHEVACH, 2002; TRZONKOWSKI et al., 2004).
Vrios mecanismos pelos quais as clulas T reguladoras realizam suas atividades
moduladoras tm sido propostos, incluindo a inibio da atividade citotxica pela regulao
negativa de IL-12 e CD25 em linfcitos T CD8+ ou atravs de contato direto com essas
clulas efetoras (PICCIRILLO & SHEVAC, 2001; GROSSMAN et al., 2004; OGARRA &
VIEIRA, 2004; TRZONKOWSKI et al., 2004; CASSIS et al., 2005,). Embora em modelos
experimentais murinos, as clulas T CD4+ reguladoras sejam caracterizadas por apresentarem
o fentipo CD4+CD25+, sendo todas possuidoras de potencial papel regulador, caracterizado
por uma diminuio de produo de citocinas e habilidade de inibir proliferao celular in
vitro, em humanos, apenas as CD4+CD25HIGH apresentam esta habilidade. No contexto da
doena de Chagas, ARAJO e colabores (2007) demonstraram freqncia aumentada de
clulas CD4+CD25HIGHFOXP3+ em pacientes da forma IND quando comparados com
pacientes portadores da forma clnica cardaca, indicando que estas clulas teriam funo
importante na manuteno da forma clnica indeterminada da doena de Chagas.
Semelhantemente s clulas T reguladoras, as clulas NKT tm sido descritas como
uma subpopulao relevante tanto na funo inata (GODFREY et al., 2000; KRONENBERG
& GAPIN, 2002), quanto na atividade anti-tumoral (GODFREY & KRONENBERG, 2004;
VAN DER VLIET et al., 2004) e reguladora (HAMMOND & KRONENBERG, 2003;
MATSUDA et al., 2003), apresentando atividades sob o controle de clulas acessrias e
fatores solveis do micro-ambiente local (LEITE-DE-MORAES et al., 1997; GODFREY &
KRONENBERG, 2004). Estudos fenotpicos demonstraram que clulas NKT compreendem
uma subpopulao de clulas T, distinta das clulas T convencionais, por expressarem
receptores de clulas NK como o CD16, CD56 e/ou CD161, sendo o CD56 o melhor
marcador para definir os subgrupos de clulas NKT (ORTALDO et al., 1991; GODFREY et
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al., 2000). As funes reguladoras das clulas NKT previnem doenas auto-imunes e
cooperam com respostas protetoras contra patgenos (GODFREY et al., 2000; GODFREY &
KRONENBERG, 2004). Clulas NKT inibem vrias doenas auto-imunes, incluindo diabetes
tipo 1, lupus eritromatoso sistmico e artrite reumatide. A populao de clulas NKT est
diminuda nessas doenas, impedindo sua ao de prevenir respostas imunes autodestrutivas
(KOJO et al., 2003; GODFREY & KRONENBERG, 2004; VAN DER VLIET et al., 2004).
Durante infeces, clulas NKT secretam citocinas pr-inflamatrias que estimulam respostas
inata e adaptativa que eliminam o patgeno (EMOTO et al., 2003). Por outro lado, clulas
NKT secretam citocinas antiinflamatrias que limitam infeces induzidas por patgenos
(TANIGUCHI et al., 2003; VAN KAER, 2004). Ainda obscuro como as clulas NKT
exacerbam respostas inflamatrias para controlar patgenos durante infeces, enquanto
favorecem uma resposta antiinflamatria em outras infeces, prevenindo dano tecidual
induzido pela infeco. Recentemente, foi demonstrado em modelo experimental murino de
infeco pelo T. cruzi, que as clulas NKT apresentam funo importante em ambas as
respostas, pr-inflamatria e antiinflamatria (DUTHIE et al., 2005). Esses autores sugerem
que clulas NKT invariantes limitam respostas inflamatrias, enquanto clulas NKT variantes
aumentam respostas inflamatrias que contribuem para a morbidade e mortalidade. Assim,
subpopulaes de clulas com funes distintas podem preferencialmente direcionar eventos
imunomoduladores, enquanto outras direcionam para respostas imunes inflamatrias. Essas
observaes sugerem que o sucesso no controle da infeco pelo T. cruzi e da doena de
Chagas envolve o desenvolvimento de uma resposta imune modulada suficiente para controlar
a infeco na ausncia de extensa destruio tecidual.
Ainda no contexto da imunomodulao, a rede de citocinas um importante circuito
que determina a morbidade da doena de Chagas. Estudos demonstram uma correlao entre a
secreo de IFN- e o desenvolvimento de doena cardaca grave e o papel de IL-10
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controlando a imunopatologia (BAHIA-OLIVEIRA et al., 2000; GOMES et al., 2003).
Entretanto, o fato de uma grande proporo de indivduos indeterminados tambm
produzirem nveis elevados de IFN-, em adio a outras citocinas inflamatrias levantou a
hiptese de que mais do que uma mudana para um perfil de citocinas polarizadas, um fino
balano de citocinas inflamatrias e reguladoras derivadas de diferentes fontes possa
contribuir para os mecanismos imuno-mediados relacionados s diferentes formas clnicas da
doena. De fato, tem sido demonstrado que enquanto moncitos de pacientes das formas
clnicas IND e CARD so capazes de produzir IL-10, e alguns IND produzem altos nveis de
IFN- por linfcitos T, moncitos de IND produzem nveis mais altos de IL-10, quando
comparados com moncitos de pacientes da forma clnica cardaca (CORRA-OLIVEIRA et
al., 1999; GOMES et al., 2003; SOUZA et al., 2004). Esses achados enfatizam que o balano
de citocinas representa um elemento chave no estabelecimento/manuteno das diferentes
formas clnicas. Assim, avaliar a produo de diferentes citocinas com caractersticas
inflamatrias e reguladoras produzidas por subpopulaes de leuccitos da imunidade inata e
adaptativa representa estratgia adequada para caracterizao do perfil de indivduos
portadores das diferentes formas clnicas da doena de Chagas.
A induo e/ou modulao da resposta do hospedeiro a antgenos derivados do
parasito no deve ser avaliada de forma limitada, restrita a funes imunolgicas celulares.
Existem evidncias do envolvimento da resposta humoral nos eventos que acompanham a
evoluo da doena de Chagas. Anticorpos anti-T. cruzi so amplamente detectados em
portadores da doena de Chagas (BRENER, 1980). Os estudos da imunidade humoral foram
revolucionados por KRETTLI & BRENER (1982), quando foi demonstrada a existncia de
duas categorias de anticorpos, funcionalmente distintos, no soro de hospedeiros infectados
pelo T. cruzi, os quais foram denominados anticorpos da sorologia convencional (ASC) e
anticorpos lticos (AL). Os ASC, tambm denominados no protetores, so encontrados no
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soro de hospedeiros infectados pelo T. cruzi mesmo aps quimioterapia eficaz. Esses
anticorpos so identificados in vitro por tcnicas sorolgicas de rotina. Por outro lado,
anticorpos da categoria AL, tambm conhecidos como anticorpos protetores, so encontrados
apenas no soro de hospedeiros com infeco ativa, desaparecendo aps a cura por interveno
teraputica especfica para a doena de Chagas. Esses anticorpos so especficos para epitopos
presentes na superfcie de formas tripomastigotas vivas do T. cruzi, sendo identificados in
vitro atravs das tcnicas de lise mediada pelo complemento (GALVO et al., 1993) e, mais
recentemente, pela citometria de fluxo (MARTINS-FILHO et al., 1995). Por serem capazes
de induzir a lise mediada pelo complemento de formas tripomastigotas sangneas, os
anticorpos da categoria AL tm sido considerados importantes no controle da parasitemia na
fase crnica da infeco pelo T. cruzi, e assim, a sua presena, indireta ou diretamente,
poderia estar associada ao estabelecimento da forma clnica IND. Entretanto, esse mecanismo
hipottico necessita ainda de investigaes complementares. Considerando que os estudos
sorolgicos baseados na citometria de fluxo constituem um campo com grandes
possibilidades de crescimento, devido ao aumento da sensibilidade de deteco, em relao a
outros mtodos (MARTINS-FILHO et al., 1995), a avaliao da resposta humoral por meio
da reatividade de anticorpos que se ligam a formas epimastigotas e tripomastigotas do T. cruzi
por citometria de fluxo (FC-AFEA e FC-ALTA) permitir ampliar o conhecimento desses
eventos imunolgicos. importante salientar que esse sistema isento de variabilidades
metodolgicas inerentes ao analista e com sensibilidade e especificidade muito superiores aos
diferentes protocolos de deteco e revelao convencionais, podendo assim trazer novas
perspectivas para os estudos sorolgicos aplicados ao diagnstico, prognstico, e critrio de
cura da doena de Chagas (MARTINS-FILHO et al., 2002).
Em suma, considerando o exposto, podemos observar que diversos mecanismos da
resposta imune tm sido propostos e apresentados como elos no estabelecimento/manuteno
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das diferentes formas clnicas na fase crnica da doena de Chagas. Entretanto, o grande
avano em tcnicas imunolgicas tem permitido a elaborao de perguntas ainda mais
refinadas e o estabelecimento de novas hipteses que podem estar associadas ao complexo
conjunto de interaes que envolvem a doena de Chagas humana. Nesse sentido,
acreditamos que o estudo de caractersticas fenotpicas adicionais de populaes e
subpopulaes leucocitrias do sangue perifrico, atravs do uso de novas estratgias de
anlises, bem como a investigao do panorama de citocinas intracitoplasmticas de
leuccitos circulantes, em paralelo ao estudo da reatividade de anticorpos IgG anti-T. cruzi,
apresenta-se como uma estratgia atual e relevante para subsidiar o entendimento do
fenmeno da cronificao diferenciada na doena de Chagas.
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2. OBJETIVOS
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Objetivo
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2.1. Objetivo Geral
Investigar aspectos imunolgicos celulares e humorais na fase crnica da doena de Chagas
com nfase no perfil fenotpico e panorama de citocinas intracitoplasmticas de leuccitos
circulantes e na reatividade de anticorpos IgG anti-Trypanosoma cruzi.
2.2. Objetivos Especficos
1. Caracterizar aspectos fenotpicos de leuccitos circulantes a fim de estabelecer
biomarcadores capazes de decodificar diferentes formas clnicas da infeco crnica pelo T.
cruzi.
2. Instituir um novo modelo para a anlise do perfil panormico de citocinas
intracitoplasmticas de leuccitos do sangue perifrico em portadores das formas clnicas
indeterminada e cardaca.
3. Explorar as aplicabilidades de tcnicas no convencionais para o estudo da reatividade
sorolgica anti-T. cruzi aplicada em estudos clnicos da doena de Chagas.
-
Tpicos de Investigao
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2.3. Tpicos de Investigao
Estudar de forma descritivo-analtica o perfil fenotpico de leuccitos do sangue
perifrico de indivduos portadores das formas clnicas indeterminada, cardaca e
digestiva, com nfase na anlise de clulas T CD4+ e CD8
+ ativadas, subpopulaes de
clulas NK e NKT e na freqncia de clulas T reguladoras (Artigo 1);
Caracterizar o perfil fenotpico de leuccitos do sangue perifrico de indivduos
portadores da fase crnica recente, focalizando em subpopulaes de clulas T e B,
marcadores de ativao e de adeso celular, subpopulaes de moncitos, clulas NK
e NKT e na freqncia de clulas T reguladoras (Artigo 2);
Correlacionar os principais achados imunofenotpicos de leuccitos do sangue
perifrico observados em portadores das formas clnicas indeterminada e cardaca
(Artigo 2);
Estabelecer uma nova estratgia para anlise panormica do perfil de citocinas
intracitoplasmticas de leuccitos circulantes associados imunidade inata e
adaptativa (Artigo 3).;
Caracterizar o impacto da estimulao in vitro com antgenos de formas
tripomastigotas do T. cruzi no panorama de citocinas intracitoplasmticas de
leuccitos circulantes associados imunidade inata e adaptativa (Artigo 3).
Avaliar a aplicabilidade da pesquisa de anticorpos IgG anti-formas epimastigotas
fixadas do T. cruzi (FC-AFEA) no diagnstico sorolgico da Doena de Chagas
(Artigo 4);
Caracterizar o potencial da pesquisa de anticorpos IgG1 anti-formas tripomastigotas
vivas do T. cruzi (FC-ALTA) e da FC-AFEA para fins prognsticos na monitorao
clnica da infeco crnica pelo T. cruzi (Artigo 4);
Avaliar o desempenho da FC-AFEA como tcnica complementar na monitorao de
cura ps-teraputica etiolgica da Doena de Chagas (Artigo 4).
-
3. MATERIAL E MTODOS
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Material e Mtodos
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3.1. Populao de estudo
Os dados que compem as publicaes 1 Chagasic patients with indeterminate
clinical form of the disease have high frequencies of circulating CD3+CD16
-CD56
+ natural
killer T cells and CD4+CD25
High regulatory T lymphocytes e 2 Are increased frequency of
macrophage-like and natural killer (NK) cells, together with high levels of NKT and
CD4+CD25
high T cells balancing activated CD8
+ T cells, the key to control Chagas' disease
morbidity? correspondem ao objetivo especfico 1.
Para cumprir o proposto no objetivo especfico 1, foram selecionados 54 indivduos,
sendo 13 crianas e 41 adultos. Todos os participantes foram submetidos a testes de sorologia
convencional especficos para o diagnstico da doena de Chagas. Os indivduos pertencentes
ao grupo de pacientes chagsicos apresentaram resultados concomitantemente positivos nas
reaes de hemaglutinao indireta (HAI) e imunofluorescncia indireta (IFI) para o T. cruzi.
Considerando que esse estudo teve como objetivo realizar uma anlise de diferentes
parmetros imunolgicos associados morbidade da infeco pelo T. cruzi, todos pacientes
foram submetidos a exames clnicos, radiolgicos e eletrocardiogrficos que permitiram
agrup-los como pacientes portadores da forma clnica indeterminada recente (Early
INDeterminate chronic phase E-IND), indeterminada crnica (IND), cardaca crnica
(CARD) e digestiva crnica (DIG). Indivduos dos grupos E-IND e IND foram selecionados a
partir da comprovao da infeco chagsica na ausncia de manifestaes clnicas,
eletrocardiogrficas ou radiolgicas de acometimento cardaco ou digestivo. A segregao
entre os indivduos crnicos recentes (E-IND) e tardios (IND) foi feita de acordo com o
Consenso Brasileiro em Doena de Chagas (2005) que considera como recente o perodo de
cinco a doze anos aps a infeco inicial. Os portadores da forma clnica CARD foram
caracterizados pela presena de sintomas, sinais fsicos e alteraes em exames laboratoriais
(eletrocardiograma /ECG e radiografia de trax). O grupo DIG foi definido a partir do
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Material e Mtodos
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diagnstico radiolgico de megaesfago e megaclon, caracterstica desta forma clnica,
baseando-se essencialmente no exame clnico e radiolgico - raio X de trax em posies PA
e PE, raio X contrastado de esfago em OAD (oblqua anterior direita), pela tcnica de
HADDAD E GODOY (1963) e enema opaco (REZENDE & MOREIRA, 2000).
Sete crianas da mesma rea, assintomticas e sem sinais de outra enfermidade, foram
submetidas a testes sorolgicos que confirmaram a ausncia de infeco pelo T. cruzi,
constituindo assim o grupo no infectado pelo T. cruzi (NI-1) usado como parmetro de
comparao para avaliao de alteraes imunofenotpicas observadas no grupo E-IND. J
como parmetro de comparao para as anlises realizadas no grupo IND foram selecionados
adultos saudveis com resultados negativos para os testes de sorologia convencional
supracitados, constituindo o grupo NI-2.
Todos os indivduos foram voluntrios, sendo provenientes das cidades Bambu,
Berilo e Jos Gonalves de Minas do estado de Minas Gerais. O consentimento escrito foi
obtido de todos os participantes. No caso das crianas, os pais ou responsveis foram
esclarecidos quanto ao estudo e, aqueles que concordaram em participar, assinaram o Termo
de Consentimento Livre e Esclarecido para Pacientes Voluntrios. A conduta clnico-
laboratorial adotada nesse estudo foi previamente aprovada pelo Comit de tica do
IRR/FIOCRUZ (Protocolo CEPSH/CPqRR #09/2003 e #11/2004). Todos os procedimentos,
incluindo os estudos eletrocardiogrficos, radiolgicos e a assistncia mdico-laboratorial
dada aos pacientes, bem como o acompanhamento ambulatorial e a coleta de sangue esteve
sob a responsabilidade do Dr. Joo Carlos Pinto Dias, do Dr. Joo Soares Moreira Magalhes
e da Dra. Marta de Lana. A Tabela 1 sumariza as informaes referentes aos grupos de
pacientes estudados.
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Material e Mtodos
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23
Os dados que compem a terceira publicao New strategy to assess the overall
cytokine profile of circulating leukocytes and decode distinct clinical status of human
chagas disease correspondem ao objetivo especfico 2.
O grupo de pacientes portadores da doena Chagas crnica foi o mesmo empregado
para o primeiro e segundo artigo excluindo-se o grupo de indivduos com comprometimento
digestivo. Para a anlise pontual do efeito do tratamento foram selecionados 18 indivduos,
sendo 5 indivduos do grupo IND selecionados a partir da comprovao da infeco chagsica
na ausncia de manifestaes clnicas, eletrocardiogrficas ou radiolgicas de acometimento
cardaco ou digestivo e 13 indivduos portadores da forma clnica CARD, caracterizados pela
presena de sintomas, sinais fsicos e alteraes em exames laboratoriais (eletrocardiograma e
radiografia de trax). Os indivduos foram voluntrios provenientes do Ambulatrio de
Doena de Chagas do Hospital das Clnicas de UFMG. O consentimento escrito foi obtido de
todos os participantes. A conduta clnico-laboratorial adotada nesse estudo foi previamente
aprovada pelo Comit de tica do IRR/FIOCRUZ (IRR/FIOCRUZ-Minas protocolos
#09/2003) e da Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG-COEP protocolo #ETIC
070/00). Todos os procedimentos, incluindo os estudos eletrocardiogrficos, radiolgicos e a
assistncia mdico-laboratorial dada aos pacientes, bem como o tratamento dos indivduos
infectados com benzonidazol (5mg/kg/peso por dia, durante 60 dias consecutivos) estiveram
sob a responsabilidade da Dra. Silvana Maria Eli Santos e da Dra. Eliane Dias Gontijo. Para
o estudo longitudinal, foram feitas duas coletas (antes e aps um ano do trmino do
tratamento) de amostras de sangue perifrico coletadas em tubos Vacutainer, contendo
EDTA ou heparina sdica como anticoagulantes. A Tabela 1 sumariza as informaes
concernentes aos grupos de pacientes estudados.
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Material e Mtodos
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Os dados que compem a quarta publicao Non-conventional flow cytometry
approaches to detect anti-Trypanosoma cruzi immunoglobulin G in the clinical
laboratory. correspondem ao objetivo especfico 3.
Para esse estudo foram empregadas 4 coortes de amostras de soro: (1) de pacientes
portadores da doena de Chagas crnica tardia, de leishmaniose visceral (VL), leishmaniose
tegumentar (LCL), toxoplasmose (TX), malria (MA) e esquistossomose (SCH). As amostras
de soros de pacientes portadores da doena de Chagas crnica tardia e os controles no
infectados foram os mesmos dos objetivos especficos 1 e 2. J as amostras de soros de
indivduos portadores de outras infeces foram obtidas a partir de sorotecas previamente
montadas e consistiram de indivduos adultos que por deciso do comit de tica em
pesquisas no foram identificados; (2) de pacientes portadores da doena de Chagas crnica
tardia segregados nas diferentes formas clnicas (IND, CARD e DIG) e controles no
infectados, sendo os mesmos empregados nos objetivos especficos 1 e 2; (3) de pacientes
portadores da doena de Chagas crnica tardia segregados nas diferentes formas clnicas. A
coleta desses soros foi realizada no Centro de treinamento e Referncia de doenas
Infecciosas e Parasitrias (CTRDIP) do Hospital das Clnicas da Faculdade de Medicina da
Universidade Federal de Minas Gerais, sob a superviso do Dr. Manoel Otvio da Costa
Rocha. As amostras de soros dos pacientes DIG foram enviadas para Belo Horizonte pela Dra.
Sheila Jorge Adad do Departamento de Patologia Cirrgica da Faculdade de Medicina do
Tringulo Mineiro (FMTM). A distribuio etria dessa coorte iniciou uma disperso etria na
faixa de 24-77 anos de idade; (4) de pacientes chagsicos no tratados (NT), tratados no
curados (TNC) e tratados curados (TC). Essa coorte contm 60 indivduos com idades de 6
meses a 68 anos, acompanhados pelo Dr. Anis Rassi da Faculdade de Medicina da
Universidade Federal de Gois. Estes pacientes tiveram exames sorolgicos (IFA e HA) e
parasitolgico (hemocultura) avaliados em um estudo retrospectivo, que variou de trs a 26
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Material e Mtodos
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anos aps tratamento etiolgico, e foram classificados em trs diferentes categorias como
descrito por MARTINS-FILHO et al. (2002). O tratamento foi realizado durante a fase aguda,
sub-aguda, ou crnica da infeco. O critrio de cura utilizado para a classificao dos grupos
baseou-se na negativao conjunta dos testes sorolgicos convencionais IFI, HAI e ELISA e
do xenodiagnstico. Indivduos NT e TNC persistiram com resultados positivos tanto nos
testes parasitolgicos como sorolgicos. Pacientes foram considerados TC somente quando
ambos exames foram consistentemente negativos pelo menos em 8 ensaios de coleta serial de
amostras de sangue. Nesse estudo no foi dada nfase aos diferentes esquemas de tratamento
uma vez que no foi nosso objetivo. A Tabela 1 sumariza as informaes concernentes aos
grupos de pacientes estudados.
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Material e Mtodos
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Tabela 1: Populao de estudo
Grupo No de indivduos Idade Sexo (M/F)
Artigo 1 No infectado* NI 12 20-53 3/9 Indeterminado* IND 08 44-67 3/5 Cardaco* CARD 13 50-70 5/8 Digestivo* DIG 08 45-65 5/3
Artigo 2 Crianas no infectadas NI-1 07 9-14 6/1 Adultos no infectados* NI-2 12 20-59 3/9 Indeterminado recente E-IND 06 9-14 4/2 Indeterminado* IND 08 44-67 3/5 Cardaco* CARD 13 50-70 5/8
Artigo 3 Coorte 1 No infectado* NI 11 20-53 3/8 Indeterminado* IND 06 44-67 3/3 Cardaco* CARD 08 50-70 2/6
Coorte 2 Indeterminado IND 05 35-46 1/4 Cardaco CARD 13 29-58 7/6
Artigo 4 Coorte 1 No infectado* NI 12 20-53 3/8 Doena de Chagas* CH 28 44-70 13/15 Leishmaniose visceral VL 26 - - Leishmaniose tegumentar LCL 20 - - Toxoplasmose TX 20 - - Malria MA 20 - - Esquistossomose SCH 20 - -
Coorte 2 No infectado* NI 12 20-53 3/9 Indeterminado* IND 06 44-67 3/3 Cardaco* CARD 13 50-70 5/8 Digestivo* DIG 07 45-65 4/3
Coorte 3 Indeterminado IND 10 24-59 8/12 Cardaco CARD 10 26-71 15/12 Digestivo DIG 10 30-77 19/10
Coorte 4 No tratados NT 19 34-68 10/9 Tratados no curados TNC 17 12-66 9/8 Tratados curados TC 24 6 meses-54 6/18
M= masculino; F= feminino. * Representam a mesma populao
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Material e Mtodos
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3.2. Anlise do fentipo celular dos leuccitos do sangue perifrico
3.2.1. Protocolo de imunofenotipagem celular por citometria de fluxo
Os ensaios de imunofenotipagem dos leuccitos do sangue perifrico foram feitos
segundo protocolo proposto pelo fabricante, modificado conforme descrito a seguir.
Em tubos de poliestireno 12x75mm, foram adicionados 5L do anticorpo monoclonal
especfico para o marcador de superfcie celular de interesse marcado com fluorocromo
(Tabela 2). Combinaes especficas de anticorpos monoclonais marcados com fluorocromos
distintos foram utilizadas para a anlise simultnea de marcadores de superfcie celular
necessrios para a caracterizao de subpopulaes celulares de interesse. Para cada
combinao de anticorpos monoclonais, foram adicionadas alquotas de 100L de sangue
perifrico total coletado em EDTA. Aps homogeneizao em vrtex, as preparaes foram
incubadas por 30 minutos, temperatura ambiente e ao abrigo da luz. Aps o perodo de
incubao, as amostras foram submetidas lise dos eritrcitos, utilizando 2ml de soluo de
lise comercial (FACS Lysing Solution Becton Dickinson) diluda 10 vezes em gua
destilada. Aps nova homogeneizao em vrtex, as preparaes foram incubadas por 10
minutos a temperatura ambiente e ento submetidas centrifugao (400g, 10 minutos a
18C). O sobrenadante foi descartado e os leuccitos lavados com 2mL de PBS (0,015M pH
7,4), empregando-se as mesmas condies de centrifugao anteriormente citadas. Numa
etapa final, os leuccitos foram fixados com 200L de soluo fixadora (10g/L de
paraformaldedo, 1 % de cacodilato de sdio, 6,65g/L de cloreto de sdio, pH 7,2). Aps um
perodo de pelo menos 15 minutos a 4C, os parmetros fenotpicos e morfomtricos das
clulas presentes em cada tubo foram determinados no citmetro de fluxo (FACScalibur
Becton Dickinson). O programa CELLQuest foi utilizado para a aquisio de dados e para a
anlise dos resultados empregando diferentes estratgias.
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Material e Mtodos
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Tabela 2: Anticorpos monoclonais marcados com fluorocromos utilizados para anlise de populaes, subpopulaes celulares e molculas de superfcie.
Anticorpo Fluorocromo Clone Fentipo alvo no estudo
Anti-CD3 FITC, PE UCHT1 Linfcitos T, NKT
Anti-CD4 FITC, PE 13B8.2 ou RPA-
T4 Linfcitos T auxiliares
Anti-CD5 FITC L17F12 Linfcitos B1
Anti-CD8 FITC, TC B9.11 ou M-L233 Linfcitos T citotxicos
Anti-CD14 TC TK4 Moncitos
Anti-CD16 FITC, TC 3G8 Clulas NK, NKT, Macrfago-like
Anti-CD18 FITC YF118.3 Linfcito T ativado
Anti-CD19 FITC, PE, TC HID19 ou 4G7, Linfcitos B
Anti-CD23 PE M-L233 Subpopulaes de Linfcito B
Anti-CD25 PE 3G10 Clula T reguladora
Anti-CD28 PE 15E8 Linfcito T ativado
Anti-CD38 PE AT13/5 Linfcito T ativado
Anti-CD54 FITC 15.2 Linfcito T ativado
Anti-CD56 PE B159 Clulas NK, NKT
Anti-CD62L FITC DREG-56 Linfcito T ativado
Anti-HLA-DR PE T36 Linfcito T ativado,
Monc. pr-inflamatrios
FITC = isotiocianato de fluorescena; PE = ficoeritrina; TC = tricolo 3.2.2. Estratgias para anlises imunofenotpicas de leuccitos circulantes
Os dados referentes imunofenotipagem dos leuccitos do sangue perifrico foram
analisados atravs de diversas estratgias, dependendo do fentipo celular rastreado. Assim,
empregando os recursos mltiplos do programa CELLQuest, foram adotadas diferentes
estratgias para anlise fenotpica denominadas: anlise convencional (SATHLER-AVELAR
et al., 2003); anlise de clulas T reguladoras (BAECHER-ALLAN et al., 2001); anlise do
marcador CD56 em subpopulaes de clulas CD3-CD16+ (GADDY et al., 1997), anlise de
subpopulaes de clulas CD3-CD56+ (COOPER et al., 2001); anlise de clulas NKT
(DOHERTY, et al., 1999); anlise combinada gated (SATHLER-AVELAR et al., 2003) e
anlise de moncitos pr-inflamatrios (BELGE et al., 2002).
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Material e Mtodos
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3.2.2.1. Anlise convencional
A anlise convencional foi realizada segundo proposto por SATHLER-AVELAR et
al. (2003). A Figura 1 ilustra a seqncia de passos para a anlise convencional. Esse tipo de
anlise consistiu na seleo da populao celular de interesse baseada em aspectos
morfomtricos, realizada atravs de grficos de distribuio puntual de tamanho (FSC) versus
granulosidade (SSC) (Figura 1A). Aps a seleo da regio de interesse (R1), o percentual de
subpopulaes celulares fluorescentes, dentro da populao selecionada, foi obtido em
grficos bidimensionais de distribuio puntual de fluorescncia, incluindo as modalidades
FL1 versus FL2, FL2 versus FL3 ou FL1 versus FL3 (Figura 1B).
FL3/CD19
FL2/CD5
A B
Tamanho
Granulosidade
R1
82.38% 0.37%
2.57%14.69%
Figura 1: Seqncia de procedimentos utilizados para as anlises dos percentuais de populaes celulares por citometria de fluxo. (A) Grfico de distribuio puntual FSC versus SSC utilizado para a seleo da populao de interesse, nesse caso linfcitos pequenos R1. (B) Grfico de distribuio puntual FL1 versus FL2 utilizado para quantificar o percentual das populaes ou subpopulaes celulares especficas, confinadas em R1.
3.2.2.2. Anlise de clulas T reguladoras
A anlise de clulas T reguladoras foi realizada segundo proposto por BAECHER-
ALLAN et al. (2001). A Figura 2 ilustra a seqncia de procedimentos para a anlise de
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Material e Mtodos
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clulas T reguladoras com fentipo CD4+CD25HIGH. Aps a seleo da regio de interesse
(R1), baseada em aspectos morfomtricos, realizada atravs de grficos de distribuio
puntual de tamanho (FSC) versus granulosidade (SSC) (Figura 2A), grficos de FL1/CD4
versus FL2/CD25 foram construdos, permitindo identificar a segregao da populao CD4+
em 3 subpopulaes: CD4+CD25- (R2), CD4+CD25LOW (R3) e CD4+CD25HIGH (R4). A frao
celular confinada em R4, representa o valor percentual de clulas T reguladoras na populao
de linfcitos totais (Figura 2B).
FL1/CD4
FL2/CD25
A B
Tamanho
Granulosidade
R1
1.98%
25.74%
23.37%
R2
R3
R4
Figura 2: Seqncia de procedimentos utilizados para as anlises dos percentuais de clulas T reguladoras (CD4+CD25HIGH) por citometria de fluxo. (A) Grfico de distribuio puntual FSC versus SSC utilizado para a seleo da populao de interesse, nesse caso linfcitos pequenos R1. (B) Grfico de distribuio puntual FL1/CD4 versus FL2/CD25 utilizado para quantificar o percentual de clulas T reguladoras (CD4+CD25HIGH), confinadas em R4.
3.2.2.3. Anlise do marcador CD56 em subpopulaes de clulas CD3-CD16+
A anlise de subpopulaes de clulas CD3-CD16+ foi realizada segundo proposto por
GADDY et al. (1997). A Figura 3 ilustra a seqncia de procedimentos para a anlise das
subpopulaes de clulas pr-NK (CD3-CD16+CD56-) e clulas NK maduras (CD3-
CD16+CD56+). Aps a seleo da regio de interesse (R1), baseada em aspectos
morfomtricos, realizada atravs de grficos de distribuio puntual de tamanho (FSC) versus
granulosidade (SSC) (Figura 3A), foram construdos grficos de FL1/CD3 versus FL3/CD16,
onde uma nova regio R2 foi construda, confinando a populao CD3-CD16+ (Figura 3B).
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Material e Mtodos
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31
Posteriormente, grficos de FL1/CD3 versus FL2/CD56 foram empregados, onde uma nova
regio (R3) foi construda, confinando a populao CD3-CD56+. Em seguida, aps a
combinao das regies R1, R2 e R3 atravs das frmulas G2=R2+R3 e G3=R1 and G2
onde + representa o somatrio de clulas confinadas nas regies R1 e R2 e and designa a
interceco dos eventos presentes simultaneamente em G2 e R1. Em seguida grficos de
FL3/CD16 versus FL2/CD56, contendo as clulas confinadas em G3, foram utilizados para
quantificar os percentuais das subpopulaes CD3-CD16+CD56- e CD3-CD16+CD56+.
FL1/CD3
FL3/CD16
A B
Tamanho
Granulosidade
R1
FL3/CD16
FL2/CD56
D
FL1/CD3
FL2/CD56
C
7.29% 84.21%
5.67%2.83%
CD3-CD16+CD56+
CD3-CD16+CD56-
Figura 3: Seqncia de procedimentos utilizados para as anlises dos percentuais das subpopulaes de clulas NK: pr-NK (CD3-CD16+CD56-) e NK madura (CD3-
CD16+CD56+) por citometria de fluxo. (A) Grfico de distribuio puntual FSC versus SSC utilizado para a seleo da populao de interesse, nesse caso linfcitos pequenos R1. (B) Grfico de distribuio puntual FL1/CD3 versus FL3/CD16 utilizado para selecionar a populao celular CD3-CD16+ (R2). (C) Grfico de distribuio puntual FL1/CD3 versus FL2/CD56 utilizado para selecionar a populao celular CD3-CD56+ (R3). (D) Aps a combinao das regies R1, R2 e R3 atravs das frmulas G2=R2 + R3 e G3=R1 and G2 um grfico de FL3/CD16 versus FL2/CD56 contendo as clulas confinadas em G3 foi utilizado para quantificar os percentuais das subpopulaes de clulas NK.
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Material e Mtodos
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32
3.2.2.4. Anlise de subpopulaes de clulas CD3-CD56+
A anlise de clulas CD3-CD56+ foi realizada segundo proposto por COOPER et al.
(2001). A Figura 4 ilustra a seqncia de procedimentos para a anlise de clulas CD3-
CD56DIMCD16-/+ e CD3-CD56BRIGHTCD16-/+. Aps a seleo da regio de interesse (R1),
baseada em aspectos morfomtricos, realizada atravs de grficos de distribuio puntual de
tamanho (FSC) versus granulosidade (SSC) (Figura 4A), foram construdos grficos de
FL1/CD3 versus FL2/CD56, onde uma regio (R2) foi construda selecionando a populao
CD3-CD56+ (Figura 4B). O prximo passo consistiu na combinao das regies R1 e R2
atravs da frmula G2=R1 and R2, onde and designa a interseo dos eventos presentes
simultaneamente em R1 e R2. Em seguida, grficos de FL3/CD16 versus FL2/CD56,
contendo as clulas confinadas em G2, foram utilizados para quantificar os percentuais das
subpopulaes CD3-CD56DIMCD16-/+ e CD3-CD56BRIGHTCD16-/+ (Figura 4C).
FL1/CD3
FL2/CD56
A B
Tamanho
R1
Granulosidade
-
Material e Mtodos
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33
FL3/CD16
FL2/CD56
C
3.23% 3.88%
85.56%7.33%
CD3- CD56BRIGHT CD16+
CD3-CD56DIMCD16+CD3-CD56DIM
CD16-
CD3-CD56BRIGHT
CD16-
Figura 4: Seqncia de procedimentos utilizados para as anlises dos percentuais das subpopulaes CD3-CD56DIMCD16-/+ e CD3-CD56BRIGHTCD16-/+ por citometria de fluxo. (A) Grfico de distribuio puntual FSC versus SSC utilizado para a seleo da populao de interesse, nesse caso linfcitos pequenos R1. (B) Grfico de distribuio puntual FL1/CD3 versus FL2/CD56 (R2) utilizado para selecionar a populao celular CD3-CD56+ - R2. (C) Aps a combinao das regies R1 e R2, atravs da frmula G2=R1 and R2, um grfico de FL3/CD16 versus FL2/CD56, contendo as clulas confinadas em G2, foi empregado para quantificar o percentual das subpopulaes CD3-CD56DIMCD16-/+ e CD3-CD56BRIGHTCD16-/+.
3.2.2.5. Anlise de clulas NKT
A anlise de clulas NKT foi realizada segundo proposto por DOHERTY el al. (1999)
e modificado por MARTINS-FILHO (2000). A Figura 5 ilustra a sequncia de procedimentos
para a anlise de clulas NKT (CD3+CD16-/+CD56-/+). Aps a seleo da regio de interesse
(R1), baseada em aspectos morfomtricos, realizada atravs de grficos de distribuio
puntual de tamanho (FSC) versus granulosidade (SSC) (Figura 5A), foram construdos
grficos de FL1/CD3 versus FL3/CD16, onde uma regio (R2) foi construda selecionando a
populao CD3+CD16-/+ (Figura 5B). O prximo passo consistiu na combinao das regies
R1 e R2 atravs da frmula G2=R1andR2, onde and designa a interseo dos eventos
presentes simultaneamente em R1 e R2. Em seguida, grficos de FL3/CD16 versus
FL2/CD56, contendo as clulas confinadas em G2, foram utilizados para quantificar os
percentuais das seguintes subpopulaes, por ns definidas: NKT1 (CD3+CD16+CD56-),
NKT2 (CD3+CD16-CD56+) e NKT3 (CD3+CD16+CD56+) (Figura 5C).
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Material e Mtodos
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34
A
Tamanho
R1
Granulosidade
A
FL1/CD3
B
R2
FL3/CD16
FL3/CD16
C
NKT1
(CD3+CD16+CD56-)
NKT3
(CD3+CD16+CD56+)NKT2
7.27% 0,29%
2,46%89,98%
FL2/CD56
Figura 5: Seqncia de procedimentos utilizados para as anlises dos percentuais das subpopulaes NKT1 (CD3+CD16+CD56-), NKT2 (CD3+CD16-CD56+) e NKT3 (CD3+CD16+CD56+) por cito