Aus der Medizinischen Klinik Ider Universitat zu Lubeck
Direktor: Prof. Dr. med. H. Lehnert
In-vitro- und In-vivo-Untersuchungen einerKombinationstherapie mit Bortezomib,
Mafosfamid und 4-OH-Trofosfamid an humanenTumorzelllinien LX1, MX1 und S117
Inauguraldissertation
zur Erlangung der Doktorwurdean der Universitat zu Lubeck
– Aus der Sektion Medizin –
vorgelegt vonJan Mikael Gerl
aus Hillerød
Lubeck 2013
1. Berichterstatter: Prof. Dr. med. T. Wagner
2. Berichterstatter/-in: Priv.-Doz. Dr. rer. physiol. M. Tegtmeier
Tag der mundlichen Prufung: 21.11.2014
Zum Druck genehmigt. Lubeck, den 21.11.2014
Promotionskommission der Sektion Medizin
i
iii
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung 1
1.1 Geschichte der Chemotherapie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
1.2 Alkylanzien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
1.3 Neue Generation der Krebstherapie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
1.4 Bortezomib . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
1.5 Kombinationstherapie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
1.6 Stand der Forschung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
1.7 Fragestellung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
2 Material und Methoden 11
2.1 Material . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
2.1.1 Labormaterial . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
2.1.2 Gerate . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
2.2 Reagenzien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
2.2.1 Medien und Zusatze . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
2.2.2 Puffer und Stammlosungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
2.3 Zytostatika . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
2.3.1 Bortezomib . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
2.3.2 Trofosfamid . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
2.3.3 Cyclophosphamid . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
2.3.4 Mafosfamid . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
2.4 Zelllinien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
2.5 Zellbiologische Methoden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
2.5.1 Herstellung der Losungen und Medien fur die Zellkultur . . . . . 15
2.6 Zellkultur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
2.6.1 Steriles Arbeiten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
2.6.2 Kultivieren und Passagieren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
2.6.3 Kryokonservierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
2.7 Proteinchemische Methode . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
2.7.1 Kristallviolett-Assay . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
2.7.2 Zytostatikaaufbereitung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
2.7.3 Behandlungsschemata . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
Inhaltsverzeichnis iv
2.8 Tierexperimentelle Versuche . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
2.8.1 Tierhaltung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
2.8.2 Narkose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
2.8.3 Tumoranzuchtung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
2.8.4 Tumortransplantation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
2.8.5 Behandlungsschemata . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
2.9 Biometrie und Statistik . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
3 Ergebnisse 25
3.1 In-vitro-Versuche . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
3.1.1 Ermittlung der IC-Werte von Bortezomib . . . . . . . . . . . . . 25
3.1.2 Ermittlung der Konzentrationsreihen von Mafosfamid und 4OH-
Trofosfamid . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
3.1.3 Zeitgleiche Kombinationsbehandlung . . . . . . . . . . . . . . . 27
3.1.3.1 Zeitgleiche Kombinationsbehandlung mit Mafosfamid
und Bortezomib . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
3.1.3.2 Zeitgleiche Kombinationsbehandlung mit Trofosfamid
und Bortezomib . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
3.1.4 Zeitversetzte Kombinationsversuche . . . . . . . . . . . . . . . . 34
3.1.4.1 Zeitversetzte Kombinationstherapie mit Mafosfamid am
MX1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
3.1.4.2 Zeitversetzte Kombinationstherapie mit Trofosfamid am
MX1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
3.1.4.3 Zeitversetzte Kombinationstherapie mit Mafosfamid am
LX1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
3.1.4.4 Zeitversetzte Kombinationstherapie mit Trofosfamid am
LX1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
3.1.4.5 Zeitversetzte Kombinationstherapie mit Mafosfamid am
S117 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
3.1.4.6 Zeitversetzte Kombinationstherapie mit Trofosfamid am
S117 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47
3.2 Versuchsablauf in vivo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49
3.2.1 Bortezomib als Einzelbehandlung . . . . . . . . . . . . . . . . . 49
3.2.2 In-vivo-Kombinationsversuche mit Trofosfamid und Bortezomib 50
3.2.3 In-vivo-Kombinationsversuche mit Cyclophosphamid und Borte-
zomib . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
4 Diskussion 54
4.1 Hintergrund . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54
4.2 Das kleinzellige Lungenkarzinom LX1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
Inhaltsverzeichnis v
4.2.1 In-vivo-Versuche am LX1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57
4.3 Das Mammakarzinom MX1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59
4.4 Das Weichteilsarkom S117 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61
4.5 Zeitversetzte Versuche . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61
4.6 Schlussfolgerung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63
5 Zusammenfassung 64
Literaturverzeichnis 66
Abbildungsverzeichnis 77
Tabellenverzeichnis 79
A Abkurzungsverzeichnis 82
B Grafische Darstellungen 84
C Daten 90
D Danksagung 99
E Lebenslauf 100
F Erklarung 101
1
1 Einleitung
1.1 Geschichte der Chemotherapie
Die Behandlung maligner Tumore hat sich im 20. Jahrhundert entwickelt. Lange Zeit
stand als Therapie lediglich die Moglichkeit der lokalen Tumortherapie durch Chirurgie
oder Bestrahlung zur Verfugung. 1942 wurde als erstes Chemotherapeutikum Stickstoff-
Lost eingesetzt und markierte damit den Beginn der systemischen Therapieansatze.
Zu Beginn der 90er Jahre wurden die ersten Antikorper entwickelt, und 10 Jahre
spater standen die ersten zielgerichteten Therapien (englisch”Targeted Therapies“) zur
Verfugung [10].
Die Entwicklung der systemischen Chemotherapie brachte den entscheidenden Vor-
teil, Tumore auch in fortgeschrittenen Stadien behandeln zu konnen und damit die
Lebenszeit der Patienten zu verlangern und die Lebensqualitat zu verbessern. Da die
zytotoxische Wirkung von Chemotherapien allerdings nicht ausschließlich auf Tumorzel-
len beschrankt ist, verursachen sie zahlreiche und zum Teil erhebliche Nebenwirkungen,
die sich limitierend auf die Therapie auswirken konnen. Viele schnell proliferierende
Gewebe, wie das Knochenmark, die Schleimhaut des Magen-Darm-Traktes und die Ge-
schlechtszellen, leiden unter der zytotoxischen Wirkung der Medikamente. So entstehen
Leukozytopenien, Mukositiden und Sterilitat. Nach wie vor ist es Inhalt zahlreicher
Forschungsvorhaben, die Behandlungsmoglichkeiten gezielter einzusetzen und damit
Nebenwirkungen zu reduzieren [81].
Dank neuer Erkenntnisse der Biomedizin und Molekularbiologie konnen bestimm-
te Eigenschaften maligner Zellen fur die Entwicklung neuer, spezifischer Arzneistof-
fe genutzt werden. Diese Medikamente umfassen u.a. monoklonale Antikorper ge-
gen Oberflachenproteine von Krebszellen oder Inhibitoren der Blutgefaßneubildung
[65].
1 Einleitung 2
1.2 Alkylanzien
Zu den altesten Chemotherapeutika gehoren die Alkylanzien. Sie sind eine Stoffgrup-
pe, die zyklusunspezifisch DNA-Schaden induziert [42]. Die Alkylanzien lassen sich
in die Untergruppen der platinhaltigen Chemotherapeutika, wie Cisplatin, und in die
Senfgasderivate, wie beispielsweise Cyclophosphamid, Trofosfamid und Mafosfamid,
aufteilen. Die Stoffe der zuletzt genannten Gruppe werden auch als Oxazaphosphorin-
derivate bezeichnet. Cyclophosphamid wurde als eines der ersten Zytostatika Anfang
der funfziger Jahre entdeckt und ist zur Behandlung vieler verschiedener Tumore zuge-
lassen, wie beispielsweise dem Mammakarzinom, Lungenkarzinom und Weichteilsarkom
[14, 56].
Das heutzutage am haufigsten angewandte Oxazaphosphorin ist das Cyclophosphamid.
Es ist eine inaktive Vorstufe (Prodrug) und wird erst in der Leber mittels Cytochrom
P450-abhangigen Oxidasen zu dem aktiven Metaboliten 4-Hydroxycyclophosphamid
hydroxyliert. Im Falle des Cyclophosphamids handelt es sich um das Cytochrom 2B6
(Cyp2B6). In der aktivierten Form gelangt das Cyclophosphamid leicht durch die
Zellmembran ins Zellinnere, wo es dann spontan zu Acrolein und dem alkylierenden
Phosphoramid-Mustard zerfallt (Abb. 1.1). Letztgenanntes bewirkt in der Zelle eine
Vernetzung der einzelnen DNA-Strange, was zu Einzel- oder Doppelstrangbruchen fuhrt
und letztendlich den Zelltod induziert. Fur die toxischen Nebenwirkungen macht man
unter anderem Acrolein und in geringerem Ausmaß Chloracetaldehyd verantwortlich. Um
Nebenwirkungen vorzubeugen wird Cyclophosphamid mit Mesna kombiniert, welches an
Acrolein bindet und es dadurch neutralisiert [14, 31, 52, 56, 74]. Da Cyclophosphamid
erst durch Enzyme aktiviert werden muss, wird es in Zellversuchen durch Mafosfamid
ersetzt. Dieses zerfallt in wassriger Losung spontan aquimolar zu 4-OH-Cyclophosphamid
und Mesna [15].
Trofosfamid schadigt die DNA von metabolisch aktiven Zellen auf gleiche Weise wie
Cyclophosphamid und Mafosfamid. Aufgrund der stark lipophilen Eigenschaften wird
Trofosfamid ausschließlich per os verabreicht. Im Organismus wird es teilweise zu Ifos-
famid und zu einem geringen Teil zu Cyclophosphamid metabolisiert. Trofosfamid
wird wie Cyclophosphamid uber Enzyme der Cytochrom P450-Familie in der Leber
aktiviert, in diesem Fall jedoch durch das Cytochrom 3A4 (Cyp3A4). Das so entstandene
4-OH-Trofosfamid zerfallt spontan zu Trofosfamid-Lost (Abb. 1.1). Im Gegensatz zu
Cyclophosphamid ist die aktivierte Form von Trofosfamid in seiner kristallinen Form
stabil und kann deshalb in Zellkulturversuchen verwendet werden. Die Nebenwirkungen
von Trofosfamid werden zu einem großeren Teil vom Chloracetaldehyd verursacht,
anders als bei Cyclophosphamid, was die starker ausgepragteren neurotoxischen Ne-
benwirkungen erklart. Vergleichsweise hat Trofosfamid jedoch ein niedrigeres Neben-
1 Einleitung 3
wirkungsprofil und scheint eine vielversprechende palliative Behandlungsmoglichkeit
fur eine Reihe von Tumoren zu sein. Es wird, ebenfalls wie Cyclophosphamid, un-
ter anderem beim Mammakarzinom, Weichteilsarkom und Lungenkarzinom eingesetzt
[14, 31, 52, 56, 74].
Oxazaphosphorine
Trofosfamid Ifosfamid
Mafosfamid
Mesna
Cyclophosphamid
Strukturisomere
Cyp 3A4 Cyp 3A4 Cyp 2B6
4-OH-Trofosfamid
Acrolein
4-OH-Ifosfamid 4-OH-Cyclophospamid
Acrolein
Chloracetaldehyd
Pro
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Chloracetaldehyd
Abbildung 1.1: Dargestellt ist der Stoffwechsel der Oxazaphosphorin-Derivate Trofosfa-mid, Mafosfamid und Cyclophosphamid. Sie liegen als inaktive Vorstufe(Prodrug) vor. Die Pfeile in dieser Ebene indizieren spontanen Zerfall.Damit die Stoffe aktiviert werden konnen, mussen sie erst durch dieUntertypen des Cytochrom P450 (Cyp 450) verstoffwechselt werden,welche auf dem endoplasmatischen Retikulum (ER) der Leberzellenzu finden sind. Mafosfamid bedarf als einziges keiner enzymatischenMetabolisierung, da es spontan in seine aktive Form zerfallen kann. [56]
1.3 Neue Generation der Krebstherapie
Die neue Generation der systemischen Chemotherapien umfasst, wie oben erwahnt, die
sogenannten”Targeted Therapies“. Man kann sie unter anderem in die Wirkklassen der
”niedermolekularen Arzneimittel“ (englisch
”small molecule drugs“),
”Monoklonalen An-
tikorper“ und”Apoptose induzierenden Arzneimittel“ unterteilen.
Die”small molecule drugs“ blockieren spezifische Enzyme und Rezeptoren fur Wachs-
tumsfaktoren, welche am Prozess des Tumorwachstums beteiligt sind. Ein Beispiel
dafur ist Imatinib, das fehlgefaltete Enzyme oder Proteine in einer Zelle erkennt und
weitere Zellteilungen dieser Zelle durch die kompetitive Hemmung der Tyrosinkinase
verhindert.
Monoklonale Antikorper blockieren Molekule, wie Oberflachenrezeptoren oder Wachs-
tumsfaktoren. Als Beispiel ist hier Bevacizumab zu nennen, welches die Angioneo-
1 Einleitung 4
genese hemmt. Das wichtigste angiogenetische Molekul ist der”Vascular Endotheli-
al Growth Factor“ (VEGF), welcher mitogen auf das Gefaßendothel wirkt und die
Permeabilitat der Gefaße beeinflusst. Bevacizumab bindet den VEGF, verhindert so-
mit die Gefaßneubildung in Tumoren und verbessert die Membranpermeabilitat der
Gefaße. Letzteres kann die Wirkung zeitgleich gegebener Zytostatika begunstigen
[72].
Apoptose induzierende Therapeutika losen, wie der Name schon sagt, den programmier-
ten Zelltod aus. Zu den Apoptose induzierenden Medikamenten gehort u.a. Bortezomib.
Entdeckt wurde es, als man gezielt proteasomhemmende Proteine entwickelte, da man
sich aufgrund theoretischer Kenntnisse eine proapoptotische Wirkung erhoffte. Bei
den In-vitro-Screeningsversuchsreihen des”National Cancer Institute“ (NCI) erwies
sich PS-341, welches spater in Bortezomib umbenannt wurde, als potentes zytotoxi-
sches Agens gegenuber einer Reihe von humanen Krebszelllinien. Aufgrund der hohen
Ansprechrate und der geringen Nebenwirkungen bei der Behandlung des Multiplen
Myeloms wurde Bortezomib 2003 im Eilverfahren von der amerikanischen”Food and
Drug Administration“ (FDA) und ein Jahr spater von der europaischen”European
Medicines Agency“ (EMA) fur die Behandlung des Multiplen Myeloms zugelassen
[61].
1.4 Bortezomib
Die Hemmung der Proteindegradierung uber das Proteasom stellt eine neue Therapieop-
tion fur die Behandlung von malignen Erkrankungen dar, da insbesondere gezeigt werden
konnte, dass maligne Zellen sensibler als normale Zellen auf die Proteasomhemmung
reagieren. Dies wurde in vitro und in vivo am Beispiel von transformierten Fibroblasten,
CLL-Zellen (chronisch lymphatische Leukamie) oder CD34-positiven hamatopoetischen
Vorlauferzellen von Patienten mit CML gezeigt [39, 43, 66]. Die Wirkungsweise des Bor-
tezomib steht in engem Zusammenhang mit dem Wirkmechanismus der Proteasomen.
Es gibt mehrere zellulare Systeme, die Proteine abbauen, wobei man lysosomale und
nicht lysosomale Systeme unterscheidet. Proteasome spalten Proteine nicht lysosomal
und sind maßgeblich an der zellularen Homoostase beteiligt. Durch das Degradieren
von Proteinen bilden sie einen Gegenspieler der Proteinbiosynthese. Das Proteasom
ist ein Enzymkomplex, bestehend aus einer 20S-Kerneinheit und zwei regulativen 19S-
Untereinheiten. Die zur Degradation bestimmten Proteine werden vom Proteasom unter
Energieverbrauch entfaltet und anschließend in der Kerneinheit proteolytisch gespalten.
Zuvor mussen diese Proteine jedoch mit Ubiquitin markiert werden, welches ein hoch
konservatives Protein ist. Die Bindung des Ubiquitins an ein Protein wird durch drei
1 Einleitung 5
Enzyme (E1, E2 und E3) katalysiert (Abb. 1.2). Der weitere Werdegang des markierten
Proteins hangt dann von der Art sowie von der Anzahl angehangter Ubiquitin-Molekule
ab. Das Anbinden von einem oder mehreren einzelnen Ubiquitin-Molekulen beeinflusst
die intrazellulare Verteilung eines Proteins und ermoglicht die Interaktion mit anderen
Proteinen. Eine Polyubiquitinierung, die Markierung eines Proteins mit mehr als funf
aneinander geketteten Ubiquitin-Molekulen, bewirkt den Abbau uber das Proteasom
[37, 71].
Es wird eine Vielzahl von Proteinen durch das Proteasom gespalten. Die Spaltung
bewirkt je nach Protein eine Aktivierung, Stabilisierung oder Inaktivierung. Durch
diese Vorgange beeinflusst das Proteasom die intrazellulare Konzentration von Regu-
latoren des Zellzyklus (p21, p27 [83]), der DNA-Reparatur [22, 26, 30], der Apoptose
(Glykoprotein 130 [38, 64, 68]), der Tumorsuppression (p53 [84]), des Immunsystems
(Iκ Bα Inhibitor des Transkriptionsfaktor NF-κ B [85]) und der zellularen Stressantwort
(c-Jun N-terminale Kinase [89][92]). Außerdem beseitigt es auch fehlgefaltete sowie
uberflussige Proteine. Die Wirkungsweise des Bortezomib entsteht durch die Hem-
mung der Proteasomen und den dadurch entstehenden Einfluss auf die oben genannten
Systeme.
Abbildung 1.2: Dargestellt ist der Proteasomstoffwechsel. Ein zu verstoffwechselndesProtein wird durch die Enzyme E1-E3 ubiquitiniert und unter Ener-gieverbrauch durch das Proteasom gespalten. - ADP = Adenosin Di-phosphat, ATP = Adenosin Triphosphat, E1 = Ubiquitin aktivierendesEnzym, E2 = Ubiquitin konjugierendes Enzym, E3 = Ubiquitin ProteinLigase. Abbildung von Rieken et al. 2010 [75].
Bortezomib besetzt reversibel, mit hoher Affinitat und Selektivitat die katalytische
Untereinheit des Proteasoms und hemmt somit dessen Funktion. Eine Verhinderung der
regelrechten Verstoffwechselung der oben genannten Proteine verursacht eine Storung
des Gleichgewichts derselben in der Zelle. Das somit entstehende Uberangebot oder der
Mangel dieser Proteine fuhrt zur Hemmung der Zelldifferenzierung, zur Initiierung von
Entzundungsreaktionen und letztendlich zum Zellzyklusarrest und dem programmierten
Zelltod (Apoptose).
Zahlreiche Studien konnten zeigen, dass Bortezomib eine zytostatische Wirkung auf
1 Einleitung 6
eine Vielzahl von Tumoren hat. Zu diesen Tumoren gehoren unter anderem das Multiple
Myelom [53], die T-Zell-Leukamie [78, 86, 87], das Prostata-Karzinom [1, 93], das Kolon-
Karzinom [19], das Melanom [3] sowie das Lungenkarzinom [1], das Mammakarzinom
[1] und das Sarkom [82].
Eine Reihe von Studien wurden zum nicht-kleinzelligen Lungenkarzinom (NSCLC)
durchgefuhrt, im Gegensatz dazu finden sich nur wenige Studien zum kleinzelligen
Lungenkarzinom (SCLC). Mortenson et al. konnten 2005 in einem Zellversuch zeigen,
dass das SCLC empfindlich auf Bortezomib reagiert. Außerdem liegen Studien vor, die
vermuten lassen, dass Bortezomib die Chemoresistenz von SCLC unterbinden kann
(Siehe Kap. 1.6). Bis heute liegen fur Bortezomib keine In-vivo-Daten vor, weder fur
das SCLC noch fur die Kombinationsgabe. Eine 2006 veroffentlichte Phase-II-Studie
von Lara et al. zur Behandlung von refraktaren SCLC-Patienten mit Bortezomib als
Einzelbehandlung konnte keine signifikante Uberlebensverlangerung zeigen [49]. Im
Gegensatz zu der Phase-II-Studie zum SCLC liegen Daten zu einem In-vivo-Versuch
fur Kombinationsversuche am NSCLC vor. Teicher et al. haben fur das NSCLC im
Tiermodell der Maus eine signifikante antineoplastische Wirkung von Bortezomib
als Einzeltherapie und auch als Kombinationstherapie mit Cisplatin, Flourourazil,
Taxol oder Adriamyzin zeigen konnen [87]. Beim Mammakarzinom konnten Teicher et
al. einen zytotoxischen Effekt von Bortezomib sowohl bei In-vitro- als auch In-vivo-
Versuchen nachweisen [87]. In den In-vivo-Versuchen mit Mausen wurde Bortezomib
alleine und in Kombination mit Cyclophosphamid oder Cisplatin untersucht. Bei
der Einzeltherapie mit Bortezomib konnte man im Vergleich zur peroralen bei der
intraperitonealen Verabreichung eine signifikant niedrigere Zelluberlebensrate sehen. Die
Kombination von Bortezomib und Cyclophosphamid in den Tierversuchen verstarkte
die zytotoxische Wirkungen sowohl auf die Tumorzellen (bis zum 40-fachen) als auch
auf die Knochenmarkszellen, dies jedoch zu einem geringeren Grad (bis zum 18-fachen).
Dies bedeutet eine effektivere Krebsbehandlung, aber auch ein erhohtes Risiko fur
Knochenmarksdepression in Form von Anamie, Trombozytopenie oder Leukopenie und
ein damit verbundenes erhohtes Risiko fur schwere Infektionen.
Bis heute befassen sich nur wenige Studien mit der Wirkung von Bortezomib auf
das Sarkom. Eine 2010 veroffentlichte In-vitro-Studie von Bauer et al. zu den Ga-
strointestinalen Stromatumoren (GIST) zeigte, dass diese empfindlich auf Bortezomib
reagieren [7]. In der Studie wurde die Zelllinie GIST882 mit verschiedenen Bortezomib-
Konzentrationen im nM-Bereich behandelt und uber 3 Tage inkubiert. Anschließend
wurde die Zelluberlebensrate mit einem Apoptose-Assay gemessen. Die Konzentration,
bei der 50% des Wachstums gehemmt wurde, lag ungefahr bei 20 nM. Im gleichen Jahr
wurde eine Studie von Shapovalov et al. publiziert, in der gezeigt wurde, dass Mause
mit einem Rhabdomyosarkom ebenfalls gut auf die Einzeltherapie mit Bortezomib
1 Einleitung 7
ansprechen. Maki et al. hatten bereits 2005 eine Phase-II-Studie zur Einzelbehandlung
von Patienten mit metastasierendem Sarkom mit Bortezomib durchgefuhrt. Man stellte
fest, dass die Einzelbehandlung mit Bortezomib keinen signifikanten antineoplastischen
Effekt hatte und man in zukunftigen Studien nur praklinisch getestete Kombinationsbe-
handlungen anwenden sollte. Bis heute gibt es allerdings keine Studien uber die Kombi-
nationsbehandlungen von Bortezomib und Oxazaphosphorinen.
1.5 Kombinationstherapie
Wie im vorhergehenden Kapitel dargestellt, stoßt die Einzeltherapie an ihre Grenzen,
und der Einsatz von Kombinationstherapien in der Krebsbehandlung gewinnt immer
mehr an Bedeutung. Ist ein Medikament zur Einzeltherapie zugelassen, ist es gesetzlich
nicht zwingend notwendig, eventuelle Kombinationen praklinisch zu testen [24]. Das
hat zur Folge, dass man Kombinationsbehandlungen an Patienten einsetzen kann, ohne
die Wirkung in praklinischen Studien gezeigt zu haben. Dies birgt die Gefahr, dass
man Wechselwirkungen wie z.B. Resistenzmechanismen erst zu einem spateren Zeit-
punkt beim Patienten entdeckt. Fanucchi et al. haben 2006 in einer Phase-II-Studie
die Kombination von Bortezomib und Docetaxel, einem antimikrotubularen Zytosta-
tikum, an Lungenkarzinom-Patienten untersucht [27]. Man hat nur eine geringfugig
verstarkte antineoplastische Wirkung fur die Kombinationsbehandlung im Vergleich
zur Einzelbehandlung mit Bortezomib festgestellt. In der Arbeit wird auf den positiven
Effekt der Kombinationstherapie von Bortezomib und Doxetacel, einem Taxan, verwie-
sen. Es fehlt jedoch ein Verweis auf Studien, welche dies in praklinischen Versuchen
belegen. In den 1999 durchgefuhrten Studien von Teicher et al. wurde gezeigt, dass
Paclitaxel, welches ebenfalls ein Taxan ist, in Kombination mit Bortezomib einen guten
antineoplastischen Effekt auf eine Lungenkrebszelllinie hat [87]. Auch wenn Docetaxel
und Paclitaxel zur Gruppe der Taxane gehoren und eine gleiches Grundgerust haben,
konnen alleine aufgrund unterschiedlicher Seitenketten unerwartete Wechselwirkungen
in der Kombination mit Bortezomib auftreten. Dies veranlasste 2007 Jung et al., eine
In-vitro-Studie zur Kombination von Docetaxel und Bortezomib am NSCLC durch-
zufuhren, in der sie sowohl antagonistische als auch synergistische Effekte beobachten
konnten [41]. Der synergistische Effekt war dann zu beobachten, wenn die Zellen erst
mit Docetaxel und zeitverzogert mit Bortezomib behandelt wurden. Auch wenn man
nicht direkt vom praklinischen Effekt auf den klinischen Effekt einer Behandlung schlie-
ßen kann, zeigen diese Daten, wie wichtig es ist, eine Kombinationstherapie erst in
praklinischen Studien zu untersuchen, um im Patienten eine optimale Wirkung erzielen
zu konnen.
1 Einleitung 8
1.6 Stand der Forschung
Das Lungenkarzinom ist die haufigste maligne Erkrankung des Mannes. Veroffentlichungen
der deutsche Krebsgesellschaft [4] kann man entnehmen, dass das kleinzellige Lungen-
karzinom, ein Subtyp des Lungenkarzinoms, charakteristischerweise zentral mit hoher
Proliferationsrate wachst und fruh hamatogen oder lymphogen metastasiert, vorzugs-
weise in das Gehirn, die Knochen, Leber oder Nebenniere. Klinisch wird das kleinzellige
Lungenkarzinom in eine begrenzte (limited disease, LD) und eine ausgedehnte Krank-
heitsausdehnung (extensive disease, ED) eingeteilt. Da es meist erst im fortgeschrittenen
Stadium symptomatisch wird, liegt die mediane Uberlebensrate bei drei bis funf Mona-
ten und die 1 Jahresuberlebensrate bei ca. vier Prozent. Die deutsche Krebsgesellschaft
erklart, dass die Therapie der Wahl bei begrenzter wie bei dissiminierender Erkrankung
die Polychemotherapie ist. Beim SCLC LD kann die Therapie mit Bestrahlung und in
seltenen Fallen auch mit Chirurgie erganzt werden. Außerdem fuhren sie aus, dass eine
Polychemotherapie einen bedeutend besseren Effekt hat als eine Einzelstoffbehandlung.
”Die Gabe einer zytostatischen Monotherapie entspricht nicht dem evidenzbasiertem
medizinischen Standard.“ [4]. Die Standardchemotherapien stellen sich aus einem Al-
kylanzium wie Cisplatin oder Cyclphosphamid, und einem zweiten und eventuell dritten
Medikament zusammen.
Klinische Studien zur Kombinationsbehandlung des SCLC mit Bortezomib sind bis jetzt
noch nicht veroffentlicht worden. In praklinischen Studien haben Mortenson et al. zeigen
konnen, dass es die Synthese der regulatorischen Proteine des”B-cell lymphoma 2“
(Bcl-2) hemmt [63]. Außerdem wurde in praklinischen Studien von Zangemeister-Wittke
et al. gezeigt, dass diese Bcl-2-Proteine Grund fur die Chemoresistenz des SCLC sein
konnen [96]. Durch die Blockade der Synthese von funktionsfahigen Bcl-2-Proteinen
zeigten sie, dass diese Proteine, die von Proteasomen verstoffwechselt werden, antia-
poptotisch wirken und einer der Hauptfaktoren der Chemoresistenz im SCLC sind.
Diese Beobachtungen fuhren zu der Hypothese, dass Bortezomib einer Cheomoresistenz
im SCLC entgegenwirken kann. Dowlati et al. konstatierten in ihrer Studie von 2007,
dass im SCLC eine hohe angiogenetische Aktivitat zu beobachten sei und dies sich
als therapeutischer Angriffspunkt eigne [23]. Im Jahr zuvor haben Roccaro et al. mit
verschiedenen Untersuchungen festgestellt, dass Bortezomib antiangiogenetisch wirkt
[77]. Sie zeigten, dass die Proliferation von Endothelzellen von Myelom-Patienten durch
Bortezomib gehemmt wird. Außerdem haben sie eine dosisabhangige Inhibition der
Angiogenese anhand von verschiedenen Assays nachgewiesen.
Die haufigste maligne Erkrankung der Frau ist das Mammakarzinom, wobei das invasive
duktale Mammakarzinom der am haufigsten vorkommende Untertyp des Mamma-
karzinoms ist. Die Wahl der Therapie des Mammakarzinoms soll den individuellen
1 Einleitung 9
Gegebenheiten gerecht werden und hangt unter anderem von Tumortyp, Aus-breitung,
Lokalisation und diversen Risikofaktoren ab. Die ausfuhrlichen Leitlinien sind auf der
Homepage der Deutschen Krebsgesellschaft einzusehen [46]. Vereinfacht wird primar ope-
riert und speziell bei brusterhaltender Operation nachbestrahlt. Erst in den fortgeschrit-
tenen Stadien kommt die neoadjuvante und adjuvante Polychemotherapie hinzu, die
sich aus einer Kombination von u.a. Cyclophosphamid, Methotrexat und 5-Flourouracil
zusammensetzt. Im fortgeschrittenen Stadium wird diese aggressive Kombinations-
therapie gegebenenfalls von einer milderen palliativen Monotherapie abgelost. Seit
einigen Jahren wird der Effekt von Bortezomib auf das Mammakarzinom untersucht.
Es gibt einige Forschungsgruppen, die in In-vitro-Versuchen zeigten, dass verschiedene
Mammakarzinomzellen auf eine Therapie mit Bortezomib ansprechen [16, 18, 87]. Im
Vergleich dazu konnten Ames et al. 2009 keine signifikante Steigerung der Apoptoserate
bei der Monotherapie mit Bortezomib feststellen, hingegen jedoch erhohte Aktivitat der
Apoptose induzierenden Pfade, weswegen man empfiehlt, eine Kombinationsbehandlung
zu untersuchen [2]. Einzig die 2008 veroffentlichten Ergebnisse der Forschungsgruppe
um Xu et al. [95] zeigten eine Resistenz des Mammakarzinoms gegenuber Bortezomib.
Klinische Versuche zur Kombination mit einem zweiten Zytostatikum haben verschiedene
Ergebnisse erbracht. Eine 2008 veroffentlichte Studie von Schmid et al. zur Kombination
von Capecitabin mit Bortezomib an therapierefraktaren Mammakarzinom-Patientinnen
zeigte eine moderate Verlangerung des progressionsfreien Uberlebens [80]. Die Kombi-
nation war fur die Patientinnen gut vertraglich und hatte wenige Nebenwirkungen. Die
Kombination von Bortezomib und Doxorubicin in einer 2010 veroffentlichten Studie von
Irvin et al. wurde gut toleriert, hatte aber keine signifikante Wirkungsverstarkung [40].
Zur Kombination von Cyclophosphamid und Bortezomib gibt es bis heute eine einzige
Arbeit aus dem Jahr 1999 von Teicher et al. [87]. In ihren Vorversuchen mit Mausen
konnte gezeigt werden, dass die intraperitoneale Verabreichung von Bortezomib der
oralen Verabreichung vorzuziehen ist, da Bortezomib eine um ein Vielfach verstarkte
zytotoxische Wirkung bei einer nur gering erhohten Knochenmarkstoxizitat zeigte.
Bei den In-vivo-Kombinationsversuchen mit Cyclophosphamid und Bortezomib zum
Mammakarzinom konnte eine bis zu 40-fache Verstarkung der Zytotoxizitat beobachtet
werden. Die Knochenmarkstoxizitat verstarkte sich im Vergleich dazu nur um das
17-fache.
Anders als bei den Erwachsenen kommt Lungen- und Brustkrebs bei Kindern seltener
vor. Das Weichteilsarkom stellt nach den Malignomen des zentralen Nervensystems
(ZNS) die zweitgroßte Gruppe der soliden Tumoren in der Padiatrie dar. Es ist mesen-
chymalen Ursprungs und kommt zu 60% an den Extremitaten vor. Die WHO hat 61
maligne Sarkomentitaten registriert. Die Vielzahl an Sarkomen erklart die Uneinigkeit
und die widerspruchlichen Ergebnisse bei Studien zum Ansprechen auf Chemothera-
1 Einleitung 10
pieprotokolle. Die niedrig malignen Sarkome und Chondrosarkome sprechen nicht bis
kaum auf Chemotherapien an, weswegen sie chirurgisch angegangen werden sollten.
Bei inoperablen Fallen wird u.a. mit Ifosfamid, Doxorubicin, Cyclophosphamid und
Methotrexat in verschiedenen Kombinationen behandelt [67, 79, 94]. Bei Begleiterkran-
kungen oder reduziertem Allgemeinzustand sollte weniger aggressiv therapiert werden.
In solchen Fallen wird u.a. Trofosfamid als Monotherapie empfohlen. Die Ansprech-
wahrscheinlichkeit bei der Trofosfamid-Monotherapie ist gering und kann alternativ
mit einer neueren Substanz kombiniert werden [79]. Die bis jetzt vorliegenden Studien
zeigen jedoch keinen signifikanten Unterschied in der Mortalitat beim Vergleich von
Mono- und Polychemotherapie [60, 73]. In der 2009 durchgefuhrten klinischen Studie
von Maurel et al. verglich man den Effekt von Doxorubicin mit dem der Kombination
von Doxorubicin und Ifosfamid [60]. Bei der Kombinationstherapie wurden mehr Ne-
benwirkungen beobachtet, aber keine Verlangerung des progressionsfreien Uberleben.
Es gibt wenige Studien zu Sarkomen und der Behandlung mit Bortezomib. Diese
zeigen, dass Ewingsarkome [57], Rhabdomyosarkome [9] und Osteosarkome [82] sen-
sibel gegenuber Bortezomib sind. In einer Phase-II-Studie von Maki et al. aus dem
Jahr 2005 zur Einzelbehandlung von Sarkomrezidiven mit Bortezomib wurde eine
nur geringfugige antineoplastische Aktivitat beobachtet, weswegen man auch hier eine
Kombinationsbehandlung vorschlagt [58].
1.7 Fragestellung
Die meisten Neoplasien werden mit einer Kombination von Chemotherapeutika be-
handelt, da diese sich als effektiver als die jeweilige Einzelbehandlung erwiesen haben.
In Kapitel 1.4 und 1.6 werden Studien erwahnt, die gezeigt haben, dass Bortezomib
Eigenschaften hat, die eine Kombination mit einem zweiten Zytostatikum als vielver-
sprechend erscheinen lassen. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, zu untersuchen, ob es
bei der Kombination von den Oxazaphosphorinen Trofosfamid und Mafosfamid mit Bor-
tezomib in Zellversuchen zu einer Wirkungsverstarkung kommt und ob eine eventuelle
Wirkungsverstarkung durch die zeitversetzte Gabe der Substanzen beeinflusst wird. Die
Kombinationsbehandlungen wurden in Zellversuchen an den haufigsten Malignomen
der Frau, des Mannes und des Kindes untersucht. In vorliegender Studie wurden das
Mammakarzinom MX1, das Lungenkarzinom LX1 und das Weichteilssarkom S117 ver-
wendet. Im Anschluss an die In-vitro-Untersuchungen wurde der Frage nachgegangen,
ob sich die Ergebnisse der Zellversuche am Tiermodell der Maus zum LX1 reproduzieren
lassen.
11
2 Material und Methoden
2.1 Material
2.1.1 Labormaterial
Tabelle 2.1: Labormaterial
Labormaterial Bezugsquelle96 Well - Mikrotiterplatten Nunc, WiesbadenFalcon Rohrchen (15 ml, 50 ml) Nunc, Wiesbadensterile Pipetten Eppendorf AG, HamburgPipettenspitzen (200 µl, 1000 µl) Greiner, GriesheimBiocidal ZF Desinfektionsspray WAK Chemie Medical GmbH, SteinbachZellkulturflaschen 75cm2 Nunc, WiesbadenEinfrierrohrchen, Cryo Tube Nunc, WiesbadenTuberkulinspritze 1ml BD Plastipak, HeidelbergKanule 26G, 0,45mm BD Pastipak, HeidelbergSteriles Abdecktuch 45cm x 75cm Hartmann AG, HeidenheimSkalpell 11er Klinge C. Bruno Bayha GmbH, TuttlingenKnopfsonde Aesculap AG, TuttlingenCutasept Bode Chemie, HamburgSteri-Strip Noba Verbandmittel, Wetter
2.1.2 Gerate
Tabelle 2.2: Gerate
Gerate Bezugsquelle
Brutschrank Typ BB 6220 CU Heraeus Instruments, Hanau
Werkbank Gelaire, Sydney, Australien
Spektralphotometer fur Mikrotiterplatten Dynex Technologies, Berlin
Mikroskop ID 03 Carl Zeiss, Gottingen
Neubauer Zahlkammer Karl Hecht KG, Sondenheim/Rhon
Megafuge Heraeus Sepatech, Osterode
2 Material und Methoden 12
Tabelle 2.2: Fortsetzung
Gerate Bezugsquelle
Elektronische Waage Sartorius, Gottingen
Wasserbad GFL, Burgwedel
Ultraschallbad, Dandelin Sonorex, TK 52 Bandelin Electronic, Berlin
ELISA-Waschstation Behring, Marburg
Ruttler, MS2 Minishaker IKA-Werk GmbH, Staufen
Pipetus-Akku Hirschmann, Eberstadt
Stickstoffbehalter Cryson GmbH, Schollkrippen
Wasserstrahlpumpe KNF-Lab, Balterswil, Schweiz
Glaspasteurpipetten Hecht- Assistent, Sondeheim
Kafig Makrolon Typ III E. Becker und Co., Castrop-Rauxel
2.2 Reagenzien
2.2.1 Medien und Zusatze
Tabelle 2.3: Medien und Zusatze
Medien und Zusatze BezugsquelleRPMI 1640 Zellmedium Cambrex Bio Science, Verviers, BelgienEinfriermedium Cryo-Safe I c.c.pro GmbH, OberdorlaFetal Bovine Serum Biochrom AG, BerlinPenicillin-Streptomycin Gibco/ Invitrogen, Karlsruhe(Penicillin 50.000 IU/mlStreptomycin 50 mg/ml)Trypsin-EDTA-Losung Gibco/ Invitrogen, KarlsruheAmpicillin Ratiopharm, UlmRompun 2% BayerVital, LeverkusenPentobarbital-Na. 1,8 ml Amp. Apotheke UK-SH, Lubeck
2.2.2 Puffer und Stammlosungen
Tabelle 2.4: Puffer und Stammlosungen
Puffer und Stammlosungen Bezugsquelle
MES-Puffer, Morpholenoethansulfonic acid Gerbu, Gaiberg
Essigsaure 10% J.T. Backer, Griesheim
Kristallviolett 0,1% Sigma, Deisenhofen
2 Material und Methoden 13
Tabelle 2.4: Fortsetzung
Puffer und Stammlosungen Bezugsquelle
Glutaraldehyd Grade II 25% Losung Sigma, Deisenhofen
Natriumchloridlosung 0,9% Apotheke UK-SH, Lubeck
Ethanol 70% hergestellt aus Ethanol 96% Apotheke UK-SH, Lubeck
Natriumhydroxid 1N (NaOH) Apotheke UK-SH, Lubeck
Aqua destillata Apotheke UK-SH, Lubeck
2.3 Zytostatika
2.3.1 Bortezomib
Bezugsquelle: Millennium Pharmaceuticals, Cambridge, USA
Summenformel: C19H25BN4O4
Bortezomib ist eine Dipeptidyl-Borsaure. Das bei den Versuchen verwendete Bortezomib
war eine fertig hergestellte Injektionslosung, die aus den Bestanden der stationaren
Therapie zur Verfugung gestellt wurde. Die Losung wurde aliquotiert und bei -20°Cgelagert. Bortezomib hat eine Molekulargewicht von 384,24. Die verschiedenen Konzen-
trationen fur die einzelnen Versuche wurden durch Verdunnung mit Medium hergestellt
(Kap. 2.7.2).
2.3.2 Trofosfamid
Bezugsquelle: Baxter Oncology, Frankfurt
Summenformel: C9H18Cl3N2O2P
Trofosfamid wurde in zwei Formen angewandt. Das aktivierte Trofosfamid, auch 4OH-
oder 4OOH-Trofosfamid genannt, wurde in den Zellversuchen angewandt. Die inaktive
Grundsubstanz Trofosfamid wurde in den Tierversuchen verwendet. Das kristalline 4OH-
Trofosfamid hat ein Molekulargewicht von 355,6. Fur die Versuche wurden Rohrchen
mit 2 µg Zytostatikum eingewogen und bei -80°C gelagert, um sie bei Bedarf fur die
Behandlung der Zellen als Stocklosung nutzen zu konnen. Die gewunschten Konzentra-
tionen wurden mittels einer Verdunnungsreihe hergestellt (Kap. 2.7.2).
Das inaktive Trofosfamid mit einem Molekulargewicht von 323,59 wurde ebenfalls als
kristalline Substanz geliefert. Es wurde bei -80°C gelagert, wobei fur die Versuche
Rohrchen mit jeweils 80 mg Trofosfamid abgewogen wurden. Vor Behandlung der
Tiere wurde das Trofosfamid in 16 ml 0,9% Kochsalzlosung mittels des Ultraschallba-
des aufgelost, wonach die gewunschte Menge intraperitoneal (i.p.) verabreicht wurde
2 Material und Methoden 14
[13, 54, 48, 44, 91]. Bei der peroralen (p.o.) Therapie wurde in Abhangigkeit von Anzahl
und Gewicht der Tiere die gewunschte Menge Trofosfamid in dem jeweils notigen
Volumen Leitungswasser gelost [8, 59].
2.3.3 Cyclophosphamid
Bezugsquelle: Pfizer, Karlsruhe
Summenformel:C7H15Cl2N2O2P
Das kristalline Cyclophosphamid von der Firma Pfizer wurde aus den Bestanden der
stationaren Therapie zur Verfugung gestellt. Das Pulver wurde bei Raumtemperatur
trocken gelagert. Am Tag der Therapie wurde mit physiologischer Kochsalzlosung die
gewunschte Dosis hergestellt, welche vom Korpergewicht des Versuchstier abhangt (Kap.
2.8.5). Das Molekulargewicht betragt 279,1.
2.3.4 Mafosfamid
Bezugsquelle: NIOMECH, Bielefeld
Summenformel: C9H18C12N2O5PS2xC6H14N
Mafosfamid wurde in seiner kristallinen Form als Mafosfamid L-Lysine mit einem
Molekulargewicht von 500,5 g/mol von Niomech bezogen und bei -20°C trocken gelagert.
Fur die Versuche wurden Rohrchen mit 2 mg Zytostatikum vorbereitet, um sie bei
Bedarf fur die Behandlung der Zellen als Stocklosung zu verwenden. Die gewunschten
Konzentrationen wurden anschließend anhand einer Verdunnungsreihe, wie in Kapitel
2.7.2 beschrieben, hergestellt [13, 54, 48, 44, 91]
2.4 Zelllinien
Tabelle 2.5: Auflistung der verwendeten Tumorzelllinien
Zelllinie Histologie Bezugsquelle Etablierung
S117 polymorphkerniges Cell Lines in vitro etabliert
Sarkom der Service von H. Lohrke, 1985
Schilddruse Heidelberg Deutsches Krebs-
forschungszentrum Heidelberg
2 Material und Methoden 15
Tabelle 2.5: Fortsetzung
Zelllinie Histologie Bezugsquelle Etablierung
MX1 invasives duktales Cell Lines in vitro etabliert
Mammakarzinom Service von H. Lohrke, 1985
ohne Heidelberg Deutsches Krebs-
Ostrogenrezeptoren forschungszentrum Heidelberg
LX1 kleinzelliges Cell Lines in vitro etabliert
Bronchialkarzinom Service von H. Lohrke, 1985
Heidelberg Deutsches Krebs-
forschungszentrum Heidelberg
2.5 Zellbiologische Methoden
2.5.1 Herstellung der Losungen und Medien fur die
Zellkultur
Tabelle 2.6: Zusammenstellung der verwendeten Losungen und Medien
Medium, Losung Komponenten Menge
Kulturmedium RMPI 1640 (25 mM Hepes, L-Glutamin) 450 ml
fetales Kalberserum, 50 ml
Penicillin-Streptomycin 1 ml
(50.000IU/ml und 50 mg/ml)
Gefriermedium Cryo-safe gebrauchsfertig
Glutaraldehyd 11% Glutaraldehyd 25% 44 %
NaCl 0,9% 56 %
Trypsin EDTA Trypsin EDTA gebrauchsfertig
MES Puffer MES 4,2652g
200mM pH 6,0 Aqua dest. 100 ml
NaOH 1N bis pH 6,0
Kristallviolett 0,1% Kristallviolett 100 mg
MES-Puffer pH 6,0 100 ml
Essigsaure 10% Essigsaure 100% 5 ml
Aqua dest. 45 ml
Pentobarbital-Na. Pentobarbital-Na. 1 ml
-Rompun-Lsg. NaCl-Lsg. 0,9% 9 ml
Rompun 2% 1 ml
NaCl-Lsg. 0,9% 9 ml
2 Material und Methoden 16
2.6 Zellkultur
2.6.1 Steriles Arbeiten
Um die Kontamination der Zellkulturen mit Mikroorganismen zu vermeiden, wurde
steril gearbeitet. Alle Arbeiten mit den Zellen wurden unter der sterilen Werkbank
durchgefuhrt. Die Arbeitsflache und die Arbeitsmaterialien wurden zu Beginn der Arbeit
mit 70% Ethanol desinfiziert. Außerdem wurden steril verpackte Einmalartikel benutzt
und zuvor autoklavierte Glasmaterialien.
2.6.2 Kultivieren und Passagieren
Es wurden die humanen Zelllinien MX1, LX1 und S117 verwendet (Tab. 2.5). Die
Tumorzellen wurden als Aliquots von 4x106 Zellen in flussigem Stickstoff gelagert. Um
ausreichend Zellen fur die Versuchsansatze zu erhalten, mussten sie nach dem Auftauen
in Kulturflaschen (75 cm2) subkultiviert werden. Zur Vermehrung wurden die Zellen,
die als adharente Monolayer wachsen, ab einer Konfluenz von ca. 95 % passagiert, indem
sie auf zwei oder mehr Flaschen verteilt wurden.
Die in flussigem Stickstoff kryokonservierten Tumorzellen wurden in einem 37°C war-
men Wasserbad aufgetaut und anschließend in Kulturmedium aufgenommen und in
ein Falconrohrchen uberfuhrt. Um die Tumorzellen vom restlichen Gefriermedium zu
befreien, wurden die Rohrchen mit der Zellsuspension drei Minuten bei 1000-1500
Umdrehungen per Minute (U/min) zentrifugiert, und das Medium wurde anschließend
abgesaugt. Das ubriggebliebene Zellpellet wurde in Kulturmedium resuspendiert und
auf Zellkulturflaschen verteilt. Diese wurden im Brutschrank bei 37°C in wasserdampf-
gesattigter Atmosphare mit 5% CO2 kultiviert. Vor den Versuchen fand immer eine
Subkultivierung statt, um eventuelle Schaden durch die Kryokonservierung auszuschlie-
ßen.
Wahrend die MX1- und LX1-Zellen alle drei Tage subkultiviert wurden, reichten fur
die Vermehrung der S117–Zellen vier Tage aus. Fur das Passagieren der Zellen wurde
zunachst das Nahrmedium abgesaugt, durch Zugabe von 10 ml 0,9% Kochsalzlosung
wurden die Zellen gespult und anschließend mit einer 10%igen Trypsin-Losung fur 5 Mi-
nuten bei 37°C inkubiert. Durch Beklopfen der Kulturflasche losten sich die Zellen vom
Flaschenboden. Um die Trypsinwirkung zu neutralisieren, wurden funf ml Kulturmedi-
um zugegeben. Diese Suspension wurde in einem 50 ml-Falconrohrchen bei 1500 U/min
fur 3 Minuten zentrifugiert. Die S117-Zellen wurden bei 1000 U/min uber die gleiche Zeit
2 Material und Methoden 17
zentrifugiert. Der Mediumuberstand wurde abgesaugt und das Pellet in Medium resus-
pendiert. Anschließend wurde die Zellzahl, mittels der Neubauerzahlkammer bestimmt,
und pro Kulturflasche wurden 4–6x106 Tumorzellen eingesat.
2.6.3 Kryokonservierung
Fur die Kryokonservierung von Zellen wurde das Pellet wie oben beschrieben ge-
wonnen und in Cryo-Safe-Medium resuspendiert. Durch Cryo-Safe-Medium wird das
Auskristallisieren von Wasser im Zellinneren verhindert. Dabei wurde die Zellzahl dies-
mal auf 4x106 Zellen/ml eingestellt. Die Zellsuspension wurde in Nunc-Kryorohrchen
mit einem Volumen von je 1,8 ml uberfuhrt und anschließend einen Tag bei -80°Cheruntergekuhlt. Die Kryorohrchen wurden am nachsten Tag in flussigen Stickstoff
umgelagert.
2.7 Proteinchemische Methode
2.7.1 Kristallviolett-Assay
Der Kristallviolett-Assay wurde erstmals von Joseph E. Grady 1960 beschrieben [33]
und fur die vorliegenden Versuche - wie von W. Kueng 1989 optimiert [47] - durchgefuhrt.
Mit dieser Methode erhalt man ein quantitatives Maß fur vitale Zellen. Die Versuche
wurden in 96-Well-Platten durchgefuhrt, die mit einer zuvor festgelegten Anzahl Zellen
beimpft wurden. Die zu messenden Zellen wurden 15 Minuten mit einer 11%-igen
Glutaraldehydlosung auf einem Plattenruttler bei 500 U/min inkubiert (Tab. 2.6). Nach
Entfernung des Uberstands und einem Waschschritt mit destilliertem Wasser wurden
die Versuchsplatten luftgetrocknet. Anschließend wurden die Zellen mit einer 1%-igen
Kristallviolett-Losung gefarbt und 20 Minuten auf einem Plattenruttler inkubiert (Tab.
2.6). Da abgestorbene Zellen ihre Adharenz verlieren, wurden diese samt dem freien
Farbstoff durch den folgenden Waschschritt entfernt. Anschließend wurden die Platten
luftgetrocknet und die verbleibenden angefarbten Zellen danach mit 1 ml 10% Essigsaure
lysiert (Tab. 2.6). Auf diese Weise wurde der Farbstoff freigesetzt, dessen optische Dichte
bei 590 nm im Photometer bestimmt wurde. Durch die Farbstoffkonzentration bzw. die
optische Dichte kann man auf die Zellkonzentration ruckschließen.
2 Material und Methoden 18
2.7.2 Zytostatikaaufbereitung
Fur die Herstellung von Verdunnungsreihen wurden Stocklosungen von Mafosfamid (1
mmol/l), 4OH-Trofosfamid (1 mmol/l) und Bortezomib (1 µmol/l) angesetzt (siehe hier-
zu auch Kapitel 2.3). Die Zytostatika wurden in Medium suspendiert. Anschließend wur-
den Mafosfamid und 4OH-Trofosfamid fur 3 Minuten im verschlossenen Reagenzglas in
ein Ultraschallbad gestellt, um die vollstandige Losung der Stoffe im Medium zu sichern.
Zur Bestimmung der geeigneten Mafosfamid- und 4OH-Trofosfamid-Konzentrationen
wurden die Arbeiten von Klink et al., Letsch et al. und Braasch et al. herangezogen
[54, 11, 44]. Die Arbeit von Teicher et al. diente als Orientierung bei der Bestimmung
der Bortezomibkonzentrationen [87]. Die Bortezomibkonzentrationen werden in der vor-
liegenden Arbeit als”Inhibiting Concentration“ IC25, IC50 oder IC75 angegeben, und
entsprechen bei der jeweiligen Zelllinie einer Wachstumshemmung von 25, 50 oder 75%
(durch Bortezomib). Die verschiedenen IC-Werte von Bortezomib sind im Ergebnisteil
in Tabelle 3.1 dargestellt. Die Konzentrationsreihen der Oxazaphosphorine sind im
Ergebnisteil in Tabelle 3.2 dargestellt.
2.7.3 Behandlungsschemata
Da, abgesehen von den verwendeten Zytostatikakonzentrationen, der Versuchsaufbau bei
allen Zelllinien identisch war, wird dieser im Folgenden exemplarisch an einer Zelllinie
dargestellt. Die 96-Well-Platten wurden am Tag 1 des Versuchs mit Zellen beimpft.
LX1- und S117-Platten wurden mit 3x103 Zellen pro Well beimpft, und MX1-Platten
wurden mit 5x103 Zellen pro Well beimpft.
Der zweite Schritt, die Behandlung, wurde am Tag 2 durchgefuhrt. Je nach Versuch
wurden unterschiedliche Behandlungsschemata angewandt. Es wurden Kombinations-
versuche durchgefuhrt, in denen die Zytostatika zeitgleich und zeitversetzt gegeben
wurden. Bei den zeitgleichen Versuchen gab es eine unbehandelte Kontrollplatte und
jeweils eine Kontrollplatte zur Einzelbehandlung mit Mafosfamid, 4OH-Trofosfamid und
Bortezomib mit den zuvor festgelegten Konzentrationsreihen, die in den Tabellen 3.1
und 3.2 im Ergebnisteil dargestellt sind. Die Versuchsplatten wurden mit Mafosfamid
und Bortezomib IC25 bzw. 4OH-Trofosfamid und Bortezomib IC25 behandelt. Die
gleichen Versuche wurden ebenfalls mit Bortezomib IC50 und IC75 durchgefuhrt (Tab.
2.7).
Bei den zeitversetzten Kombinationsversuchen wurden die Zellen mit einer Stunde
Zeitverzogerung behandelt. Dies ist ebenfalls in Tabelle 2.7 dargestellt. Es wurde zum
Zeitpunkt null Stunden (0h) mit Bortezomib (IC25 oder IC50) behandelt, und eine
2 Material und Methoden 19
Stunde spater (1h) mit Mafosfamid bzw. 4OH-Trofosfamid und umgekehrt, in den
gleichen Konzentrationen wie die zeitgleichen Kombinationen. Der Versuchsaufbau
ahnelt dem Aufbau der simultan behandelten Zellen. Es wurden wie zuvor eine unbe-
handelte Kontrollplatte, sowie eine Kontrollplatte fur Mafosfamid, 4OH-Trofosfamid
und Bortezomib verwendet. Diesmal wurde jedoch fur Bortezomib eine Kontrollplat-
te fur die Zeitpunkte 0h und 1h benotigt. In diesen Versuchen wurde Bortezomib
IC75 ausgeschlossen, da der zytotoxische Effekt der Kombinationen mit Bortezomib
IC75 in den zuvor durchgefuhrten simultanen Behandlungen zu hoch war. Mit dem
Verdunnungseffekt, der entsteht, wenn man ein Zytostatikum zum Zeitpunkt 1h da-
zugibt, wurde folgendermaßen umgegangen: Die Versuchsplatte wurde mit 200 µl des
ersten Zytostatikums in normaler Konzentration beimpft und nach einer Stunde mit 10
µl des zweiten Zytostatikums, welches eine 21-mal hohere Konzentration hatte. Dadurch
fallt die Konzentration des ersten Zytostatikums mit ca. 5%, welches als akzeptabel
angesehen wurde. Die genannten zeitversetzten Kombinationsversuche wurden ebenfalls
mit zwei Stunden Verzogerung durchgefuhrt (Tab. 2.7). In diesem Fall wurde jedoch
nur Bortezomib IC50 angewandt, da aufgrund der vorangegangenen Versuche dies am
erfolgversprechendsten erschien.
Im dritten Schritt wurde die Zelluberlebensrate gemessen. Dies geschah anhand des
Kristallviolett-Assays, wie unter Kapitel 2.7.1 beschrieben. Die Versuchsreihen mit
LX1 und S117 wurden 48 Stunden nach Behandlung gemessen. Die Versuchsreihen mit
MX1-Zellen wurden wegen der geringen Teilungsrate, erst 72 Stunden nach Behandlung
gemessen. Die Absorbtionswerte wurden mit den Computerprogrammen Microsoft Excel
und GrafPad Prism ausgewertet und dargestellt.
Tabelle 2.7: Behandlungsschemata der einzelnen Zelllinien
Einzeltherapie MX1 LX1 S117
Bortezomib (B) x x x
Mafosfamid (M) x x x
Trofosfamid (T) x x x
Zeitgleich Kombinationsbehandlung mit Bortezomib IC25, IC50 und IC75
B + M x x x
B + T x x x
Um 1h versetzte Kombinationsbehandlung mit Bortezomib IC25 und IC50
B 0h + M 1h x x x
M 0h + B 1h x x x
B 0h + T 1h x x x
T 0h + B 1h x x x
2 Material und Methoden 20
Tabelle 2.7: Fortsetzung
MX1 LX1 S117
Um 2h versetzte Kombinationsbehandlung mit Bortezomib IC50
B 0h + M 2h x x x
M 0h + B 2h x x x
B 0h + T 2h x x x
T 0h + B 2h x x x
2.8 Tierexperimentelle Versuche
2.8.1 Tierhaltung
Die in den Versuchen verwendeten Nu/Nu-Nacktmause wurden aus der Zuchtung von
Taconic erworben. Durch Deletion eines Gens sind die Nacktmause athymisch, was
eine fehlende T-Zellpragung zur Folge hat. Artfremde Zellen werden daher nur bedingt
vom Immunsystem der Maus erkannt und abgestoßen, was diese Mause zum idealen
Wirt von Xenografts macht. Die Tiere wurden in der spezifisiert pathogenfreien (SPF)
Abteilung der Universitatsklinik Schleswig-Holstein, Campus Lubeck gehalten. Futter
und Kafigstreu wurde bei der Firma Altromin erworben. Die Mause bekamen Leitungs-
wasser ad libitum und hatten einen konstanten Tag-/Nacht-Rhythmus. Gemaß dem
Tierschutzgesetz wurden alle Tierversuche dieser Dissertation unter der Tierversuchsan-
tragsnummer V742-72241 122-4 (22-3/05) vom Ministerium fur Umweltschutz, Natur
und Forsten des Landes Schleswig-Holstein genehmigt.
2.8.2 Narkose
Die Narkose wurde mittels einer Mischung aus Nembutal (Pentobarbital-Natrium) und
Rompun durchgefuhrt (Tab. 2.6). Hierfur wurde Nembutal, wie auch Rompun 2% mit
einer isotonischen Kochsalzlosung im Verhaltnis 1:10 verdunnt. Beide Losungen wurden
zu gleichen Teilen gemischt (1:1). Die zu verabreichende Dosis war vom Gewicht des
Versuchstier abhangig (8 ml/kg KG Nembutal sowie 8 ml/kg KG Rompun 2%). Zur
Betaubung eines Tiers wurde nach Desinfektion der Haut die Nembutal-/Rompun-
Losung i.p. injiziert.
2 Material und Methoden 21
2.8.3 Tumoranzuchtung
In den Tierversuchen wurde die Tumoranzuchtung im Nacken der Maus wie folgt
durchgefuhrt: Es wurde ausschließlich die Tumorzelllinie LX1 verwendet. In einem
ersten Schritt wurden die Zellen in vitro kultiviert, wie unter Kapitel 2.6 beschrieben.
Anschließend wurde das Zellpellet zweimal mit 20 ml Zellkulturmedium gewaschen. Das
gereinigte Zellpellet wurde in Ringerlosung resuspendiert, und die Zellen wurden auf eine
Konzentration von 2 - 4x106 Zellen pro 100 µl eingestellt. Diese wurden dann in einer 1
ml-Spritze aufgenommen und unverzuglich weiterverarbeitet, d.h. dem Anzuchtstier
nach Desinfektion der Haut in den Nacken injiziert. Dazu wurde fur jede Maus eine
neue 12er Kanule verwendet. Als Prophylaxe wurde fur die drei darauffolgenden Tage
Ampicillin (10 mg/kg KG) ins Trinkwasser gegeben. Um die Maus mit den Zellen
zu beimpfen, wurde sie, wie zuvor beschrieben, mit der Nembutal-/Rompun-Losung
narkotisiert (Kap. 2.8.2).
2.8.4 Tumortransplantation
Bei einem Tumorvolumen von mindestens 300 mm3 wurde der Tumor entweder auf ein
neues Anzuchttier oder ein Versuchstier transplantiert. Dazu wurden die Tiere, wie unter
Kapitel 2.8.2 narkotisiert. Unter aseptischen Bedingungen wurde der Tumor explantiert
und auf einer Petrischale in ca. 1 mm3 große Tumorstuckchen zerteilt. Zum Schutz vor
Austrocknung lagerten die Tumorstuckchen bis zur Implantation in einer Petrischale
mit 0,9% Kochsalzlosung. Nach der Entnahme des Tumors wurde das narkotisierte
Tier durch Genickbruch getotet. Bei den Anzuchttieren wurde der Tumor ins Genick
transplantiert und bei den Versuchstieren in die Flanke. Von der Implantationsstelle
abgesehen, war der Transplantationsvorgang identisch. In Narkose und unter sterilen
Bedingungen wurde an der gewunschten Stelle ein ca. 0,5 cm langer Hautschnitt
vorgenommen und mit Hilfe einer Kiefersonde eine subkutane Hauttasche prapariert.
Nach der Implantation eines Tumorstuckchens wurde der Schnitt mit einem Steri-Strip
verschlossen. Zur Infekionsprophylaxse verabreichte man den Tieren Ampicillin uber
das Trinkwasser, wie in Kapitel 2.8.3 beschrieben. Transplantationsdatum, Tumortyp
und Passage wurden entsprechend vermerkt. Jeden zweiten bis dritten Tag wurde das
Tumorwachstum kontrolliert (Kap. 2.9).
2.8.5 Behandlungsschemata
Die Therapie wurde bei einem Tumorvolumen von 100-150 mm3 begonnen. Die Berech-
nung des Tumorvolumens ist in Kapitel 2.9 beschrieben. Es wurde mit Trofosfamid,
2 Material und Methoden 22
Cyclophosphamid und Bortezomib behandelt. Die Wirkung einer Einzeltherapie mit je
einem der drei Medikamente wurde untersucht sowie die Kombination von Bortezomib
und Trofosfamid bzw. Cyclophosphamid. Bortezomib wurde zweimal wochentlich verab-
reicht. Trofosfamid und Cyclophosphamid wurden i.p. einmal alle 14 Tage verabreicht.
Bortezomib wurde i.p. injiziert in den Konzentrationen 0,3 mg/kg(KG), 0,6 mg/kg(KG)
und 1,0 mg/kg(KG). Trofosfamid wurde i.p. als Stoßtherapie von 176,4 mg/kg(KG)
verabreicht. Cyclophosphamid (als Aquvalent zu Mafosfamid der In-vitro-Versuche)
wurde i.p. als Stoßtherapie von 176,4 mg/kg(KG) verabreicht. Außerdem wurde die
metronomische Therapie mit der Stoßtherapie von Trofosfamid in Kombination mit
Bortezomib i.p. untersucht. Hierbei wurde Trofosfamid (19 mg/kg(KG)) kontinuier-
lich uber das Trinkwasser verabreicht und zwei-mal wochentlich mit Bortezomib (0,6
mg/kg (KG)) i.p. kombiniert. Wahrend der Versuche wurde dreimal wochentlich das
Tumorvolumen bestimmt und vermerkt, ob Nekrosen auf dem Tumor zu sehen wa-
ren.
2.9 Biometrie und Statistik
Bei den in den Graphiken angegebenen Werten handelt es sich um Mittelwerte (Mean)
und Standardfehler (SEM). Die Berechnung und Darstellung der Werte erfolgte mit dem
Computerprogramm ExcelTM. Die IC-Werte wurden an den Graphiken des Computer-
programms GraphPad Prism 4 berechnet. Die Zelluberlebensrate wurde anhand der
optischen Dichte (OD) errechnet. Dabei wurde eine unbehandelte Kontrolle als 100%
Zelluberleben gewertet. Folgende Formel wurde zur Berechnung der Zelluberlebensrate
verwendet:
Zelluberlebensrate% = 100 ODProbeODKontrolle
Zum Vergleich der Mittelwerte wurde der Mann-Withney-U-Test verwendet, da es
sich um ein parameterfreies Prufverfahren handelt, bei dem die Voraussetzung der
Normalverteilung nicht erfullt sein muß. Ein Signifikanzniveau (p) ≤ 0,05 wurde als sta-
tistisch signifikant gewertet. Es wurde untersucht, ob es einen signifikanten Unterschied
zwischen der Kontrolle und der Kombinationstherapie gibt. Dazu wurden die jeweiligen
Mittelwerte bei jeder verwendeten Konzentrationsstufe miteinander verglichen. Die
Werte sind tabellarisch u.a. im Anhang C dargestellt. Die p-Werte wurden mit dem Pro-
gramm”PAST“ (Paleontological Statistics Software) berechnet (Universitat Blindern
in Oslo, Norwegen [34]). Bei den zeitversetzten Kombinationsversuchen wurde mehr als
ein Vergleich pro Datensatz durchgefuhrt, was es notig machte, das Signifikanzniveau
anzupassen, um eine Kumulation des Alphafehlers zu vermeiden. Die Alphafehler-
Kumulierung besagt, dass mehr Vergleiche pro Datensatz das Risiko erhohen, ein
2 Material und Methoden 23
falsch positives Ergebnis zu bekommen. Nach der Bonferroni-Methode fur multiple
Paarvergleiche adjustiert man das Signifikanzniveau, indem man das initial festgelegte
Signifikanzniveau (in vorliegender Arbeit p≤0,05) durch die Anzahl der Vergleiche
teilt. Bei den zeitversetzten Versuchen wurden bis zu zwei Vergleiche pro Datensatz
durchgefuhrt, weswegen das Signifikanzniveau bei p≤0,025 lag.
Außerdem wurde als Mittel der Effektmessung der”Combination Index“ (CI) ange-
wandt. Dieser beruht auf einer von Chou und Talalay entwickelten Methode, welche der
quantitativen Beschreibung einer Kombinationstherapie dient [17]. Wenn die Gesamtwir-
kung zweier Medikamente die Summe der Einzelwirkungen ist, spricht man von einem
additiven Effekt (CI=1). Ein synergistischer Effekt liegt vor, wenn die Gesamtwirkung
zweier Medikamente die Summe der Einzelwirkungen ubertrifft (CI<1). Wenn die Ge-
samtwirkung zweier Medikamente niedriger ist als die jeweiligen Einzelwirkungen, wird
das als antagonistischer Effekt bezeichnet (CI>1). Der CI wurde mit der Software”Cal-
cuSyn“ von Firma Biosoft berechnet. Um den CI genauer zu beschreiben, empfiehlt der
Hersteller eine Unterteilung des CI, wie in Tabelle 2.8 dargestellt.
Tabelle 2.8: Unterteilung des CI
Beschreibung CI
stark synergistisch 0,10 - 0,30
synergistisch 0,30 - 0,70
moderat synergistisch 0,70 - 0,85
leicht synergistisch 0,85 - 0,90
additiv 0,90 - 1,10
leicht antagonistisch 1,10 - 1,20
moderat antagonistisch 1,20 - 1,45
antagonistisch 1,45 - 3,30
stark antagonistisch 3,30 - 10
Um die abschließende Diskussion zu erleichtern, soll der Begriff”subadditiver Effekt“
erganzend definiert werden, welcher infolge CalcuSyn schon in den antagonistischen
Bereich gehort. Als subadditiv wird der Effekt definiert, bei dem die Gesamtwirkung
zweier Medikamente geringer ist als die Summe der Einzelwirkungen, hingegen hoher
ist als die jeweiligen Einzelwirkungen. Diese Definitionen orientieren sich an dem
Buch”Anasthesiologische Pharmakotherapie“ von Holger Thiel und Norbert Roewer
[88].
In den Tierversuchen wurde das Tumorvolumen mit Hilfe eines Messschiebers berechnet.
Der Tumor wurde in Langs- und Querrichtung ausgemessen. Da die Tiefe eines Tumors
2 Material und Methoden 24
nicht mit einfachen Mitteln gemessen werden kann, wurde folgende viel verwendete
Formel zu Hilfe genommen:
Volumen (mm3) = Lange (mm) x Breite (mm2)/ 2 [21, 29]
Der Behandlungseffekt wurde anhand der Tumorwachstumsverzogerung gemessen. Dies
ist die Zeit, die benotigt wird, um ein gewisses Tumorvolumen zu erreichen im Ver-
gleich zur jeweiligen Kontrolle. In diesem Fall wurden 800 mm3 als Zielwert festge-
legt.
25
3 Ergebnisse
3.1 In-vitro-Versuche
3.1.1 Ermittlung der IC-Werte von Bortezomib
Um die IC25-, IC50- und IC75-Werte fur Bortezomib fur die Zelllinien MX1, LX1 und
S117 (Kap. 2.4) zu ermitteln, wurden die Zellen mit einer steigenden Konzentrationsreihe
von Bortezomib behandelt. Anschließend wurde die relative Zelluberlebensrate mit
dem Kristallviolett-Assay (Kap. 2.7.1) ermittelt. Die benotigte Dosis, um 25% (IC25),
50% (IC50) bzw. 75% (IC75) des Zellwachstums zu hemmen, wurde berechnet. In der
Tabelle 3.1 sind die ermittelten Werte fur alle drei Zelllinien zusammengefasst. Der
Abbildung 3.1 kann man entnehmen, dass die drei Zelllinien gegenuber einer Behandlung
mit Bortezomib sensibel reagieren. Am empfindlichsten reagierten die LX1-Zellen auf
eine Bortezomibbehandlung, wohingegen die MX1-Zellen am unempfindlichsten waren;
sie benotigten bei einer IC50 eine um das 4,5-fache hohere Dosis als die MX1-Zellen.
Die S117-Zellen lagen bei der IC25 und IC50 nur geringfugig hoher als die LX1-
Zellen.
Tabelle 3.1: Zusammenfassung der IC25, IC50 und IC75 von Bortezomib der Zelllinien
Zelllinie Bortezomib IC25 Bortezomib IC50 Bortezomib IC75MX1 6,98 nmol/l 18,36 nmol/l 53,12 nmol/lLX1 2,92 nmol/l 4,03 nmol/l 5,25 nmol/lS117 3,93 nmol/l 6,04 nmol/l 18,90 nmol/l
3 Ergebnisse 26
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Bortezomib [nmol/l]
LX1 MX1 S117
Abbildung 3.1: Dargestellt sind die Zelluberlebensraten fur Bortezomib bei den ZelllinienMX1 (n=10), LX1 (n=10) und S117 (n=10). Die y-Achse stellt dierelative Uberlebensrate im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle, unddie x-Achse die untersuchte Bortezomibkonzentration in nmol/l dar.
3.1.2 Ermittlung der Konzentrationsreihen von Mafosfamid
und 4OH-Trofosfamid
Außerdem wurden in dieser Arbeit Mafosfamid und 4OH-Trofosfamid zur Behand-
lung der drei Zelllinien untersucht. Das in den In-vitro-Versuchen verwendete 4OH-
Trofosfamid wird im folgenden Text als Trofosfamid bezeichnet. In der Tabelle 3.2
ist die jeweilige IC50 der beiden Oxazaphosphorine dargestellt. Trofosfamid zeigte
fur alle drei Zelllinien eine geringfugig hohere IC50 als Mafosfamid. In der gleichen
Tabelle sind die in den Versuchen verwendeten Konzentrationsreihen fur die einzelnen
Zelllinien aufgefuhrt. Die in den Arbeiten von Klink et al. [44] und Letsch et al. [54]
verwendeten Oxazaphosphorin-Konzentrationen wurden mit der vorliegenden Arbeit
bestatigt.
Tabelle 3.2: Konzentrationsreihen der Oxazaphosphorine
Oxazaphosphorin MX1 LX1 S117
MafosfamidIC50 5,91 µmol/l 11,83 µmol/l 15,07 µmol/lKonz.-reihe
1,25; 2,5; 5; 7,5;10; 15 µmol/l
2,5; 5; 10; 20; 40µmol/l
5; 10; 15; 20; 30µmol/l
TrofosfamidIC50 12,85 µmol/l 16,75 µmol/l 16,08 µmol/lKonz.-reihe
2,5; 5; 10; 15; 20;30 µmol/l
2,5; 5; 10; 20; 40µmol/l
5; 10; 15; 20; 30µmol/l
3 Ergebnisse 27
3.1.3 Zeitgleiche Kombinationsbehandlung
Die Zelllinien wurden mit den in Tabelle 3.2 aufgefuhrten Konzentrationsreihen fur
Mafosfamid oder Trofosfamid behandelt und mit Bortezomib IC25, IC50 bzw. IC75
(Tab. 3.1) kombiniert. Als Kontrolle diente eine Behandlung mit Mafosfamid und Tro-
fosfamid als Einzeltherapie. Um Unterschiede in den Kombinationsbehandlungen und
den Einzelbehandlungen zu ermitteln, wurden die Zelluberlebensraten der Kombinati-
onsbehandlungen mit denen der Einzelbehandlung verglichen. Im Folgenden wird uber
Signifikanzen geschrieben, die sich auf den Vergleich mit der jeweiligen Einzelbehandlung
beziehen. Die berechneten p-Werte sind im Anhang fur die Zelllinien MX1, LX1 und
S117 zu sehen (Anhang C). Außerdem wird der”Combination Index“ (CI) verwendet,
um zu beurteilen, ob eine Kombinationsbehandlung einen wirkungsverstarkenden oder
einen wirkungsabschwachenden Effekt hat. Dies wird in Kapitel 2.9 und Tabelle 2.8
beschrieben.
3.1.3.1 Zeitgleiche Kombinationsbehandlung mit Mafosfamid und
Bortezomib
In den Abbildungen 3.2-3.4 wird an den Zelllinen MX1, LX1 und S117 die Einzeltherapie
mit der Mafosfamidkonzentrationsreihe im Vergleich zur Kombinationstherapie der
Konzentrationsreihe mit Bortezomib IC25, IC50 und IC75 gezeigt. Abbildung 3.2
stellt die zeitgleiche Kombinationsgabe an der Zelllinie MX1 dar. Es konnten fur alle
Mafosfamidkonzentrationen bei der Kombinationsgabe mit Bortezoimb IC75 signifikante
Unterschiede ermittelt werden (Tab. 3.3). Bei den Kombinationen mit Bortezomib IC50
waren alle Messpunkte signifikant bis auf den mit der hochsten Mafosfamidkonzentration.
Im Gegensatz dazu konnten Signifikanzen bei der Kombination mit Bortezomib IC25
nur fur die Mafosfamidkonzentrationen 1,25 µmol/l bis 5 µmol/l ermittelt werden. Die
Kombination von Mafosfamid und Bortezomib IC50 zeigte CI-Werte knapp uber und
unter eins, was einem moderat antagonistischen bis moderat synergistischen Effekt
entspricht (Tab. 3.4).
In Abbildung 3.3 sind die Kombinationsversuche fur das LX1 abgebildet. Die Kombina-
tion von Mafosfamid mit Bortezomib IC25 war dem Kurvenverlauf der Kontrolle sehr
ahnlich. Nur bei der Mafosfamidkonzentration von 5 µmol/l konnte eine Signifikanz
nachgewiesen werden (Tab. 3.3). Die Kombinationen mit Bortezomib IC50 bzw. IC75
ahnelten sich in ihrem Verlauf und unterschieden sich signifikant von der der Kontrolle
anhand der niedrigsten drei bzw. vier Mafosfamidkonzentrationen. Die Kombination
von Mafosfamid und Bortezomib IC50 zeigte CI-Werte uber eins entsprechend einem
moderat antagonistischen bis antagonistischen Effekt (Tab. 3.4).
3 Ergebnisse 28
Die Ergebnisse der Versuche mit der Zelllinie S117 sind in Abbildung 3.4 dargestellt.
Auch hier war der Kurvenverlauf der Kombination mit Bortezomib IC25 der Kontrolle
sehr ahnlich und wies keinen signifikanten Unterschied auf (Tab. 3.3). Die Kombina-
tion von Mafosfamid mit Bortezomib IC50 zeigte signifikante Unterschiede fur die
drei niedrigsten Mafosfamidkonzentrationen. Ahnlich war es bei der Kombination mit
Bortezomib IC75, die mit Ausnahme der beiden hochsten Mafosfamidkonzentrationen
Signifikanzen zeigte (Tab. 3.3). Die Kombination von Mafosfamid mit Bortezomib IC50
zeigte CI-Werte, die knapp unter eins lagen, und belegen somit einen additiven bis
moderat synergistischen Effekt (Tab. 3.4).
Tabelle 3.3: Signifikante (+) und nicht signifikante (-) Unterschiede der zeitgleichenKombinationsbehandlungen mit Mafosfamid und Bortezomib IC25, IC50bzw. IC75 an den Zelllinien MX1, LX1 und S117. Signifikanzniveau p≤0,05.
MX1
Mafosfamid µmol/l 1,25 2,5 5 7,5 10 15M vs. M + B IC25 + + + - - -M vs. M + B IC50 + + + + + -M vs. M + B IC75 + + + + + +
LX1
Mafosfamid µmol/l 2,5 5 10 20 40M vs. M + B IC25 - + - - -M vs. M + B IC50 + + + - -M vs. M + B IC75 + + + + -
S117
Mafosfamid µmol/l 5 10 15 20 30M vs. M + B IC25 - - - - -M vs. M + B IC50 + + + - -M vs. M + B IC75 + + + + -
Tabelle 3.4: Der CI der zeitgleichen Kombinationsbehandlung mit Mafosfamid (M) undBortezomib IC50 an den Zelllinien MX1, LX1 und S117. Der CI ist in Kap.2.9 erlautert.
MX1M µmol/l 1,25 2,5 5 7,5 10 15CI 1.309 1.197 1.118 0.857 0.771 0.815
LX1M µmol/l 2,5 5 10 20 40CI 1.377 1.590 1.771 1.638 1.247
S117M µmol/l 5 10 15 20 30CI 1.028 1.085 0.803 0.759 0.796
3 Ergebnisse 29
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Mafosfamid [µmol/l]
Mafosfamid Mafosfamid + Bortezomib IC25Mafosfamid + Bortezomib IC50 Mafosfamid + Bortezomib IC75
Abbildung 3.2: Dargestellt ist die relative Uberlebensrate des MX1 unter der Behand-lung mit Mafosfamid als Einzelbehandlung und als Kombinationsbe-handlung mit Bortezomib IC25 (n=14), IC50 (n=14) und IC75 (n=14).
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Mafosfamid [µmol/l]
Mafosfamid Mafosfamid + Bortezomib IC25Mafosfamid + Bortezomib IC50 Mafosfamid + Bortezomib IC75
Abbildung 3.3: Abgebildet ist die relative Uberlebensrate des LX1 unter der Behandlungmit Mafosfamid als Einzelbehandlung und als Kombinationsbehandlungmit Bortezomib IC25 (n=10), IC50 (n=11) und IC75 (n=12).
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Mafosfamid [µmol/l]
Mafosfamid Mafosfamid + Bortezomib IC25Mafosfamid + Bortezomib IC50 Mafosfamid + Bortezomib IC75
Abbildung 3.4: Die Grafik zeigt die relative Uberlebensrate des S117 unter der Be-handlung mit Mafosfamid als Einzelbehandlung und als Kombinati-onsbehandlung mit Bortezomib IC25 (n=10), IC50 (n=10) und IC75(n=12).
3.1.3.2 Zeitgleiche Kombinationsbehandlung mit Trofosfamid und
Bortezomib
In den Abbildungen 3.5-3.7 wird die Kombinationsbehandlung mit Trofosfamid und
Bortezomib IC25, IC50 und IC75 an den Zelllinien MX1, LX1 und S117 dargestellt.
In diesen Versuchen wurde die Kombination von Trofosfamid und Bortezomib mit der
Einzelbehandlung mit Trofosfamid verglichen.
Die Ergebnisse mit MX1 sind in Abbildung 3.5(a) dargestellt. Bei der Kombination
von Trofosfamid und Bortezomib IC25 gab es einen signifikanten Unterschied fur die
Trofosfamidkonzentration 5 µmol/l (Tab. 3.5). Vergleichsweise gab es Signifikanzen fur
die Kombinationen mit Bortezomib IC50 und IC75 bei den Trofosfamidkonzentrationen
5 µmol/l bis 10 µmol/l. In Abbildung 3.5(b) ist der CI der Kombination von Trofosfamid
mit Bortezomib IC50 grafisch dargestellt. Die Ordinatenachse zeigt den CI an, wobei die
gestrichelte Linie CI=1 markiert, welches der Umschlagpunkt zwischen Synergismus und
Antagonismus ist. Alle gemessenen Werte hatten einen CI von uber 1 und lagen somit im
antagonistischen Bereich. Den Zahlenwerten des CI kann man entnehmen, dass der Effekt
der Kombinationsbehandlung rein antagonistisch war (Tab. 3.6).
An der Abbildung 3.6 zum LX1 wird deutlich, dass alle drei Kurven der Kombinations-
versuche sich der Trofosfamidkontrolle schon bei geringen Trofosfamidkonzentrationen
anpassen. Die Kurven deuten anfanglich eine Abnahme der Proliferationshemmung an,
3 Ergebnisse 31
im Sinne eines antagonistischen Effekts. Der CI zur Kombination von Trofosfamid und
Bortezomib IC50 bestatigt dies (Tab. 3.6). Der einzige signifikante Unterschied war
fur die Trofosfamidkonzentration von 2,5 µmol/l bei der Kombination mit Bortezomib
IC75 zu sehen (Tab. 3.5).
Die Versuche zum S117 wurden in Abbildung 3.7 dargestellt. Auch hier war die Kurve
der Kombination mit Bortezomib IC25 der Kontrolle sehr ahnlich und wies keinen
signifikanten Unterschied auf (Tab. 3.6). Die Kombination mit Bortezomib IC50 wies
lediglich eine Signifikanz fur die niedrigste Trofosfamidkonzentration auf, wohingegen
die Kombination mit Bortezomib IC75 fur die Konzentrationen 5 µmol/l bis 15 µmol/l
Signifikanzen aufwies. Der CI der Kombination von Trofosfamid und Bortezomib IC50
lag zwischen 1,3 und 1,9, entsprechend einer Wirkungsabschwachung im moderat
antagonistischen bis antagonistischen Bereich (Tab. 3.6).
Zusammenfassend fur die zeitgleichen Kombinationstherapien kann man sagen, dass
die Zelllinien allen Behandlungen gegenuber sensibel waren. Wie zu erwarten, zeigte
sich, dass mit steigender Dosis von Mafosfamid die Proliferationsrate der Zellen fiel
und ein vorhandener signifikanter Unterschied mit steigender Mafosfamidkonzentration
immer kleiner wurde. Ahnliches war auch fur die Kombination mit Trofosfamid zu
beobachten, wobei die Proliferation anfanglich jedoch stabil war bzw. tendenziell zunahm,
was den Eindruck erweckt, dass eine Kombination mit Mafosfamid und Bortezomib
einen besseren Effekt hat als die Kombination mit Trofosfamid. Ein additiver bis
synergistischer Effekt wurde nur fur die Kombinationsbehandlungen mit Mafosfamid
fur das MX1 und das S117 festgestellt, jedoch nicht fur das LX1. Die Kombination
mit Trofosfamid zeigte fur alle drei Zelllinien einen unterschiedlich stark ausgepragten
Antagonismus.
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(a)
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Trofosfamid [µmol/l]
Trofosfamid Trofosfamid + Bortezomib IC25Trofosfamid + Bortezomib IC50 Trofosfamid + Bortezomib IC75
(b)
Abbildung 3.5: (a)Dargestellt ist die relative Uberlebensrate vom MX1 unter der Be-handlung mit Trofosfamid als Einzelbehandlung und als Kombinati-onsbehandlung mit Bortezomib IC25 (n=12), IC50 (n=12) und IC75(n=12). In Abbildung (b) ist der CI im Vergleich zur rel. Uberlebensrateals Fraktion (eng. Fractional Effect) zu sehen. Der Effekt der Kom-binationsbehandlung mit Trofosfamid und Bortezomib IC50 wird mitder jeweiligen Einzelbehandlung der beiden Stoffe verglichen. Die Mess-punkte sind nach steigender Konzentration nummeriert, wobei 1 derniedrigsten und 6 der hochsten Trofosfamidkonzentration entspricht.
3 Ergebnisse 33
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Trofosfamid [µmol/l]
Trofosfamid Trofosfamid + Bortezomib IC25Trofosfamid + Bortezomib IC50 Trofosfamid + Bortezomib IC75
Abbildung 3.6: Abgebildet ist die rel. Uberlebensrate vom LX1 unter der Behandlungmit Trofosfamid als Einzelbehandlung und als Kombinationsbehandlungmit Bortezomib IC25 (n=10), IC50 (n=11) und IC75 (n=12).
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Trofosfamid [µmol/l]
Trofosfamid Trofosfamid + Bortezomib IC25Trofosfamid + Bortezomib IC50 Trofosfamid + Bortezomib IC75
Abbildung 3.7: Die Grafik zeigt die rel. Uberlebensrate vom S117 unter der Behandlungmit Trofosfamid als Einzelbehandlung und als Kombinationsbehandlungmit Bortezomib IC25 (n=10), IC50 (n=10) und IC75 (n=12).
3 Ergebnisse 34
Tabelle 3.5: Signifikante (+) und nicht signifikante (-) Unterschiede der zeitgleichenKombinationsbehandlungen mit Trofosfamid und Bortezomib IC25, IC50bzw. IC75 an den Zelllinien MX1, LX1 und S117. Signifikanzniveau p≤0,05.
MX1
Trofosfamid µmol/l 2,5 5 10 15 20 30T vs. T + B IC25 - + - - - -T vs. T + B IC50 + + + - - -T vs. T + B IC75 + + + - - -
LX1
Trofosfamid µmol/l 2,5 5 10 20 40T vs. T + B IC25 - - - - -T vs. T + B IC50 - - - - -T vs. T + B IC75 + - - - -
S117
Trofosfamid µmol/l 5 10 15 20 30T vs. T + B IC25 - - - - -T vs. T + B IC50 + - - - -T vs. T + B IC75 + + + - -
Tabelle 3.6: CI der zeitgleichen Kombinationsbehandlung mit Trofosfamid (T) undBortezomib IC50 an den Zelllinien MX1, LX1 und S117. Siehe auch Kap.2.9
MX1T µmol/l 2,5 5 15 10 20 30CI 2.112 2.201 2.482 1.938 1.677 1.995
LX1T µmol/l 2,5 5 10 20 40CI 1.780 1.903 2.037 1.813 0.858
S117T µmol/l 5 10 15 20 30CI 1.616 1.753 1.828 1.336 1.406
3.1.4 Zeitversetzte Kombinationsversuche
Nach den unter Kapitel 3.1.3 beschriebenen zeitgleichen Kombinationsgaben wurde
der Frage nachgegangen, ob eine zeitversetzte Gabe der Medikamente Einfluss auf das
Uberleben der Tumorzellen hat. Diese Frage stellt sich, da eine zeitversetzte Gabe der
Stoffe theoretisch von Vorteil sein konnte, wenn man bedenkt, dass die Oxazaphos-
phorine am besten auf schnell proliferierende Gewebe wirkt, wohingegen Bortezomib
zyklusunspezifisch einen hemmenden Effekt auf den Zellzyklus ausubt. Das eine zeitver-
setzte Gabe von Medikamenten einer zeitgleichen Gabe uberlegen seien kann, haben
Gomi et al. bereits 1992 gezeigt. Mit ihren In-vitro-Versuchen an einer NSCLC-Zelllinie
zeigten sie, dass die zeitversetzte Gabe von Navelbine und Cisplatin einen agonis-
tischen Effekt hatte, wohingegen die zeitgleiche Gabe einen antagonistischen Effekt
hatte [32]. Die In-vivo-Versuche zu einem NSCLC von Kodama et al. zeigten, dass die
zeitversetzte Gabe von Cisplatin und Docetaxel der zeitgleichen Gabe uberlegen war
[45].
3 Ergebnisse 35
In den vorliegenden zeitversetzten Versuchen wurde, wie in Kapitel 2.7.2 beschrieben,
erst Mafosfamid bzw. Trofosfamid und dann zeitversetzt Bortezomib gegeben und umge-
kehrt. Aus Grunden der Lesbarkeit werden diese Kombinationen im folgenden Text an
einigen Stellen als Abkurzungen dargestellt, wobei”M“ fur Mafosfamid,
”T“ fur Trofosfa-
mid und”B IC25“ bzw.
”B IC50“ fur Bortezomib IC25 bzw. IC50 steht. Die zeitversetzte
Kombination, in der Bortezomib IC25 nach Mafosfamid gegeben wurde, ist als”M>B
IC25“ dargestellt. Die Kombination mit Bortezomib IC75 wurde nicht durchgefuhrt, da
die hohe Apoptoserate einen nur geringen Spielraum fur die Kombinationsbehandlung
ubrig ließ. Im Anschluss an die um eine Stunde versetzten Kombinationsbehandlungen
wurde untersucht, ob eine Verlangerung des Zeitintervalls auf zwei Stunden die gefunde-
nen Effekte verstarkt. In diesen Versuchen wurden nur Kombinationen mit Bortezomib
IC50 untersucht, da man an diesen Kombinationen sowohl antagonistische als auch
synergistische Effekte gut darstellen kann. Der genaue Versuchsaufbau wurde unter
Kapitel 2.7.3 beschrieben. Aus Grunden der Ubersichtlichkeit werden in den folgenden
Kapiteln einige Grafiken lediglich im Anhang B aufgefuhrt, insbesondere wenn sie keine
neuen Informationen bringen. Die Ergebnisse werden stattdessen tabellarisch zusam-
mengefasst. Das adjustierte Signifikanzniveau lag bei den zeitversetzten Versuchen, wie
in Kapitel 2.9 erklart, bei p≤ 0,025.
3.1.4.1 Zeitversetzte Kombinationstherapie mit Mafosfamid am
MX1
Um eine Stunde versetzte Kombinationstherapie mit Mafosfamid am
MX1
Die um eine Stunde versetzten Kombinationsversuche mit Mafosfamid und Bortezomib
IC50 am MX1 sind in Abbildung 3.8 dargestellt. Der Kurvenverlauf der zeitgleichen
Kombinationen, wie sie in Abbildung 3.2 zu sehen sind, und der hier dargestellten
zeitversetzten Kombination von Mafosfamid mit Bortezomib IC50 ahneln einander.
Die zeitversetzten Kombinationen mit Bortezomib IC50 zeigten Signifikanzen fur die
Mafosfamidkonzentrationen 1,25-5µmol/l (Tab. 3.7). Es gab keinen signifikanten Un-
terschied im Vergleich zwischen den zeitversetzten Kombinationen, unabhangig davon,
ob Mafosfamid an erster oder zweiter Stelle gegeben wurde. Der Tabelle 3.7 kann
man entnehmen, dass der CI der zeitversetzten Kombination”M>B IC50“ großtenteils
im additiven Bereich lag, wohingegen die Kombination”B IC50>M“ einen leichten
Antagonismus aufwies. Der Unterschied war jedoch nicht signifikant. Die zeitversetzten
Kombinationen von Mafosfamid und Bortezomib IC25 unterschieden sich nicht signifi-
kant von der Einzelbehandlung mit Mafosfamid. Grafik und p-Werte sind im Anhang
B.1 und C.7 zu finden.
3 Ergebnisse 36
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0 1,25 2,5 5 7,5 10 15
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]
Mafosfamid [µmol/l]
Mafosfamid Mafosfamid 0h + Bortezomib IC50 1hBortezomib IC50 0h + Mafosfamid 1h
Abbildung 3.8: Abgebildet ist die rel. Uberlebensrate der um eine Stunde versetztenKombinationsversuche von Mafosfamid und Bortezomib IC50 im Ver-gleich zur Mafosfamidkontrolle am MX1 (n=15).
Tabelle 3.7: Signifikanzen und CI der um eine Stunde versetzten Kombinationstherapiemit Mafosfamid und Bortezomib IC50 am MX1. Der erste Abschnitt derTabelle zeigt, ob die p-Werte der Kombination signifikante (+) oder nichtsignifikante (-) Unterschiede aufweisen. p≤ 0,025. Der zweite Abschnitt derTabelle zeigt den CI der untersuchten Kombination. Siehe auch Kap. 2.9.
Mafosfamid µmol/l 1,25 2,5 5 7,5 10 15
p-WerteM vs. M>B IC50 + + + - - -M vs. B IC50 >M + + + - - -
M>B IC50 vs. B IC50>M - - - - - -
CIM >B IC50 1.149 1.125 0.922 0.916 0.844 1.099B IC50 >M 1.557 1.483 1.183 1.138 0.977 2.242
Um zwei Stunden versetzte Kombinationsbehandlung mit Mafosfamid am
MX1
Als Erweiterung der um eine Stunde versetzten Kombinationsbehandlungen wurde
untersucht, ob eine Verlangerung des Intervalls zwischen der Medikamentengabe auf
zwei Stunden vorhandene Effekte verstarkt. Die um zwei Stunden versetzte Kombination
von Mafosfamid und Bortezomib IC50 zeigte einen ahnlichen Kurvenverlauf, wie die um
eine Stunde versetzte Kombination (Anhang B.3 und C.11). Signifikante Unterschiede
waren fur die drei niedrigsten Mafosfamidkonzentrationen zu sehen, wie auch bei der
um eine Stunde versetzten Kombination (Tab. 3.8). Die Gabe von Mafosfamid zwei
Stunden vor oder nach Bortezomib IC50 zeigte keinen unterschiedlichen Effekt. Der CI
3 Ergebnisse 37
der um zwei Stunden versetzten Kombination streckte sich von moderat antagonistisch
bis synergistisch fur beide Kombinationsvarianten (Tab. 3.8).
Tabelle 3.8: Signifikanzen und CI der um zwei Stunde versetzten Kombinationstherapiemit Mafosfamid und Bortezomib IC50 am MX1. Der erste Abschnitt derTabelle zeigt, ob die p-Werte der Kombination signifikante (+) oder nichtsignifikante (-) Unterschiede aufweisen. p≤ 0,025. Der zweite Abschnitt derTabelle zeigt den CI der untersuchten Kombination. Siehe auch Kapitel2.9.
Mafosfamid µmol/l 1,25 2,5 5 7,5 10 15
p-WerteM vs. M>B IC50 + + + - - -M vs. B IC50 >M + + + - - -
M>B IC50 vs. B IC50>M - - - - - -
CIM >B IC50 1.412 1.263 1.055 0.811 0.708 0.584B IC50 >M 1.392 1.207 1.027 0.933 0.861 0.675
3.1.4.2 Zeitversetzte Kombinationstherapie mit Trofosfamid am
MX1
Um eine Stunde versetzte Kombinationstherapie mit Trofosfamid am
MX1
Die um eine Stunde versetzten Kombinationsversuche mit Trofosfamid und Bortezomib
IC50 am MX1 zeigten einen ahnlichen Kurvenverlauf wie die zuvor in Abbildung 3.5(a)
dargestellten zeitgleichen Kombinationsversuche. Die um eine Stunde versetzten Kom-
binationen von Trofosfamid und Bortezomib IC50 sind in Abbildung 3.9 dargestellt.
Fur beide Kombinationsvarianten waren Signifikanzen fur die zwei niedrigsten Trofos-
famidkonzentrationen zu sehen (Tab. 3.9). Im Vergleich der Kombinationsvarianten
untereinander zeigten sich signifikante Unterschiede fur die Konzentrationen 5 µmol/l
und 15 µmol/l. Die zeitversetzte Kombination”B IC50 >T“ lag hauptsachlich im
antagonistischen Bereich, ahnlich der zeitgleichen Kombination (Tab. 3.9). Die zeitver-
setzte Kombination”T >B IC50“, die an zwei Messpunkten einen signifikant hoheren
antineoplastischen Effekt aufwies als”B IC50 >T“, hatte lediglich einen geringfugig
niedrigeren CI im moderat antagonistischen bis antagonistischen Bereich. Die um eine
Stunde versetzten Kombinationen von Trofosfamid und Bortzeomib IC25 wiesen keine
signifikanten Unterschiede auf, weder im Vergleich zur Kontrolle noch im Vergleich
zueinander (Anhang B.2 und C.9).
3 Ergebnisse 38
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Trofosfamid [µmol/l]
Trofosfamid Trofosfamid 0h + Bortezomib IC50 1h
Bortezomib IC50 0h + Trofosfamid 1h
Abbildung 3.9: Dargestellt ist die rel. Uberlebensrate des MX1 bei der um eine Stundeversetzten Kombinationsbehandlung mit Trofosfamid und BortezomibIC50 im Vergleich zur Einzelbehandlung mit Trofosfamid (n=15).
Tabelle 3.9: Signifikanzen und CI der um eine Stunde versetzten Kombinationstherapiemit Trofosfamid und Bortezomib IC50 am MX1. Der erste Abschnitt derTabelle zeigt, ob die p-Werte der Kombination signifikante (+) oder nichtsignifikante (-) Unterschiede aufweisen. p≤ 0,025. Der zweite Abschnitt derTabelle zeigt den CI der untersuchten Kombination. Siehe auch Kap. 2.9
Trofosfamid µmol/l 2,5 5 10 15 20 30
p-WerteT vs. T >B IC50 + + - - - -T vs. B IC50 >T + + - - - -
T >B IC50 vs. B IC50 >T - + - + - -
CIT >B IC50 1.432 1.562 1.379 1.359 0.946 0.983B IC50 >T 1.987 2.438 2.088 2.088 1.158 1.212
Um zwei Stunden versetzte Kombinationstherapie mit Trofosfamid am
MX1
Die Verlangerung des Zeitintervalls zwischen der Arzneimittelgabe bei der Kombination
von Trofosfamid und Bortezomib IC50 am MX1 hatte keinen bedeutenden wirkungs-
verstarkenden Effekt. Abbildung und p-Werte sind im Anhang B.4 und C.12 abgebildet.
Der Vergleich der um eine und um zwei Stunden versetzten Kombinationsversuche von
Trofosfamid und Bortezomib IC50 zeigte eine Veranderung in der Anzahl signifikan-
ter Messpunkte fur die Kombination”T>B IC50“. Wahrend bei der um eine Stunde
versetzten Kombinationsbehandlung signifikante Unterschiede fur die Trofosfamidkon-
zentrationen von 2,5 - 5 µmol/l gemessen wurden, zeigte die um zwei Stunden versetzte
Kombination Signifikanzen fur die Trofosfamidkonzentrationen von 2,5 - 15 µmol/l (Tab.
3 Ergebnisse 39
3.9 und 3.10). Die Verlangerung des Zeitintervalls fur die Kombinationsbehandlung”B
IC50>T“ bewirkte dahingegen keine Veranderung. Im Vergleich der beiden um zwei
Stunden versetzten Kombinationen untereinander zeigten sich signifikante Unterschiede
fur die Trofosfamidkonzentrationen 5 - 10 µmol/l. Der CI der Kombination”T>B
IC50“ lag im moderat antagonistischen bis additiven Bereich, wohingegen der CI der
Kombination”B IC50>T“ im antagonistischen Bereich lag. Wie auch bei den um eine
Stunde versetzten Kombinationen zu sehen war, hatte die Kombination”T>B IC50“
einen geringfugig starkeren antineoplastischen Effekt als die Kombination”B IC50>T“.
Die Kombination”T>B IC50“ zeigt jedoch lediglich zwei signifikante Messpunkte und
einen CI uber eins.
Tabelle 3.10: Signifikanzen und CI der um zwei Stunden versetzten Kombinationsthera-pie mit Trofosfamid und Bortezomib IC50 am MX1. Der erste Abschnittder Tabelle zeigt, ob die p-Werte der Kombination signifikante (+) odernicht signifikante (-) Unterschiede aufweisen. p≤ 0,025. Der zweite Ab-schnitt der Tabelle zeigt den CI der untersuchten Kombination. Sieheauch Kap. 2.9
Trofosfamid µmol/l 2,5 5 10 15 20 30
p-WerteT vs. T>B IC50 + + + + - -T vs. B IC50 >T + + - - - -
T>B IC50 vs. B IC50>T - + + - - -
CIT >B IC50 1.167 1.252 1.184 1.009 0.826 0.764B IC50 >T 1.923 2.270 2.261 1.823 1.037 0.961
3.1.4.3 Zeitversetzte Kombinationstherapie mit Mafosfamid am
LX1
Um eine Stunde versetzte Kombinationstherapie mit Mafosfamid am
LX1
In Abbildung 3.10 ist die um eine Stunde versetzte Kombination von Mafosfamid
und Bortezomib IC50 am LX1 abgebildet. Die Kombination”B IC50>M“ zeigte si-
gnifikante Unterschiede fur die Mafosfamidkonzentrationen 2,5 und 5 µmol/l (Tab.
3.11). Vergleichsweise erbrachte die Kombination”M>B IC50“ Signifikanzen fur die
Mafosfamidkonzentrationen 2,5 - 10 µmol/l. Signifikanzen fur die drei niedrigsten Ma-
fosfamidkonzentrationen waren auch bei den zeitgleichen Kombinationen zu sehen (Tab.
3.3). Der CI der zeitversetzten Kombination”M>B IC50“ lag im moderat antagonistisch
Bereich, wohingegen die Kombination”B IC50>M“ hauptsachlich im antagonistischen
Bereich lag (Tab. 3.11). Fur die zeitgleiche Kombination wurden ahnliche CI-Werte
3 Ergebnisse 40
dokumentiert wie fur die zeitversetzten Kombinationen. Der Vergleich der zwei zeit-
versetzten Kombinationen untereinander zeigte einen signifikanten Unterschied fur die
Mafosfamidkonzentration 2,5 µmol/l. Die um eine Stunde versetzten Kombinationen
von Mafosfamid und Bortezomib IC25 wiesen keine signifikanten Unterschiede auf,
weder im Vergleich zur Mafosfamid-Kontrolle noch im Vergleich untereinander (Anhang
B.5 und C.13).
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0 2,5 5 10 20 40Rel
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Mafosfamid [µmol/l]
Mafosfamid Mafosfamid 0h + Bortezomib IC50 1hBortezomib IC50 0h + Mafosfamid 1h
Abbildung 3.10: Die Abbildung zeigt die rel. Uberlebensrate des LX1 bei den umeine Stunde versetzten Kombinationstherapien mit Mafosfamid undBortezomib IC50 im Vergleich zur Kontrolle mit Mafosfamid (n=11).
Tabelle 3.11: Signifikanzen und CI der um eine Stunde versetzten Kombinationstherapiemit Mafosfamid und Bortezomib IC50 am LX1. Der erste Abschnitt derTabelle zeigt, ob die p-Werte der Kombination signifikante (+) oder nichtsignifikante (-) Unterschiede aufweisen. p≤ 0,025. Der zweite Abschnittder Tabelle zeigt den CI der untersuchten Kombination. Siehe auch Kap.2.9
Mafosfamid µmol/l 2,5 5 10 20 40
p-WerteM vs. M>B IC50 + + + - -M vs. B IC50 >M + + - - -
M>B IC50 vs. B IC50>M + - - - -
ICM >B IC50 1.286 1.367 1.223 1.130 1.588B IC50 >M 1.548 1.520 1.395 1.214 1.592
3 Ergebnisse 41
Um zwei Stunden versetzte Kombinationstherapie mit Mafosfamid am
LX1
Die um zwei Stunden versetzte Kombinationstherapie mit Mafosfamid und Bortezomib
IC50 am LX1 ahnelt vom Kurvenverlauf den zuvor durchgefuhrten zeitgleichen und
um ein Stunde versetzten Kombinationen (Anhang B.7). Ungleich der um eine Stunde
versetzten Kombinationsbehandlungen zeigten die um zwei Stunden versetzten Kombi-
nationen Signifikanzen fur die drei niedrigsten Mafosfamidkonzentrationen fur beide
Kombinationsvarianten (Tab. 3.12). Dafur war beim Vergleich der beiden Kombinatio-
nen untereinander keine Signifikanz festzustellen. Der CI zeigte fur die Kombination
”M >B IC50“ einen moderat antagonistischen Effekt und fur die Kombination
”B IC50
>M“ einen antagonistischen Effekt, wobei es jedoch keinen signifikanten Unterschied
gab (Tab. 3.12).
Tabelle 3.12: Signifikanzen und CI der um zwei Stunde versetzten Kombinationstherapiemit Mafosfamid und Bortezomib IC50 am LX1. Der erste Abschnitt derTabelle zeigt, ob die p-Werte der Kombination signifikante (+) oder nichtsignifikante (-) Unterschiede aufweisen. p≤ 0,025. Der zweite Abschnittder Tabelle zeigt den CI der untersuchten Kombination. Siehe auch Kap.2.9
Mafosfamid µmol/l 2,5 5 10 20 40
p-WerteM vs. M>B IC50 + + + - -M vs. B IC50 >M + + + - -
M>B IC50 vs. B IC50>M - - - - -
ICM >B IC50 1.230 1.357 1.494 1.350 1.187B IC50 >M 1.331 1.464 1.690 1.548 1.404
3.1.4.4 Zeitversetzte Kombinationstherapie mit Trofosfamid am
LX1
Um eine Stunde versetzte Kombinationstherapie mit Trofosfamid am
LX1
Die zeitversetzten Kombinationen mit Trofosfamid und Bortezomib IC50 unterschieden
sich deutlich von der zeitgleich Kombination (Abb. 3.11). Es zeigten sich Signifikanzen
fur die drei bzw. vier niedrigsten Trofosfamidkonzentrationen fur die Kombination
”T>B IC50“ bzw.
”B IC50>T“ (Tab. 3.13). Im Gegensatz dazu unterschied sich die
zeitgleiche Kombination von Trofosfamid und Bortezomib IC50 nicht signifikant von der
Kontrolle (Tab. 3.5). Die Graphen der beiden zeitversetzten Kombinationen kreuzen
sich an einem Punkt. Es ergaben sich signifikante Unterschiede beim Vergleich der
3 Ergebnisse 42
Kombinationsvarianten untereinander fur die Konzentrationen 2,5 und 5 µmol/l sowie
20 µmol/l. Der CI beschreibt die Wirkung der beiden Kombinationsvarianten als ant-
agonistisch bis leicht antagonistisch, fur die Kombination”B IC50>T“ sogar bis additiv
(Tab. 3.13). Das Proliferationsverhalten der LX1 unter der Kombinationsbehandlung
mit Trofosfamid und Bortezomib IC25, ahnelte dem der zeitgleichen Kombinations-
behandlung. Sie zeigten weder Signifikanzen im Vergleich zur Trofosfamid-Kontrolle
noch im Vergleich der zeitversetzten Kombinationen untereinander. Die Grafik und die
p-Werte sind im Anhang B.6 und C.15 zu finden.
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Trofosfamid [µmol/l]
Trofosfamid Trofosfamid 0h + Bortezomib IC50 1hBortezomib IC50 0h + Trofosfamid 1h
Abbildung 3.11: Abgebildet ist die rel. Uberlebensrate des LX1 unter der um eine Stundeversetzten Kombinationsbehandlung mit Trofosfamid und BortezomibIC50 im Vergleich zur Einzelbehandlung mit Trofosfamid (n=13).
Tabelle 3.13: Signifikanzen und CI der um eine Stunde versetzten Kombinationstherapiemit Trofosfamid und Bortezomib IC50 am LX1. Der erste Abschnitt derTabelle zeigt, ob die p-Werte der Kombination signifikante (+) oder nichtsignifikante (-) Unterschiede aufweisen. p≤ 0,025. Der zweite Abschnittder Tabelle zeigt den CI der untersuchten Kombination. Siehe auch Kap.2.9.
Trofosfamid µmol/l 2,5 5 10 20 40
p-WerteT vs. T>B IC50 + + + - -T vs. B IC50 >T + + + + -
T>B IC50 vs. B IC50>T + + - + -
ICT >B IC50 1.208 1.386 1.675 1.739 1.114B IC50 >T 1.479 1.637 1.425 0.998 0.882
3 Ergebnisse 43
Um zwei Stunden versetzte Kombinationstherapie mit Trofosfamid am
LX1
Die Ergebnisse der Versuche, in denen Trofosfamid und Bortezomib IC50 im Abstand von
zwei Stunden gegeben wurden, sind in Abbildung 3.12 zu sehen. Die um zwei Stunden
versetzte Kombination”T>B IC50“ zeigte einen gleichen Kurvenverlauf, wie dieselbe
Kombination mit einem Behandlungsintervall von einer Stunde. In beiden Fallen waren
signifikante Unterschiede zu sehen im Vergleich zu den drei niedrigsten Konzentrationen
der Kontrolle (Tab. 3.14). Die um zwei Stunden versetzte Kombination”B IC50>T“
unterschied sich von der Kontrolle lediglich bei der Mafosfamidkonzentration 2,5 µmol/l.
Ahnlich der zeitgleichen Kombinationstherapie waren CI-Werte im antagonistischen
Bereich zu sehen (Tab. 3.14). Die Kombination”T >B IC50“ befand sich im moderat
antagonistischen bis antagonistischen Bereich. Der Unterschied zwischen den beiden
Kombinationsvarianten war fur die beiden niedrigsten Trofosfamidkonzentrationen
signifikant.
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0 2,5 5 10 20 40
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Kon
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le [%
]
Trofosfamid [µmol/l]
Trofosfamid Trofosfamid 0h + Bortezomib IC50 2hBortezomib IC50 0h + Trofosfamid 2h
Abbildung 3.12: Abgebildet ist rel. Uberlebensrate des LX1 bei der um zwei Stundenversetzten Kombinationsbehandlung mit Trofosfamid und BortezomibIC50 im Vergleich zur Einzelbehandlung mit Trofosfamid (n=13).
3 Ergebnisse 44
Tabelle 3.14: Signifikanzen und CI der um zwei Stunden versetzten Kombinationsthera-pie mit Trofosfamid und Bortezomib IC50 am LX1. Der erste Abschnittder Tabelle zeigt, ob die p-Werte der Kombination signifikante (+) odernicht signifikante (-) Unterschiede aufweisen. p≤ 0,025. Der zweite Ab-schnitt der Tabelle zeigt den CI der untersuchten Kombination. Sieheauch Kap. 2.9.
Trofosfamid µmol/l 2,5 5 10 20 40
p-WerteT vs. T>B IC50 + + + - -T vs. B IC50 >T + - - - -
T>B IC50 vs. B IC50>T + + - - -
ICT >B IC50 1.235 1.322 1.537 1.489 1.591B IC50 >T 1.567 1.820 2.157 2.177 1.813
3.1.4.5 Zeitversetzte Kombinationstherapie mit Mafosfamid am
S117
Um eine Stunde versetzte Kombinationstherapie mit Mafosfamid am
S117
Die um eine Stunde versetzten Kombinationsbehandlungen mit Mafosfamid und Borte-
zomib IC25 am S117 erbrachten Signifikanzen fur die zwei niedrigsten Mafosfamidkon-
zentrationen in beiden Kombinationsvarianten (Tab. 3.15). Im Vergleich dazu zeigte
die zeitgleiche Kombination keine Signifikanzen (Tab. 3.3). Im Vergleich untereinander
zeigten die beiden Varianten der zeitversetzten Kombinationen keinen signifikanten
Unterschied. Grafik und p-Werte sind im Anhang B.8 und C.19 abgebildet. Die zeit-
versetzten Kombinationsversuche mit Mafosfamid und Bortezomib IC50 zeigten fur
beide Kombinationen einen fast deckungsgleichen Kurvenverlauf (Abb. 3.13(a)). Die
Ergebnisse der Kombinationen”M>B IC50“ bzw.
”B IC50>M“ zeigten Signifikanzen
fur die vier bzw. drei niedrigsten Mafosfamidkonzentrationen (Tab. 3.15). Der Ver-
gleich der Kombinationen untereinander erbrachte keinen signifikanten Unterschied.
Der CI beider Kombinationen lag zwischen 0,82 und 1,14 und befand sich somit im
uberwiegend additiven Bereich. Dies ist grafisch am Beispiel der Kombination”M>B
IC50“ dargestellt (Abb. 3.13(b)).
3 Ergebnisse 45
(a)
0
10
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30
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100
0 5 10 15 20 30
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. Zel
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nsra
te im
Vgl
. zur
Kon
trol
le [%
]
Mafosfamid [µmol/l]
Mafosfamid Mafosfamid 0h + Bortezomib IC50 1hBortezomib IC50 0h + Mafosfamid 1h
(b)
Abbildung 3.13: (a) Dargestellt ist die rel. Uberlebensrate des S117 bei der um eineStunde versetzten Kombinationsbehandlungen mit Mafosfamid undBortezomib IC50 im Vergleich zur Einzelbehandlung mit Mafosfamid(n=31). In Abbildung (b) ist der CI im Vergleich zur rel. Uberlebensrateals Fraktion (eng. Fractional Effect) zu sehen. Der Effekt der um eineStunde versetzten Kombinationsbehandlung
”M>B IC50“ wird mit
der jeweiligen Einzelbehandlung der beiden Stoffe verglichen. DieMesspunkte sind nach steigender Konzentration nummeriert, wobei 1der niedrigsten und 5 der hochsten Mafosfamidkonzentration entspricht.
3 Ergebnisse 46
Tabelle 3.15: Signifikanzen und CI der um eine Stunde versetzten Kombinationstherapiemit Mafosfamid und Bortezomib IC50 am LX1. Der erste Abschnitt derTabelle zeigt, ob die p-Werte der Kombination signifikante (+) oder nichtsignifikante (-) Unterschiede aufweisen. p≤ 0,025. Der zweite Abschnittder Tabelle zeigt den CI der untersuchten Kombination. Siehe auch Kap.2.9.
Mafosfamid µmol/l 5 10 15 20 30
p-WerteM vs. M>B IC50 + + + + -M vs. B IC50 >M + + + - -
M>B IC50 vs. B IC50>M - - - - -
CIM >B IC50 1.081 1.158 1.004 0.875 0.823B IC50 >M 1.144 1.173 1.092 0.988 0.948
Um zwei Stunden versetzte Kombinationstherapie mit Mafosfamid am
S117
Bei den um zwei Stunden versetzten Kombinationsversuchen von Mafosfamid und Bor-
tezomib IC50 am S117 bewirkte die Verlangerung des Zeitintervalls auf zwei Stunden
keinen Unterschied. Abbildung und p-Werte sind im Anhang B.10 und C.24 dargestellt.
Signifikante Unterschiede zeigten die vier bzw. drei niedrigsten Mafosfamidkonzen-
trationen fur die Kombination”M>B IC50“ bzw.
”B IC50 >M“ (Tab. 3.16). Beide
Kombinationsvarianten der um zwei Stunden versetzten Behandlung zeigten CI-Werte
im additiven bis leicht synergistischen Bereich (Abb. 3.14). Gleiches war fur die um
eine Stunde versetzten Kombinationsbehandlungen zu sehen (Tab. 3.15). Der Unter-
schied zwischen den um zwei Stunden versetzten Kombinationsbehandlungen war nicht
signifikant (Tab. 3.16).
Tabelle 3.16: Signifikanzen und CI der um zwei Stunde versetzten Kombinationstherapiemit Mafosfamid und Bortezomib IC50 am S117. Der erste Abschnitt derTabelle zeigt, ob die p-Werte der Kombination signifikante (+) oder nichtsignifikante (-) Unterschiede aufweisen. p≤ 0,025. Der zweite Abschnittder Tabelle zeigt den CI der untersuchten Kombination. Siehe auch Kap.2.9.
Mafosfamid µmol/l 5 10 15 20 30
p-WerteM vs. M>B IC50 + + + + -M vs. B IC50 >M + + + - -
M>B IC50 vs. B IC50>M - - - - -
CIM >B IC50 0.876 0.777 0.751 0.956 1.063B IC50 >M 0.942 0.865 0.879 1.093 1.528
3 Ergebnisse 47
Abbildung 3.14: Dargestellt ist der CI im Vergleich zur rel. Uberlebensrate als Fraktion(eng. Fractional Effect). Der Effekt der um zwei Stunden versetztenKombinationsbehandlung
”M>B IC50“ wird mit der jeweiligen Einzel-
behandlung der beiden Stoffe verglichen. Die Messpunkte sind nachsteigender Konzentration nummeriert, wobei 1 der niedrigsten und 5der hochsten Mafosfamidkonzentration entspricht.
3.1.4.6 Zeitversetzte Kombinationstherapie mit Trofosfamid am
S117
Um eine Stunde versetzte Kombinationstherapie mit Trofosfamid am
S117
Die um eine Stunde versetzte Kombinationsbehandlung mit Trofosfamid und Bortezomib
IC25 zeigte, wie dieselbe zeitgleiche Kombination, keine signifikanten Unterschiede
im Vergleich zur Kontrolle. Im Vergleich untereinander unterschieden sich die beiden
zeitversetzten Kombinationsbehandlungen mit Bortezomib IC25 ebenfalls nicht (Anhang
B.9 und C.21). Die Kombinationsbehandlung mit Trofosfamid und Bortezomib IC50 mit
einem Zeitintervall von einer Stunde ist in Abbildung 3.15 dargestellt. Die Kombination
”B IC50>T“ erbrachte Signifikanzen fur die Konzentrationen 5 µmol/l und 10 µmol/l,
wohingegen die zeitgleiche Kombination lediglich fur die niedrigste Konzentration einen
signifikanten Unterschied aufwies (Tab. 3.17). Im Vergleich dazu zeigte die Kombination
”T>B IC50“ Signifikanzen fur alle untersuchten Konzentrationen. Der Vergleich der
beiden Kombinationsvarianten untereinander erbrachte signifikante Unterschiede fur
alle bis auf die hochste Trofosfamidkonzentration. Die Kombination”T>B IC50“ lag
im additiven bis leicht antagonistischen Bereich im Vergleich zur Kombination”B
3 Ergebnisse 48
IC50>T“, welche im moderat antagonistischen bis antagonistischen Bereich lag (Tab.
3.17).
0
10
20
30
40
50
60
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80
90
100
0 5 10 15 20 30
Rel
. Zel
lübe
rlebe
nsra
te im
Vgl
. zur
Kon
trol
le [%
]
Trofosfamid [µmol/l]
Trofosfamid Trofosfamid 0h + Bortezomib IC50 1hBortezomib IC50 0h + Trofosfamid 1h
Abbildung 3.15: Abgebildet ist die rel. Uberlebensrate des S117 unter den um eineStunde versetzten Kombinationsbehandlungen mit Trofosfamid undBortezomib IC50 im Vergleich zur Einzelbehandlung mit Trofosfamid(n=31).
Tabelle 3.17: Signifikanzen und CI der um eine Stunde versetzten Kombinationstherapiemit Trofosfamid und Bortezomib IC50 am S117. Der erste Abschnitt derTabelle zeigt, ob die p-Werte der Kombination signifikante (+) oder nichtsignifikante (-) Unterschiede aufweisen. p≤ 0,025. Der zweite Abschnittder Tabelle zeigt den CI der untersuchten Kombination. Siehe auch Kap.2.9.
Trofosfamid µmol/l 5 10 15 20 30
p-WerteT vs. T>B IC50 + + + + +T vs. B IC50 >T + + - - -
T>B IC50 vs. B IC50>T + + + + -
CIT >B IC50 1.012 1.184 1.141 1.156 0.843B IC50 >T 1.438 1.943 1.984 1.784 1.120
Um zwei Stunden versetzte Kombinationstherapie mit Trofosfamid am
S117
Die um zwei Stunden versetzten Kombinationsversuche mit Trofosfamid und Bortezomib
IC50 am S117 erreichten nicht den gleichen Effekt wie dieselbe Kombination mit einer
Stunde zwischen den Behandlungen (Anhang B.11). Die um zwei Stunden versetzten
Kombinationsbehandlungen erbrachten lediglich Signifikanzen fur die ersten drei bzw.
3 Ergebnisse 49
zwei Trofosfamidkonzentrationen fur die Kombinationen”T >B IC50“ bzw.
”B IC50 >T“
(Tab. 3.18). Der Vergleich zwischen den beiden Kombinationen zeigte einen signifikanten
Unterschied fur die niedrigste Trofosfamidkonzentration. Der CI zeigte einen leichten
antagonistischen Effekt fur die Kombination”T >B IC50“, wohingegen die Kombination
”B IC50 >T“ einen antagonistischen Effekt hatte.
Tabelle 3.18: Signifikanzen und CI der um zwei Stunden versetzten Kombinationsthera-pie mit Trofosfamid und Bortezomib IC50 am S117. Der erste Abschnittder Tabelle zeigt, ob die p-Werte der Kombination signifikante (+) odernicht signifikante (-) Unterschiede aufweisen. p≤ 0,025. Der zweite Ab-schnitt der Tabelle zeigt den CI der untersuchten Kombination. Sieheauch Kap. 2.9.
Trofosfamid µmol/l 5 10 15 20 30
p-WerteT vs. T>B IC50 + + + - -T vs. B IC50 >T + + - + -
T>B IC50 vs. B IC50>T + - - - -
CIT >B IC50 1.106 1.282 1.220 0.933 0.714B IC50 >T 1.755 1.338 1.390 0.794 0.831
3.2 Versuchsablauf in vivo
Aufgrund der umfangreichen In-vitro-Versuche und der hinsichtlich der Tieranzahl
restriktiven Tierversuchsgenehmigung wurde die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse im
Tiermodell exemplarisch anhand der LX1-Zelllinie untersucht. Diese Zelllinie zeigte bei
den In-vitro-Experimenten die beste Ansprechrate auf die untersuchten Chemothera-
peutika. Die Ergebnisse werden aufgrund der marginalen Unterschiede zwischen den
Versuchen und der geringen Fallzahl nur deskriptiv dargestellt. Die Tiere wurden mit
Bortezomib, Trofosfamid und Cyclophosphamid wie unter Kapitel 2.8.5 behandelt. Die
Versuche wurden wie unter Kapitel 2.9 ausgewertet.
3.2.1 Bortezomib als Einzelbehandlung
In den ersten Tierversuchen wurde untersucht, wie das Tumorwachstum auf die Ein-
zelbehandlung mit Bortezomib reagiert. In Abbildung 3.16 wurde die Behandlung
mit Bortezomib in verschieden Konzentrationen dargestellt. Die y-Achse stellt das
Tumorvolumen in mm3 und die x-Achse die Zeit in Tagen dar. Der Abbildung kann
man entnehmen, dass die unbehandelte Kontrolle das Zielvolumen von 800 mm3 nach
ca. 6,5 Tagen erreicht, wohingegen die Behandlung mit den drei verschiedenen Borte-
zomibkonzentrationen das Zielvolumen erst nach ca. 12 Tagen erreicht. Die einzelnen
3 Ergebnisse 50
Bortezomibkonzentrationen wiesen untereinander keine großen Unterschiede im Tumor-
wachstum auf. Die Wachstumsverlangsamung entsprach dementsprechend ca. 5,5 Tagen
(ca. 45%).
0
200
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1 3 5 8 10 12 15
Tu
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rvo
lum
en
mm
³
Tage
Kontrolle Bortezomib i.p. 0,3 mg/kg KG 2x/Woche
Bortezomib i.p. 0,6 mg/kg KG 2x/Woche Bortezomib i.p. 1,0 mg/kg KG 2x/Woche
Abbildung 3.16: Xenograftmodell mit LX1-Tumor zur Einzelbehandlung mit Borte-zomib. Dargestellt ist die Entwicklung des Tumorvolumens in mm3
(y-Achse) uber Tage (x-Achse). Abgebildet ist eine unbehandelte Kon-trolle (n=3) im Vergleich zu i.p. verabreichtem Bortezomib zweimalWochentlich, einmal als 0,3 mg/kg (n=2), einmal als 0,6 mg/kg (n=2)und einmal als 1,0 mg/kg (n=8).
3.2.2 In-vivo-Kombinationsversuche mit Trofosfamid und
Bortezomib
In Abbildung 3.17 ist die Kombinationstherapie mit Trofosfamid (i.p.) und Bortezomib
0,6 mg/kg am Tiermodell dargestellt. Aufgrund der begrenzten Anzahl von Versuchstie-
ren wurde auf die Kombination mit der niedrigsten Bortezomibkonzentration verzichtet.
Die Behandlung mit Bortezomib (0,6 mg/kg(KG)) alleine und in Kombination mit
Trofosfamid bewirkte eine Wachstumsverlangsamung von ca. 5,5 Tagen. Die Einzelbe-
handlung mit Trofosfamid bewirkte eine Wachstumsverlangsamung von 8,5 Tagen (ca.
57%), was drei Tage mehr waren als bei der Kombinationsbehandlung. In Abbildung
3.18 ist die gleiche Kombinationsbehandlung nur mit Bortezomib 1,0 mg/kg (KG)
dargestellt. In diesem Fall hatte die Kombinationsbehandlung den gleichen wachstums-
verlangsamenden Effekt wie Trofosfamid als Einzelbehandlung.
3 Ergebnisse 51
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200
400
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1000
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1 3 5 8 10 12 15 17 19
Tu
mo
rvo
lum
en
mm
³
TageKontrolle
Bortezomib i.p. 0,6 mg/kg KG 2x/Woche
Trofosfamid i.p. 176,4 mg/kg KG Tag 1. und 15.
Trofosfamid i.p. 176,4 mg/kg KG + Bortezomib 0,6 mg/kg KG i.p.
Abbildung 3.17: Xenograftmodell mit LX1-Tumor zur Kombinationsbehandlung vonBortezomib (0,6 mg/kg (KG)) und Trofosfamid (176,4 mg/kg (KG))im Vergleich zu den jeweiligen Einzelbehandlung als Kontrollen. x-Achse = Zeit in Tagen, y-Achse = Tumorvolumen. Kontrolle n=3,Bortezomib n=2, Trofosfamid n=8, Trofosfamid in Kombination mitBortezomib n=8.
0
200
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1 3 5 8 10 12 15 17 19
Tu
mo
rvo
lum
en
mm
³
Tage
Kontrolle
Bortezomib i.p. 1,0 mg/kg KG 2x/Woche
Trofosfamid i.p. 176,4 mg/kg KG Tag 1. und 15.
Trofosfamid i.p. 176,4 mg/kg KG + Bortezomib 1,0 mg/kg KG i.p.
Abbildung 3.18: Xenograftmodell mit LX1-Tumor zur Kombinationsbehandlung vonBortezomib (1,0 mg/kg (KG)) und Trofosfamid (176,4 mg/kg (KG))im Vergleich zu den jeweiligen Einzelbehandlung als Kontrollen. x-Achse = Zeit in Tagen, y-Achse = Tumorvolumen. Kontrolle n=3,Bortezomib n=8, Trofosfamid n=8, Trofosfamid in Kombination mitBortezomib n=8.
3 Ergebnisse 52
Außerdem wurde untersucht, ob die metronomische Gabe von Trofosfamid p.o. in
der Kombinationsbehandlung einen Unterschied bewirken konnte (Siehe auch Kap.
2.8.5). Aus den oben genannten Grunden wurde der Kombinationsversuch lediglich mit
Bortezomib 0,6 mg/kg (KG) i.p. und Trofosfamid p.o. bzw. i.p. durchgefuhrt. Wie in
Abbildung 3.19 zu sehen, verlangsamte die Kombinationsbehandlung mit Trofosfamid
(19 mg/kg (KG)) p.o. das Tumorwachstum um 10,5 Tage (ca. 62%) im Vergleich zur
unbehandelten Kontrolle. Dahingegen verlangsamte die Kombinationsbehandlung, in
der Trofosfamid i.p. alle 14 Tage verabreicht wurde, das Tumorwachstum nur mit
8,5 Tagen (ca. 57%) im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle. Die p.o.-Gabe von
Trofosfamid verlangsamte das Tumorwachstum um funf Tage im Vergleich zur i.p.-Gabe
von Trofosfamid.
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1 3 5 8 10 12 15 17 19
Tu
mo
rvo
lum
en
mm
³
TageKontrolle
Bortezomib i.p. 0,6 mg/kg KG 2x/Woche
Trofosfamid i.p. 176,4 mg/kg KG + Bortezomib 0,6 mg/kg KG i.p.
Trofosfamid p.o. 19 mg/kg KG + Bortezomib i.p. 0,6 mg/kg KG i.p.
Abbildung 3.19: Xenograftmodell mit LX1-Tumor zum Vergleich des Applikationswe-ges von Trofosfamid in der Kombinationsbehandlung von Trofosfamid(176,4 mg/kg (KG)) und Bortezomib (0,6 mg/kg (KG)). Kombinations-behandlung mit Trofosfamid i.p. (n=8) im Vergleich mit Trofosfamidp.o. (n=2). x-Achse = Zeit in Tagen, y-Achse = Tumorvolumen.
3.2.3 In-vivo-Kombinationsversuche mit Cyclophosphamid
und Bortezomib
Parallel zu den Kombinationsbehandlungen mit Bortezomib und Trofosfamid wurde
die Kombination von Bortezomib (1,0 mg/kg (KG) i.p.) und Cyclophosphamid (176,4
mg/kg (KG) i.p.) untersucht (Abb. 3.20). Wie in Kapitel 2.8.5 beschrieben, wurde
Bortezomib zwei-mal pro Woche und Cyclophosphamid einmal jede zweite Woche
verabreicht. Die Einzelbehandlung mit Cyclophosphamid bzw. Bortezomib bewirkten
3 Ergebnisse 53
0
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1 3 5 8 10 12 15 17 19 22
Tu
mo
rvo
lum
en
mm
³
TageKontrolle
Bortezomib i.p. 1,0 mg/kg KG 2x/Woche
Cyclophosphamid i.p. 176,4 mg/kg KG
Cyclophosphamid i.p. 176,4 mg/kg KG + Bortezomib 1,0 mg/kg KG i.p. 2x/Woche
Abbildung 3.20: Xenograftmodell am LX1-Tumor zur Kombinationsbehandlung vonCyclophosphamid (176,4 mg/kg (KG) i.p.) und Bortezomib (0,6 mg/kg(KG) i.p.) (n=2) im Vergleich zur Einzelbehandlung mit Cyclophos-phamid (n=2). x-Achse = Zeit in Tagen, y-Achse = Tumorvolumen.
jeweils eine Wachstumsverlangsamung von ca. 5,5 Tagen (ca. 45%), wohingegen die
Kombination der beiden Arzneien eine Wachstumsverlangsamung von ca. 8,5 Tagen (ca.
57%) bewirkte. Die Kombination hatte dementsprechend einen wirkungsverstarkenden
Effekt, wenn auch nur einen leichten.
54
4 Diskussion
4.1 Hintergrund
”Die Gabe einer zytostatischen Monotherapie entspricht nicht dem evidenzbasierten me-
dizinischen Standard“, lautet es von der deutschen Krebsgesellschaft zu der Behandlung
des kleinzelligen Lungenkarzinoms. In der Behandlung von vielen Krebsleiden konnte
man zeigen, dass eine Kombinationstherapie im Hinblick auf das Nebenwirkungsprofil
und die Uberlebensrate einer Monotherapie uberlegen ist. Aufgrund der komplexen
Wirkungsmechanismen und Interaktionen verschiedener Stoffe ist es schwierig voraus-
zusagen, welche Kombinationen eine positive Wirkungsverstarkung entwickeln und
welche dem Patienten letztendlich mehr Schaden zufugen. Deswegen ist es wichtig,
jede Kombinationsbehandlung in praklinischen Studien zu testen, auch wenn es nicht
in jedem Fall gesetzlich vorgeschrieben ist. Wie einleitend erwahnt, wurde die Wirk-
samkeit von Bortezomib als Monotherapeutikum diverser Tumoren in praklinischen
Studien gezeigt. In klinischen Studien jedoch wurde gezeigt, dass sich Bortezomib als
Einzelstoffbehandlung fur dieselben Tumoren nicht bewahrt, weshalb in diesen Fallen
Kombinationsbehandlungen mit verschiedenen Chemotherapeutika diskutiert wurden
[25, 55, 58]. Inzwischen liegt eine Reihe klinischer Studien vor, die Bortezomib mit einem
zweiten Chemotherapeutikum kombinieren. Eine der wenigen Kombinationsbehandlun-
gen, die einen verstarkenden Effekt zeigen, ist die Kombination von Bortezomib mit
Transtuzumab (In-vitro-Studie) oder mit Docetaxel (Phase-II-Studie), wobei letztere
Kombination mit einer Verstarkung der Nebenwirkungen einhergeht [6, 16]. Ziel dieser
Arbeit war es, die Wirkung und damit den eventuellen Nutzen einer Kombination
von Bortezomib mit einem Oxazaphosphorin zu prufen. Außerdem sollte die Repro-
duzierbarkeit von In-vitro-Versuchen in In-vivo-Versuchen exemplarisch untersucht
werden.
4 Diskussion 55
4.2 Das kleinzellige Lungenkarzinom
LX1
Mit den vorliegenden Versuchen konnte gezeigt werden, dass die SCLC-Zelllinie LX1 auf
die Behandlung mit Bortezomib anspricht (Abb. 3.1). Von den untersuchten Zelllinien
zeigte LX1 das beste Ansprechen mit einer IC50 von ca. 4 nM. Dies bestatigt die
2005 veroffentlichten Ergebnisse von Mortenson et al. [63]. In ihren Zellversuchen am
SCLC wurde eine Apoptoserate von 25-50% fur 20 nM Bortezomib nachgewiesen.
Weitere praklinische Versuche zur Einzelbehandlung von SCLC mit Bortezomib liegen
bis heute nicht vor. Lara et al. konnten in einer Phase-II-Studie zur Einzelbehandlung
mit Bortezomib keinen Effekt am Patienten nachweisen und schlugen deshalb eine
Kombinationsbehandlung vor [51].
In den vorliegenden In-vitro-Versuchen wurde die Kombination von Bortezomib mit
den Oxazaphosphorinen Mafosfamid und Trofosfamid untersucht. Cyclophosphamid
ist von einer enzymatischen Aktivierung abhangig und wurde deshalb in den Zell-
versuchen durch Mafosfamid ersetzt, da dieses spontan in den aktiven Metaboliten
von Cyclophosphamid zerfallt. Sowohl Trofosfamid als auch Cyclophosphamid sind
fur die Behandlung des SCLC zugelassen. Studien zur Kombinationsbehandlung mit
Bortezomib am SCLC wurden bisher nicht durchgefuhrt. Andere Lungenkarzinome
werden daher zum Vergleich herangezogen. Die zeitgleiche Kombination der beiden
Oxazaphosphorinen mit Bortezomib am LX1 zeigte einen unterschiedlich stark ausge-
pragten Antagonismus. Speziell fur die Kombination mit Trofosfamid ist eine negative
Interaktion zu vermuten, da es zu einer Wirkungsabschwachung kommt (Abb. 3.6). Die
Kombination von Bortzeomib mit Mafosfamid zeigte vergleichsweise einen zytotoxischen
Effekt, der nur geringfugig starker war als der der jeweiligen Einzelbehandlung. Die
Wirkung von Mafosfamid war relativ unbeeinflusst von der Kombination mit Bortezomib.
Das kann damit erklart werden, dass die beiden Medikamente einen unterschiedlichen
Ansatzpunkt haben. Dies wirft jedoch die Frage auf, warum es bei der Kombination von
Trofosfamid und Bortezomib zu einer Wirkungsabschwachung kommt. Die Studie von
Mortenson et al. legt nahe, dass der negative Effekt der Kombination von Trofosfamid
und Bortezomib nicht am Wirkungsmechanismus der Gruppe der Alkylanzien liegt
[62]. In ihrer Studie zeigten sie an einem NSCLC, dass die zeitgleiche Kombination von
Bortezomib, Gemcitabin und Carboplatin, welches ebenfalls ein Alkylantium ist, einen
wirkungsverstarkenden Effekt hatte. Abgesehen davon, dass im Versuch ein anderer
Lungenkarzinomtyp verwendet wurde, war der Versuchsaufbau dem der vorliegenden
Studie relativ ahnlich. Die Behandlungsdauer der Zellen betrug in beiden Fallen 24
Stunden. Die Auswertung der Ergebnisse erfolgte anhand des MTT-Assays, das dem
in vorliegender Arbeit verwendeten Kristallviolett-Assay sehr ahnlich ist. Ein kleiner
4 Diskussion 56
Unterschied besteht darin, dass in der Kombinationsbehandlung von Mortenson et al.
eine Bortezomibkonzentration von 50 nM verwendet wurde, was uber der IC50 des
NSCLC liegt (IC50 = 30 nM). 2009 veroffentlichten Davies et al. eine Phase-II-Studie
zur Kombination von Bortezomib, Carboplatin und Gemcitabin, die eine Verlangerung
der medianen Uberlebenszeit auf 11 Monate erzielte [20]. Diese beiden Studien zeigen,
dass Bortezomib und ein Alkylanzium sich in einer Kombination nicht gegenseitig aus-
schließen. Eine andere mogliche Erklarung fur den negativen Effekt der Kombination der
Oxazaphosphorine und Bortezomib am LX1 in vorliegender Studie ist auch in der eben
genannten Studie von Mortenson et al. zu finden [62]. Sie haben die gleiche Kombination
von Bortezomib, Carboplatin und Gemcitabin auch zeitversetzt untersucht. Die Gabe
von Bortezomib zwolf Stunden vor Carboplatin und Gemcitabin bewirkte eine Apopto-
serate von 6,7%, wohingegen die Gabe von Bortezomib zwolf Stunden nach Carboplatin
und Gemcitabin eine Apoptoserate von 33,6% ergab. Die zeitgleiche Gabe zeigte eine
Apoptoserate von 21,5%. Die zeitversetzte Gabe der Oxazaphosphorine und Bortezomib
in der vorliegenden Studie konnte einen ahnlichen Effekt nur tendenziell bestatigen.
Generalisierend gesagt, zeigten die zeitgleichen Kombinationen und diejenigen, in denen
Bortezomib an erster Stelle gegeben wurden, einen ahnlichen antagonistischen Effekt.
Lediglich die Kombinationen, in denen die Oxazaphosphorine an erster Stelle gege-
ben wurden, zeigten einen tendenziell starkeren antineoplastischen Effekt, der jedoch
immer noch im antagonistischen Bereich lag. Zwischen den zeitversetzten Versuchen
von Mortenson et al. und denen der vorliegenden Studie gab es einige Unterschiede,
die die Ergebnisse beeinflusst haben konnen. Wie bei den zeitgleichen Versuchen von
Mortenson et al. handelt es sich auch bei den zeitversetzten Versuchen um ein NSCLC.
Außerdem fehlte in der vorliegenden Studie ein Gegenstuck zu Gemcitabin, das in der
Dreierkombination von Mortenson et al. mit aller Wahrscheinlichkeit seinen Teil zur
Wirkungsverstarkung beigetragen hat. Die Behandlung dauerte unverandert 24 Stunden.
In den ersten zwolf Stunden wurde mit dem ersten Medikament behandelt. Danach
wurde das Medium getauscht, und die Zellen wurden fur weitere zwolf Stunden dem
zweiten Medikament ausgesetzt. In der vorliegenden Arbeit betrug das Zeitintervall
zwischen den Behandlungen eine bzw. zwei Stunden, und die Medikamente wirkten
danach gemeinsam auf die Zellen ein. Einerseits eignet sich der Versuchsaufbau von
Mortenson et al. wahrscheinlich besser zur Darstellung des Effekts einer zeitversetzten
Therapie, da der Zeitintervall bedeutend langer ist. Andererseits hat Bortezomib eine
mittlere Eliminationshalbwertzeit von mindestens 40 Stunden laut EMA (European Me-
dicines Agency). Das bedeutet, dass ein Kombinationspartner, der zwolf Stunden spater
dazugegeben wird, auch unter dem Beisein von Bortezomib wirken wird. Umgekehrt gilt
Ahnliches fur Carboplatin, welches eine terminale Halbwertszeit von 24 Stunden hat.
Falls die Medikamente uber und auf gleiche Zellstrukturen, wie z.B. Enzyme, wirken
sollten, wird ein realistischeres Bild vermittelt, wenn, wie in vorliegender Studie, das
4 Diskussion 57
Medikament nach dem gewahlten Zeitintervall hinzugegeben wird. Ob und wie die
Reihenfolge der Medikamentengabe einen Einfluss auf die Zelluberlebensrate hat, wird
in Kapitel 4.5 ausfuhrlicher diskutiert.
4.2.1 In-vivo-Versuche am LX1
Da das LX1 am empfindlichsten gegenuber der Einzelbehandlung mit Bortezomib
war, wurde es in den weiterfuhrenden In-vivo-Versuchen naher untersucht. Aus zuvor
genannten Grunden werden die In-vivo-Versuche lediglich deskriptiv abgehandelt (Kap.
3.2). Die durchgefuhrten Versuche zeigten, dass Bortezomib als Einzelbehandlung im
Vergleich zu einer unbehandelten Kontrolle eine Verzogerung des Tumorwachstums um
41% - 45% bewirkt (Abb. 3.16). Der wachstumsverzogernde Effekt von Bortezomib wurde
nur geringfugig durch die verwendeten Dosen (0,3 - 1,0 mg/kg) beeinflusst. Dies stutzt
die In-vivo-Ergebnisse der Arbeitsgruppe um Teicher et al., die am NSCLC zeigten, dass
eine Dosisanderung von Bortezomib (0,1 - 1,0 mg/kg) den wachstumshemmenden Effekt
der Einzelbehandlung nicht signifikant beeinflusste [87]. Dies kann an den Eigenschaften
von Bortezomib liegen. Wie in der Einleitung beschrieben, besetzt es reversibel mit
hoher Affinitat und Selektivitat die katalytische Untereinheit des Proteasoms (Kap.
1.4). Wenn ein Großteil der Proteasome bei einer gewissen Bortezomibkonzentration
gebunden ist, scheint eine Erhohung der Bortezomibkonzentration einen nur geringen
Mehreffekt zu bringen. Daruber hinaus nehmen die Bindungen an andere Proteine zu,
was eventuell Nebenwirkungen verursachen kann [5].
Auch wenn der Effekt der Einzelbehandlung mit Bortezomib begrenzt ist, erhofft man
sich einen positiven Effekt in einer Kombinationsbehandlung an Tieren. Einerseits
konnte gezeigt werden, dass Bortezomib die Bcl-2-Proteinfamilie hemmt, welche fur die
Chemoresistenz des SCLC verantwortlich gemacht wird [96]. Andererseits soll Borte-
zomib einen antiangiogenetischen Effekt haben, was speziell bei der Behandlung des
SCLC ein Vorteil ware [23, 77]. In den vorliegenden In-vivo-Versuchen wurde u.a. die
Kombination von Cyclophosphamid und Bortezomib am LX1 untersucht (Abb. 3.20).
Die Kombination bewirkte eine Wachstumsverzogerung von ca. 20% im Vergleich zur
jeweiligen Einzelbehandlung. Tendenziell hatte die Kombination einen subadditiven
Effekt, was etwas besser war als die gleiche Kombination in den In-vitro-Versuchen (Abb.
3.3). Dieser Unterschied kann damit erklart werden, dass bei Zellversuchen lediglich
die Zellen direkt untersucht werden und die Interaktion mit dem Tumorstroma nicht
reprasentiert wird. Die einzigen publizierten Ergebnisse zur Kombination von Cyclophos-
phamid und Bortezomib stammen von Teicher et al. [87]. In ihrer 1999 veroffentlichten
Studie untersuchten sie u.a. diese Kombination in einem Xenograftmodell zum Mam-
makarzinom MCF-7. Sie beschreiben den Kombinationseffekt als synergistisch, was
4 Diskussion 58
einer ausgepragteren Wirkungsverstarkung entspricht, als es die vorliegende Studie
zeigen konnte. Im Vergleich zu den vorliegenden Tierversuchen handelt es sich um zwei
verschiedene Tumortypen und einen unterschiedlichen Versuchsaufbau. Im Tiermodell
von Teicher et al. wurde nach einem abgeschlossenen Behandlungszyklus von neun
Tagen Tumorgewebe und Knochenmark von den Versuchstieren in Zellkultur uberfuhrt,
um auf diese Weise eine Proliferationshemmung zu messen. In den In-vivo-Versuchen der
vorliegenden Arbeit wurde mit der Tumorwachstumsverzogerung gearbeitet. Das lasst
einerseits nur eine grobere Beurteilung zu, andererseits wird der Behandlungsverlauf
etwas realistischer widergespiegelt, da das Versuchstier mehrere Behandlungszyklen
durchlauft. Auf diese Weise kann man genauer den lebensverlangernden Effekt der
Behandlung beurteilen. Ein weiterer Unterschied war, dass Teicher et al. eine relativ nied-
rige Bortezomibkonzentration von 0,1 mg/kg KG gewahlt hatten, die als Einzeltherapie
einen geringen klinischen Effekt hatte. An den Anfang dieser Diskussion zur Einzelbe-
handlung mit Bortezomib zuruckdenkend, konnte man die Vermutung aufstellen, dass
Bortezomib am besten unterstutzend zu einer zweiten Behandlung eingesetzt werden
sollte. Man wurde so auf die zytotoxische Eigenwirkung von Bortezomib verzichten und
nur die potenzierende Wirkung auf das zweite Zytostatikum nutzen. Davon ausgehend,
dass man Cyclophosphamid und Trofosfamid miteinander vergleichen kann, erscheint
dies eher unwahrscheinlich. Die Ergebnisse der In-vivo-Versuche zur Kombination von
Trofosfamid mit verschiedenen Dosen Bortezomib (0,6 mg/kg KG und 1,0 mg/kg KG),
wie sie in Kapitel 3.2.2 beschrieben sind, sprechen dagegen. Die Kombination mit der
niedrigeren Dosis Bortezomib hatte den gleichen wachstumsverzogernden Effekt, wie die
Einzelbehandlung mit derselben Dosis Bortezomib. Das war 13% weniger als die Einzel-
behandlung mit Trofosfamid. Dies zeigt, dass die Kombination antagonistisch wirkte.
Die gleiche Kombination mit der hoheren Bortezomibdosis hatte den gleichen Effekt wie
Trofosfamid als Einzelbehandlung. Somit kam es nicht zu einer Wirkungsverstarkung,
jedoch auch nicht zu einem Effektverlust. Diese Ergebnisse fur die Kombination mit
Trofosfamid waren in Anbetracht der durchgefuhrten In-vitro-Versuche nicht unerwartet
(Abb. 3.6). Ruckblickend muss die Frage gestellt werden, ob man bei so unterschied-
lichen Ergebnissen die beiden Alkylanzien Trofosfamid und Cyclophosphamid fur die
Kombination mit Bortezomib miteinander vergleichen kann. Unterschiede zwischen der
Kombination mit Cyclophosphamid und der mit Trofosfamid konnen an der Verstoff-
wechselung liegen. Trofosfamid und Bortezomib werden beide durch das Leberenzym
Cyp3A4 metabolisiert, wohingegen Cyclophosphamid von Cyp2B6 metabolisiert wird.
Durch das Enzym Cyp3A4 wird Trofosfamid aktiviert und Bortezomib inaktiviert (Abb.
1.1). Außerdem hat Bortezomib eine leicht hemmende Wirkung auf einige Proteine
der Cytochrom P450-Familie. Cyp2B6, welches Cyclophosphamid metabolisiert, gehort
jedoch nicht zu den von Bortezomib gehemmten Cytochrom P450-Proteinen [36, 70].
In welchem Ausmaß dieses Einfluss auf den Behandlungseffekt hat, ist unklar. Der
4 Diskussion 59
Unterschied zwischen den beiden Alkylanzien war in den In-vitro-Versuchen zu LX1
nur leicht ausgepragt. Dies kann jedoch nicht mit dem Metabolismus der Stoffe erklart
werden, da einerseits die Cytochrome in nicht-hepatischen Geweben wie der Lunge in
nur geringen Konzentrationen vorkommen, und andererseits, weil in den Zellversuchen
aktiviertes 4OH-Trofosfamid verwendet wurde [69].
Im klinischen Alltag wird Trofosfamid oral verabreicht. In unseren In-vivo-Versuchen
hatten wir uns fur eine intraperitoneale Verabreichung entschieden. Es ware mit einigen
Herausforderungen und Unsicherheiten verbunden, Tieren eine gewunschte Menge Tro-
fosfamid p.o. zu verabreichen. Da die orale Bioverfugbarkeit von Trofosfamid gut ist,
sollte es keinen großen Unterschied machen, ob die gewunschte Stoffmenge i.p. oder p.o.
gegeben wird. Mit dem letzten In-vivo-Versuch sollte diese Annahme bestatigt werden.
Dies wurde anhand einer Kombination von Bortezomib und Trofosfamid getestet, wobei
Trofosfamid einmal wie bisher als Injektion verabreicht wurde und einmal uber das
Trinkwasser. Die Trofosfamiddosierung basierte auf vorher durchgefuhrten Untersuchun-
gen zum Trinkwasserverbrauch der Versuchstiere. Die Kombination, in der Trofosfamid
p.o. verabreicht wurde, verlangsamte das Tumorwachstum um weitere funf Tage im
Vergleich zur Kombination, in der das Trofosfamid i.p. verabreicht wurde. Diese beiden
Applikationswege von Trofosfamid wurden auch in der Arbeit von Bela et al. untersucht
[8]. Die Tumorwachstumskurven fur die beiden Applikationswege zeigten in dieser Stu-
die den gleichen Effekt. Im Vergleich zur vorliegenden Arbeit fallen zwei Unterschiede
auf. Erstens wurde in vorliegender Arbeit eine Kombinationsbehandlung untersucht.
Zweitens wurde die per-orale-Behandlung bei Bela et al. mit acht Tieren untersucht,
im Vergleich zu zwei Tieren in der vorliegenden Studie, was bei den sich ergebenden
Unsicherheiten einer metronomischen Therapie zu wenig war.
Die Resultate der Tierversuche bestatigten mit geringfugigen Abweichungen die vorange-
gangenen Versuche zu den LX1-Zellen und die Aussagekraft von In-vitro-Experimenten
zur Wirkung von Chemotherapeutika. Allerdings war dies aufgrund der geringen
Fallzahl und hoher biologischer Varianz im Tumorwachstum nicht statistisch zu si-
chern.
4.3 Das Mammakarzinom MX1
Bei den Mammakarzinomen wurden anfanglich nur Ostrogen-Rezeptor-positive Zelllinien
mit Bortezomib untersucht. Erst Ende 2009 wurde die Empfindlichkeit von Ostrogen-
Rezeptor-negativen Mammakarzinom-Zelllinien auf Bortezomib getestet [35]. In den Ver-
suchen war kein wesentlicher Unterschied in der Empfindlichkeit gegenuber Bortezomib
zwischen Ostrogen-Rezeptor-positiven oder Ostrogen-Rezeptor-negativen Zelllinien zu
4 Diskussion 60
erkennen. Aufgrund dieser Ergebnisse wird in der vorliegenden Diskussion auf den Rezep-
torstatus der Mammakarzinomzellen keine Rucksicht genommen.
In der vorliegend Studie konnte gezeigt werden, dass das Mammakarzinom MX1 auf
die Behandlung mit Bortezomib anspricht (Kap. 3.1.1). Dies bestatigten die 1999
veroffentlichten In-vitro-Versuche zum Mammakarzinom MCF-7 von Teicher et al.
[87]. Eine 2008 publizierte Studie von Xu et al. zeigte hingegen, dass verschiedene
Mammakarzinom-Zelllinien, u.a. MCF-7-Zellen, resistent gegen Bortezomib waren [95].
Es ist schwierig, diese Diskrepanz aus dem Stand zu erklaren, da ein ahnlicher Ver-
suchsaufbau benutzt wurde wie von Teicher et al.. Der gleiche Versuchsaufbau wurde
auch in der vorliegenden Arbeit angewandt. Die MX1-Zellen wurden 72 Stunden mit
Bortezomib behandelt, wohingegen die MCF-7-Zellen einer Behandlungsdauer von
lediglich 48 Stunden ausgesetzt waren. Bei 50 nM Bortezomib war bei den Versuchen
von Xu et al. eine relative Zelluberlebensrate von uber 90% zu sehen. Jedoch zeigten
Teicher et al. bei der gleichen Konzentration eine Uberlebensrate von ca. 1%, und
die vorliegenden Ergebnisse zeigten fur die MX1-Zellen eine Uberlebensrate von ca.
25% (Abb. 3.1). Der Verweis von Xu et al. auf eine klinische Studie, die zeigte, dass
Bortezomib als Einzelbehandlung keinen signifikanten Effekt hatte, spricht zwar fur die
Ergebnisse von Xu et al., erklart jedoch nicht den Unterschied zwischen den Studien.
Eine mogliche Erklarung ist, dass die Empfindlichkeit der Zellen sich verandert hat. Es
wurde beispielsweise wahrend eines der Versuche der vorliegenden Arbeit bemerkt, dass
sich die Empfindlichkeit bei einer Zellreihe mit einer hohen Passagenummer (”altere“
Zellen), schlagartig markant und bleibend verringerte.
Abgesehen von den zuvor diskutierten Versuchen von Teicher et al. liegen bis heute
keine Studien zur Kombination von Bortezomib mit Oxazaphosphorinen vor. Bei der
zeitgleichen Kombination von Bortezomib und Mafosfamid zeigte das MX1 einen
Effekt im additiven Bereich, wie er auch fur das S117 zu sehen war. Im Vergleich
dazu zeigte der CI fur das LX1 einen moderat antagonistischen Effekt fur dieselbe
Kombination. Dabei war das LX1 die empfindlichste Zelllinie bei der Einzelbehandlung
mit Bortezomib. Da die gleiche Kombinationsbehandlung auf die eine Zelllinie einen
moderat antagonistischen und auf die beiden anderen einen addiditiven Effekt hatte,
ist es schwierig, die Ursache hierfur in der Interaktionen der beiden Stoffe zu suchen.
Bei der Kombination von Trofosfamid und Bortezomib ist dies eher moglich. Da
diese Kombination in allen drei Zelllinien einen mehr oder weniger stark ausgepragten
Antagonismus ausubt, stellt sich die Frage, warum nicht ein ahnlicher Effekt gesehen
wird wie bei der Kombination von Mafosfamid und Bortezomib, jedenfalls fur das MX1
und das S117. Wie in Kapitel 4.2.1 diskutiert wird, konnte dies mit einem Unterschied
zwischen den beiden Alkylanzien Mafosfamid und Trofosfamid erklart werden, wie
z.B. der Membrangangigkeit. Dabei hat Trofosfamid jedoch aufgrund seiner lipophilen
4 Diskussion 61
Eigenschaft eine bessere Membrangangigkeit als Mafosfamid [12]. Mafosfamid hingegen
zerfallt zu 4OH-Cyclophosphamid mit ebenfalls guter Membrangangigkeit, da es im
chemischen Gleichgewicht mit seinem Tautomer Aldolphosphamid steht. Bortezomib
konnte einerseits die Membrangangigkeit von Trofosfamid beeinflussen durch Konkurrenz
um einen Transportmechanismus, andererseits ware eine chemische Interaktion der Stoffe
auch denkbar. Trofosfamid hat z.B. eine schlechtere Wasserloslichkeit als Mafosfamid.
Eine Kombination von Midazolam und Ketamin als Infusion fuhrt beispielsweise zur
Herabsetzung der Loslichkeit und damit zur Ausfallung der Stoffe [76]. Die zeitversetzten
Kombinationen zu MX1 werden in Kapitel 4.5 diskutiert.
4.4 Das Weichteilsarkom S117
In den vorliegenden Ergebnissen wird gezeigt, dass die Sarkomzellen S117 auf die Be-
handlung mit Bortezomib ansprechen (Abb. 3.1). Dies stutzt die 2008 veroffentlichten
Ergebnisse von Lu et al. und Bersani et al., die in Zellkulturversuchen zeigten, dass
verschiedene Weichteilsarkome empfindlich auf Bortezomib als Einzeltherapie reagieren
[9, 57]. Eine Studie zu der Kombination von Bortezomib mit einem Oxazaphosphorin
am Sarkom wurde bis heute nicht veroffentlicht. Es liegen jedoch Studien vor, die einen
synergistischen Effekt bei der Kombination von Bortezomib mit Cisplatin, Doxorubicin
oder 5-Flourouracil beschrieben haben [28, 90]. Wie Oxazaphosphorine entfalten diese
Zytostatika ihre Wirkung auch uber DNA-Schadigung. Speziell Cisplatin gehort wie
die Oxazaphosphorine zur Familie der Alkylanzien. Es sollte dementsprechend nicht an
der alkylierenden Wirkung von Trofosfamid liegen, dass die Kombination mit Bortezo-
mib einen antagonistischen Effekt hatte. Einen neuen Betrachtungswinkel bringen die
zeitversetzten Kombinationstherapien im folgendem Kapitel 4.5.
4.5 Zeitversetzte Versuche
Beim Betrachten der zeitversetzten Ergebnisse fiel auf, dass die Kombinationen, in
denen Bortezomib an erster Stelle gegeben wurde, einen tendenziell schlechteren Effekt
hatten. Dies galt sowohl fur die Kombination mit Mafosfamid als auch fur die mit Tro-
fosfamid. Der einzige Versuch, der signifikante Unterschiede zwischen den zeitversetzen
Kombinationen zeigte, war der um eine Stunde versetzte Kombinationsversuch mit
Trofosfamid und Bortezomib IC50 (Abb. 3.15). Im Vergleich dazu haben die erwahnten
Versuche von Mortenson et al. zum NSCLC signifikante Unterschiede bei den zeit-
versetzten Kombinationen von Carboplatin, Gemcitabin und Bortezomib gezeigt [62].
Wie in Kapitel 4.2.1 beschrieben wurde, zeigte die Behandlung mit Gemcitabin und
4 Diskussion 62
Carboplatin, gefolgt von Bortezomib, die starkste Wirkungsverstarkung. Die zeitgleiche
Kombination zeigte einen etwas geringeren Effekt. Die Kombination, in der Bortezomib
als erstes gegeben wurde, zeigte lediglich eine minimale Wirkungsverstarkung. Diese
Ergebnisse konnten Mortenson et al. anhand von Tierversuchen zum gleichen NSCLC
reproduzieren. Versuchsgruppen von je vier Tieren wurden entweder zeitgleich oder
zeitversetzt mit Gemcitabin, Carboplatin und Bortezomib beimpft. Das Zeitintervall
der zeitversetzten Versuche betrug acht Stunden, wobei wie in den Zellversuchen Borte-
zomib entweder vor oder nach den beiden anderen Zytostatika gegeben wurde. Diese
Kombinationsbehandlungen wurden zweimal wochentlich durchgefuhrt. In ihren Er-
gebnissen berichten Mortenson et al., dass Bortezomib, als es an erster Stelle gegeben
wurde, den antineoplastischen Effekt der Behandlung fast ganzlich aufhob. Im Gegensatz
dazu zeigten die zeitgleiche Kombination und die Kombination, in der Bortezomib um
acht Stunden spater gegeben wurde, eine signifikante Wachstumsverlangsamung. Die
Zellversuche von Mortenson et al. zeigten einen geringen Effekt von Bortezomib auf
die beiden anderen Zytostatika, jedoch nicht einen so ausgepragten antagonistischen
Effekt wie bei den Tierversuchen. Idealerweise kann man mit praklinischen Versuchen
den Effekt einer Behandlung in klinischen Versuchen voraussagen, wie es Jung et al.
2007 zeigten [41]. Aufgrund ihrer praklinischen Versuche rieten sie von einer zeitglei-
chen Kombination von Bortezomib und Docetaxel ab und empfahlen stattdessen eine
zeitversetzte Behandlung, in der Bortezomib an zweiter Stelle dazugegeben werden
sollte. Im Januar 2011 veroffentlichten Lara et al. eine Phase-II-Studie, in der Patienten
mit NSCLC zu erst mit Docetaxel und dann zeitversetzt mit Bortezomib behandelt
wurden, und verglichen dies mit einer Gruppe, die beide Stoffe gleichzeitig erhielt. Die
zeitversetzte Behandlung zeigte eine mediane Uberlebenszeit von 13,3 Monaten im
Vergleich zu 10,5 Monaten bei der zeitgleichen Behandlung, was die Ergebnisse von
Jung et al. bestatigte.
Bezuglich der Wirkung von Bortezomib in zeitversetzten Kombinationsbehandlungen
konnte man diese wie folgt erklaren: In vielen Studien wurde beschrieben, wie Bortezomib
den Zellzyklus unter anderem durch seine Wirkung auf Protein 21, Protein 27 und
Protein 53 (auch als”Wachter des Genoms“ bekannt) zum Stillstand bringt und durch
Herunterregulation der katalytischen Untereinheit der DNA-abhanigen Protein-Kinase
(DNA-PKcs) die DNA-Reparatur hemmt [22, 26, 30, 83, 84]. Im Vergleich dazu bewirken
Oxazaphosphorine bzw. Carboplatin DNA-Schaden, wobei sie bei schnell proliferierenden
Zellen mit hohem Stoffwechsel den besten Effekt entwickeln. Der antagonistische Effekt
von Bortezomib, wenn es an erster Stelle in einer Kombination gegeben wird, konnte
also durch die Hemmung des Zellzyklus erklart werden. Der Umkehrschluss, dass
die Reparatur von Alkylanzien induzierter DNA-Schaden durch spatere Zugabe von
Bortezomib verhindert werde, konnte durch diese Arbeit nicht unterstutzt werden, sehr
4 Diskussion 63
wohl hingegen durch die Studie von Mortenson et. al..
4.6 Schlussfolgerung
Wie man in den zahlreichen praklinischen Untersuchungen zur Einzelbehandlung mit
Bortezomib sieht, sind erfolgreiche Zell- und Tierversuchen keine Garantie fur erfolg-
reiche klinische Studien. Sie dienen jedoch als Wegweiser, weswegen es auch wichtig
ist, Versuche zu veroffentlichen, die kein positives Resultat aufweisen. Die molekularen
Mechanismen und moglichen Interaktionen einer Kombinationstherapie mit Bortezomib
sind noch nicht ausreichend geklart und bedurfen weiterer Untersuchungen. Uberdies
sollten keine klinischen Kombinationsversuche durchgefuhrt werden, ohne dass diese
vorher mit aquivalenten praklinischen Versuchen untermauert wurden. Aufgrund der
vorliegenden Ergebnisse sollte vorlaufig von klinischen Studien zur Kombination von
Bortezomib und Oxazaphosphorinen bei soliden Tumoren abgeraten werden, da die
Ergebnisse bestenfalls eine subadditive Wirkungsverstarkung erwarten lassen. Außerdem
muss man vermuten, dass die Behandlungsabfolge einen Einfluss auf den Behandlungs-
effekt hat. In kunftigen Studien sollte deshalb auch hierauf ein Augenmark gelegt
werden.
64
5 Zusammenfassung
Bortezomib ist ein neuartiges”Targeted Drug“ aus der Klasse der Proteasomen-
Inhibitoren, welches zur Behandlung des multiplen Myeloms eingesetzt wird. Die
vorliegende Arbeit untersuchte die Wirksamkeit von Bortezomib in Kombination mit Ma-
fosfamid bzw. 4OH-Trofosfamid in Zellversuchen, und die Kombination von Bortezomib
mit Cyclophosphamid bzw. Trofosfamid in Tierversuchen. Mafosfamid ersetzte Cyclo-
phosphamid in den Zellversuchen, da Mafosfamid spontan in den aktiven Metaboliten
4OH-Cyclophosphamid zerfallt, wohingegen Cyclophosphamid von einer enzymatischen
Aktivierung abhangig ist. Ziel der Arbeit war es, die Wirkung und damit den even-
tuellen Nutzen der Kombinationstherapien zu prufen, da es hierzu bis heute nur eine
praklinische Studie gibt.
Um die Wirkung der Kombinationstherapien bewerten zu konnen, wurde die Zell-
uberlebensrate photometrisch mit dem Kristallviolett-Assay bestimmt. Zu den in vitro
untersuchten Zelllinien gehorten das Mammakarzinom MX1, das kleinzellige Lungenkar-
zinom LX1 und das Weichteilssarkom S117. Der Behandlungseffekt in den Tierversuchen
wurde anhand des Tumorvolumens gemessen. In den Tierversuchen wurden die Kom-
binationstherapien wegen der begrenzten Anzahl der Versuchstiere und des hohen
Zeitaufwands lediglich an der LX1-Zellline untersucht.
Die vorliegenden Versuche bestatigen die Empfindlichkeit der drei Zelllinien gegenuber
Bortezomib. Die zeitgleiche Therapie mit Mafosfamid und Bortezomib IC50 erbrachte
einen wirkungsverstarkenden Effekt im additiven Bereich fur die Zelllinien MX1 und S117.
Bei LX1 hatte diese Kombination einen moderat antagonistischen Effekt. Im zweiten
Versuchsabschnitt wurde untersucht, ob eine zeitversetzte Gabe der Medikamente
Einfluss auf die Wirkung der Kombinationen hat. Dabei wurden die Medikamente einmal
mit einem Zeitintervall von einer Stunde gegeben und einmal mit einem Zeitintervall
von zwei Stunden. Fur die zeitversetzte Kombination von Mafosfamid mit Bortezomib
IC50 wurde keine großere Veranderung des Behandlungseffekts fur die drei Zelllinien
beobachtet, unabhangig davon, ob die Medikamente um eine oder zwei Stunden versetzt
gegeben wurden. Fur die zeitversetzten Kombinationen, in denen Mafosfamid (M) vor
Bortezomib IC50 (B IC50) gegeben wurde (M >B IC50), zeigte sich eine tendenziell
niedrigere Zelluberlebensrate als fur die Kombinationen, in denen Bortezomib an erster
Stelle gegeben wurde. Der Unterschied war jedoch nicht signifikant. Die zeitgleiche
5 Zusammenfassung 65
Kombinationsbehandlung mit 4OH-Trofosfamid und Bortezomib IC50 erzielte fur
alle drei Zelllinien einen hauptsachlich antagonistischen Effekt. Fur die zeitversetzten
Kombinationen, in denen Bortezomib IC50 vor 4OH-Trofosfamid (T) gegeben wurde
(B IC50>T), war ein ahnlicher antagonistischer Effekt festzustellen. Die zeitversetzten
Kombinationen”T>B IC50“ zeigten eine tendenzielle Wirkungsverstarkung, da nur
einzelne Messpunkte der Kombinationen signifikante Unterschiede aufwiesen. Nur das
S117 zeigte einen klaren signifikanten Unterschied fur die um eine Stunde versetzte
Kombinationsbehandlung (Abb. 3.15). Die Kombination”T>B IC50“ lag im additiven
bis leicht antagonistischen Bereich, was sich signifikant von der Kombination”B IC50>T“
unterschied. Die letztgenannte Kombination lag ebenso wie die zeitgleiche Kombination
im antagonistischen Bereich. Dass eine zeitversetzte Behandlung einer zeitgleichen
Behandlung uberlegen sein kann, haben Jung et al. 2007 (In-vitro-Studie) und Lara et
al. 2011 (Phase-II-Studie) fur die Kombination von Bortezomib mit Docetaxel an einem
NSCLC gezeigt [41, 50]. Einige der Kombinationsversuche der vorliegenden Studie
wurden auch mit Bortezomib IC25 und IC75 durchgefuhrt, sollen hier aber nur erwahnt
werden, weil sie keine neuen Informationen erbrachten.
Die gleichen Behandlungen wurden auch am Xenograftmodell zum LX1-Tumor unter-
sucht. Das LX1 wurde fur die In-vivo-Versuche ausgewahlt, weil es in den In-vitro-
Versuchen am empfindlichsten auf Bortezomib reagierte. Die Tierversuche bestatigten
die Wirksamkeit von Bortezomib als Einzelbehandlung. Der Effekt war unabhangig von
der verabreichten Dosis. Die Kombination von Bortezomib mit Trofosfamid zeigte einen
antagonistischen Effekt, ahnlich dem der Zellversuche. Im Vergleich dazu zeigte die
Kombination von Cyclophosphamid mit Bortezomib eine leichte Wirkungsverstarkung
im Sinne einer subadditiven Wirkungsverstarkung, im Vergleich zur jeweiligen Einzelbe-
handlung.
Abgesehen von der Studie von Teicher et al. zur Kombinationsversuchen von Cyclo-
phosphamid und Bortezomib am Xenograftmodell zum Mammakarzinom liegen bis
heute keine ahnlichen Arbeiten uber die untersuchten Kombinationsbehandlungen
vor. Die molekularen Mechanismen und moglichen Interaktionen einer Kombinations-
therapie mit Bortezomib sind noch nicht ausreichend geklart und bedurfen weiterer
Untersuchungen. In Anbetracht der vorliegenden Ergebnisse sollte von einer klinischen
Untersuchung der Kombination von Bortezomib mit einem Oxazaphosphorin an soliden
Tumoren abgeraten werden, solange keine Arbeiten vorliegen, die Gegenteiliges belegen.
Außerdem muss man vermuten, dass die Behandlungsabfolge einen Einfluss auf den
Behandlungseffekt hat. In kunftigen Studien sollte deshalb auch hierauf ein Augenmerk
gelegt werden.
66
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77
Abbildungsverzeichnis
1.1 Stoffwechsel der Oxazaphosphorin-Derivate . . . . . . . . . . . . . . . . 3
1.2 Proteasomstoffwechsel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
3.1 Bortezomib als Einzelbehandlung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
3.2 Zeitgleiche Kombinationsbehandlung mit Bortezomib und Mafosfamid
am MX1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
3.3 Zeitgleiche Kombinationsbehandlung mit Bortezomib und Mafosfamid
am LX1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
3.4 Zeitgleiche Kombinationsbehandlung mit Bortezomib und Mafosfamid
am S117 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
3.5 (a) Zeitgleiche Kombinationsbehandlung mit Trofosfamid und Bortezo-
mib am MX1 (b) CI der Kombination von Trofosfamid und Bortezomib
IC50 am MX1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
3.6 Zeitgleiche Kombinationsbehandlung mit Trofosfamid und Bortezomib
am LX1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
3.7 Zeitgleiche Kombinationsbehandlung mit Trofosfamid und Bortezomib
am S117 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
3.8 Um eine Stunde versetzte Kombinationsbehandlung mit Mafosfamid und
Bortezomib am MX1. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
3.9 Um eine Stunde versetzte Kombinationsbehandlung mit Trofosfamid und
Bortezomib IC50 am MX1. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38
3.10 Um eine Stunde versetzte Kombinationsversuche mit Mafosfamid und
Bortezomib IC50 am LX1. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
3.11 Um eine Stunde versetzte Kombinationsbehandlung mit Trofosfamid und
Bortezomib IC50 am LX1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
3.12 Um zwei Stunden versetzte Kombinationsversuch mit Trofosfamid und
Bortezomib am LX1. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
3.13 (a) Um eine Stunde versetzte Kombinationsbehandlung mit Mafosfamid
und Bortezomib IC50 am S117; (b) CI der um eine Stunde versetzten
Kombination”M>B IC50“ am S117 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
3.14 CI der um zwei Stunden versetzten Kombination”M>B IC50“ . . . . . 47
Abbildungsverzeichnis 78
3.15 Um eine Stunde versetzte Kombinationsversuche mit Trofosfamid und
Bortezomib IC25 am S117. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48
3.16 Xenograftmodell mit LX1-Tumor zur Einzelbehandlung mit Bortezomib 50
3.17 Xenograftmodell mit LX1-Tumor zur Kombinationsbehandlung von Bor-
tezomib (0,6 mg/kg (KG)) und Trofosfamid . . . . . . . . . . . . . . . 51
3.18 Xenograftmodell mit LX1-Tumor zur Kombinationsbehandlung von Bor-
tezomib (1,0 mg/kg (KG)) und Trofosfamid . . . . . . . . . . . . . . . 51
3.19 Xenograftmodell mit LX1-Tumor zum Vergleich des Applikationsweges
von Trofosfamid in der Kombinationsbehandlung von Trofosfamid und
Bortezomib . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
3.20 Xenograftmodell am LX1-Tumor zur Kombinationsbehandlung von Cy-
clophosphamid und Bortezomib . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53
B.1 Um eine Stunde versetzte Kombinationsbehandlung mit Mafosfamid und
Bortezomib IC25 am MX1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84
B.2 Um eine Stunde versetzte Kombinationsbehandlung mit Trofosfamid und
Bortezomib IC25 am MX1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85
B.3 Um zwei Stunden versetzte Kombinationsbehandlung mit Mafosfamid
und Bortezomib MX1. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85
B.4 Um zwei Stunden versetzte Kombinationsbehandlung mit Trofosfamid
und Bortezomib IC50 am MX1. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86
B.5 Um eine Stunde versetzte Kombinationstherapie mit Mafosfamid und
Bortezomib IC25 am LX1. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86
B.6 Die um eine Stunde versetzte Kombinationsbehandlung mit Trofosfamid
und Bortezomib IC25 am LX1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87
B.7 Um zwei Stunden versetzte Kombinationsversuch mit Mafosfamid und
Bortezomib IC50 am LX1. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87
B.8 Um eine Stunde versetzte Kombinationsversuche mit Mafosfamid und
Bortezomib IC25 am S117 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 88
B.9 Um eine Stunde versetzte Kombinationsbehandlungen mit Trofosfamid
und Bortezomib IC25 am S117. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 88
B.10 Um zwei Stunden versetzte Kombinationsversuch mit Mafosfamid und
Bortezomib am S117. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89
B.11 Um zwei Stunden versetzte Kombinationsbehandlung mit Trofosfamid
und Bortezomib IC50 am S117. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89
79
Tabellenverzeichnis
2.1 Labormaterial . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
2.2 Gerate . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
2.3 Medien und Zusatze . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
2.4 Puffer und Stammlosungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
2.5 Auflistung der verwendeten Tumorzelllinien . . . . . . . . . . . . . . . 14
2.6 Zusammenstellung der verwendeten Losungen und Medien . . . . . . . 15
2.7 Behandlungsschemata der einzelnen Zelllinien . . . . . . . . . . . . . . 19
2.7 Fortsetzung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
2.8 Unterteilung des CI . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
3.1 Zusammenfassung der IC25, IC50 und IC75 von Bortezomib der Zelllinien 25
3.2 Konzentrationsreihen der Oxazaphosphorine . . . . . . . . . . . . . . . 26
3.3 Signifikanzen der zeitgleichen Kombinationen von Mafosfamid und Bor-
tezomib . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
3.4 CI der zeitgleichen Kombination mit Mafosfamid und Bortezomib . . . 28
3.5 Signifikanzen der zeitgleichen Kombinationen von Trofosfamid und Bor-
tezomib . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34
3.6 CI der zeitgleichen Kombination mit Trofosfamid und Bortezomib . . . 34
3.7 MX1 - Signifikanzen und CI der um eine Stunde versetzten Kombinati-
onstherapie mit Mafosfamid und Bortezomib . . . . . . . . . . . . . . . 36
3.8 MX1 - Signifikanzen und CI der um zwei Stunden versetzten Kombinati-
onstherapie mit Mafosfamid und Bortezomib . . . . . . . . . . . . . . . 37
3.9 MX1 - Signifikanzen und CI der um eine Stunde versetzten Kombinati-
onstherapie mit Trofosfamid und Bortezomib . . . . . . . . . . . . . . . 38
3.10 MX1 - Signifikanzen und CI der um zwei Stunden versetzten Kombinati-
onstherapie mit Trofosfamid und Bortezomib . . . . . . . . . . . . . . . 39
3.11 LX1 - Signifikanzen und CI der um eine Stunde versetzten Kombinati-
onstherapie mit Mafosfamid und Bortezomib . . . . . . . . . . . . . . . 40
3.12 LX1 - Signifikanzen und CI der um zwei Stunden versetzten Kombinati-
onstherapie mit Mafosfamid und Bortezomib . . . . . . . . . . . . . . . 41
3.13 LX1 - Signifikanzen und CI der um eine Stunde versetzten Kombinati-
onstherapie mit Trofosfamid und Bortezomib . . . . . . . . . . . . . . . 42
Tabellenverzeichnis 80
3.14 LX1 - Signifikanzen und CI der um zwei Stunden versetzten Kombinati-
onstherapie mit Trofosfamid und Bortezomib . . . . . . . . . . . . . . . 44
3.15 S117 - Signifikanzen und CI der um eine Stunde versetzten Kombinati-
onstherapie mit Mafosfamid und Bortezomib . . . . . . . . . . . . . . . 46
3.16 S117 - Signifikanzen und CI der um zwei Stunden versetzten Kombinati-
onstherapie mit Mafosfamid und Bortezomib . . . . . . . . . . . . . . . 46
3.17 S117 - Signifikanzen und CI der um eine Stunde versetzten Kombinati-
onstherapie mit Trofosfamid und Bortezomib . . . . . . . . . . . . . . . 48
3.18 S117 - Signifikanzen und CI der um zwei Stunden versetzten Kombinati-
onstherapie mit Trofosfamid und Bortezomib . . . . . . . . . . . . . . . 49
C.1 MX1 - p-Werte der zeitgleichen Kombinationstherapie von Mafosfamid
mit Bortezomib . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90
C.2 LX1 - p-Werte der zeitgleichen Kombinationstherapie von Mafosfamid
mit Bortezomib . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90
C.3 S117 - p-Werte der zeitgleichen Kombinationstherapie von Mafosfamid
mit Bortezomib . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90
C.4 MX1 - p-Werte der zeitgleichen Kombinationstherapie von Trofosfamid
mit Bortezomib . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91
C.5 LX1 - p-Werte der zeitgleichen Kombinationstherapie von Trofosfamid
mit Bortezomib . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91
C.6 S117 - p-Werte der zeitgleichen Kombinationstherapie von Trofosfamid
mit Bortezomib . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91
C.7 MX1 - p-Werte der um eine Stunde versetzten Kombinationstherapie
mit Mafosfamid und Bortezomib IC25. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92
C.8 MX1 - p-Werte der um eine Stunde versetzten Kombinationstherapie
mit Mafosfamid und Bortezomib IC50. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92
C.9 MX1 - p-Werte der um eine Stunde versetzten Kombinationstherapie
mit Trofosfamid und Bortezomib IC25. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93
C.10 MX1 - p-Werte der um eine Stunde versetzten Kombinationstherapie
mit Trofosfamid und Bortezomib IC50. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93
C.11 MX1 - p-Werte der um zwei Stunden versetzten Kombinationstherapie
mit Mafosfamid und Bortezomib IC50. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93
C.12 MX1 - p-Werte der um zwei Stunden versetzten Kombinationstherapie
mit Trofosfamid und Bortezomib IC50. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94
C.13 LX1 - p-Werte der um eine Stunde versetzten Kombinationstherapie mit
Mafosfamid und Bortezomib IC25. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94
C.14 LX1 - p-Werte der um eine Stunde versetzten Kombinationstherapie mit
Mafosfamid und Bortezomib IC50. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94
Tabellenverzeichnis 81
C.15 LX1 - p-Werte der um eine Stunde versetzten Kombinationstherapie mit
Trofosfamid und Bortezomib IC25. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95
C.16 LX1 - p-Werte der um eine Stunde versetzten Kombinationstherapie mit
Trofosfamid und Bortezomib IC50. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95
C.17 LX1 - p-Werte der um zwei Stunden versetzten Kombinationstherapie
mit Mafosfamid und Bortezomib IC50. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95
C.18 LX1 - p-Werte der um zwei Stunden versetzten Kombinationstherapie
mit Trofosfamid und Bortezomib IC50. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96
C.19 S117 - p-Werte der um eine Stunde versetzten Kombinationstherapie mit
Mafosfamid und Bortezomib IC25. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96
C.20 S117 - p-Werte der um eine Stunde versetzten Kombinationstherapie mit
Mafosfamid und Bortezomib IC50. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96
C.21 S117 - p-Werte der um eine Stunde versetzten Kombinationstherapie mit
Trofosfamid und Bortezomib IC25. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97
C.22 S117 - p-Werte der um eine Stunde versetzten Kombinationstherapie mit
Trofosfamid und Bortezomib IC50. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97
C.23 S117 - p-Werte der um zwei Stunden versetzten Kombinationstherapie
mit Mafosfamid und Bortezomib IC50. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97
C.24 S117 - p-Werte der um zwei Stunden versetzten Kombinationstherapie
mit Trofosfamid und Bortezomib IC50. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 98
82
Anhang A
Abkurzungsverzeichnis
Abb. Abbildung
ADP Adenosindiphosphat
Amp. Ampulle
Aqua dest. Aqua destillata
ATP Adenosintriphosphat
B Bortezomib
Bcl-2 B-cell lymphoma 2
bzw. beziehungsweise
CI Combination Index
CLL chronisch lymphatische Leukamie
CML chronisch myeloische Leukamie
Cyp Cytochrom P450
DNA Desoxyribonukleinsaure
ED extensive disease
EMA European Medicines Agency
ER Endoplasmatisches Retikulum
evtl. eventuell
FKS fetales Kalberserum
GIST gastrointestinale Stromatumoren
IC25 Inhibiting Concentration 25%
IC50 Inhibiting Concentration 50%
IC75 Inhibiting Concentration 75%
i.p. intraperitoneal
Kap. Kapitel
KG Korpergewicht
Konz. Konzentration
LD limited disease
M Mafosfamid
MES-Puffer 2-(N-Morpholino)ethansulfonsaure
Anhang A Abkurzungsverzeichnis 83
NaCl-Lsg. Natrium Chlorid Losung
NCI National Cancer Institute
NSCLC nicht-kleinzelliges Lungenkarzinom
OD optische Dichte
PAST Paleontological Statistiscs
p.o. peroral
rel. Uberlebensrate relative Uberlebensrate
rpm rounds per minute - siehe auch U/min.
SCLC kleinzelliges Lungenkarzinom
SEM Standard Error of Mean
T Trofosfamid
Tab. Tabelle
u.a. unter anderem
U/min Umdrehungen pro Minute
VEGF vascular endothelial growth factor
Vgl. Vergleich
vs. versus
ZNS Zentrales Nervensystem
84
Anhang B
Grafische Darstellungen
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 1,25 2,5 5 7,5 10 15
Rel
. Pro
lifer
atio
nshe
mm
ung
im V
gl. z
ur K
ontr
olle
[%]
Mafosfamid [µmol/l]
Mafosfamid Mafosfamid 0h + Bortezomib IC25 1h Bortezomib IC25 0h + Mafosfamid 1h
Abbildung B.1: Dargestellt ist die rel. Uberlebensrate der MX1 Zellen unter der umeine Stunde versetzten Kombinationsbehandlungen mit Mafosfamidund Bortezomib IC25 im Vergleich zur Mafosfamidkontrolle (n=11).
Anhang B Grafische Darstellungen 85
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 2,5 5 10 15 20 30
Rel
. Pro
lifer
atio
nshe
mm
ung
im V
gl. z
ur K
ontr
olle
[%
]
Trofosfamid [µmol/l]
Trofosfamid Trofosfamid 0h + Bortezomib IC25 1h Bortezomib IC25 0h + Trofosfamid 1h
Abbildung B.2: Dargestellt ist die rel. Uberlebensrate des MX1 bei den um eine Stundeversetzten Kombinationsversuchen mit Trofosfamid und BortezomibIC25 im Vergleich zu Trofosfamid als Einzelbehandlung (n=11).
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 2,5 5 7,5 10 15 20
Rel
. Pro
lifer
atio
nshe
mm
ung
im V
gl. z
ur K
ontr
olle
[%
]
Mafosfamid [µmol/l]
Mafosfamid Mafosfamid 0h + Bortezomib IC50 2h Bortezomib IC50 0h + Mafosfamid 2h
Abbildung B.3: Dargestellt ist die um zwei Stunden versetzt Kombinationstherapie mitMafosfamid und Bortezomib IC50 am Mammakazinom MX1 (n=11).
Anhang B Grafische Darstellungen 86
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 2,5 5 10 15 20 30
Rel
. Pro
lifer
atio
nshe
mm
ung
im V
gl. z
ur K
ontr
olle
[%
]
Trofosfamid [µmol/l]
Trofosfamid 4OH-Trofosfamid 0h + Bortezomib IC50 2h Bortezomib IC50 0h + 4OH-Trofosfamid 2h
Abbildung B.4: Dargestellt ist die Zelluberlebensrate des MX1 unter der um zweiStunden versetzten Kombinationsbehandlung mit Trofosfamid undBortezomib IC50 (n=11).
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 2,5 5 10 20 40
Rel
. Pro
lifer
atio
nshe
mm
ung
im V
gl. z
ur K
ontr
olle
[%]
Mafosfamid [µmol/l]
Mafosfamid Mafosfamid 0h + Bortezomib IC25 1h Bortezomib IC25 0h + Mafosfamid 1h
Abbildung B.5: Die Grafik zeigt am LX1 die um eine Stunde versetzte Kombinations-therapie von Mafosfamid und Bortezomib IC25, sowie die Kontrollemit Mafosfamid (n=10).
Anhang B Grafische Darstellungen 87
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 2,5 5 10 20 40Rel
. Pro
lifer
atio
nshe
mm
ung
im V
gl. z
ur K
ontr
olle
[%
]
Trofosfamid [µmol/l]
Trofosfamid Trofosfamid 0h + Bortezomib IC25 1h Bortezomib IC25 0h + Trofosfamid 1h
Abbildung B.6: Die Abbildung zeigt die relative Uberlebensrate der LX1 unter der umeine Stunde versetzten Kombinationsbehandlung mit Trofosfamid undBortezomib IC25 (n=10).
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 2,5 5 10 20 40
Rel
. Pro
lifer
atio
nshe
mm
ung
im V
gl. z
ur K
ontr
olle
[%]
Mafosfamid [µmol/l]
Mafosfamid Mafosfamid 0h + Bortezomib IC50 2h Bortezomib IC50 0h + Mafosfamid 2h
Abbildung B.7: Abgebildet ist die rel. Uberlebensrate des LX1 bei der um zwei Stundenversetzte Kombinationsbehandlung mit Mafosfamid und BortezomibIC50 (n=13).
Anhang B Grafische Darstellungen 88
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 5 10 15 20 30
Rel
. Pro
lifer
atio
nshe
mm
ung
im V
gl. z
ur K
ontr
olle
[%]
Mafosfamid [µmol/l]
Mafosfamid Mafosfamid 0h + Bortezomib IC25 1h Bortezomib IC25 0h + Mafosfamid 1h
Abbildung B.8: Abgebildet ist die rel. Uberlebensrate des S117 bei der um eine Stundeversetzten Kombinationsbehandlung mit Mafosfamid und BortezomibIC25, sowie die Kontrolle mit Mafosfamid (n=11).
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 5 10 15 20 30Rel
. Pro
lifer
atio
nshe
mm
ung
im V
gl. z
ur K
ontr
olle
[%
]
Trofosfamid [µmol/l]
Trofosfamid Trofosfamid 0h + Bortezomib IC25 1h Bortezomib IC25 0h + Trofosfamid 1h
Abbildung B.9: Abgebildet ist rel. Uberlebensrate des S117 unter der um eine Stundeversetzten Kombinationsbehandlung mit Trofosfamid und BortezomibIC25 im Vergleich zur Trofosfamidkontrolle (n=11).
Anhang B Grafische Darstellungen 89
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
0 5 10 15 20 30
Rel
. Pro
lifer
atio
nshe
mm
ung
im V
gl. z
ur K
ontr
olle
[%]
Mafosfamid [µmol/l]
Mafosfamid Mafosfamid 0h + Bortezomib IC50 2h Bortezomib IC50 0h + Mafosfamid 2h
Abbildung B.10: Dargestellt ist die rel. Uberlebensrate des S117 unter der um zweiStunden versetzten Kombinationsbehandlung mit Mafosfamid undBortezomib IC50 (n=16).
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 5 10 15 20 30Rel
. Pro
lifer
atio
nshe
mm
ung
im V
gl. z
ur K
ontr
olle
[%
]
Trofosfamid [µmol/l]
Trofosfamid Trofosfamid 0h + Bortezomib IC50 2h Bortezomib IC50 0h + Trofosfamid 2h
Abbildung B.11: Dargestellt ist rel. Uberlebensrate des S117 bei der um zwei Stundenversetzten Kombinationsbehandlung mit Trofosfamid und BortezomibIC50 im Vergleich zu Trofosfamid als Einzelbehandlung (n=12).
90
Anhang C
Daten
Zeitgleiche Kombinationsbehandlung
Dargestellt sind die p-Werte der zeitgleichen Kombinationsversuche der Zelllinien
MX1, LX1 und S117. Ein Signifikanzniveau von p≤ 0,05 wurde fur diese Versuche
festgelegt.
Tabelle C.1: Mafosfamid vs. Mafosfamid mit Bortezomib IC25, IC50 und IC75 am MX1
Mafosfamid µmol/l 1,25 2,5 5 7,5 10 15
p-WertBort. IC25 >0,01 >0,01 >0,01 0,11 0,33 0,71Bort. IC50 >0,01 >0,01 >0,01 >0,01 0,05 0,49Bort. IC75 >0,01 >0,01 >0,01 >0,01 >0,01 0,043
Tabelle C.2: Mafosfamid vs. Mafosfamid mit Bortezomib IC25, IC50 und IC75 am LX1
Mafosfamid µmol/l 2,5 5 10 20 40
p-WertBort. IC25 0,31 0,04 0,25 0,68 0,70Bort. IC50 >0,01 >0,01 >0,01 0,17 0,55Bort. IC75 >0,01 >0,01 >0,01 0,03 0,45
Tabelle C.3: Mafosfamid vs. Mafosfamid mit Bortezomib IC25, IC50 und IC75 am S117
Mafosfamid µmol/l 5 10 15 20 30
p-WertBort. IC25 0,35 0,17 0,36 0,51 0,97Bort. IC50 >0,01 >0,01 0,023 0,12 0,44Bort. IC75 >0,01 >0,01 >0,01 0,02 0,46
Anhang C Daten 91
Tabelle C.4: Trofosfamid vs. Trofosfamid mit Bortezomib IC25, IC50 und IC75 amMX1
Trofosfamid µmol/l 2,5 5 10 15 20 30
p-WertBort. IC25 0,37 0,04 0,40 0,24 0,30 0,11Bort. IC50 >0,01 >0,01 0,02 0,76 0,32 0,29Bort. IC75 >0,01 >0,01 >0,01 0,16 0,72 0,37
Tabelle C.5: Trofosfamid vs. Trofosfamid mit Bortezomib IC25, IC50 und IC75 am LX1
Trofosfamid µmol/l 2,5 5 10 20 40
p-WertBort. IC25 0,48 0,90 0,67 0,16 0,78Bort. IC50 0,10 0,61 0,33 0,95 0,99Bort. IC75 0,02 0,13 0,74 0,11 0,43
Tabelle C.6: Trofosfamid vs. Trofosfamid mit Bortezomib IC25, IC50 und IC75 am S117
Trofosfamid µmol/l 5 10 15 20 30
p-WertBort. IC25 0,97 0,68 0,74 0,80 0,80Bort. IC50 >0,01 0,25 0,36 0,74 0,74Bort. IC75 >0,01 >0,01 >0,01 0,75 0,74
Anhang C Daten 92
Zeitversetzte Kombinationsbehandlungen
Dargestellt sind die p-Werte der zeitverzogerten Kombinationsversuche der Zelllinien
MX1, LX1 und S117. Ein Signifikanzniveau von p>0,025 wurde fur diese Versuche
festgelegt.
Tabelle C.7: MX1 - p-Werte der um eine Stunde versetzten Kombinationstherapie mitMafosfamid und Bortezomib IC25.
Mafosfamid vs. Mafosfamid 0h + Bortezomib IC25 1hMafosfamid µmol/l 1,25 2,5 5 7,5 10 15
p-Wert 0,30 0,09 0,27 0,33 0,67 0,80
Mafosfamid vs. Bortezomib IC25 0h + Mafosfamid 1hMafosfamid µmol/l 1,25 2,5 5 7,5 10 15
p-Wert 0,09 0,27 0,52 0,80 0,70 0,95
Mafosfamid 0h + Bortezomib IC25 1h vs. Bortezomib IC25 0h + Mafosfamid 1hMafosfamid µmol/l 1,25 2,5 5 7,5 10 15
p-Wert 0,70 0,56 0,75 0,70 0,47 1,00
Tabelle C.8: MX1 - p-Werte der um eine Stunde versetzten Kombinationstherapie mitMafosfamid und Bortezomib IC50.
Mafosfamid vs. Mafosfamid 0h + Bortezomib IC50 1hMafosfamid µmol/l 1,25 2,5 5 7,5 10 15
p-Wert >0,01 >0,01 >0,01 0,04 0,46 0,60
Mafosfamid vs. Bortezomib IC50 0h + Mafosfamid 1hMafosfamid µmol/l 1,25 2,5 5 7,5 10 15
p-Wert >0,01 >0,01 >0,01 0,20 0,78 0,45
Mafosfamid 0h + Bortezomib IC50 1h vs. Bortezomib IC50 0h + Mafosfamid 1hMafosfamid µmol/l 1,25 2,5 5 7,5 10 15
p-Wert 0,15 0,09 0,23 0,25 0,68 0,78
Anhang C Daten 93
Tabelle C.9: MX1 - p-Werte der um eine Stunde versetzten Kombinationstherapie mitTrofosfamid und Bortezomib IC25.
Trofosfamid vs. Trofosfamid 0h + Bortezomib IC25 1hTrofosfamid µmol/l 2,5 5 10 15 20 30
p-Wert 0,70 0,24 0,36 0,80 0,33 0,22
Trofosfamid vs. Bortezomib IC25 0h + Trofosfamid 1hTrofosfamid µmol/l 2,5 5 10 15 20 30
p-Wert 0,90 0,13 0,51 0,56 0,85 0,33
Trofosfamid 0h + Bortezomib IC25 1h vs. Bortezomib IC25 0h + Trofosfamid 1hTrofosfamid µmol/l 2,5 5 10 15 20 30
p-Wert 0,95 0,95 0,85 0,56 0,57 0,80
Tabelle C.10: MX1 - p-Werte der um eine Stunde versetzten Kombinationstherapie mitTrofosfamid und Bortezomib IC50.
Trofosfamid vs. Trofosfamid 0h + Bortezomib IC50 1hTrofosfamid µmol/l 2,5 5 10 15 20 30
p-Wert >0,01 >0,01 0,07 0,13 0,33 0,37
Trofosfamid vs. Bortezomib IC50 0h + Trofosfamid 1hTrofosfamid µmol/l 2,5 5 10 15 20 30
p-Wert >0,01 >0,01 0,90 0,54 1 0,67
Trofosfamid 0h + Bortezomib IC50 1h vs. Bortezomib IC50 0h + Trofosfamid 1hTrofosfamid µmol/l 2,5 5 10 15 20 30
p-Wert 0,07 0,02 0,06 0,02 0,44 0,50
Tabelle C.11: MX1 - p-Werte der um zwei Stunden versetzten Kombinationstherapiemit Mafosfamid und Bortezomib IC50.
Mafosfamid vs. Mafosfamid 0h + Bortezomib IC50 2hMafosfamid µmol/l 1,25 2,5 5 7,5 10 15
p-Wert >0,01 >0,01 >0,01 >0,01 0,01 0,09
Mafosfamid vs. Bortezomib IC50 0h + Mafosfamid 2hMafosfamid µmol/l 1,25 2,5 5 7,5 10 15
p-Wert >0,01 >0,01 >0,01 >0,01 0,03 0,12
Mafosfamid 0h + Bortezomib IC50 2h vs. Bortezomib IC50 0h + Mafosfamid 2hMafosfamid µmol/l 1,25 2,5 5 7,5 10 15
p-Wert 0,75 0,80 0,80 0,75 0,70 0,57
Anhang C Daten 94
Tabelle C.12: MX1 - p-Werte der um zwei Stunden versetzten Kombinationstherapiemit Trofosfamid und Bortezomib IC50.
Trofosfamid vs. Trofosfamid 0h + Bortezomib IC50 2hTrofosfamid µmol/l 2,5 5 10 15 20 30
p-Wert >0,01 >0,01 >0,01 0,02 0,07 0,24
Trofosfamid vs. Bortezomib IC50 0h + Trofosfamid 2hTrofosfamid µmol/l 2,5 5 10 15 20 30
p-Wert 0,02 0,12 0,06 0,65 0,19 0,52
Trofosfamid 0h + Bortezomib IC50 2h vs. Bortezomib IC50 0h + Trofosfamid 2hTrofosfamid µmol/l 2,5 5 10 15 20 30
p-Wert 0,07 0,01 0,02 0,08 0,48 0,85
Tabelle C.13: LX1 - p-Werte der um eine Stunde versetzten Kombinationstherapie mitMafosfamid und Bortezomib IC25.
Mafosfamid vs. Mafosfamid 0h + Bortezomib IC25 1hMafosfamid µmol/l 2,5 5 10 20 40
p-Wert 0,40 0,60 0,60 0,90 0,78
Mafosfamid vs. Bortezomib IC25 0h + Mafosfamid 1hMafosfamid µmol/l 2,5 5 10 20 40
p-Wert 0,39 0,91 0,91 0,53 0,32
Mafosfamid 0h + Bortezomib IC25 1h vs. Bortezomib IC25 0h + Mafosfamid 1hMafosfamid µmol/l 2,5 5 10 20 40
p-Wert 0,97 0,81 0,53 0,40 0,39
Tabelle C.14: LX1 - p-Werte der um eine Stunde versetzten Kombinationstherapie mitMafosfamid und Bortezomib IC50.
Mafosfamid vs. Mafosfamid 0h + Bortezomib IC50 1hMafosfamid µmol/l 2,5 5 10 20 40
p-Wert >0,01 >0,01 0,02 0,73 0,19
Mafosfamid vs. Bortezomib IC50 0h + Mafosfamid 1hMafosfamid µmol/l 2,5 5 10 20 40
p-Wert >0,01 >0,01 0,17 0,81 0,42
Mafosfamid 0h + Bortezomib IC25 1h vs. Bortezomib IC50 0h + Mafosfamid 1hMafosfamid µmol/l 2,5 5 10 20 40
p-Wert >0,01 0,13 0,27 0,53 0,44
Anhang C Daten 95
Tabelle C.15: LX1 - p-Werte der um eine Stunde versetzten Kombinationstherapie mitTrofosfamid und Bortezomib IC25.
Trofosfamid vs. Trofosfamidamid 0h + Bortezomib IC25 1hTrofosfamid µmol/l 2,5 5 10 20 40
p-Wert 0,34 0,64 0,59 0,93 0,54
Trofosfamid vs. Bortezomib IC25 0h + Trofosfamid 1hTrofosfamid µmol/l 2,5 5 10 20 40
p-Wert 0,54 0,44 0,91 0,19 0,85
Trofosfamid 0h + Bortezomib IC25 1h vs. Bortezomib IC25 0h + Trofosfamid 1hTrofosfamid µmol/l 2,5 5 10 20 40
p-Wert 0,66 0,21 0,66 0,18 0,72
Tabelle C.16: LX1 - p-Werte der um eine Stunde versetzten Kombinationstherapie mitTrofosfamid und Bortezomib IC50.
Trofosfamid vs. Trofosfamidamid 0h + Bortezomib IC50 1hTrofosfamid µmol/l 2,5 5 10 20 40
p-Wert >0,01 >0,01 0,01 0,13 0,53
Trofosfamid vs. Bortezomib IC50 0h + Trofosfamid 1hTrofosfamid µmol/l 2,5 5 10 20 40
p-Wert >0,01 >0,01 >0,01 >0,01 0,10
Trofosfamid 0h + Bortezomib IC50 1h vs. Bortezomib IC50 0h + Trofosfamid 1hTrofosfamid µmol/l 2,5 5 10 20 40
p-Wert >0,01 0,02 0,27 >0,01 0,24
Tabelle C.17: LX1 - p-Werte der um zwei Stunden versetzten Kombinationstherapiemit Mafosfamid und Bortezomib IC50.
Mafosfamid vs. Mafosfamid 0h + Bortezomib IC50 2hMafosfamid µmol/l 2,5 5 10 20 40
p-Wert >0,01 >0,01 >0,01 0,30 0,69
Mafosfamid vs. Bortezomib IC50 0h + Mafosfamid 2hMafosfamid µmol/l 2,5 5 10 20 40
p-Wert >0,01 >0,01 >0,01 0,88 0,72
Mafosfamid 0h + Bortezomib IC25 2h vs. Bortezomib IC50 0h + Mafosfamid 2hMafosfamid µmol/l 2,5 5 10 20 40
p-Wert 0,54 0,76 0,41 0,24 0,41
Anhang C Daten 96
Tabelle C.18: LX1 - p-Werte der um zwei Stunden versetzten Kombinationstherapiemit Trofosfamid und Bortezomib IC50.
Trofosfamid vs. Trofosfamidamid 0h + Bortezomib IC50 2hTrofosfamid µmol/l 2,5 5 10 20 40
p-Wert >0,01 >0,01 >0,01 0,32 0,76
Trofosfamid vs. Bortezomib IC50 0h + Trofosfamid 2hTrofosfamid µmol/l 2,5 5 10 20 40
p-Wert >0,01 0,03 0,42 0,52 0,76
Trofosfamid 0h + Bortezomib IC50 2h vs. Bortezomib IC50 0h + Trofosfamid 2hTrofosfamid µmol/l 2,5 5 10 20 40
p-Wert 0,05 >0,01 >0,01 0,12 0,27
Tabelle C.19: S117 - p-Werte der um eine Stunde versetzten Kombinationstherapie mitMafosfamid und Bortezomib IC25.
Mafosfamid vs. Mafosfamid 0h + Bortezomib IC25 1hMafosfamid µmol/l 5 10 15 20 30
p-Wert 0,01 0,01 0,05 0,21 0,24
Mafosfamid vs. Bortezomib IC25 0h + Mafosfamid 1hMafosfamid µmol/l 5 10 15 20 30
p-Wert 0,03 >0,01 0,12 0,19 0,44
Mafosfamid 0h + Bortezomib IC25 1h vs. Bortezomib IC25 0h + Mafosfamid 1hMafosfamid µmol/l 5 10 15 20 30
p-Wert 0,13 0,40 0,16 0,23 0,33
Tabelle C.20: S117 - p-Werte der um eine Stunde versetzten Kombinationstherapie mitMafosfamid und Bortezomib IC50.
Mafosfamid vs. Mafosfamid 0h + Bortezomib IC50 1hMafosfamid µmol/l 5 10 15 20 30
p-Wert >0,01 >0,01 >0,01 >0,01 0,04
Mafosfamid vs. Bortezomib IC50 0h + Mafosfamid 1hMafosfamid µmol/l 5 10 15 20 30
p-Wert >0,01 >0,01 >0,01 0,03 0,21
Mafosfamid 0h + Bortezomib IC50 1h vs. Bortezomib IC50 0h + Mafosfamid 1hMafosfamid µmol/l 5 10 15 20 30
p-Wert 0,12 0,41 0,16 0,23 0,32
Anhang C Daten 97
Tabelle C.21: S117 - p-Werte der um eine Stunde versetzten Kombinationstherapie mitTrofosfamid und Bortezomib IC25.
Trofosfamid vs. Trofosfamid 0h + Bortezomib IC25 1hTrofosfamid µmol/l 5 10 15 20 30
p-Wert 0,52 0,85 0,66 0,65 0,95
Trofosfamid vs. Bortezomib IC25 0h + Trofosfamid 1hTrofosfamid µmol/l 5 10 15 20 30
p-Wert 0,85 1 0,70 0,19 0,61
Trofosfamid 0h + Bortezomib IC25 1h vs. Bortezomib IC25 0h + Trofosfamid 1hTrofosfamid µmol/l 5 10 15 20 30
p-Wert 0,65 0,85 0,85 0,3 0,61
Tabelle C.22: S117 - p-Werte der um eine Stunde versetzten Kombinationstherapie mitTrofosfamid und Bortezomib IC50.
Trofosfamid vs. Trofosfamid 0h + Bortezomib IC50 1hTrofosfamid µmol/l 5 10 15 20 30
p-Wert >0,01 >0,01 >0,01 >0,01 >0,01
Trofosfamid vs. Bortezomib IC50 0h + Trofosfamid 1hTrofosfamid µmol/l 5 10 15 20 30
p-Wert >0,01 >0,01 0,06 0,07 0,21
Trofosfamid 0h + Bortezomib IC50 1h vs. Bortezomib IC50 0h + Trofosfamid 1hTrofosfamid µmol/l 5 10 15 20 30
p-Wert >0,01 >0,01 >0,01 >0,01 0,45
Tabelle C.23: S117 - p-Werte der um zwei Stunden versetzten Kombinationstherapiemit Mafosfamid und Bortezomib IC50.
Mafosfamid vs. Mafosfamid 0h + Bortezomib IC50 2hMafosfamid µmol/l 5 10 15 20 30
p-Wert >0,01 >0,01 >0,01 >0,01 0,07
Mafosfamid vs. Bortezomib IC50 0h + Mafosfamid 2hMafosfamid µmol/l 5 10 15 20 30
p-Wert >0,01 >0,01 >0,01 0,03 0,16
Mafosfamid 0h + Bortezomib IC50 2h vs. Bortezomib IC50 0h + Mafosfamid 2hMafosfamid µmol/l 5 10 15 20 30
p-Wert 0,27 0,27 0,09 0,15 0,03
Anhang C Daten 98
Tabelle C.24: S117 - p-Werte der um zwei Stunden versetzten Kombinationstherapiemit Trofosfamid und Bortezomib IC50.
Trofosfamid vs. Trofosfamid 0h + Bortezomib IC50 2hTrofosfamid µmol/l 5 10 15 20 30
p-Wert >0,01 >0,01 0,02 0,07 0,09
Trofosfamid vs. Bortezomib IC50 0h + Trofosfamid 2hTrofosfamid µmol/l 5 10 15 20 30
p-Wert >0,01 >0,01 0,16 >0,01 0,27
Trofosfamid 0h + Bortezomib IC50 2h vs. Bortezomib IC50 0h + Trofosfamid 2hTrofosfamid µmol/l 5 10 15 20 30
p-Wert >0,01 0,98 0,44 0,10 0,81
99
Anhang D
Danksagung
Mein besonderer Dank gilt meinem Doktorvater Herrn Prof. Dr. med. Thomas Wag-
ner fur die Uberlassung des Themas dieser Dissertation und der Nutzungsmoglichkeit
des Labors. Außerdem mochte ich mich bei ihm fur die intensive und geduldigen
Betreuung bedanken.
Außerdem mochte ich mich bei Frau Dr. Stephanie Stolting bedanken fur die moti-
vierende Unterstutzung, die wiederholte Korrektur der Arbeit, sowie die Hilfestellung
bei der Statistik.
Danken mochte ich auch Frau Monica Vollmert fur die Einweisung in die Arbeitsme-
thoden, die Betreuung wahrend der Versuche sowie fur die Korrektur von Teilen der
Arbeit.
Fur die großartige Hilfe bei den Tierversuchen mochte ich mich bei meiner Mitdokto-
randin Friederike Auerswald bedanken.
Bei Mark Schenk mochte ich mich fur die Einfuhrung in das Arbeitsprogramm
LaTex bedanken sowie dafur, dass er jederzeit mit Rat und Tat bei der Losung von
Programmproblemen geholfen hat.
Außerdem mochte ich mich bei Dr. Mathias Hoizcyk von der Onkologischen Klinik
in Essen und Dr. Tobias Wohrle von der Anastesiologischen Klinik der Ludwig-
Maximilians-Universitat Munchen fur die Korrekturlesung meiner Arbeit bedanken.
Fur die Rettung meiner Daten von meinem ausgebrannten Computer bin ich meinem
Freund Kasper Worsøe Andersen sehr zu Dank verpflichtet.
Auch dem Laborteam und den Mitdoktoranden mochte ich fur die aufmunternde
Zusammenarbeit danken.
Zuletzt gilt mein besonderer Dank meinen Eltern und meinem Bruder dafur, das sie mir
mein Studium ermoglicht und mir wahrend dieser Arbeit Vertrauen und Unterstutzung
geschenkt haben.
100
Anhang E
Lebenslauf
Personliche Daten
Name: Jan Mikael GerlGeburtstag/-ort: 26. Marz 1981,
Hillerød, Danemark
Hochschulausbildung
2000-2007 Studium der Humanmedizin04/03 - 12/07 Klinischer Abschnitt, Universitat zu Lubeck, Deutschland09/00 - 08/02 Vorklinischer Abschnitt, Semmelweis Universitat, Budapest, Ungarn02/06 - 10/06 PJ, Chirurgie und HNO, Universitat zu Lubeck, Deutschland11/06 - 02/07 PJ, Innere Medizin, Haukeland Sykehus, Bergen, Norwegen
Beruflicher Werdegang
09/12 - Ass.-Arzt HNO, Ahus Sykehus, Lørenskog, Norwegen06/12 - 08/12 Ass.-Arzt Innere Medizin, Dronning Ingrids Hospital, Nuuk, Gronland06/11 - 05/12 Ass.-Arzt HNO, Slagelse Hospital, Danemark04/11 - 05/12 Ass.-Arzt Audiologie, Slagelse Hospital, Slagelse, Danemark04/10 - 03/11 Ass.-Arzt Onkologie, Rigshospitalet, Kopenhagen, Danemark09/08 - 03/10 Ass.-Arzt Innere Medizin, Herlev Hospital, Kopenhagen, Danemark04/08 - 08/09 Ass.-Arzt Gastromedizin, Herlev Hospital, Kopenhagen, Danemark
Extracurriculare Aktivitaten
09/11 - 05/12 Assistentensprecher des Krankenhauses in Slagelse04/09 - 04/10 Assistentensprecher der internistischen Abteilung in Herlev05/05 - 05/06 1. Vorsitzender des ”deutschen Famulantenaustausches”(dfa)06/04 - 12/07 Experimenteller Teil der Dissertation
101
Anhang F
Erklarung
Ich versichere, die vorliegende Arbeit selbststandig und nur unter Benutzung der
angegebenen Hilfsmittel angefertigt zu haben.
Die Tierversuche wurden vom Ministerium fur Umweltschutz, Natur und Forsten des
Landes Schleswig-Holstein unter der Tierversuchsantragsnummer V742-72241 122-4
(22-3/05) genehmigt (siehe auch Kap. 2.8.1).
Lubeck, den 30.01.2013