UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE BIOCIÊNCIAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
MESTRADO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
AVALIAÇÃO DO POTENCIAL DE FORMIGAS
(HYMENOPTERA: FORMICIDAE) COMO VETORES MECÂNICOS DE BACTÉRIAS DO GÊNERO Staphylococcus NO
AMBIENTE HOSPITALAR.
EUTÁLIA ELIZABETH NOVAES FERREIRA DA SILVA
NATAL/ RN 2009
EUTÁLIA ELIZABETH NOVAES FERREIRA DA SILVA
AVALIAÇÃO DO POTENCIAL DE FORMIGAS
(HYMENOPTERA: FORMICIDAE) COMO VETORES MECÂNICOS DE BACTÉRIAS DO GÊNERO Staphylococcus NO
AMBIENTE HOSPITALAR.
Orientadora: Drª. Maria de Fátima Freire de Melo Ximenes. CB/DMP/UFRN.
Co-orientadora: Drª Maria Celeste Nunes de Melo. CB/DMP/UFRN.
NATAL/ RN Dezembro de 2009
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas, do Centro de Biociências, da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como pré-requisito para a obtenção do Grau de Mestre.
Dedico este trabalho aos meus pais Carlos e Márcia, aos meus irmãos Camilo e Abigail e ao meu namorado André, presentes de Deus na minha vida.
AGRADECIMENTOS
A Deus, pelo dom da vida, pela força e esperança, pela iluminação e também por ter
colocado em meu caminho todos os anjos em pessoa que cito abaixo, que me ajudaram
desde uma breve palavra até os mais altos esforços.
À Drª. Maria de Fátima Freire de Melo Ximenes que acreditou no meu trabalho, um
tema bem diferente, e me deu todo apoio como minha orientadora e amiga em todos os
momentos em que precisei. Aprendi muito com ela como pessoa, como pesquisadora, como
professora. Obrigada pelos conselhos e pelo carinho.
À Drª. Maria Celeste Nunes de Melo que me acolheu em seu Laboratório, me
apoiou e me ensinou com muita paciência, “vestiu à camisa” e dedicou-se ao sucesso do
trabalho. A ela devo tudo o que aprendi sobre os estafilococos. Agradeço também por todos
os conselhos, as orientações, às vezes que dispôs dos seus fins de semana pelo nosso
trabalho, pelas amizades que fiz através dela, enfim, por tudo de bom que aconteceu desde
que Deus a colocou no meu caminho, muito obrigada. À ela toda a minha admiração e
agradecimento.
À Drª. Lenise Arneiro Teixeira por ter me recebido muito bem em seu Laboratório,
na Universidade Federal Fluminense - UFF, por ter aceitado participar do nosso trabalho e
nos apoiado nas análises moleculares. Agradeço pela disposição, conselhos e idéias acerca
de propostas futuras para nossas pesquisas.
Ao Dr. Jacques Hubert Charles Delabie pela participação em nosso trabalho
auxiliando na identificação de nossas formigas.
À Universidade Federal do Rio Grande do Norte, que nos concede estrutura e
professores de qualidade, fundamental na minha formação.
À Coordenação do Programa de Pós-gradução em Ciências Biológicas, aos
professores do Programa e os funcionários, que auxiliaram e orientaram a mim e aos meus
colegas do Mestrado.
À FAPERN – Fundo de Apoio à Pesquisa do Rio Grande do Norte, que me
concedeu uma bolsa de Mestrado, através do edital 002/2008, muito importante na
manutenção dos meus estudos.
Á Jannyce Guedes da Costa, aluna de Biomedicina, que não só me auxiliou na
análise dos nossos estafilococos, como também foi minha amiga, conselheira, companheira,
pessoa leal que me ensinou muito e com ela pude contar em todos os momentos, obrigada.
À André Luiz Bezerra Falcão Freire, aluno de Ciências Biológicas, que fotografou e
me auxiliou a identificar mais de 400 formigas, me ajudou na organização do trabalho.
Além disso, como meu namorado, me deu todo apoio, entendeu a minha ausência muitas
vezes, fez todos os esforços para me ajudar em todos os momentos, não me deixou
esmorecer, me fazendo sempre acreditar que tudo ia dar certo. Meu muito obrigada a esse
meu companheiro e amigo, presente de Deus na minha vida.
À Carolina Garnica Pérez Taco López, aluna da UFF, que nos ajudou nas análises
moleculares de nossas amostras.
Á Carlos Alberto Ferreira da Silva, meu pai, que me auxiliou no transporte do
material em todas as coletas, sempre disponível e paciente.
Aos professores da disciplina de Entomologia: Dr. Herbet Tadeu Almeida Andrade
e MSc. Adalberto Antônio Varela Freire, que me deram todo apoio, ainda na graduação,
para começar um trabalho a respeito das formigas urbanas e ao Dr. Ricardo Andreazze, que
me acolheu na sua disciplina, para o Estágio à Docência, por todo apoio e por tudo que me
ensinou sobre a carreira acadêmica.
À Drª. Cecília Maria de Carvalho Xavier Holanda pelo auxílio no uso do
Laboratório de Microbiologia do Hospital Universitário Onofre Lopes- HUOL; à Drª.
Maria Tereza Barreto de Oliveira pelo empréstimo de muitos dos seus meios de cultura
para execução do nosso trabalho; à professora Maria José de Britto Costa Fernandes e a
Francisco Canindé de Sousa, Farmacêutico, pelo apoio e ensinamentos quando comecei a
trabalhar no LabMed com os estafilococos; ao professor Ermeton Duarte do Nascimento,
meu amigo e colega no Mestrado, pelo apoio e carinho; a Drª. Magnólia Fernandes
Florêncio de Araújo, pela boa vontade em nos ajudar na aquisição de materiais; ao Dr. José
Veríssimo Fernandes, chefe do Departamento de Microbiologia e Parasitologia, com quem
sempre contamos e aos demais funcionários desse departamento Srª Otani, Sr. Edson e
Srª.Olívia.
Agradeço à minha mãe, Marcia Maria de Freitas Novaes Ferreira da Silva, que
muito me apoiou com o seu carinho, a sua dedicação como mãe, por me dar seu consolo de
mãe e por me fazer sempre acreditar que posso vencer as barreiras dessa vida.
Ao meu Pai mais uma vez, Carlos Alberto Ferreira da Silva, por me apoiar nesse
trabalho, e pela educação, apoio e carinho que me deu, junto com minha mãe, ao longo de
toda a minha vida, me permitindo estudar e crescer como pessoa. Amo vocês!
Agradeço aos meus irmãos Abigail e Camilo, que sempre demonstraram toda a
paciência comigo, carinho e nunca me deixaram desanimar. São pessoas de bem que muito
me orgulha tê-los como meus irmãos, amo vocês!
Agradeço ao meu namorado André Luiz e aos pais dele Sr. Alcindo e Srª. Dulce por
estarem sempre dispostos a me ajudar, pela amizade, pelo carinho e pela alegria que
trouxeram à minha vida. Á Cecília, tia Fátima e tia Lázara, Dona Lourdinha,... e a todos
que fazem essa família linda de pessoas maravilhosas que conheci através de André.
Aos meus amigos Joseane, Bueno, Glauce, Rayssa, Mara Fernanda, Jailma, Suely,
Álvaro e a todos que me auxiliaram com uma palavra de carinho, compreensão e gestos de
generosidade. Aos amigos do LabMed e do LabEnt: Jannyce, Leonardo, Luanda, Pedro,
Cláudio, Francisco, Glauce, Rodrigo, Hilário, Vanessa, Virgínia, Marcos.
Aos professores que aceitaram contribuir com o nosso trabalho fazendo parte das
bancas de Pré-qualificação e Qualificação: Drª Sathyabama Chellapa, Dr. Herbet Tadeu
Almeida Andrade e Dr. Valter Ferreira de Andrade Neto.
A todos os meus colegas da Pós Graduação em Ciências Biológicas, que
enfrentaram as dificuldades e aprenderam bastante como eu.
RESUMO
No ambiente hospitalar, bactérias podem ser disseminadas por insetos, tais como as formigas,
que se destacam pela alta adaptabilidade ao ambiente urbano. As bactérias do gênero
Staphylococcus são uma das principais causas de infecção hospitalar. Em países da Europa,
América Latina, Estados Unidos e Canadá, o grupo dos estafilococos coagulase-negativos
(ECN) representa a segunda maior causa dessas infecções, segundo o SENTRY (Programa de
vigilância antimicrobiana- EUA). No presente estudo foi analisado o potencial de formigas
(Hymenoptera: Formicidae) como veículos mecânicos de bactérias do gênero Staphylococcus
em um hospital da rede pública de saúde, no município de Natal-RN. As formigas capturadas
em coletas diurnas e noturnas, entre junho de 2007 e maio de 2008, nos seguintes setores:
enfermarias, lavanderia, cozinha, banco de sangue. Esses insetos foram identificados segundo a
chave de identificação de Bolton, 1997. Para a análise da presença de estafilococos, as formigas
foram incubadas em caldo de caseína de soja (TSB) por 24h, a 35ºC para posterior semeadura
em Agar Manitol Salgado. As colônias características de estafilococos incubadas por 24h a
35ºC, em Tryptic Soy Agar, para testes de caracterização do gênero (coloração de Gram,
catalase, susceptibilidade à bacitracina e coagulase livre). A identificação dos ECN foi
realizada através das provas bioquímicas: susceptibilidade à novobiocina, crescimento em
anaerobiose, presença de urease, descarboxilação da ornitina e produção de ácidos a partir dos
açúcares manose, maltose, trealose, manitol e xilose. A susceptibilidade aos antimicrobianos
analisada através da técnica disco-difusão. Para confirmar a presença do gene mecA foi
utilizada a técnica da Reação em Cadeia da Polimerase e a capacidade de produção de biofilme
foi verificada através de ensaio in vitro usando superfície inerte de poliestireno, em amostras de
estafilococos resistentes. Entre 440 formigas, 85 (19,1%) estavam transportando os ECN das
espécies Staphylococcus saprophyticus (17), Staphylococcus epidermidis (15), Staphylococcus
xylosus (13), Staphylococcus hominis hominis (10), Staphylococcus lugdunensis (10),
Staphylococcus warneri (6), Staphylococcus cohnii urealyticum (5), Staphylococcus
haemolyticus (3), Staphylococcus simulans (3), Staphylococcus cohnii cohnii (2), e
Staphylococcus capitis (1 ). Nenhum Staphylococcus aureus foi encontrado. Entre os isolados,
30,58% apresentaram resistência à eritromicina. Duas amostras de ECN (2,35%), obtidas a
partir da formiga Tapinoma melanocephalum coletadas na enfermaria feminina pós-cirúrgica,
S. hominis hominis e S. lugdunensis albergavam o gene mecA e foram resistentes a múltiplos
antibióticos. Além disso, a espécie S. hominis hominis ainda mostrou ser um produtor de
biofilme. Este estudo demonstra que as formigas podem agir como veiculadoras de ECN multi-
resistentes aos antimicrobianos e produtores de biofilme, e, ainda, aponta para o risco da
disseminação de microrganismos patogênicos por esse inseto no ambiente hospitalar.
PALAVRAS-CHAVE: Formigas, Ambiente Hospitalar, Estafilococos coagulase-negativos
(ECN).
ABSTRACT In a hospital environment, these bacteria can be spread by insects such as ants, which are
characterized by high adaptability to the urban environment. Staphylococcus is a leading
cause of hospital infection. In Europe, Latin America, USA and Canada, the group of
coagulase negative staphylococci (CoNS) is the second leading cause of these infections,
according to SENTRY (antimicrobial surveillance program- EUA). In this study, we
investigated the potential of ants (Hymenoptera: Formicidae) as vehicle mechanics of
Staphylococcus bacteria in a public hospital, in Natal-RN. The ants were collected, day and
night, from June 2007 to may 2008, in the following sectors: hospitals, laundry, kitchen,
blood bank. The ants were identified according to the identification key of Bolton, 1997.
For the analysis of staphylococci, the ants were incubated in broth Tryptic Soy Broth (TSB)
for 24 hours at 35 º C and then incubated on Mannitol Salt Agar. The typical colonies of
staphylococci incubated for 24 hours at 35 ° C in Tryptic Soy Agar for the characterization
tests (Gram stain, catalase, susceptibility to bacitracin and free coagulase). The
identification of CoNS was performed through biochemical tests: susceptibility to
novobiocin, growth under anaerobic conditions, presence of urease, the ornithine
decarboxylation and acid production from the sugars mannose, maltose, trehalose, mannitol
and xylose. The antimicrobial susceptibility examined by disk-diffusion technique. The
technique of Polymerase Chain Reaction was used to confirm the presence of mecA gene
and the ability to produce biofilm was verified by testing in vitro using polystyrene inert
surface, in samples of resistant staphylococci. Among 440 ants, 85 (19.1%) were carrying
coagulase-negative staphylococci (CoNS) of the species Staphylococcus saprophyticus
(17), Staphylococcus epidermidis (15), Staphylococcus xylosus (13), Staphylococcus
hominis hominis (10), Staphylococcus lugdunensis (10), Staphylococcus warneri (6),
Staphylococcus cohnii urealyticum (5), Staphylococcus haemolyticus (3), Staphylococcus
simulans (3), Staphylococcus cohnii cohnii (2), and Staphylococcus capitis (1). No
Staphylococcus aureus was found. Among the isolates, 30.58% showed resistance to
erythromycin. Two samples of CoNS (2.35%), obtained from the ant Tapinoma
melanocephalum collected in the post-surgical female ward, S. Hominis hominis and S.
lugdunensis harbored the mecA gene and were resistant to multiple antibiotics, and the
specie S. hominis hominis even showed to be a biofilm producer. This study proves that
ants act as carriers of multidrug-resistant coagulase-negative Staphylococci and biofilm
producers and points to the risk of the spreading of pathogenic microorganisms by this
insect in the hospital environment.
KEY WORDS: Ants, Hospital enfironment, Coagulase-negative staphylococci (CoNS).
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 Espécies de formigas (Formicidae) presentes nas coletas. A) Tapinoma
melanocephalum (Fabricius); B) Paratrechina longicornis (Latrielle);
C) Crematogaster victima (Smith); D) Solenopsis globularia (Smith) e
E) Camponotus vittatus Forel.
9
FIGURA 2 Distribuição das espécies de formigas segundo os meses pesquisados. 53
FIGURA 3 Distribuição das espécies de formigas segundo os turnos 54
FIGURA 4 Distribuição das espécies de formigas por setor do hospital. 55
FIGURA 5 Amostras de Staphylococcus coagulase negativos resistentes aos
antibióticos, oxacilina (1µg) e cefoxitina (30µg). A) Amostra 3ES4D
apresentando halo de inibição de 5mm para oxacilina e 16mm para
cefoxitina. B) Amostra 11ES2D apresentando halo de inibição de
11mm para cefoxitina e nenhuma formação de halo de inibição para
oxacilina.
57
FIGURA 6 Produção da proteína PBP2a nas amostras de S. hominis hominis
(3ES4D) e S. lugdunensis (11ES2D).
58
FIGURA 7 Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) para as amostras de ECN
multirresistentes. Coluna 1: Marcador de peso molecular; Coluna 2:
Controle + (S. aureus 9393); Coluna 3: S. hominis hominis (3ES4D); S.
lugdunensis (11ES2D); Coluna 5: Controle negativo (S. epidermidis
ATCC12228).
59
FIGURA 8 Produção de Biofilme. 1A,B,C - ausência de amostras; 1D,E,F -
Staphylococcus pyogenes 75194 (amostra controle não produtora de
biofilme); 2A,B - S. epidermidis 70d (amostra controle produtora de
biofilme); 2C,D - Staphylococcus hominis hominis (amostra 3ES4D);
2E,F – Staphylococcus lugdunensis (amostra 11ES2D).
59
FIGURA 9 Distribuição dos tipos de bactérias segundo os meses pesquisados. 60
FIGURA 10 Distribuição dos tipos de bactérias por setor do hospital. 61
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 Modelo para identificação de Staphylococcus coagulase-
negativo segundo Kloos & Bannerman (1999).
42
TABELA 2 Distribuição das espécies de formigas no hospital. 52
TABELA 3 Distribuição das espécies de formigas segundo os meses
pesquisados.
53
LISTA DE ABREVIATURAS
ECN Estafilococos Coagulase-Negativo
SENTRY Programa de vigilância antimicrobiana- EUA
MRSA Staphylococcus aureus resistente à meticilina
PBP Proteína de ligação à penicilina
PBP2a Proteína de ligação à penicilina 2a
SSP1 e SSP2 Proteína da superfície de Staphylococcus1 e 2.
AtlE Autolisina E
BAP Proteína Biofilme Associada
PS/A Polissacarídeo capsular/adesina
AAP Proteína Associada de Acumulação
PIA Adesina Polissacarídica Intercelular
HUOL Hospital Universitário Onofre Lopes
SUS Sistema Único de Saúde
UFC Unidade Formadora de Colônia
TSB Caldo tríptico de soja
TSA Agar tríptico de soja
ATCC Coleção Norte-Americana de Culturas
CLSI Instituto de Padronização Clínica e Laboratorial
DNA Ácido Desoxirribonucléico
PCR Reação em Cadeia da Polimerase
EDTA Ácido Etilodiaminotetracético Dissódico
TBE Tris-borato-EDTA
DOc Densidade óptica do Crescimento bacteriano
CoNS Staphylococcus coagulase-negativo
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO 1 1.1 Caracterização das formigas urbanas 4 1.1.1 Tapinoma melanocephalum (Fabricius, 1793) 5 1.1.2 Paratrechina longicornis (Latreille, 1802) 6 1.1.3 Outras formigas urbanas 7 1.2 Formigas como disseminadoras de bactérias 10 1.3 Caracterização do gênero Staphylococcus 12 1.3.1 Estafilococos coagulase-negativo (ECN) 15 1.3.1.1 Caracterização da espécie Staphylococcus epidermidis 16 1.3.1.2 Caracterização da espécie Staphylococcus lugdunensis 18 1.3.1.3 Caracterização da espécie Staphylococcus saprophyticus 21 1.3.1.4 Outras espécies de Estafilococos coagulase-negativo (ECN) 23 1.3.2 Resistência aos antimicrobianos 26 1.3.3 Produção de Biofilme 30 2. OBJETIVOS 35 2.1 Objetivo Geral 35 2.2 Objetivos Específicos 35 3. METODOLOGIA 36 3.1 Locais de coleta e realização do estudo 36 3.2 Coleta e armazenamento das formigas 37 3.2.1 Identificação das formigas 38 3.3 Análise da presença de bactérias do gênero Staphylococcus 38 3.3.1 Caracterização do Gênero Staphylococcus 40 3.3.1.1 Susceptibilidade à Bacitracina 40 3.3.1.2 Prova da Catalase 41 3.3.1.3 Prova da Coagulase Livre 41 3.3.2 Caracterização das espécies do grupo Staphylococcus coagulase-negativo 42 3.3.2.1 Resistência à novobiocina 43 3.3.2.2 Produção da enzima urease 43 3.3.2.3 Descarboxilação da Ornitina 44 3.3.2.4 Crescimento em anaerobiose 44 3.3.2.5 Teste da hidrólise de L-pirrolidonil-β-naftilamida (PYR) 45 3.3.2.6 Produção de ácidos a partir da utilização de açúcares 45
3.4 Perfil de Susceptibilidade aos antimicrobianos 46 3.4.1 Teste de difusão de meticilina em agar 46 3.5 Detecção da produção de PBP2a (proteína de ligação à penicilina 2a) 47 3.6 Detecção do gene Meca 48 3.6.1 Extração do DNA total 48 3.6.2 Reação da PCR 49 3.6.3 Eletroforese 50 3.7 Detecção da produção de Biofilme 50 3.8 Análise dos dados 51 4. RESULTADOS 52 4.1 Coleta e identificação das formigas 52 4.2 Fatores abióticos e a ocorrência de formigas 53 4.3 Identificação dos Staphylococcus coletados 56 5. DISCUSSÃO 62 6. CONCLUSÃO 67 7. REFERÊNCIAS 69 Artigo 1 92
1. INTRODUÇÃO:
Segundo o IBGE (Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística), 81,19% da
população brasileira está localizada no meio urbano (IBGE, 2000), e a falta de políticas
públicas que venham a mitigar os problemas de saúde e ambientais faz com que as pragas
urbanas venham crescendo nas grandes cidades. A disponibilidade de abrigo e alimento
gera proliferação de diversas espécies sinantrópicas (OLIVEIRA & CAMPOS-FARINHA,
2005; PRADO et al., 2002).
Dentre os insetos sinantrópicos, as formigas se caracterizam como eussociais,
pertencentes à ordem Hymenoptera, família Formicidae, com mais de 11.000 espécies
identificadas em todo o mundo (BROWN JUNIOR et al., 2000), sendo mais de 2.000
presentes no Brasil. Em geral, as formigas são benéficas, contribuindo para ciclagem de
nutrientes, aeração do solo, polinização, dispersão de sementes de algumas plantas e
também participam da cadeia alimentar (BUENO et al., 2004), porém, das espécies que
ocorrem no Brasil, 20 a 30 são consideradas pragas urbanas (BUENO, 2003).
Os problemas ocasionados pelas formigas no meio urbano vão desde a sua
proliferação em prédios recém construídos, em construção ou mal conservados, com falhas
na estrutura arquitetônica, permitindo que possam nidificar e procurar o alimento nas áreas
externas (ZARZUELA et al., 2002); infestações em aparelhos eletrônicos, devido ao
tamanho reduzido, têm o acesso facilitado, construindo ninhos onde ficam protegidas e
aquecidas, além da grande atração à corrente elétrica, cujo motivo não se sabe. Os prejuízos
se agravam quando da ocorrência em centrais telefônicas, sistemas elétricos, escritórios,
museus, fábricas de alimentos, restaurantes, entre outras (SILVA & LOECK, 1999;
SOARES et al., 2006)
Além de todos esses possíveis danos, no que se refere aos problemas de saúde
pública e relação com o meio ambiente, alguns gêneros de formigas, tais como Wasmannia,
Labidus, Eciton, Crematogaster e subfamíla Ponerinae, podem picar dolorosamente
(MALASPINA, 2002). A espécie Solenopsis invicta possui um aguilhão no abdome no
qual injeta um veneno que pode ocasionar o aparecimento de lesões purulentas,
acompanhadas de prurido ou até mesmo reações sistêmicas, tais como edema laringeal e
hipotensão (KEMP, 2000).
As formigas ainda podem atuar como vetoras de microrganismos prejudiciais ao
homem, o que pode ser agravado em um ambiente hospitalar, devido aos riscos de
transmissão desses microrganismos a diversos setores do hospital, contaminando
instrumentos cirúrgicos, aparelhos, roupas de cama, como lençóis, além de alimentos e
medicamentos (BEATSON, 1972; ZARZUELA et al., 2002; LISE et al., 2006; PEÇANHA,
2000).
Esses insetos podem veicular mecanicamente mais de 20 espécies de fungos,
incluindo os gêneros Aspergillus e Candida, causadores de infecção nos pulmões, pele e
mucosas (PANTOJA et al., 2009), podem carrear ovos de nematódeos, como Ascaris
lumbricoides (VILLANI et al., 2008) e também bactérias. Um estudo realizado na região
sudeste mostrou que as formigas podem carrear mais de 80 bactérias potencialmente
patogênicas (PEÇANHA, 2000), alguns dos gêneros mais encontrados são: Staphylococcus,
ao qual dependendo da espécie, pode causar desde faringites e infecções urinárias, até
septicemia; Enterococcus, sendo um dos principais agentes causadores de infecções nas
vias urinárias, nos pulmões, no sistema nervoso central, na pele e tecido celular subcutâneo,
sendo comuns em ambientes domiciliares e hospitalares; e a espécie Pseudomonas
aeruginosa que se caracteriza como um agente causador de infecções no trato respiratório
inferior, em feridas superficiais na pele e no trato urinário (TRABULSI & ALTERTHUM,
2005).
1.1 Caracterização das formigas urbanas:
O sucesso na adaptação e colonização do meio urbano por algumas espécies de
formigas tem sido bastante documentado e visto com preocupação por setores de vigilância
e controle de pragas de alguns países (AKRE & HANSEN, 1990; COLLINGWOOD et al.,
1997; CHOE et al., 2009). Essas espécies fazem parte de um grupo de formigas chamadas
“andarilhas” (“tramp ants”), as quais possuem uma série de características ecológicas e
biológicas que favorecem sua dispersão no meio urbano (HÖLLDOBLER & WILSON,
1990). Essas características incluem a formação de sociedades unicoloniais, as quais não há
limites bem definidos entre suas colônias; ninhos propensos à migração; operárias
monomórficas e de tamanho reduzido; os ninhos contêm múltiplas rainhas funcionais e não
apresentam agressão intraespecífica, porém são agressivas frente a outras espécies de
formigas (HÖLLDOBLER & WILSON, 1990).
Em estudo publicado recentemente na Colômbia, Tapinoma melanocephalum
(Fabricius) e Paratrechina longicornis (Latreille) são apontadas como as formigas urbanas
mais importantes (ULLOA-CHACÓN & JARAMILLO, 2003). No Brasil, essas duas
espécies também são bastante citadas, juntamente às espécies do gênero Camponotus,
Crematogaster, Solenopsis (BUENO, 2003; LUNA et al., 2004; SOARES et al., 2006).
1.1.1 Tapinoma melanocephalum (Fabricius, 1793):
Tapinoma melanocephalum (Fabricius, 1793), conhecida como formiga fantasma, é
mundialmente distribuída, sendo difícil determinar precisamente sua origem, porém os
pesquisadores acreditam que tenha vindo das regiões tropicais do continente africano
(OSBORNE et al., 1995). É uma espécie que necessita de umidade e altas temperaturas,
estando espalhada nas regiões tropicais e mesmo nas subtropicais, onde provavelmente foi
levada pelo comércio e migração, e encontrou em cozinhas, banheiros, hospitais e
restaurantes as condições climáticas ideais para o seu estabelecimento (ESPADALER &
ESPEJO, 2002).
É uma espécie de tamanho pequeno, quando comparada às demais formigas
distribuídas no ambiente urbano, possui entre 1,3-1,5 mm, possui duas tonalidades de cor,
com o gaster, antenas e pernas na tonalidade amarelada à transparente, contrastando com a
cabeça e tórax bem escuros (Figura 1.A). Quanto ao forrageio, T. melanocephalum se
adapta com facilidade aos itens da alimentação humana, no entanto foi observada uma
preferência por doces (SMITH, 1965). Alimenta-se de larvas de besouros (Coleoptera),
borboletas (Lepidoptera) e, na Venezuela, verificou-se que essa espécie é um predador
primário dos ovos do barbeiro Rhodnius prolixus, causador da doença de Chagas
(OSBORNE et al., 1995; GOMEZ-NUNEZ, 1971).
As colônias são altamente adaptadas e com múltiplas rainhas e se caracterizam pela
mobilidade, se instalando em ambientes transitórios tais como, embaixo de escombros,
restos de madeira apodrecida, azulejos ou dentro de outras estruturas. Oster & Wilson
(1978) observaram que as colônias podem se partir em subunidades, ocupando diferentes
lugares, mas mantendo suas operárias movendo-se entre elas.
Dois relatos do avanço dessa espécie foram descritos (ESPADALER & ESPEJO,
2002; CHOE et al., 2009). A primeira coleta dessa espécie em Barcelona ocorreu em 2002,
T. melanocephalum foi encontrada em apartamentos de vários andares, próximos a uma
indústria de processamento de alimentos. Foram achados ninhos principalmente nas
cozinhas e nos banheiros e desde 1999, os moradores relatavam a presença dessa espécie
nesses locais. Em uma investigação acerca dos hábitos dos moradores, verificou-se que
alguns deles costumavam viajar para países de clima tropical do continente africano, o que
poderia explicar a origem dessa infestação (ESPADALER & ESPEJO, 2002). Choe et al.
(2009), relataram pela primeira vez a presença de T. melanocephalum em Seul, também em
residências.
1.1.2 Paratrechina longicornis (Latreille, 1802):
Paratrechina longicornis (Latreille, 1802) é conhecida como formiga louca, devido
a sua trajetória aparentemente sem senso de direção. É mundialmente distribuída e tem sua
origem desconhecida, entretanto acredita-se que pode ser asiática ou africana (SMITH,
1965). Está presente em regiões tropicais e subtropicais, onde se instalam em lugares
aquecidos como estufas e residências. Embora seja uma espécie relevante no contexto dos
insetos urbanos, existem ainda poucos estudos acerca da biologia dessa espécie nas regiões
tropicais (FOX et al., 2007).
Possui todo o corpo com coloração marrom escuro, quase preto, com pernas
alongadas e possui cerca de 3,5 mm (Figura 1.B). São poligínicas e podem construir ninhos
tanto em ambientes secos, quanto úmidos, como por exemplo, caixas de inspeção de
esgoto, gás e rede elétrica, em cavidades de paredes e telhados, sob piso e em jardins. Além
das residências, já foram encontradas infestações em hospitais e indústrias de
medicamentos (SOLIS et al., 2007). Alimentam-se de aracnídeos e insetos (dípteros,
himenópteros e ortópteros) mortos, além de itens da alimentação humana, principalmente
líquidos adocicados (SOLIS et al., 2008). Nessa espécie também já foi observada a
associação com homópteros, no qual as operárias coletavam o líquido adocicado produzido
por este inseto (TRAGER, 1984).
1.1.3 Outras formigas urbanas:
As espécies do gênero Crematogaster são caracterizadas por apresentar um gáster
pontiagudo posteriormente, em formato cordiforme e de coloração entre amarelo e marrom
(LONGINO, 2003). As espécies desse gênero são cosmopolitas e amplamente distribuídas
na região neotropical. Um estudo recentemente realizado no Brasil encontrou 27 espécies
espalhadas por vários estados brasileiros, no Nordeste foram encontradas quatro espécies
desse gênero, uma delas a Crematogaster victima (Smith, 1858) (Figura 1.C)
(FELIZARDO & HARADA, 2007).
O gênero Solenopsis possui duas espécies bastante conhecidas, uma delas é a
Solenopsis invicta Buren, 1972, conhecida como formiga de fogo, que possui um aguilhão
no final do gáster no qual injeta uma substância que pode causar sérias reações alérgicas e a
outra espécie bastante conhecida é a formiga “lava-pés”, Solenopsis saevissima (Smith,
1855), cujas operárias possuem de 3-6 mm (PITTS, et al., 2005) (Figura 1.D).
As espécies do gênero Camponotus são conhecidas como formigas carpinteiras, são
maiores que as formigas anteriormente descritas, as operárias possuem entre 6-15 mm e sua
coloração varia do amarelo ao marrom (Figura 1.E). Algumas espécies desse gênero têm o
hábito de fazer ninhos em edificações em reforma ou em construção, forros e até aparelhos
eletrônicos (BICHO et al., 2007). Estima-se que esse gênero, juntamente com o gênero
Solenopsis contempla várias espécies presentes no ambiente urbano, porém são pouco
estudados nos países neotropicais (CHÁCON DE ULLOA, 2003).
FIGURA 1: Espécies de formigas (Formicidae) presentes nas coletas. A) Tapinoma
melanocephalum (Fabricius); B) Paratrechina longicornis (Latrielle); C)
Crematogaster victima (Smith); D) Solenopsis globularia (Smith) e E)
Camponotus vittatus Forel.
1.2 Formigas como disseminadoras de bactérias:
O primeiro relato de formigas carreando bactérias no ambiente hospitalar foi
descrito ainda nos anos 70 por Beatson (1972), em uma pesquisa em hospitais da Inglaterra,
onde encontrou mais de 15 espécies de bactérias sendo disseminadas por uma única espécie
de formiga, Monomorium pharaonis. Dentre os patógenos encontrados, houve ocorrência
de bactérias do gênero Staphylococcus, sendo carreadas em cozinhas e Unidades de Terapia
Intensiva (UTIs) dos hospitais pesquisados.
Desde então, o fato despertou o interesse pela investigação das infestações por
formigas e seu potencial veiculador de patógenos no ambiente hospitalar. Outros estudos
foram realizados em seguida, em hospitais na Inglaterra, no Chile e no Brasil (EDWARDS
& BACKER, 1981; IPINZA-REGLA et al., 1981; FOWLER et al., 1993). Nesses
trabalhos, algumas espécies de formigas se destacam na atuação como veiculadoras de
bactérias, tais como as espécies Monomorium pharaonis, Tapinoma melanocephalum,
Paratrechina longicornis, Brachymyrmex sp, Camponotus sp., Solenopsis saevissima e
Crematogaster sp.
No início dos anos 90, houve um relato da ocorrência de formigas carregando
bactérias em unidades pediátricas em hospitais em Trinidad (CHADEE & MAITRE, 1990).
Nessa pesquisa foram encontradas quatro espécies de formigas: Monomorium pharaonis,
Tapinoma sessile, Solenopsis sp. e Solenopsis molestus carreando sete tipos de agentes
conhecidos como patógenos humanos.
No Brasil, o primeiro estudo foi realizado em hospitais da região sudeste (FOWLER
et al., 1993), onde foram encontradas 14 espécies de formigas, carreando várias espécies
conhecidas como patógenos humanos, incluindo o gênero Staphylococcus. Nesse estudo, os
autores destacam a alta prevalência de Tapinoma melanocephalum no ambiente hospitalar e
o potencial da espécie como carreadora de bactérias.
Em outro estudo, realizado por Peçanha (2000), no conjunto hospitalar de Sorocaba,
estado de São Paulo, as bactérias carreadas pelas formigas das espécies Tapinoma
melanocephalum, Paratrechina longicornis, Monomorium pharaonis, Brachymyrmex sp.,
Monomorium floricola, Camponotus sp. e Crematogaster sp. apresentaram níveis de
resistência quantitativamente e qualitativamente mais elevados que as bactérias recuperadas
do ambiente e ainda 66,7% das cepas isoladas eram Gram-negativas, indicando as formigas
como possíveis vias de dispersão de patógenos e de bactérias contendo genes de resistência,
dentro do ambiente hospitalar.
Recentemente, dois estudos realizados no Brasil também analisaram o perfil de
sensibilidade aos antimicrobianos de bactérias carreadas por formigas (MOREIRA et al.,
2005; RODOVALHO et al., 2007). No primeiro estudo, realizado no Rio de Janeiro, os
autores encontraram quatro espécies de formigas, sendo T. melanocephalum a mais
prevalente, carreando 21 espécies diferentes patógenos humanos, dentre esses
Acinetobacter, Streptococcus, Gemella e Klebsiella foram os gêneros de bactérias que
apresentaram resistência aos antibióticos testados. Em um segundo estudo, mais recente,
Rodovalho e colaboradores (2007), encontraram até mesmo Staphylococcus aureus
resistente a meticilina (MRSA), sendo carreados por formigas. Ainda não foram realizados
estudos que comprovem por meio de testes moleculares a presença de genes de resistência a
antimicrobianos ou responsáveis pela capacidade de formação de biofilmes nessas bactérias
carreadas por formigas, o que poderia dificultar o combate desses agentes causadores de
doenças no ambiente hospitalar.
1.3 Caracterização do gênero Staphylococcus:
Staphylococcus é derivado do grego, staphylé, que significa cacho de uva, referente
ao aspecto do grupo, quando visto ao microscópio. O gênero Staphylococcus pertence à
família Staphylococcaceae e compreende bactérias Gram-positivas, que apesar de não
apresentarem uma membrana externa, como as bactérias Gram-negativas, o qual confere
proteção contra o sistema imune e constitui uma barreira à entrada de algumas substâncias,
são compostas por uma parede formada por peptidoglicano mais espessa, quando
comparada às bactérias Gram-negativas, sendo essa parede menos susceptível a quebras
(TRABULSI & ALTERTHUM, 2005), permitindo uma maior proteção à impactos físicos
do ambiente. Possuem forma de cocos, com cerca de 1µm de diâmetro, são imóveis e
anaeróbias facultativas, ou seja, sobrevivem bem em presença de oxigênio, no ambiente ou
na pele do indivíduo colonizado e, ainda em regiões onde a concentração desse gás é
menor, como no interior do indivíduo. Crescem bem em elevadas concentrações de cloreto
de sódio (10%), resistindo à dessecação, podem conservar-se no ambiente por um período
maior. Crescem bem em temperaturas entre 35-37°C, semelhantes às condições do
organismo humano, também podem crescer em temperaturas entre 18°C a 40°C, o que
permite que também sobrevivam bem no ambiente. Produzem a enzima catalase, o que
confere a capacidade de degradação do peróxido de hidrogênio produzido pelo sistema
imune do hospedeiro contra as bactérias, facilitando a sobrevivência no indivíduo, e são
resistentes à bacitracina (0,04). Segundo Kloss & Bannerman (1999), o gênero possui 33
espécies descritas e entre estas, Staphylococcus aureus e as várias espécies do grupo dos
estafilococos coagulase-negativos (ECN).
Os estafilococos estão presentes na microbiota de indivíduos saudáveis e são
encontradas na pele, em diversas partes do corpo, fossas nasais e orofaringe de humanos
(LECLERCQ, 2009), são também encontrados em animais (STEPANOVÌC et al., 2001;
VAN DUIJKEREN et al., 2004). Os Staphylococcus são divididos em dois grupos
conforme a produção da enzima coagulase. Quando positivos podem ser identificados como
S. aureus, se provenientes de isolados clínicos humanos, e quando negativos como
pertencentes ao grupo dos ECN (KLOOS & BANNERMAN, 1999).
S. aureus é reconhecida como um dos patógenos humanos mais importantes,
responsável desde infecções na pele, até bacteremias, infecções no sistema nervoso central
e respiratório, trato urinário e infecções relacionadas a dispositivos implantáveis e
procedimentos cirúrgicos. A maioria das amostras de S. aureus é considerada patógeno
oportunista, que pode colonizar indivíduos sem sintomas, por curto ou longo período,
causando doenças quando da diminuição da resposta imune do indivíduo (OLIVEIRA et
al., 2002).
Os estafilococos coagulase-negativos (ECN) estão presentes normalmente na pele
humana e em mucosas que inclui boca e garganta e algumas espécies habitam locais
específicos, como trato urinário, região inguinal e perianal. As manifestações clínicas das
infecções por ECN são geralmente mais sutis e sem fulminantes sinais de infecção, quando
comparadas às provocadas por S. aureus. Essas infecções estão sempre relacionadas ao
comprometimento do sistema imune do hospedeiro, uso de dispositivos médicos ou
procedimentos invasivos e à capacidade de formação de biofilme, que permite à instalação
e permanência dessas bactérias em polímeros (PIETTE & VERSCHARAEGEN, 2009).
Esta prova, para a produção da coagulase, é rotineiramente usada para a
identificação dos Staphylococcus, todavia para a distinção entre as espécies do grupo dos
ECN é necessária uma série de provas bioquímicas, quase sempre não realizadas, que
poderiam direcionar melhor o tratamento quando envolvidas em infecções. Na realidade,
apesar de vários artigos tratarem da combinação de métodos para a identificação dos ECN,
esses métodos ainda são muito difíceis de executar, pelo grande número de provas e
representam um custo maior ao laboratório, devido aos vários reagentes requeridos para os
testes (ANTUNES et al., 2008; DE PAULIS et al, 2003; IEVEN et al., 1995).
Estão disponíveis comercialmente alguns testes para a identificação dos ECN, como
por exemplo o API ID 32 Staph, Vitek GPICard e o Vitek 2 System (bioMérieux, França),
American Microscan Pos Combo (Dade Behring, Alemanha) e Staph-Zym (Rosco,
Dinamarca). Esses testes possuem a vantagem de diminuir o tempo de identificação desses
microrganismos e a necessidade de preparo e execução de inúmeras baterias de testes, mas
além de representarem um alto custo financeiro, apresentam muitas vezes falhas na
identificação precisa das espécies de ECN (LIGOZZI et al., 2002).
As espécies de ECN mais freqüentemente isoladas de material clínico humano são
Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus lugdunensis, Staphylococcus saprophyticus,
Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus hominis, Staphylococcus warneri,
Staphylococcus schleiferi, Staphylococcus cohnii, Staphylococcus simulans,
Staphylococcus capitis e Staphylococcus xylosus (KLOOS & BANNERMAN, 1999).
ECN são os patógenos mais comumente relatados em infecções na corrente
sangüínea em pacientes em unidades de terapia intensiva nos EUA, representando 37,3%
das infecções e S. aureus 12,6% (NNIS, 1999). No Brasil, os ECN são o segundo patógeno
presente em infecções na corrente sangüínea (SADER et al., 2001). Essas taxas ilustram a
necessidade de pesquisas envolvendo esse grupo dos Staphylococcus, bem menos estudado
que a espécie S. aureus, para que se possa melhorar o conhecimento acerca da biologia,
mecanismos de patogenicidade e transmissão dessas bactérias, a fim de se desenvolver
formas mais eficientes de identificação e combate desses microrganismos.
1.3.1 Estafilococos coagulase-negativos (ECN):
Os ECN são identificados na rotina laboratorial pela não produção da enzima
coagulase, diferentemente dos S. aureus. Essa enzima confere a capacidade de coagulação
do plasma, protegendo a célula bacteriana contra o sistema imune do hospedeiro
(TRABULSI & ALTERTHUM, 2005). O grupo dos ECN possui várias espécies
causadoras de infecções em humanos e a variedade de espécies encontradas em amostras de
pacientes vem crescendo. As principais espécies causadoras de infecções em humanos
serão descritas nos itens a seguir.
1.3.1.1 Caracterização da espécie Staphylococcus epidermidis:
Staphylococcus epidermidis é o mais freqüente membro do grupo dos estafilococos
coagulase-negativo (ECN). Evans (1916) descreveu a espécie a partir de uma amostra
isolada do leite. Hugh & Ellis, em 1968, já recomendavam a prova da coagulase para a
diferenciação entre S. aureus e essa espécie. S. epidermidis é uma espécie muito relatada,
devido à alta prevalência em infecções em humanos. São responsáveis por 50% a 70% das
infecções em indivíduos fazendo uso de cateter e outros processos invasivos, acredita-se
que tal fato se deva a capacidade de formação de biofilme (ROGERS et al., 2009).
Na formação do biofilme, S. epidermidis tem nos genes icaADBC o potencial de
produção do polissacarídeo PIA (Polysaccharide Intercellular Adhesin), que protege às
células bacterianas da ação do sistema imune do hospedeiro e na proteína associada de
acumulação (Aap) o auxílio na fase de acumulação das células. Em acréscimo, as adesinas
conferem a aderência às proteínas do hospedeiro e aos biomateriais. As principais adesinas
encontradas em S. epidermidis são a Fbe(SdrG), ligante de fibrinogênio; a GehD e SdrF,
que se ligam ao colágeno; Ebp, que se liga à elastina e AtlE, que se liga a vitronectina na
matriz extracelular. Outras adesinas são capazes de se ligar a poliestireno (Ssp-1 e Ssp-2)
(ROGERS et al., 2009).
S. epidermidis também possui outros fatores de virulência como a produção de
peptidoglicanas, ácidos lipoteicóicos e modulinas fenol-solúveis que atuam na modulação
do sistema imune propiciando a dispersão do biofilme; a produção de exoenzimas e
proteases que provocam injúrias e destruição dos tecidos do hospedeiro; lipases que
auxiliam na colonização da pele e de lesões e algumas amostras também podem apresentar
δ-toxina, uma hemolisina que forma poros na membrana dos eritrócitos e outras células do
hospedeiro, levando à lise celular (ROGERS et al., 2009).
A maioria das infecções relacionadas a procedimentos invasivos em pacientes
submetidos à hemodiálise está relacionada ao gênero Staphylococcus e bacteremias
representam a maior causa de mortalidade em pacientes renais crônicos submetidos à
hemodiálise (HOEN et al., 1998). Abdulrahman et al. (2002) em estudo na Arábia Saudita,
com 109 infecções caudadas por cateter vascular em pacientes submetidos à hemodiálise,
encontrou que 49,5% das infecções foram causadas por S. epidermidis, já S. aureus,
sensíveis e resistentes à meticilina, somaram 18,4% das infecções. A maioria desses
pacientes apresentou, entre outras condições de risco, diabetes mellitus, lúpus eritematoso
sistêmico, doença crônica no fígado, recente ou longo período de terapia com esteróides e
pacientes com múltiplos mielomas.
A literatura relata ECN tradicionalmente como causadores de endocardites pela
implantação de prótese valvular, resultando em abscessos cardíacos, insuficiência cardíaca
e morte, mostrando-se tão agressiva quanto em endocardites causadas por S. aureus
(LALANI et al., 2006). Karchmer e colaboradores (1983) analisaram 75 episódios de
endocardites causadas por S. epidermidis e em 70,6% as cepas apresentaram resistência à
meticilina e em 55 pacientes provocaram invasão de tecidos e destruição da válvula. S.
epidermidis é também o maior causador de endocardites por implante de marca-passo e na
maioria dessas amostras são encontrados genes que mediam a formação de biofilme, como
fbe, atlE e ica (KLUG et al., 2003). Endocardite em válvula nativa também pode ser
causada por essa espécie. Chu et al. (2004) encontrou que dentre os 99 casos desse tipo de
endocardite causada por ECN, 85% das amostras foram identificadas como S. epidermidis.
A maioria das sepses de início tardio em neonatos é atribuída à S. epidermidis
(EFTEKHAR & SPEERT, 2009). A produção de biofilme é um importante fator na
ocorrência desse quadro. Em três estudos feitos em unidades de terapia intensiva (UTI)
neonatais na Inglaterra, no Canadá e na Noruega respectivamente, 40% das amostras foram
positivas para a presença do operon ica, 68,3% dos S. epidermidis também albergavam esse
operon e 71,09% o gene icaD (EFTEKHAR & SPEERT, 2009; KLINGENBERG et al.,
2007; DE SILVA et al., 2002).
Infecções na corrente sanguínea em pacientes adultos podem ser provocadas por
essa espécie. Estudos realizados com amostras de sangue de pacientes com septicemias
causadas por ECN apresentam S. epidermidis com prevalência entre 40% e 75% das
amostras isoladas (KOKSAL et al., 2007; BOISSON et al., 2002).
A endoftalmite pós-operatória é comumente associada à infecção por S.
epidermidis, que é a bactéria normalmente encontrada nos olhos e nos sacos conjuntivais
(ABU EL-ASRAR et al., 2000). Na implantação de lentes intraoculares ocorre infecção,
mesmo com o uso de soluções de antibióticos durante o procedimento cirúrgico. Nesses
casos, geralmente são cepas resistentes sendo necessária a remoção do implante, antes da
erradicação da infecção (KADRY et al., 2009).
1.3.1.2 Caracterização da espécie Staphylococcus lugdunensis:
A espécie Staphylococcus lugdunensis surgiu como nova espécie do grupo
estafilococos coagulase-negativos (ECN) em 1988, quando foi pela primeira vez descrita, a
partir de isolados clínicos humanos. Nesse estudo, S. lugdunensis foi isolada de onze
amostras de diversas origens, como abscessos, nódulo linfático, dreno torácico, intra-
uterina e a maioria de sangue (FRENEY et al., 1988). No nome da espécie S. lugdunensis,
“lugdunensis” significa, aquele que nasceu em “Lugdunum”, que é o nome em latim dado à
cidade de Lyon, na França, onde os primeiros organismos dessa espécie foram isolados.
Assim como outras espécies do grupo dos estafilococos coagulase-negativos (ECN),
essa espécie também faz parte da flora da pele de indivíduos saudáveis (HERCHLINE et
al., 1991). Estudos mostram que essa espécie é preferencialmente uma colonizadora da
região inguinal (VAN DER MEE-MARQUET et al., 2003; LUDLAM & PHILLIPS, 1989)
e é raramente encontrada na cavidade nasal de pacientes submetidos à hemodiálise
(KOZIOL-MONTEWKA et al., 2006).
Apesar de pertencer ao grupo dos ECN, S. lugdunensis possui um alto grau de
virulência e as infecções causadas por essa espécie se assemelham à severidade das
infecções causadas por S. aureus (FRANK et al., 2008). Esse fato acontece devido aos
diversos fatores de virulência que possui, tais como a produção de nuclease termoestável
(DNase), um glicocálix extracelular, lipases, hemolisinas e também são capazes de se ligar
à proteínas humanas como o colágeno e a fibronectina (ROGERS et al., 2009; HEBERT,
1990; MITCHELL et al., 2004). A produção de fator Clumping em S. lugdunensis, também
presente em S. aureus, que provoca a aglutinação das células bacterianas quando
mergulhadas em plasma, é questionada em estudos que mostram que nem todos os isolados
em plasma humano dessa espécie são fator Clumping positivo e algumas amostras, mesmo
quando testadas em plasma humano e em diferentes kits comerciais ainda continuam
apresentando resultado negativo para produção de fator Clumping (FLEURETTE et al.,
1989; PAULSSON et al., 1993).
Outra particularidade ao qual também pode se atribuir a virulência dessa espécie, é a
capacidade de produção da proteína de ligação ao fator de von Willebrand. O fator de von
Willebrand evita a degradação do fator VIII da coagulação e age na adesão das plaquetas ao
endotélio. A proteína de ligação a esse fator não permite a ligação entre às plaquetas e o
endotélio lesado (NILSSON et al., 2004).
S. lugdunensis possui características bioquímicas que permitem sua identificação,
como a susceptibilidade à novobiocina, a descarboxilação da ornitina, o crescimento em
anaerobiose e a produção de ácidos a partir da manose, maltose e trealose, porém não
produção de ácidos em meio contendo xilose (BANNERMAN & PEACOCK, 2007).
A endocardite por essa espécie é bastante agressiva. Os relatos ocorridos quase
sempre são seguidos de procedimentos cirúrgicos ou lesão na região pélvica (PATEL et al.,
2000). Dentre os ECN, S. lugdunensis é a segunda espécie que mais causa endocardite de
válvula nativa, sendo responsável por 44% dos casos (JONES et al., 2002). Em estudo feito
por Anguera et al. (2005), com amostras de S. lugdunensis, as taxas de mortalidade por
endocardite em prótese valvular foram de 78%, o índice por endocardite de válvula nativa
foi de 42% dos casos e de 14% entre as endocardites associadas a implantes de marcapasso.
Infecções em ossos e articulações, sobretudo relacionadas a próteses têm sido
relatadas em S. lugdunensis (SAMPATHKUMAR et al., 2000; WEIGHTMAN et al., 2000;
ARCIOLA et al., 2006). Sampathkumar et al. (2000) constatou que infecções em próteses
localizadas em articulações podem ocorrer a partir de 6 semanas e em até 4 anos após o
implante.
Outros tipos de infecções por S. lugdunensis também já foram relatadas, porém bem
menos freqüentes, como meningites, infecções no sistema nervoso central, infecções no
trato urinário, peritonites, bacteremia, infecções na corrente sangüínea e na cavidade oral
(KAABIA et al., 2002;GIANELLA et al., 2006; CASANOVA-ROMAN et al., 2004;
SCHNITZLER et al., 1998; EBRIGHT et al., 2004; PFALLER et al., 1999; YOU et al.,
1999).
1.3.1.3 Caracterização da espécie Staphylococcus saprophyticus:
Fairbrother (1940) sugeriu o termo Staphylococcus saprophyticus para designar
alguns isolados de humanos e animais, coagulase negativos e não fermentadores de
manitol. Shaw et al. (1951), após análise de amostras de estafilococos das mais variadas
origens (humana, animal, alimento e coleções de culturas de laboratórios), reclassificou
como S. saprophyticus algumas amostras com características semelhantes às amostras do
estudo anterior, corroborando com àquele trabalho.
Essa espécie é resistente à novobiocina (5µg), produz a enzima urease, cresce em
anaerobiose e produz ácidos a partir da maltose e da trealose. São parte da flora comensal
da pele e mucosa urogenital humana (ISHIHARA et al., 2001). Sendo uma freqüente causa
de infecções no trato urinário, principalmente em mulheres (WIDERSTRÖM et al., 2007;
JORDAN et al., 1980; LATHAM et al., 1983; HOVELIUS & MARDH, 1984).
Com o objetivo de elucidar a uropatogênese dessa espécie, em 2005 foi seqüenciado
o genoma completo de S. saprophyticus (ATCC 15305). Os resultados revelaram que é
muito menor a presença de fatores de virulência, quando comparadas à S. epidermidis e S.
aureus, porém o genoma de S. saprophyticus revela dois mecanismos principais de
virulência: a presença de proteínas que se aderem à parede das células e um sistema de
transporte relacionado à concentração de íons na urina (KURODA et al., 2005). Uma
dessas proteínas é uma adesina específica UafA (uro-adherence factor A adesin), que está
associada a aderência às células do trato urinário, proteínas da família dos NRAMP
(natural-resistance-associated macrophage protein), que estão envolvidas no transporte de
metais divalentes, outras famílias de proteínas envolvidas na tolerância alcalina, captando
prótons que auxiliam na homeostasia do pH intracelular (KURODA et al., 2005).
A formação de biofilme também é um fator de virulência dessa espécie. Hjelm &
Lundell-Etherden (1991) constataram a produção de slime em 30% das amostras de S.
saprophyticus coletadas da urina de pacientes com infecção. Também relataram que quanto
maior a concentração de uréia na urina, maior a produção de slime, porém fatores como a
concentração de ferro, pH ou a presença de hormônios sexuais não exerceram efeito nessa
produção.
A razão pela qual ocorre um grande número de infecções no trato urinário de
mulheres é desconhecida. Acredita-se que por S. saprophyticus estar muito distribuído no
ecossistema, a contaminação de diversos gêneros alimentícios possa propiciar a
colonização do trato gastrointestinal, que por sua vez parece estar associada à colonização
retal, vaginal e uretral (ORDEN-MARTINÉZ et al., 2008). Infecções no trato urinário em
mulheres têm sido mais documentadas no hemisfério norte, onde a prevalência de
colonização e infecção é freqüente durante o final do verão e no outono (WIDERSTRÖM
et al., 2007). Não há um consenso entre a média de idade das mulheres infectadas, porém a
maioria dos estudos relata o intervalo entre 13 e 40 anos (GUPTA et al., 1999;
SCHNEIDER & RILEY, 1996). Infecções no trato urinário também podem ocorrer em
crianças e em homens de todas as idades (ABRAHAMSSON et al., 1993; HOVELIUS et
al., 1984), além de pacientes com insuficiência renal crônica (GILBERT, 2006).
Embora menos freqüente, quando comparada a outras espécies de estafilococos
coagulase-negativo, pode ser encontrada em amostras de sangue de pacientes com
septicemia (KOKSAL et al., 2007). Choi et al. (2006), em estudo com S. saprophyticus
encontrados em amostras de sangue, observou que 30% dos isolados provocaram
bacteremia, resultando em morte de um dos pacientes que já apresentava leucemia mielóide
crônica.
S. saprophyticus pode, em casos mais raros, causar septicemia, pielonefrite e
endocardite (GLIMAKER et al., 1988; HEDMAN & RINGERTZ, 1991; GARDUNO et
al., 2005).
1.3.1.4. Outras espécies de ECN:
Staphylococcus hominis, juntamente com as espécies Staphylococcus warneri,
Staphylococcus capitis e Staphylococcus simulans foram descritas em 1975, a partir de
amostras da pele de indivíduos saudáveis na América do norte (KLOOS & SCHLEIFER,
1975). Essa espécie possui duas subsespécies de importância médica: Staphylococcus
hominis subespécie hominis e S. hominis subespécie novobiosepticus. As duas espécies
podem ser diferenciadas pela resistência à novobiocina apresentada somente por S. hominis
novobiosepticus e a produção de ácidos a partir da trealose apresentada somente por S.
hominis hominis. Não são espécies comumente implicadas em infecções graves, S. hominis
novobiosepticos já foi isolada da corrente sanguínea (KLOSS et al., 1998; PALAZZO et al.,
2008). Chaves et al. (2005) encontrou bacteremia causada por S. hominis novobiosepticos
em 13 neonatos em unidade de terapia intensiva (UTI), porém com nenhuma morte
relacionada à essa bactéria. A espécie S. hominis hominis é citada como presente em
amostras de cultura de sangue (KOKSAL et al., 2007; DE SILVA et al., 2002) e em
pacientes em contínua diálise peritonial (MONSEN et al., 2000). Em 2005, houve o
primeiro relato, nos EUA, dessa espécie causando endoftalmite (IYER et al., 2005). No ano
seguinte, apareceu, na Espanha, uma paciente de 73 anos, sem histórico de internação
hospitalar, apresentando dor na parte dorsal da área glútea esquerda, onde se constataram
piomiosite, sacroleíte e espondilodiscite, três inflamações que acometem a coluna vertebral
(RODRÍGUÉZ & MUÑOZ, 2006). Apesar de não ser freqüente, um estudo com 99 casos
de endocardites de válvula nativa, relatou apenas 4 desses casos como sendo provocados
por S. hominis (CHU et al., 2004). Em outro relato de endocardite por S. hominis foi
descrito recentemente, em uma paciente de meia idade que se recuperou, sendo tratada com
vancomicina (CUNHA et al., 2007).
S. haemolyticus é a segunda espécie dentre os ECN de maior importância clínica,
atrás apenas dos S. epidermidis (RODRÍGUEZ-ARANDA et al., 2009). O genoma dessa
espécie foi completamente seqüenciado em 2005, foram encontradas algumas seqüências
específicas de genes que conferem adaptação ao organismo do hospedeiro e a variações
ambientais, como, por exemplo, regiões no genoma responsáveis pelo transporte em
cápsula de aminotransferases e reguladores transcricionais (TAKEUCHI et al., 2005). Foi a
primeira espécie dentre os ECN a apresentar resistência à glicopeptídeos e à nova classe de
antibióticos oxazolidinonas (linezolide), sendo descrita como uma espécie associada à
resistência aos antimicrobianos (BIVASCO et al., 2000; TARAZONA et al., 2007; NUNES
et al., 2005). Causam bacteremias, sendo encontradas no sangue de indivíduos
imunocomprometidos que fizeram uso de cateter (NUNES et al., 2005; RODRÍGUEZ-
ARANDA et al., 2009). Foram isoladas de infecções no trato urinário e de endocardites por
prótese de válvula, porém sempre associados à pacientes hospitalizados ou indivíduos de
idade avançada (SHIGEMURA et al., 2009; SENINING et al., 2000).
O nome da espécie S. schleiferi é uma homenagem ao pesquisador Karl Heinz
Schleifer, pela contribuição dada à taxonomia dos organismos Gram-positivos. No primeiro
relato que descreveu a espécie, em 1988, S. schleiferi foi encontrada em doze amostras
clínicas de humanos isoladas de cateter jugular, dreno cranial, urina, lesões na pele e a
maioria do sangue (FRENEY et al., 1988). Dentre outras características, são produtoras da
enzima catalase, resistentes à bacitratina, sensíveis à novobiocina, não descarboxilam a
ornitina, não hidrolisa uréia, produzem ácidos a partir da manose e não produzem ácidos a
partir da maltose, manitol e xilose (BANNERMAN & PEACOCK, 2007). Ainda nesse
primeiro relato foram encontrados S. schleiferi possuindo antígenos, a4a5 e i1i2, presentes
também em S. aureus (FRENEY et al., 1988). É citada em muitos estudos de interesse
veterinário, como causador de otitis e pioderma (MAY et al., 2005). Em humanos, essa
espécie pode estar presente na flora periaxilar (CÉLARD et al., 1997). O primeiro relato de
endocardite ocorreu somente em 1999 (LEUNG et al., 1999), osteomielites, em sangue de
pacientes com septicemia, infecções no trato urinário e em implantes ortopédicos, causadas
por essa espécie tem sido relatadas (CALVO et al., 2000; KOKSAL et al., 2007).
S. warneri, S. capitis e S. simulans são espécies que podem ser a causa de
endocardites (STÖLLBERGER et al., 2006; NALMAS et al., 2008; LAMAS & EYKYN,
2000). Em 2004, foram publicados dois relados de discite e spondilodiscite, doenças que
geram inflamações na coluna vertebral, tendo como causa infecção por S. warneri
(ANNOUN et al., 2004). Cone et al. (2005) relata um caso de endocardite causada por S.
capitis e compara-os com mais 13 casos anteriores acometendo pacientes entre 35 e 80
anos, dois deles resultaram em morte por complicações neurológicas e por falência múltipla
dos órgãos.
S. cohnii é uma espécie pouco relatada na literatura relacionada a infecções em
humanos. Szewczyk et al. (2004) encontrou S. cohnii ssp. cohnii e S. cohnii ssp. urealyticus
com múltipla resistência à antibióticos colonizando o ambiente de uma unidade de terapia
intensiva (UTI) de um hospital pediátrico, porém não foi relatado nenhum caso de infecção
por essa espécie. Recentemente, houve o relato de quatro pacientes na Grécia com
bacteremia, no qual a cultura de sangue apresentou resultado positivo para S. cohnii
resistente à linezolide, porém nenhum deles com morte relacionada à infecção por essa
espécie (PETINAKI et al., 2009).
Apesar de já ter sido relatada em cultura de sangue de pacientes com bacteremia
(KOKSAL et al., 2007), S. xylosus não tem sido documentada em infecções humanas
graves, sendo uma espécie mais estudada por suas contribuições na indústria de alimentos
(SØNDERGAARD & STAHNKE, 2002).
1.3.2. Resistência aos antimicrobianos:
O primeiro experimento usando penicilina como agente antimicrobiano aconteceu
ainda em 1940, quando um indivíduo acometido por uma celulite foi tratado com uma
preparação experimental de penicilina, porém essa não promoveu um efeito de cura como
esperado, o paciente faleceu e nas amostras foram encontrados S. aureus e Streptococcus
pyogenes (ABRAHAM et al., 1941). Após esse fato, em 1944 a penicilina foi difundida
para o combate às infecções, porém já em 1946, entre os S. aureus, 6% já apresentavam
resistência ao antibiótico, pela produção de β-lactamase. Essa resistência aumentou e hoje
entre 80-90% das amostras de infecções por S. aureus são resistentes à penicilina
(HENWOOD et al., 2000).
As penicilinas são antibióticos β-lactâmicos, que interferem nas ligações cruzadas
entre as cadeias de peptidoglicano, que acontece na região externa à membrana
citoplasmática. Além disso, as penicilinas ao se ligarem à PBP (proteína de ligação à
penicilina), na parede externa da membrana citoplasmática, também são capazes de
provocar um aumento na atividade das autolisinas, gerando um desequilíbrio na síntese da
camada de peptidoglicano, resultando na lise da célula bacteriana (TRABULSI &
ALTERTHUM, 2005). O gene blaZ codifica uma enzima, a β-lactamase, que é capaz de
hidrolisar o anel β-lactâmico da penicilina, tornando-a inativa. Essa enzima confere a
resistência à penicilina, que pode ter sido adquirida através da aquisição de um plasmídio
albergando o gene blaZ. Na síntese da β-lactamase atuam dois reguladores, o anti-repressor
blaR1 e o repressor blaI, que codificam as respectivas proteínas BlaR1 e BlaI. Na ausência
do antibiótico, BlaI está ligada a região operadora impedindo a expressão de blaZ. Já na
presença de penicilina, a proteína transmembrânica BlaR1 sofre autoclivagem e atua como
protease, clivando BlaI em fragmentos inativos permitindo a transcrição de blaZ e a
produção da enzima β-lactamase (LOWRY, 2003).
Outros antibióticos naturais foram desenvolvidos após a penicilina, como a
eritromicina, a tetraciclina e o cloranfenicol, porém todos seguidos da emergência da
resistência a essas novas alternativas, sempre mediadas por plasmídeos e transposons
(LACEY, 1984). No início dos anos 60 surgiram as cefalosporinas, desenvolvidas pela
estabilidade à β-lactamase dos estafilococos e essa descoberta promoveu o surgimento de
outros antibióticos por via sintética, como a meticilina, nafcilina e oxacilinas, que por
possuírem uma maior quantidade do grupo 6’acetil, impedem estericamente o ataque ao
anel β-lactâmico (LIVERMORE, 2000).
Apesar do sucesso no uso dos antibióticos sintéticos, ainda no início dos anos 60
surgiu o primeiro caso de resistência à meticilina (JEVONS, 1961) e no final dos anos 60 a
expansão dessa resistência já era uma preocupação (BENNER & KAYSER, 1968). A
resistência à meticilina é condicionada à expressão do gene mecA, esse gene faz parte de
um elemento genético SCCmec (Staphylococcal Chromosome Cassette mec), cassete
cromossômico estafilocócico mec, que é um elemento genético móvel que pode conter
estruturas genéticas que conferem resistência à antibióticos que não β-lactâmicos, como por
exemplo os elementos Tn554 e pT181 que codificam respectivamente resistência à
ampicilina e à tetraciclina (WIELDERS et al., 2002; ITO & HIRAMATSU, 1998). O gene
mecA codifica a proteína PBP2a, que é determinante na resistência à meticilina. Os
Staphylococcus normalmente sintetizam proteínas que possuem afinidade à β-lactâmicos,
conhecidas como PBP, proteína de ligação à penicilina, sendo essas a PBP1, PBP2, PBP3,
PBP3’ e PBP4, que exercem função de transpeptidases na fase final da síntese do
peptidoglicano. As amostras resistentes à meticilina possuem uma proteína a mais, a PBP2a
que tem baixa afinidade aos β-lactâmicos e permitem que a bactéria sobreviva em meio à
esse agente antimicrobiano. A regulação da expressão do gene do gene mecA é semelhante
a regulação do gene blaZ, que confere resistência à penicilina, porém seus genes
reguladores são mecR1 e mecI, que codificam as proteínas MecR1 e MecI (CHAMBERS,
1997).
O antibióticos oxacilina e cefoxitina são dois antibióticos recomendados pelo CLSI
(Clinical and Laboratory Standards Institute), que padroniza procedimentos clínicos e
laboratoriais, como indicadores fenotípicos da resistência mediada pelo gene mecA
(SWENSON et al., 2005). Em estudo realizado pelo SENTRY-USA (Antimicrobial
Surveillance Program), programa de vigilância antimicrobiana, com amostras oriundas de
diversos sítios de infecção e coletadas em hospitais brasileiros, a taxa de resistência à
oxacilina em S. aureus foi de 34% e em Staphylococcus do grupo coagulase-negativo foi de
80.1% (SADER et al., 2001).
Logo após o surgimento da resistência à penicilina, nos anos 50, foi isolado o
primeiro antibiótico glicopeptídeo, a vancomicina (BIVASCO et al., 2000). Esse antibiótico
surgiu como uma alternativa à terapia contra os Staphylococcus, porém seu uso foi
desencorajado devido à toxicidade e reações adversas por sua administração, sendo
substituída pela meticilina e pelas cefalosporinas (WOODLEY & HALL, 1961).
O interesse no uso da vancomicina voltou no final da década de 70 quando da
emergência de infecções hospitalares em pacientes imunocomprometidos e o crescimento
das infecções causadas por bactérias gram-positivas, aliadas à melhoria na formulação da
vancomicina, tornando-a menos tóxica (BIVASCO et al., 2000). Também nesse mesmo
período, a indústria farmacêutica desenvolveu um novo antibiótico glicopeptídeo, a
teicoplanina (PARENTI et al., 1978). Entretanto, no final da década seguinte houve o
primeiro caso de resistência à classe dos glicopeptídeos, foi uma resistência à teicoplanina,
em uma amostra de Staphylococcus haemolyticus (WILSON & O’HARE, 1986). No final
da década de 90, a primeira cepa de S. aureus com susceptibilidade reduzida à vancomicina
foi encontrada no Japão (HIRAMATSU et al., 1997).
Em Staphylococcus, a resistência a glicopeptídeos é condicionada principalmente
pela presença do gene vanA, que induz a resistência em várias concentrações de
vancomicina e teicoplanina e do gene vanB, que induz a resistência em várias
concentrações apenas de vancomicina. Essa resistência é gerada pela modificação na
síntese do dipeptídeo D-Ala D-Ala para D-Ala D-Lac, na qual o aminoácido terminal D-
alanina é modificado para D-lactato, o que gera a síntese de peptidioglicano com baixa
afinidade por glicopeptídeos (PÉRICHON & COURVALIN, 2004; SRINIVASAN et al.,
2002).
O percentual de susceptibilidade do grupo ECN a diversos antibióticos foi
recentemente analisada em um estudo que fez um comparativo entre as pesquisas mais
recentes sobre esses índices, realizadas em diversos continentes (PIETTE &
VERSCHRAEGEN, 2009). Na Espanha, por exemplo, houve um aumento progressivo da
resistência à ciprofloxacina e à eritromicina, que aumentaram de 1% e 41% em 1986, para
45% e 63% em 2002 (CUEVAS et al., 2004). Por outro lado, na Europa em geral, Ásia,
Austrália e América Latina, as taxas de susceptibilidade à fluoquinolonas estão entre 42-
47%, à eritromicina entre 30-34%, à clindamicina entre 60-61%, à sulfametoxazol-
trimetoprim entre 59-62% e a gentamicina entre 71-58% (JONES et al., 2007a; JONES et
al., 2007b). Todos os estudos exibiram índices entre 65-100% de susceptibilidade à
teicoplanina e entre 98-100% de susceptibilidade à vancomicina e linezolide (PIETTE &
VERSCHRAEGEN, 2009).
1.3.3. Produção de Biofilme:
Eiff e colaboradores (2002) definem a produção de biofilme como a habilidade de
uma espécie de colonizar a superfície de um polímero pela formação de várias camadas de
células. Mah & O’Toole (2001) definem o biofilme como a união de microrganismos
unicelulares na formação de uma comunidade aderida à superfície de um sólido e revestida
de uma matriz polissacarídica. Essa capacidade de colonização de materiais poliméricos
pode originar a instalação de patógenos em instrumentos médicos dos mais diversos, como
cateteres e dispositivos implantáveis, que por sua vez podem contaminar pacientes que se
submetem a procedimentos invasivos (ARAÚJO et al., 2006).
A formação do biofilme é um fator de virulência que tem um enorme impacto nas
infecções hospitalares. Uma pesquisa realizada em hospitais dos EUA mostrou que os
biofilmes estão associados a 65% das infecções nosocomiais e que o tratamento dessas
infecções pela formação do biofilme gera um ônus de mais de um bilhão de dólares
anualmente a esse país (MAH & O’TOOLE, 2001; ARCHIBALD & GAYNES, 1997).
A produção de biofilme por estafilococos coagulase-negativo (ECN) tem sido
bastante pesquisada, sobretudo em Staphylococcus epidermidis e todos os estudos definem
duas etapas de formação: a primeira é a etapa de adesão das células bacterianas à superfície
do polímero e a segunda a etapa de acumulação, onde ocorre a formação de múltiplas
camadas de células bacterianas (HEILMANN et al., 1996; GÖTZ, 2002; HALL-
STOODLEY & STOODLEY, 2005).
Na fase inicial, a aderência do microrganismo envolve interações físico-químicas,
como as forças de van der Waal’s e as interações hidrofóbicas, condicionadas às
características da superfície da célula bacteriana e à natureza do material polimérico.
Proteínas bacterianas da superfície auxiliam nessa fase inicial de aderência (EIFF et al.,
2002). SSP-1, proteína da superfície de Staphylococcus, (280kDa) e o produto de sua
degradação SSP-2 (250kDa), formam saliências na superfície da célula bacteriana e estão
relacionadas à adesão de S. epidermidis à poliestireno (VEENSTRA et al., 1996). AtlE é
uma proteína capaz de se conectar às superfícies inertes e apesar de seus mecanismos ainda
não estarem esclarecidos. Entretanto, uma mutação nesse proteína gera uma redução na
aderência primária ao poliestireno e uma redução in vitro da ligação à vitronectina,
glicoproteína humana presente no plasma e na matriz extracelular, e em adição a bactéria
não é capaz de produzir biofilme (HEILMANN et al., 1997).
Além dessas proteínas, ainda atuam na fase inicial de aderência a Bap, proteína
biofilme-associada, e o PS/A, polissacarídeo adesina-capsular. Em estafilococos que
albergam o gene bap (proteína Bap) é observada uma alta capacidade de aderência e forte
produção de biofilme e em um experimento realizado com ratos, a proteína Bap foi
importante na persistência da infecção (CUCARELLA et al., 2001). PS/A também tem sido
associada à aderência inicial, em um estudo realizado com endocardites em coelhos, foi
observado que um mutante deficiente para a produção de PS/A foi menos virulento
(SHIRO et al., 1994).
A segunda etapa de formação do biofilme envolve a multiplicação, adesão
intercelular e a formação de um material viscoso protetor. Nessa etapa, AAP (proteína
associada à acumulação) e a PIA (adesina polissacarídica intercelular) se destacam. A PIA
é um componente mais presente na composição do slime (do inglês, substância viscosa),
que é uma substância amorfa que realiza uma frouxa ligação entre as células de
estafilococos e as envolve, tendo como função a proteção daquelas células contra as
mudanças do ambiente (GÖTZ, 2002; CAFISO et al., 2004).
A PIA consiste em duas formas de polissacarídeos, um maior composto de linear β-
1,6- glucosaminoglicanas contendo resíduos N-acetilados, que formam 80% da estrutura da
PIA e um composto menor estruturalmente relacionado ao polissacarídeo maior, porém
com baixo conteúdo de resíduos N-acetilados (MACK et al., 1996). O operon ica codifica
as proteínas da biossíntese da PIA e é formado pelo gene icaR (regulatório) e pelos genes
icaADBC (biossíntese). As proteínas icaA, C e D estão localizadas em uma fração da
membrana, enquanto icaB está localizada no sobrenadante, no meio extracelular. Na
biossíntese da PIA, icaA e icaD sintetizam oligômeros derivados de N-acetilglicosamina até
alcançar um tamanho de 10 à 20 resíduos, icaC alonga a cadeia de oligômeros formados e
icaB está provavelmente relacionada às reações de desacetilação (GÖTZ, 2002).
Na etapa de acumulação do biofilme também é essencial a proteína extracelular
AAP (proteína associada à acumulação), essa proteína ancora a PIA à superfície das células
bacterianas. Em estudo feito com mutantes de S. epidermidis negativos para a produção de
AAP, verificou-se uma diminuição no crescimento acumulativo das células na superfície de
um polímero (HUSSIAN et al., 1997).
Outros componentes se configuram como importantes no processo de interação às
substâncias do hospedeiro. O ácido teicóico está envolvido na aderência de S. epidermidis à
fibronectina (HUSSAIN et al., 2001), assim como a proteína Aas que também se liga à
fibronectina e à células uroepiteliais em S. saprophyticus, a proteína Fbe atua na ligação de
S. epidermidis à β cadeia de fibrinogênio e outras substâncias, muitas delas ainda com
função desconhecida (EIFF et al., 2002).
No estágio final da formação do biofilme, as múltiplas células bacterianas são
capazes de escapar ou pela interrupção na produção do slime ou pela falta de condições do
ambiente que permitam a manutenção dessa estrutura, o que possibilita a migração dessas
células a novos sítios de colonização (MAH & O’TOOLE, 2001).
A adaptabilidade e resistência do biofilme às diversas condições do ambiente tem
sido alvo de pesquisas. Os mecanismos de resistência incluem barreiras físicas e químicas à
difusão e penetração dos antimicrobianos no biofilme e, a ativação de diferentes respostas à
presença de algumas substâncias no ambiente (MAH & O’TOOLE, 2001).
A limitação do transporte de antibióticos gerada por componentes do biofilme é
variável. Dunne et al. (1993), verificou que o biofilme formado S. epidermidis permitiu a
difusão de rifampicina e vancomicina, mostrando que esses antibióticos podiam penetrar
eficientemente. Recentemente, um estudo avaliou o impacto de 6 diferentes antibióticos, na
aderência de Staphylococcus aureus e Staphylococcus epidermidis à dispositivos médicos.
Rifampicina, daptomicina e linezolida foram eficazes na velocidade de erradicação da
aderência dos estafilococos, quando comparadas com vancomicina, gentamicina e
ceftriazona (EDMISTON et al., 2006).
A influência de diversas substâncias na formação de biofilme também tem sido
avaliada. Em pesquisa realizada com S. saprophyticus, foi constatado que quanto maior a
presença de uréia, maior a produção de slime (HJELM & LUNDELL-ETHERDEN, 1991).
Knoblock et al. (2001), observou que em S. epidermidis, o estresse gerado pela presença de
etanol no ambiente, induz a síntese de PIA (adesina polissacarídica intercelular), porém o
estresse gerado por NaCl, nem sempre estimula a síntese desse polissacarídeo, estando
condicionado à presença de alguns genes. Em 2009, em amostras de S. epidermidis isoladas
de neonatos, foi verificado um pico na formação de biofilme quando do acréscimo de 1%
de glicose no meio de cultura, mostrando que a glicose pode estimular esse processo
(EFTEKHAR & SPEERT, 2009).
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Avaliar a presença de formigas no Hospital Universitário Onofre Lopes (HUOL), na
Cidade do Natal /RN, e verificar o seu potencial como veiculadoras mecânicas de
bactérias do gênero Staphylococcus.
2.2 Objetivos Específicos
Determinar os gêneros e espécies de formigas presentes em ambiente do hospital
pesquisado;
Correlacionar a ocorrência das espécies de formigas com fatores abióticos locais ao
longo do ano, tais como temperatura, umidade do ar e pluviosidade;
Isolar e identificar bactérias do gênero Staphylococcus carreadas por formigas;
Analisar o perfil de sensibilidade dos Staphylococcus encontrados à diferentes
antibióticos.
Analisar as amostras que apresentarem resistência a múltiplos antimicrobianos
quanto à capacidade de produção de biofilme.
3 METODOLOGIA
3.1. Locais de coleta e realização do estudo:
O estudo foi realizado na Cidade do Natal, no Hospital Universitário Onofre Lopes
(HUOL) da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, onde as formigas foram
coletadas e armazenadas. O HUOL é um hospital geral de referência terciária no Estado do
Rio Grande do Norte que se integrou ao Sistema Único de Saúde (SUS) em 1988. Desde
então, além de suas funções típicas de Hospital Escola, desenvolve ações relevantes na
saúde pública estadual. Possui 200 leitos com diversas especialidades e uma UTI. Em 2008,
obteve em torno de 4.000 pacientes internados ao longo do ano. Os setores do hospital
avaliados nessa pesquisa foram: enfermarias (masculina e feminina), banco de sangue,
cozinha e lavanderia.
A análise entomológica dos exemplares coletados foi realizada no Laboratório de
Entomologia (LABENT), do Departamento de Microbiologia e Parasitologia - UFRN, com
a colaboração do Laboratório de Mirmecologia, localizado no Centro de Pesquisa do
Cacau, Comissão Executiva do Plano da Lavoura Cacaueira - CEPEC/CEPLAC, Itabuna-
BA.
No LabMed, Laboratório de Bacteriologia Médica, localizado no Departamento de
Microbiologia e Parasitologia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte – UFRN,
foram realizadas as análises microbiológicas. Este laboratório trabalhou em colaboração
com o Laboratório de Controle Biológico, da Faculdade de Farmácia, da Universidade
Federal Fluminense – UFF, Niterói-RJ.
3.2. Coleta e armazenamento das formigas:
As coletas ocorreram entre junho de 2007 e maio de 2008, a cada quinze dias, sendo
duas coletas por mês, uma coleta diurna no horário de 12h às 14h (SILVA & LOECK,
1999) e outra noturna, entre 18h e 30min e 20h, no intuito de se coletar espécies outras que
não estivessem presentes na coleta diurna.
Essas coletas foram manuais, com o uso de pedaços de algodão, pinças e luvas
estéreis. Nós adaptamos pedaços de algodão de aproximadamente 4 cm de diâmetro, que
foram embalados individualmente e esterilizados em autoclave, 15 min à 120°C,
juntamente com pinças. Após encontrar uma formiga, um pedaço de algodão era
desembalado e manuseado com uso de luvas estéreis. A captura foi realizada através de um
leve toque do algodão sobre o dorso da formiga, ao qual ficava aprisionada às fibras do
algodão, que era cuidadosamente dobrado e colocado em uma placa de Petri, previamente
esterilizada e identificada de acordo com o setor do hospital onde ocorreu a coleta. As
pinças estéreis também foram utilizadas em algumas situações onde o algodão não foi tão
eficiente. (BEATSON, 1972; MOREIRA et al., 2005). Ao serem coletadas, as formigas
eram levadas ao Laboratório de Microbiologia do HUOL, para que, com auxílio de um bico
de Bunsen e pinça estéril, fossem imersas em tubos contendo 3 mL de Caldo de caseína de
soja (TSB) (Difco, Sparks, MD, USA) suplementado com 7,5% de NaCl, que eram
tampados e levados ao Laboratório de Bacteriologia Médica (LabMed-UFRN), para as
análises microbiológicas.
A fim de se analisar a existência de alguma relação entre a presença de
determinadas espécies de formigas e variáveis climáticas, foram feitas, a cada coleta,
medições da temperatura e da umidade relativa do ar, por local de coleta do hospital
pesquisado.
3.2.1. Identificação das formigas:
Após 24h da coleta, as formigas foram removidas e armazenadas em álcool 70%
para posterior identificação.
No Laboratório de Entomologia (LABENT-UFRN), as formigas foram identificadas
com o auxílio de estereomicroscópio (Olympus®), em aumento de 40X. As chaves
sistemáticas utilizadas foram as de Bolton (1994) e Loureiro & Queiroz (1990).
Alguns exemplares foram enviados ao Laboratório de Mirmecologia
(CEPEC/CEPLAC) para a identificação ou confirmação da identificação em nível de
espécie.
3.3. Análise da presença de bactérias do gênero Staphylococcus:
Depois de imersas em caldo TSB (Difco, Sparks, MD, USA), suplementado com
7,5% de NaCl, as formigas foram levadas ao Laboratório de Bacteriologia Médica
(LabMed-UFRN) e colocadas em estufa bacteriológica por 24h à 35°C. Após esse período,
o crescimento bacteriano foi analisado como positivo pela presença de turvação no caldo, já
os tubos que não apresentaram turvação durante esse período permaneceram na estufa por
mais 24h, para confirmação do resultado e, quando da ausência de turvação após mais esse
período, descarte da amostra.
As amostras que apresentaram turvação, com auxílio de alça bacteriológica, tiveram
uma alçada retirada do caldo e semeada por esgotamento em placas de Petri contendo meio
seletivo Ágar Manitol Salgado (Merck, Germany), que é um meio seletivo utilizado no
isolamento de bactérias do gênero Staphylococcus, devido à quantidade elevada de sal em
sua composição. Essas placas foram incubadas em estufa bacteriológica por 24h em
temperatura de 35°C.
Havendo crescimento bacteriano no meio seletivo, retirou-se uma unidade
formadora de colônia (UFC) que, por esgotamento, foi semeada em placas de Petri
contendo Agar de caseína de soja (TSA) (Difco, Sparks, MD, USA) e foram incubadas por
24h, em estufa bacteriologia a 35°C. Após esse período, foram realizados esfregaços
corados pela técnica de coloração de Gram para análise do aspecto morfotintorial das
amostras. Aquelas que se apresentaram como cocos Gram-positivos, foram submetidas a
testes para a caracterização do gênero Staphylococcus.
3.3.1. Caracterização do Gênero Staphylococcus:
As amostras presuntivas do gênero Staphylococcus, foram submetidas a testes para
a diferenciação dessas amostras dos gêneros Micrococcus e Streptococcus, que consiste na
análise da susceptibilidade à bacitracina (0,04 UI) e na prova para a produção da enzima
catalase. A produção da enzima coagulase livre também foi analisada para diferenciação
entre Staphylococcus aureus e o grupo dos ECN (JANDA et al., 2001).
3.3.1.1. Susceptibilidade à Bacitracina:
Uma suspensão de 24 horas do microrganismo foi padronizada para uma turvação
equivalente a 0,5 da escala de MacFarland e, então, semeada de forma confluente sobre a
superfície de placas contendo ágar Mueller Hinton (Difco, Sparks, MD, USA), com o
auxílio de um “swab” estéril. Em seguida, aplicou-se um disco impregnado com bacitracina
(0,04 UI) sobre o inóculo. Após incubação por 24 horas a 35°C, foi verificada a presença
ou não de halo de inibição. Os estafilococos resistentes à bacitracina não apresentam halo
de inibição ou produzem um halo ≤ 10 mm (HOLT et al., 1994). A cepa de Staphylococcus
aureus ATCC 25923 foi utilizada como padrão para esta prova.
3.3.1.2. Prova da Catalase:
Este teste consiste em por sobre uma lâmina de microscopia uma gota de peróxido
de hidrogênio (água oxigenada a 3%) e algumas colônias do cultivo de 24 h em TSA
(Difco, Sparks, MD, USA). Os cultivos que demonstraram uma rápida e sustentada
produção de bolhas de gás ou efervescência foram considerados positivos para essa prova.
O controle positivo desse teste foi feito através de uma cepa padrão de Staphylococcus
aureus ATCC 25923.
3.3.1.3. Prova da Coagulase Livre:
Para a realização deste teste, uma porção de um cultivo de 24 horas em TSA (Difco,
Sparks, MD, USA) foi inoculada em tubo de ensaio contendo 0,4 mL (400 microlitros) de
plasma de coelho (Newprov Produtos para Laboratório Ltda, Paraná, Brasil) diluído em
solução salina estéril a 0,85%, de acordo com as orientações do fabricante. A seguir o tubo
foi incubado a 35°C em estufa bacteriológica e, durante os intervalos de 2, 4, 6, 8 e 24
horas foram feitas leituras deste teste. As amostras que apresentaram formação de coágulo
durante esse intervalo são presuntivas da espécie Staphylococcus aureus, já aquelas que
apresentaram resultados negativos para o teste são identificadas como estafilococos
coagulase-negativo (ECN) (JANDA et al., 2001). A cepa padrão de Staphylococcus aureus
ATCC 25923 foi utilizada como controle positivo e a cepa Staphylococcus epidermidis
ATCC 12228 como controle negativo para essa prova.
3.3.2. Caracterização das espécies do grupo dos estafilococos coagulase-negativo:
A caracterização das amostras de ECN foi realizada conforme o modelo
simplificado empregado por Kloss & Bannerman (1999) (Tabela 1). Essa caracterização
fisiológica consiste nos testes mencionados abaixo.
TABELA 1: Modelo para identificação de Staphylococcus coagulase-negativo segundo
Kloos & Bannerman (1999).
Produção de ácidos a partir
de: ESPÉCIES NOV URE ORN ANAER PYR
MAL MAN XIL TM
S. epidermidis S + V + - + (+) - -
S. saprophyticus R + - + - + - - +
S. capitis capitis S - - (+) - - + - +
S. saccharolyticus S ND ND + V - (+) - -
S. capitis urealyticus S + - (+) (d) + + - +
S. warneri S ND - + - (+) - - +
S. hominis hominis S + - - - + - - V
S. hominis novobiosepticus R + - - - + - - -
S. schleiferi S - - + + - + - V
S. haemolyticus S - - (+) + + - - +
S. lugdunensis S d + + + + + - +
S. cohnii cohnii R - - (+) - (d) (d) - V
S. cohnii urealiticum R + - (+) d (+) + - +
S. xylosus R + - + d + + + +
S. simulans S + - + + (±) d - +
NOV: susceptibilidade a novobiocina; URE: produção de urease; ORN: descaboxilação da ornitina; ANAER:
crescimento em anaerobiose; PYR: produção de pirrolidonilaril-amilase; MAL: maltose; MAN: manose; TM:
trealose-manitol. +: reação positiva; (+): reação positiva tardia; - reação negativa; V: reação variável; ND: não
determinado; R: resistente; S: sensível; (d): 11% a 89% das amostras positivas. Adaptado de Kloos &
Bannerman, 1999.
3.3.2.1. Susceptibilidade à novobiocina:
Uma suspensão de 24 horas da amostra, padronizada para uma turvação equivalente
a 0,5 da escala de MacFarland em solução salina estéril a 0,85%, foi semeada de forma
confluente sobre a superfície de uma placa de Petri contendo Ágar Mueller Hinton (Difco,
Sparks, MD, USA), com auxílio de um “swab” estéril. Em seguida, foi depositado sobre o
meio de cultura um disco impregnado com 5µg de novobiocina, permanecendo incubado
por 24h, à 35ºC em estufa bacteriológica. Os microrganismos resistentes apresentaram
halos de inibição ≤ 16 mm. Como controles para esse teste foram utilizadas amostras
padrão das espécies Staphylococcus saprophyticus ATCC 15305 (resistente à novobiocina)
e Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 (sensível à novobiocina).
3.3.2.2. Produção da enzima urease:
Em tubos contendo 2 mL de Caldo de Uréia (Difco, Sparks, MD, USA) foram
inoculadas algumas colônias bacterianas, mantidas em aerobiose, à 35ºC, por 24h em estufa
bacteriológica. A mudança na coloração do meio de tom alaranjado para rosado é indicativo
da liberação de amônia, com alteração de pH. A amostra padrão Staphylococcus
epidermidis ATCC 12228 foi utilizada como controle positivo para o teste.
3.3.2.3. Descarboxilação da Ornitina:
Nesse teste foi adicionado à 3 mL do meio Möeller Descarboxilase (Difco, Sparks,
MD, USA) acrescido de 1% de L-ornitina, um inoculo denso da amostra. Amostras dos
estafilococos também foram inoculadas em meio Möeller Descarboxilase sem o acréscimo
do aminoácido. Esses tubos foram cobertos por uma camada de 4 mm de óleo mineral
estéril e incubados à 35ºC, por um período entre 18h e 24h. Os resultados foram
considerados positivos, quando da mudança de coloração para violeta no meio em que
continha L-ornitina. A cepa Shigella sonnei BAC 447 foi usada como controle positivo e a
cepa Staphylococcus saprophyticcus ATCC 15305 como controle negativo para o teste.
3.3.2.4. Crescimento em anaerobiose:
Amostras em suspensão de 24h foram padronizadas para uma turvação equivalente
a 0,5 da escala de MacFarland em solução salina estéril a 0,85%, sendo uma alíquota de 0,1
mL inoculada em meio Tioglicolato (Difco Laboratories, Detroit, MI, USA), à 35ºC, por
24h em estufa bacteriológica. Em até 5 dias, havendo crescimento bacteriano no terço
inferior da coluna de meio, a amostra é considerada como positiva para o teste. A cepa
Staphylococcus epidermidis ATCC 122280 foi usada como controle positivo para o teste.
3.3.2.5. Teste da hidrólise de L-pirrolidonil-β-naftilamida (PYR):
Discos contendo substrato PYR (Probac do Brasil, São Paulo, SP, Brasil) foram
colocados sobre um crescimento recente em Agar de caseína de soja (TSA). Após
incubação por 4h, à 35ºC uma gota do reagente PYR (fornecido pelo fabricante) foi
instilada sobre o disco. Após o intervalo de um minuto as amostras positivas apresentaram
coloração vermelho-cereja no disco e amostras negativas para hidrólise do PYR exibiram
coloração amarela. Esse teste se faz necessário na diferenciação das espécies
Staphylococcus warneri, que é negativa para o teste e Staphylococcus simulans, que é
positiva.
3.3.2.6. Produção de ácidos a partir da utilização de açúcares:
As amostras bacterianas foram inoculadas em 3 mL do meio Purple Broth (Difco,
Sparks, MD, USA) contendo 1% de maltose, manose ou xilose. Os tubos foram incubados
em banho maria à 36ºC, por 18-24h. Paralelamente, foi realizada outra prova contendo 2%
de trealose e manitol em um mesmo teste. Os testes foram considerados positivos quando
da mudança de coloração de púrpura para amarelo, devido à alteração de pH, em
conseqüência da degradação dos açúcares adicionados no meio. As cepas Staphylococcus
xylosus ATCC 25591, Staphylococcus saprophyticus ATCC 15305 e Staphylococcus
epidermidis ATCC 12228 foram os controles positivos dos testes da degradação de xilose,
manose, trealose-manitol e maltose, respectivamente.
3.4. Perfil de Susceptibilidade aos antimicrobianos:
As amostras de Staphylococcus foram submetidas a testes de susceptibilidade aos
antimicrobianos. Foram testados 12 antimicrobianos através da técnica de disco-difusão,
que consiste na coleta de uma suspensão de 24 horas do microrganismo, padronizada para
uma turvação equivalente a 0,5 da escala de MacFarland em solução salina estéril a 0,85%
e, semeio de forma confluente com o auxílio de um “swab” estéril, sobre a superfície de
placas de Petri contendo Ágar Mueller Hinton (Difco, Sparks, MD, USA) que, em seguida,
recebe discos impregnados com antibióticos aplicados sobre o semeio. Após a incubação
por 24 horas a 35°C, verificou-se a presença ou não de halo de inibição e foi feita a medida
do mesmo, se presente, para posterior comparação com os parâmetros do CLSI (2008). Os
antibióticos utilizados foram: penicilina G (10U), oxalicina (1µg), cefoxitina (30µg),
vancomicina (30µg), ciprofloxacina (5µg), eritromicina (15µg), sulfametoxazol-trimetoprin
(23,75µg-1,25µg), clorafenicol (30µg), gentamicina (10µg), tetraciclina (30µg),
rifampicina (5µg) e clindamicina (2µg).
3.4.1. Teste de difusão de meticilina em agar:
As amostras que apresentaram resistência à oxalicina (1µg) e cefoxitina (30µg)
foram submetidas ao teste fenotípico para a detecção da resistência à meticilina. Nesse
teste, colônias da amostra foram inoculadas em 2 mL de TSB (Difco, Sparks, MD, USA) e
submetidas à agitação de 200 rpm, em um aparelho “shaker”, por 18h a 35°C. Após esse
período 100 µL do inóculo foram espalhados de forma confluente, com um “swab” estéril,
sob a superfície de uma placa de Petri contendo TSA acrescido de 25mg/L de meticilina.
Qualquer crescimento, após incubação entre 24h à 48h, a 35°C, foi interpretado como uma
indicação da resistência à meticilina, sendo a amostra possível portadora do gene mecA.
3.5. Detecção da produção de PBP2a (proteína de ligação à penicilina 2a):
As amostras que apresentaram resistência à meticilina, no teste fenotípico de
difusão da meticilina em agar, foram submetidas ao teste para a detecção da proteína
PBP2a, que também é produto da expressão do gene mecA, que confere resistência a esse
antibiótico. Esse teste foi realizado através do Kit Slidex MRSA detection (bioMérieux,
Marcy l'Etoile, France) e se baseia na aglutinação de partículas de látex sintéticas contendo
articorpos monoclonais contra a PBP2a.
O teste consiste nos seguintes procedimentos, como indicado pelo fabricante: Em
cultivo de 24h, a 35°C em TSA (Difco, Sparks, MD, USA), retira-se 3 alçadas contendo
várias colônias isoladas até formar uma placa que cubra todo o orifício da alça de platina
com volume de 1µL, coloca-se essas três alçadas dentro de um tubo do tipo Eppendorff,
contendo 4 gotas do reagente de extração1. Esse tubo é levado à temperatura entre 95°C e
100°C por 3 minutos e depois é retirado e deixado arrefecer em temperatura ambiente.
Após o resfriamento, é adicionada uma gota do reagente de extração 2 e o tubo é levado à
centrífuga à 3000 rpm, durante 5 minutos. Em uma placa de fundo escuro são postas 50µL
do centrifugado e adiciona-se uma gota do látex sensibilizado, após leve mistura por alguns
minutos, pode-se visualizar a formação de grumos esbranquiçados, que indica a
aglutinação, sendo a amostra positiva para a presença da PBP2a. Foi utilizada uma amostra
padrão de Staphylococcus aureus resistente à meticilina 9393.
3.6. Detecção do gene mecA:
A detecção do gene mecA foi feita através da técnica de reação em cadeia da
polimerase – PCR (OLIVEIRA & DE LENCASTRE, 2002).
3.6.1. Extração do DNA total
A extração do DNA total foi realizada como descrito por Pacheco et al., 1997 . As
amostras estocadas foram semeadas em caldo TSB e incubadas por 18 h, sob agitação, a
37ºC. A seguir, 100µL dessa cultura foi semeada, através da técnica de esgotamento, na
superfície de uma placa com TSA. Após incubação por 24 h, a 37ºC, algumas colônias
isoladas foram removidas e diluídas em 3 mL de TE para lise (1,0mL de Tris 1mM pH 7,4;
0,2mL de EDTA 1mM pH 8,0; 98,8mL de água bidestilada). A seguir, 400 µL desta
suspensão foram adicionados a 3,6 mL de água bidestilada (diluição 1:10), mediu-se o
comprimento de onda (600nm) e obteve-se o volume necessário da suspensão celular para a
fervura. O volume calculado foi transferido para um tubo para microcentrifugação e
centrifugado por 2 min a 12.000xg. O sobrenadante foi removido e o conteúdo ressuspenso
em 200µL de TE. A amostra foi fervida por 10 min e, em seguida, centrifugada por 1 min
para obtenção de sobrenadante límpido.
3.6.2. Reação da PCR:
Após a extração do DNA, foram postos em uma solução: tampão para PCR (1X)
suplementado com cloreto de magnésio (MgCl2) para uma concentração final de 4 mM, 30
pmol de cada oligonucleotídeo indiciador, 200µM de cada desoxirribonucleotídeo
trifosfatado (dNTPs), água MilliQ estéril e 5µL da preparação do DNA molde para um
volume final de 50µL. As misturas de reação foram colocadas em aparelho termociclador e
submetidas a um ciclo de 50ºC por 10min e a outro de 94ºC por 10min. A reação foi então
interrompida para a adição de 2U da Taq DNA polimerase. Após adição da enzima, foram
realizados 35 ciclos de 94ºC por 1min, 55ºC por 30 segundos e 72ºC por 30 segundos.
Os oligonucleotídeos iniciadores usados foram: 5’-AAA ATC GAT GGT AAA
GGT TGG C-3’ e 5’-AGT TCT GCA GTA CCG GAT TTG C-3’.
3.6.3. Eletroforese:
Os produtos da amplificação foram submetidos à eletroforese em gel de agarose a
2,0% em cuba horizontal, contendo solução tampão TBE 1X (Tris base 0,2M, ácido bórico
0,2M, e EDTA 0,5M – pH 8,0), por 30 minutos em uma corrente constante de 125V. Sendo
visualizados através de trasilumidador de luz UV, no qual a presença do gene mecA foi
visualizada pela observação de uma banda correspondente a amplificação de um
seguimento de 160pb.
3.7. Detecção da produção de Biofilme:
As amostras que apresentaram multi-resistência aos antibióticos testados foram
analisadas qualitativamente, quanto à capacidade de formação de biofilme (ARAÚJO et al.,
2006). Foram utilizadas placas para microtitulação de fundo plano, compostas de
poliestireno inerte, contendo 96 poços (Nunclon, Delta, Nunc. InterMed, Denmark). As
cepas analisadas foram semeadas por esgotamento em meio TSA e incubadas por 24h a
37ºC. Após esse período, colônias foram repicadas para tubos contendo TSB e incubadas
por 18h a 35°C com agitação. Em seguida, as culturas foram diluídas em TSB
suplementado com 1% (p/v) de glicose e em cada 4 poços aplica-se 200µL de uma mesma
cultura. Posteriormente, as placas foram incubadas por 24h a 37ºC. A densidade ótica
provocada pelo crescimento bacteriano (DOc) foi determinada em leitor ELISA a 540 nm.
Após essa leitura, a placa foi lavada 4 vezes com solução salina e as bactérias fixadas à
placa a 65ºC por 1h. Em seguida, 200µL de solução de cristal violeta para Gram foi
adicionado a cada poço, por 1 min. A placa foi lavada 2 vezes com água destilada estéril e a
água evaporada a 45ºC. Foi possível visualizar uma forte coloração lilás nos poços onde
havia amostras produtoras de biofilme, do contrário, a amostra foi considerada negativa
para a produção de biofilme.
3.8. Análise dos Dados:
Para fazer a análise dos dados desta pesquisa utilizou-se algumas técnicas
estatísticas como: cruzamentos de variáveis visando determinar informações camufladas na
pesquisa, bem como, tabelas de distribuição de freqüência, que determinam coleções de
objetos classificados de modo a mostrar o número existente em cada classe.
A correlação de Spearman, também foi utilizada para medir a intensidade da relação
entre variáveis, que neste caso, usou-se o valor observado na ordem das observações, pois
deste modo, o coeficiente da correlação não seria sensível a assimetrias na distribuição, não
exigindo, portanto, que os dados provenham de duas populações normais; também foi
utilizado o teste de Kruskal-Wallis, que incidi na comparação de grupos através de
variáveis independentes, onde a variáveis devem ser de mensuração ordinal/intervalar ou
razão e, finalizando, também houve a necessidade da utilização da técnica de análise de
correspondência, onde esta, permite explorar associações entre variáveis categóricas que
geram tabelas de contingência. E o interesse estar em verificar independência às categorias
das variáveis que formam as linhas e colunas da tabela de contingência bidimensional.
4 RESULTADOS:
4.1 Coleta e Identificação das formigas:
Foram coletadas 471 formigas nas instalações do hospital pesquisado, no período de
um ano, entre junho de 2007 e maio de 2008, sendo todas as fomigas identificadas em nível
de espécie, com exceção de 2 formigas que só puderam ser identificadas em gênero. As
formigas encontradas foram: Dorymyrmex sp. (0,4%); Camponotus vittatus Forel (3,6%);
Crematogaster victima Smith (27,8%); Paratrechina longicornis (Latreille) (21,7%);
Pheidole diligens (Smith) (6,4%); Pheidole radoszkowskii Mayr (1,3%); Solenopsis
globularia (Smith) (8,7%); Tapinoma melanocephalum (Fabricius) (30,1%).
Através de uma distribuição de freqüência verificamos que houve predominância
das espécies Crematogaster victima Smith e Paratrechina longicornis (Latreille), nas quais
corresponderam a mais que 50% do total das formigas, conforme demonstra a Tabela 2:
TABELA 2: Distribuição das espécies de formigas no hospital.
ESPÉCIES DE FORMIGAS QTD % Dorymyrmex sp. 2 0,42 Camponotus vittatus Forel 17 3,61 Crematogaster victima Smith 131 27,81 Paratrechina longicornis (Latreille) 102 21,66 Pheidole diligens (Smith) 30 6,37 Pheidole radoszkowskii Mayr 6 1,27 Solenopsis globularia (Smith) 41 8,70 Tapinoma melanocephalum (Fabricius) 142 30,15 TOTAL 471 100
4.2 Fatores abióticos e a ocorrência de formigas
Como o p-valor para as espécies de formigas foi p = 0,000, podemos concluir que
existem evidências estatísticas significantivas de uma relação entre a abundância e a
espécie de formiga com os meses pesquisados. Esse resultado mostra que existe uma
relação direta entre os meses do ano e a espécie e o números de formigas que se encontram
no hospital. A relação entre formigas e meses do ano pode ser visualizada na Tabela 3 e na
Figura 2.
TABELA 3: Distribuição das espécies de formigas segundo os meses pesquisados.
Figura 2: Distribuição das espécies de formigas segundo os meses pesquisados.
MESES ESPÉCIES DE FORMIGAS jun/07 jul/07 ago/07 Set/07 out/07 nov/07 dez/07 jan/08 fev/08 mar/08 abr/08 mai/08
TOTAL %
Dorymyrmex sp. 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 2 0,4 Camponotus vittatus Forel 3 2 4 0 1 0 1 3 0 0 3 0 17 3,6 Crematogaster victima Smith 6 7 0 11 9 12 14 25 15 8 13 11 131 27,8 Paratrechina longicornis (Latreille) 12 12 3 5 17 16 18 4 2 6 3 4 102 21,7 Pheidole diligens (Smith) 7 9 7 4 0 0 0 2 0 0 1 0 30 6,4 Pheidole radoszkowskii Mayr 0 0 0 2 2 0 1 0 0 0 1 0 6 1,3 Solenopsis globularia (Smith) 0 0 1 2 1 6 6 2 4 6 6 7 41 8,7 Tapinoma melanocephalum (Fabricius) 8 11 7 14 6 7 5 8 20 17 18 21 142 30,1 TOTAL 36 41 22 38 37 41 45 44 41 37 46 43 471 100,0 % 7,6 8,7 4,7 8,1 7,9 8,7 9,6 9,3 8,7 7,9 9,8 9,1 100,0
Número de Espécies
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
jun/07 jul/07 ag o/07 s et/07 out/07 nov/07 dez/07 jan/08 fev/08 mar/08 abr/08 mai/08
Dorymyrmex s p. C amponotus vittatus F orelC rematog as ter vic tima S mith P aratrec hina long ic ornis (L atreille)Pheidole dilig ens (S mith) P heidole rados zkows kii MayrS olenops is g lobularia (S mith) Tapinoma melanoc ephalum (F abric ius )
QUANTIDADE
Contatou-se que há diferença significativa no aparecimento de determinadas
espécies de formigas entre os turnos noturno e diurno. Isso significa que algumas espécies
possuem maior atividade em determinado período do dia (ver Figura 3).
Figura 3: Distribuição das espécies de formigas segundo os turnos
A análise estatística revela que a espécie Crematogaster victima Smith é uma
formiga de hábitos noturnos (Figura 3), pois mesmo sendo encontrada durante o dia, sua
aparição noturna é significativamente maior demonstrando uma atividade preferencial da
espécie durante a noite.
Para temperatura, o coeficiente de Spearman foi 0,096, para umidade, foi 0,118 e
para pluviosidade, foi 0,109, portanto, apesar de todos os coeficientes serem positivos,
nenhuma espécie de formiga estabeleceu correlação (relação de intensidade) com
temperatura, umidade ou pluviosidade.
Número de Espécies
2 0
14
3
108
23
39
63
16 14
4 2
17
24
45
97
0
20
40
60
80
100
120
NOTUR NO DIUR NO
Dorymyrmex s p. C amponotus vittatus F orel
C rematog as ter vic tima S mith P aratrec hina long ic ornis (L atreille)P heidole dilig ens (S mith) P heidole rados zkows kii MayrS olenops is g lobularia (S mith) Tapinoma melanoc ephalum (F abric ius )
Q UANTIDADE
Através de cruzamento de variáveis podemos observar que algumas espécies de
formigas predominaram em determinados setores do hospital: nas enfermarias masculina e
feminina predominaram a formiga Tapinoma melanocephalum (Fabricius); na cozinha
houve prevalência da Paratrechina longicornis (Latreille); na lavanderia predominou a
espécie Crematogaster victima Smith; e no banco de sangue houve maior presença da
Crematogaster victima Smith (Figura 4).
Figura 4: Distribuição das espécies de formigas por setor do hospital.
Verificou-se que a cozinha associa-se a espécie Paratrechina longicornis
(Latreille), na enfermaria feminina, a Tapinoma melanocephalum (Fabricius) e no banco de
sangue a Crematogaster victima Smith, nos demais setores não existem outras associações
significantes.
Número de Espécies
0 0 1 1 00 0
5
9
3
27
10
16
32
46
14
29
32
15
12
0 1 1
4
24
1 0 0 1
4
0
5
1
20
15
46
54
21
16
5
0
10
20
30
40
50
60
E nfermaria mas c . E nfermaria fem. C oz inha L avanderia B anc o de s ang ue
Dorymyrmex s p.
C amponotus vittatus F orel
C rematog as ter vic tima S mith
P aratrec hina long ic ornis (L atreille)
P heidole dilig ens (S mith)
P heidole rados zkows kii Mayr
S olenops is g lobularia (S mith)
Tapinoma melanoc ephalum(F abric ius )
Q UANTIDADE
4.3 Identificação dos Staphylococcus coletados:
Foram encontradas 85 amostras de Staphylococcus. Os estafilococos encontrados
pertenciam todos ao grupo dos ECN e nenhuma amostra de Staphylococcus aureus foi
encontrada neste estudo. A identificação através das provas bioquímicas (KLOSS &
BANNERMAN, 1999) revelou a presença das seguintes espécies de ECN: 17 amostras de
Staphylococcus saprophyticus, 15 amostras de Staphylococcus epidermidis, 13 amostras de
Staphylococcus xylosus, 10 amostras de Staphylococcus hominis hominis, 10 amostras de
Staphylococcus lugdunensis, 6 amostras de Staphylococcus warneri, 5 amostras de
Staphylococcus cohnii urealyticum, 3 amostras de Staphylococcus haemolyticus, 3 amostras
de Staphylococcus simulans, 2 amostras de Staphylococcus cohnii cohnii e uma amostra de
Staphylococcus capitis.
Essas amostras também já foram analisadas quanto ao perfil de susceptibilidade às
duas principais drogas de triagem para resistência aos antibióticos em estafilococos,
segundo recomendado pelo CLSI (2008). As drogas testadas foram a cefoxitina (30µg) e a
oxacilina (1µg), onde duas amostras apresentaram resistência. Além desses antibióticos,
também foram testados 10 antimicrobianos, no qual as duas amostras que apresentaram
resistência à oxaxilina (1µg) e a cefoxitina (30µg), também apresentaram perfil de
multirresistência aos seguintes antimicrobianos: ciprofloxacina (5µg), clindamicina (2µg),
eritromicina (15µg), gentamicina (10µg), penicilina G (10U), sulfametoxazol-trimetoprin
(23,75µg-1,25µg), oxalicina (1µg) e cefoxitina (30µg). A primeira amostra foi detectada na
coleta diurna do mês de agosto de 2007 e foi identificada como S. hominis hominis (código
da amostra: 3ES4D), apresentando halos de inibição de 5 mm para oxacilina e 16 mm para
cefoxitina e a segunda amostra de estafilococos resistente foi encontrada na coleta diurna
do mês de abril de 2008 e foi identificada como S. lugdunensis (código da amostra:
11ES2D) não apresentando halo de inibição para oxacilina e apresentando halo de inibição
de 11mm para cefoxitina (Figura 5). As duas amostras resistentes estavam sendo carreadas
por formigas da espécie Tapinoma melanocephalum (Fabricius).
Figura 5: Amostras de Staphylococcus coagulase negativos resistentes aos antibióticos,
oxacilina (1µg) e cefoxitina (30µg). A) Amostra 3ES4D apresentando halo de
inibição de 5mm para oxacilina e 16mm para cefoxitina. B) Amostra 11ES2D
apresentando halo de inibição de 11mm para cefoxitina e nenhuma formação de
halo de inibição para oxacilina.
A análise da produção da proteína PBP2a, que é o produto da expressão do gene
mecA, conferindo a bactéria a capacidade de sobreviver em presença de antibióticos β-
lactâmicos, foi analisada nas duas amostras com perfil de multirresistência: S. hominis
hominis e S. lugdunensis (amostras: 3ES4D e 11ES2D) e nelas houve reação, sendo as
amostras produtoras dessa proteína (Figura 6).
Figura 6: Produção da proteína PBP2a nas amostras de S. hominis hominis (3ES4D) e S.
lugdunensis (11ES2D).
Nas amostras de S. hominis hominis e S. lugdunensis com perfil de multirresistência
ainda foram realizadas análises do perfil de susceptibilidade à meticilina (25 mg/L), com
este antibiótico diluído em TSA. Houve crescimento das amostras, mostrando uma
resistência ao antibiótico e indicando a presença do gene mecA, que foi confirmada através
de uma Reação em Cadeia da Polimerase-PCR (Figura 7).
As duas amostras multirresistentes, S. hominis hominis (3ES4D) e S. lugdunensis
(11ES2D), foram testadas quanto à produção de biofilme e apenas a amostra da espécie S.
hominis hominis apresentou-se como forte produtora de biofilme (Figura 8).
O total das amostras de ECN ainda apresentou um percentual de 30.58% de
resistência à eritromicina (15µg) e todas as amostras foram susceptíveis à vancomicina
(30µg).
Figura 7: Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) para as amostras de ECN
multirresistentes. Coluna 1: Marcador de peso molecular; Coluna 2: Controle +
(S. aureus 9393); Coluna 3: S. hominis hominis (3ES4D); S. lugdunensis
(11ES2D); Coluna 5: Controle negativo (S. epidermidis ATCC12228).
Figura 8: Produção de Biofilme. 1A,B,C - ausência de amostras; 1D,E,F - Staphylococcus
pyogenes 75194 (amostra controle não produtora de biofilme); 2A,B - S.
epidermidis 70d (amostra controle produtora de biofilme); 2C,D -
Staphylococcus hominis hominis (amostra 3ES4D); 2E,F - Staphylococcus
lugdunensis (amostra 11ES2D).
Para testar se houve diferença significativa nas espécies de bactérias ao longo dos
meses pesquisados (Figura 9), com o p-valor ≤ 0,05, utilizou-se o teste de Kruskal-Wallis.
Mas, o p-valor foi de 0,0697, assim, podemos dizer que não houve diferença da presença
das bactérias ao longo dos meses.
Figura 9: Distribuição dos tipos de bactérias segundo os meses pesquisados.
Através de cruzamento de variáveis podemos observar que algumas espécies de
bactérias predominaram em determinados setores do hospital: nas enfermarias masculina e
feminina predominou a S. epidermidis; na cozinha a S. lugdunensis; na lavanderia a S.
xylosus; e no banco de sangue as espícies S. epidermidis e S. saprophyticus (ver Figura 10).
Foi observado que a lavanderia tem mais chance de apresentar a bactéria S. xylosus, bem
como, na enfermaria feminina é mais provável se encontrar as bactérias S. epidermidis e S.
hominis.
Figura 10: Distribuição dos tipos de bactérias por setor do hospital.
5. DISCUSSÃO
Em nosso estudo foram encontradas espécies distintas de formigas nidificando e,
por conseguinte, infestando o hospital pesquisado. Entre as espécies de formigas urbanas
encontradas, duas são consideradas exóticas, Tapinoma melanocephalum (Fabricius) e
Paratrechina longicornis (Latreille), originárias da região tropical da África. Em outros
estudos conduzidos na região sudeste do Brasil, a presença dos gêneros de formigas
Tapinoma, Paratrechina, Camponotus e Solenopsis são sempre citados (FOWLER et al.,
1993; MOREIRA et al., 2005; RODOVALHO et al., 2007). O número de espécies de P.
longicornis esteve presente de forma distribuída dentre os locais coletados. Tal fato
confirma outro estudo que cita a espécie como bem adaptada à construção de ninhos sob as
mais diversas condições, além de apresentar uma preferência alimentar variada (SOLIS et
al., 2008).
Apesar da espécie Crematogaster victima Smith ter sido encontrada em maior
número no turno noturno e a espécie Tapinoma melanocephalum (Fabricius) no turno
diurno, todas as espécies de formiga coletas puderam ser capturadas nos dois turnos, o que
demonstra uma plasticidade comportamental por parte de todas as espécies encontradas.
O presente estudo não encontrou relações significativas entre fatores abióticos e a
quantidade de formigas coletadas, o que sugere uma adaptação desses insetos ao ambiente
independentemente das variações de temperatura, pluviosidade e umidade. Nosso resultado
corrobora com HÖLLDOBLER & WILSON (1990) que identificam, entre outras, as
espécies de formigas encontradas em nosso trabalho como integrantes de um grupo de
formigas chamadas “andarilhas” (“tramp ants”), as quais possuem uma série de
características adaptativas que favorecem a colonização do ambiente urbano. Tapinoma
melanocephalum (Fabricius) e Paratrechina longicornis (Latreille) são apontadas como
importantes exemplos de sucesso nessa adaptação (ULLOA-CHACÓN & JARAMILLO,
2003). Outros trabalhos encontraram plasticidade de comportamento em formigas (MORI e
LE MOLI, 1988; KELLER e KENNETH, 1993; SEID e TRANIELLO, 2006). Segundo
SEID e TRANIELLO (2006), a variação individual e a plasticidade comportamental de
formigas são uma forma de expansão do seu repertório comportamental, ecológico e
fisiológico.
Nosso trabalho concluiu que a presença de T. melanocephalum no ambiente
hospitalar eleva o risco de veiculação dos ECN e de contaminação do ambiente hospitalar.
Na ausência de trabalhos relacionando formigas com ECN, podemos supor que o fato de T.
melanocephalum ser uma das menores em tamanho dentre as espécies de formigas
adaptadas ao ambiente urbano propicie sua capacidade de carrear ECN. O tamanho
reduzido facilita o acesso das formigas a locais estreitos que as demais não alcançam. Em
nossa pesquisa, essa mesma espécie de formiga, T. melanocephalum, foi encontrada em
maior número nas enfermarias, o que representa um risco devido ao potencial de veiculação
de bactérias com perfil de resistência aos antibióticos demostrado nesse trabalho. O seu
pequeno tamanho pode ter sido mais uma vez a causa dessa infestação, já que pode
dificultar a detecção dessa espécie pela equipe de limpeza, fazendo com que ela colonizasse
facilmente o hospital. Assim como em nossos resultados, outros autores (FOWLER et al.,
1993; MOREIRA et al., 2005; CHACÓN DE ULLOA, 2003) encontraram em pesquisas
realizadas no Brasil e na América do Sul a espécie T. melanocephalum como a mais
presente no ambiente hospitalar. Um fato novo do nosso estudo foi encontrar T.
melanocephalum carreando amostras de ECN resistentes a meticilina, sendo uma delas
produtora de biofilme. Isso aponta para o risco de transmissão de patógenos importantes
por essa espécie no ambiente hospitalar.
O fato de formigas terem sido encontradas veiculando ECN em um hospital é algo
preocupante, pois ECN são uma importante causa de bacteremias nosocomiais e septicemia
(KOKSAL et al., 2007). Além disso, todas as espécies de ECN que encontramos sendo
carreadas por formigas no hospital são descritas como presentes em isolados clínicos
(CUEVAS et al., 2004). Duas de nossas amostras, S. hominis hominis e S. lugdunensis,
eram multirresistentes e estavam albergando o gene mec A, sendo a primeira vez que ECN
com essas características foram isoladas de formigas presentes no ambiente hospitalar, o
que representa um risco de contaminação dos pacientes, que por imunocomprometimento,
podem adquirir uma infecção causada por esses patógenos.
Nossos resultados indicam que a presença de espécies de ECN com
multirresistência aos antibióticos na enfermaria feminina de pós-operatório pode significar
a formação de um reservatório de genes de resistência nesse setor. A literatura relata a
transmissão de genes de resistência de uma espécie de ECN, S. epidermidis, para S. aureus
(WIELDERS et al., 2001), reforçando o fato de, em nosso estudo, duas espécies diferentes
de ECN, terem sido coletadas em um mesmo setor, a enfermaria feminina pós-cirúrgica,
albergando o gene de resistência a meticilina e possuindo perfis de multiresistência a
drogas similares.
S. hominis hominis é citada na literatura como causa de endocardites e bacteremias
(PIETTE & VERSCHRAEGEN, 2009). S. lugdunensis, ao contrário das demais espécies de
ECN, exibem um alto grau de virulência, pois expressam fatores de virulência também
presentes em S. aureus (FRANK et al.,2008). São freqüentemente encontrados em
infecções no trato urinário e relacionada a dispositivos implantáveis, e ainda, infecções na
pele e corrente sanguínea, peritonites e endocardites (FRANK et al.,2008).
ECN tem se tornado um motivo de preocupação pela comunidade médica devido ao
fato dessas bactérias apresentarem a habilidade de rápida adaptação ao stress causado por
antibióticos (LIVERMORE, 2000). A maioria dos ECN isolados de infecções nosocomiais
são resistentes à meticilina e à outras drogas (PIETTE & VERSCHRAEGEN, 2009). Em
nosso estudo, 30.58% dos ECN foram resistentes à eritromicina, o que corrobora com outro
estudo com isolados clínicos (CUEVAS et al., 2004).
A produção do biofilme pode propiciar a permanência de cepas multirresistentes,
atuando como um determinante nas infecções por ECN. Alguns autores relatam que a
produção do biofilme é mais comumente encontrada em isolados associados à sepse,
incluindo bacteremias associadas à cateteres intravenosos e outros dispositivos
implantáveis (GOTZ, 2002; DE SILVA et al., 2002). Nosso estudo relata pela primeira vez
uma espécie de ECN, S. hominis hominis, produtora de biofilme sendo veiculada por
formigas presentes no ambiente hospitalar. Em estudos feitos com ECN isolados de
culturas de sangue, respectivamente 26% e 44% dos S. hominis hominis isolados, eram
produtores de biofilme (KOKSAL et al., 2007; DE SILVA et al., 2002). Em nossos
isolados de S. hominis hominis (n=10), apenas 1 (10%) apresentou produção de biofilme.
Após quatro décadas do primeiro relato de bactérias patogênicas sendo veiculadas
por formigas em instituições de saúde, nosso estudo demonstra que mesmo com o avanço
das medidas de higiene do ambiente hospitalar, esse fato ainda acontece e é agravado pela
aquisição de fatores de virulência por essas bactérias, tais como aumento da resistência aos
antimicrobianos e a produção de biofilme. Há uma necessidade de um periódico
monitoramento das infestações por insetos no ambiente hospitalar, para que se evite a
disseminação de bactérias importantes em infecções nosocomiais.
6. CONCLUSÃO
Espécies distintas de formigas estavam nidificando e, por conseguinte, infestando o
hospital pesquisado;
Formigas podem veicular Staphylococcus coagulase-negativos com perfil de multi-
resistência aos antimicrobianos em ambiente hospitalar;
Formigas podem veicular ECN com potencial de produção de biofilme;
A presença de espécies de ECN com multirresistência aos antibióticos na
enfermaria feminina de pós-operatório pode significar a formação de um
reservatório de genes de resistência nesse setor;
A presença de T. melanocephalum no ambiente hospitalar eleva o risco de
veiculação dos ECN e de contaminação do ambiente hospitalar.
A espécie de formiga T. melanocephalum foi encontrada em maior número nas
enfermarias, o que representa um risco devido ao potencial de veiculação de
bactérias com perfil de resistência aos antibióticos demostrado nesse trabalho.
Não há evidencias no presente estudo de relações significativas entre fatores
abióticos e a quantidade de formigas coletadas, o que sugere uma adaptação desses
insetos ao ambiente independentemente das variações de temperatura, pluviosidade
e umidade.
Apesar da espécie Crematogaster victima Smith ter sido encontrada em maior
número no turno noturno e a espécie Tapinoma melanocephalum (Fabricius) no
turno diurno, todas as espécies de formiga coletas puderam ser capturadas nos dois
turnos, o que demonstra uma plasticidade comportamental por parte de todas as
espécies encontradas.
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ARTIGO 1
TÍTULO: STAPHYLOCOCCUS COAGULASE-NEGATIVO, MECA POSITIVO E
PRODUTOR DE BIOFILME VEICULADO POR FORMIGAS ((HYMENOPTERA:
FORMICIDAE) NA REGIÃO NORDESTE DO BRASIL.
AUTORES: E.E.N.F. SILVA, J.G. COSTA, C.G.P.T. LÓPEZ, J.H.C. DELABIE, L.A.
TEIXEIRA, M.C.N. MELO, M.F.F.M. XIMENES.
REVISTA: Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene.
SITUAÇÃO: Enviado.
mecA positive and biofilm producer coagulase-negative Staphylococci
carried by ants (Hymenoptera: Formicidae) in a hospital in northeastern
Brazil.
Eutália Elizabeth Novaes Ferreira da Silvaa, Jannyce Guedes da Costaa, Carolina
Garnica Pérez Taco Lópezb, Jacques Hubert Charles Delabiec, Lenise Arneiro
Teixeirab, Maria Celeste Nunes de Meloa, Maria de Fátima Freire de Melo
Ximenesa,*
aPrograma de Pós-Graduação em Ciências Biológicas, Departamento de
Microbiologia e Parasitologia, Centro de Biociências, Universidade Federal do Rio
Grande do Norte. Av. Senador Salgado Filho, S/N, Campus Universitário, Lagoa
Nova, 59072-970, Natal, RN, Brasil.
bLaboratório de Controle Microbiológico, Faculdade de Farmácia, Universidade
Federal Fluminense. Rua Dr. Mário Vianna, 523, Santa Rosa, 24241002, Niterói,
RJ, Brasil.
c Laboratório de Mirmecologia, Centro de Pesquisas do Cacau, CEPLAC, Caixa
postal 7, 45600-000, Itabuna, BA, Brasil.
*Corresponding author: +55 84 3215 3437; Fax: +55 84 3211 9212.
E-mail address: [email protected] (MFFM Ximenes)
Summary
This study evaluated the potential of ants as carriers of Staphylococcus resistant to
antibiotics and biofilm-producing in a hospital in Natal, in northeastern Brazil. Ants
were caught with sterile tweezers in the following hospital areas: the blood bank,
post-surgical wards, the kitchen, and the laundry. Among 440 ants, 85 (19.1%)
were carrying coagulase-negative staphylococci (CoNS) of the species
Staphylococcus saprophyticus (17), Staphylococcus epidermidis (15),
Staphylococcus xylosus (13), Staphylococcus hominis hominis (10),
Staphylococcus lugdunensis (10), Staphylococcus warneri (6), Staphylococcus
cohnii urealyticum (5), Staphylococcus haemolyticus (3), Staphylococcus simulans
(3), Staphylococcus cohnii cohnii (2), and Staphylococcus capitis (1). No S. aureus
was found. Among the isolates, 30.58% showed resistance to erythromycin. Two
samples of CoNS (2.35%), obtained from the ant Tapinoma melanocephalum
(Fabricius) collected in the post-surgical female ward, S. hominis hominis and S.
lugdunensis, harbored the mecA gene and were resistant to multiple antibiotics,
and the specie S. hominis hominis even showed to be a biofilm producer. This
study proves that ants act as carriers of multidrug-resistant coagulase-negative
Staphylococci and biofilm producers and points to the risk of the spreading of
pathogenic microorganisms by this insect in the hospital environment.
Keywords: coagulase-negative Staphylococci; mecA gene; biofilm; ants; hospital
environment.
1. Introduction:
Among animals, insects form the most successful group in the world in
terms of number of species, richness, and abundance. The adaptability of insects
to the urban environment has led to the expansion of species that affect the quality
of human life. Within this group, the ants are noted for their evolutionary success,
their ability to form complex social systems and establish mutualistic or symbiotic
interactions with microorganisms. About 11,000 species were identified around the
world and approximately 2,000 in Brazil.1
About 30 species of ants can be considered urban pests. These species are
known as the “tramp” species, the workers are monomorphic and small, form nests
prone to migration, and do not show intraspecific aggression. These characteristics
have allowed some ants of tropical origin, mainly due to the commerce, to colonize
in temperate countries. In these countries, their presence in buildings with
controlled temperature favors the establishment of these species. Problems result
from the infestation of these urban ants in offices, museums, libraries, telephone
exchanges and homes and hospitals, where the latter can act as vehicles of the
mechanical spread of pathogens.2,3
The potential of ants as carriers of pathogenic microorganisms has been
investigated. Some studies have reported ants as carriers of many species of fungi
and also as intermediate hosts of helminthes. 4,5
The first report of ants carrying pathogenic bacteria in hospitals was
described in the 70s.6 In the following decades, other studies has shown the
potential for the mechanical vectoring of species of Acinetobacter, Klebsiella,
Enterococcus, Proteus, Pseudomonas and Staphylococcus by ants7,8, and still
others have tried to understand the epidemiological role of this insect. 9,10
The free access of the ants-vehicle in the hospital environment allows the
contamination of surfaces that can provide support for bacterial growth, such as
food, therapeutic solutions, catheters, and respirators.9 The establishment of
pathogens in the hospital environment is compounded by the potential for antibiotic
resistance.11
The coagulase-negative staphylococci (CoNS) are inhabitants of human
skin and mucous membranes of healthy individuals but are increasingly recognized
as a cause of clinically important infections.12 CoNS represent the third cause of
bloodstream infections around the world and in Brazil, CoNS are the second cause
of bloodstream infection.13
CoNS may be associated with bacteremia as a result of previous use of
antibiotics, and also there is an increase in resistance to commonly used
antimicrobial.14 Resistance to methicillin, caused by the expression of the penicillin-
binding protein 2a (PBP2a), encoded by the mecA gene, has been a concern,
because this gene is included in a genetic element called staphylococcal cassette
chromosome (SCCmec), which also harbors other genes that confer resistance to
other antibiotics.15 In clinical isolates of CoNS, rates of meticillin resistance
(MRCoNS) are 55-77% and even more than 80% in intensive care unit (ICU).12
CoNS are also the most common cause of infections related to medical
devices.13 This is due mainly to the ability of biofilm formation, which occurs by the
association of bacteria with polymers. In Staphylococcus, this process seems to
occur in basically two steps: adherence to inert surface and biofilm accumulation.
The first step include the AtlE protein, teichoic acid and also staphylococcal
adhesins, proteins which play an important role in plasma-coated biomaterial. The
second step consists of the accumulation of bacterial cells and the production of a
matrix composed primarily of polysaccharide intercellular adhesin (PIA), which is
essential for the biofilm production.16 Following the establishment of biofilm on a
device implanted in the patient, a chronic infection is generally established and, in
most cases, surgery is required for implant removal.17
The spread of clones of CoNS with a profile of multiresistance to drugs have
been recently documented.18,19 Although other studies have reported the potential
of ants as carriers of pathogens, no study has demonstrated the presence of genes
of resistance to drugs in Staphylococcus nor assessed the potential of biofilm
production by these bacteria carried by ants. The aim of this study was to evaluate
the potential of ants as a mechanics vehicle to drug resistant Staphylococcus and
also the potential of these strains to produce biofilm in a hospital in northeastern
Brazil.
2. Materials and methods
2.1. Ants collection and CoNS identification
The study was conducted in a public hospital in Natal, the capital of Rio
Grande do Norte State, with the capacity for 200 beds and 4000 patients
hospitalized annually. In the hospital, five sectors were analyzed: the blood bank,
two post-surgical wards (female and male), the kitchen, and the laundry. From May
2007 to June 2008, ants were collected fortnightly, in the daytime and the
nighttime. They were caught with sterile tweezers and placed in sterile tubes
containing Trypticase Soy Broth (Oxoid, UK) supplemented with NaCl (7.5%), at
35°C for 24-48h. After incubation, the ants were stored in alcohol (70%) for later
identification, examined under a stereoscopic microscope, using identification
keys.20 The tubes showing growth were streaked on Manitol Salt Agar (Oxoid, UK)
to 35°C for 24h, recultured in Trypticase Soy Agar (Oxoid, UK) for 24h to 35ºC and
the isolated colonies were subjected to Gram staining, susceptibility to bacitracin
(>9 mm), and tests that determine the production of catalase and coagulase.
Subsequently, CoNS at species level were identified by the conventional method21,
which consists of a set of biochemical tests that determine the production ornithine
descarboxylase, urease, PYR (pirrolidonyl arylamidase), anaerobic growth in
thioglycolate, susceptibility to novobiocin (0.5 U) (>16 mm) and acid production
from carbohydrates (trehalose, manitol, mannose, maltose, xylose). Test readings
were obtained after 24, 48 and 72h of incubation at 37°C.
2.2. Antimicrobial Susceptibility test
Antimicrobic susceptibilities of the CoNS strains were determined by the
disk diffusion method on Mueller-Hinton Agar (bioMérieux, Marcy L’Etoile, France),
according to the Clinical and Laboratory Standards Institute.22 In our study,
penicillin 10U, clindamycin 2µg, erytromycin 15µg, ciprofoxacin 5µg,
trimethoprim/sulfamethoxazole 1.25/23.75 µg, gentamicin 10 µg, oxacillin 1 µg,
cefoxitin µg, and vancomycin 30 µg (Newprov Ltda, Paraná, Brazil) disks were
used.
2.3. mecA and PBP2a analysis
The mecA gene was amplified by PCR with the primers mecA-F 5’-
TCCAGATTACAACTTCACCAGG-3’ and mecA-R 5’-CCACTTCATATCTTGTAAC-
3’. These primers were designed on the basis of the mecA sequence (Genbank
accession n°YO68000). The program used for standard PCR was as follows: initial
denaturation at 94°C for 4 min, 30 cycles of amplification of 94°C for 30s, 53°C for
30s, annealing at 55°C for 1min, DNA extension at 72°C for 1 min, and a final
extension at 72°C for 4 min. The PCR product was visualized on a 1.5% agarose
gel by using ethidium bromide and a UV transilluminator.15
The PBP2a (penicillin-binding protein 2a) was also investigated by testing
Slidex MRSA Detection (bioMérieux SA, Paris, France), according to the
manufacturer's instructions.
2.4. Biofilm production
CoNS strains were submitted to biofilm assays. They were performed in
TSB supplemented with 1% (w/v) glucose using 96-well polystyrene flat-bottom
tissue culture plates (Nunclon; Nalge Nunc International, Rochester, NY, USA). All
the procedures were performed as described previously.23 The optical densities of
the culture (ODg) and of the stained biofilm (ODb) were measured at 570 nm.24
Strains of S. epidermidis 70D (a strong biofilm producer) and Staphylococcus
pyogenes 75194 (a biofilm non-producer) were used as positive and negative
controls, respectively.23
3. Results
A total of 440 ants were collected, belonging to five species: Tapinoma
melanocephalum (Fabricius), Paratrechina longicornis (Latreille), Camponotus
vittatus (Forel), Crematogaster victima Smith and Solenopsis Globularia (Smith).
The majority of ants belonged to the specie T. melanocephalum (30.22%) and this
specie presented the highest level of contamination by coagulase-negative
staphylococci, 31.76%, among the ant species that were carrying bacteria.
CoNS were obtained from 85 (19.31%) ants. Identified among the CoNS
were the following: 17 Staphylococcus saprophyticus, 15 Staphylococcus
epidermidis, 13 Staphylococcus xylosus, 10 Staphylococcus hominis hominis, 10
Staphylococcus lugdunensis, 6 Staphylococcus warneri, 5 Staphylococcus cohnii
urealyticum, 3 Staphylococcus haemolyticus, 3 Staphylococcus simulans, 2
Staphylococcus cohnii cohnii, and 1 Staphylococcus capitis. No S. aureus was
detected.
Two strains, obtained from the T. melanocephalum collected in the female
post-surgical ward, belonging to the species S. hominis hominis and S.
lugdunensis, were methicillin resistant and also showed resistance to ciprofloxacin,
clindamycin, erythromycin, gentamicin, penicillin, trimethoprim/sulfamethoxazole,
cefoxitin, and oxacillin. These strains were positive for the production of PBP2a
and harbored the mecA gene (Figure 1). The sample of multidrug resistant S.
hominis hominis was also classified as biofilm-producing (Figure 2). Among the
isolates of CoNS, 30.58% showed resistance to erythromycin and all isolates were
susceptible to vancomycin.
4. Discussion
One of the problems arising from urbanization is the adaptation of invasive
species to new habitats. Among the ant species found in this study, two are
considered exotic, Tapinoma melanocephalum (Fabricius) and Paratrechina
longicornis (Latreille), originating in the tropics of Africa.2 Studies conducted in the
southeastern region of Brazil reveal the presence of the genera of ants: Tapinoma,
Paratrechina, Camponotus e Solenopsis.7,11,3 T. melanocephalum was the ant
species collected the most (30.22%) in the hospital, corroborating studies in Brazil
and other countries in South America, where T. melanocephalum is cited as the
most abundant in hospitals.7,11,2 The factors that contributed to the abundance of
this species in the hospital are not yet understood. However, the fact that T.
melanocephalum carried two samples of methicillin-resistant CoNS and one of
them a biofilm producer, points to the risk of the transmission of important
pathogens in the hospital.
The dispersion of CoNS by ants collected in the hospital has resulted in
concern about the risk of causing nosocomial bacteremia and even sepsis.14 All
species of CoNS that we found are present in clinical isolates.25 S. hominis hominis
is cited in the literature as a cause of endocarditis and bacteremia.12 S.
lugdunensis, unlike the other species of CoNS, displays a high degree of virulence,
it expresses virulence factors also present in S. aureus.26 These bacteria are often
found in urinary tract infections, related to implantable devices such as prostheses
and pacemakers, and, skin infections and bloodstream infection, peritonitis, and
endocarditis.26
In addition, CoNS have a great capacity for adaptation to stress caused by
antibiotics.27 Most of the CoNS isolated from nosocomial infections are resistant to
methicillin and other drugs.12 In our study, 30.58% of CoNS were resistant to
erythromycin; similar results were also found in another study with clinical
isolates.25
Two samples of CoNS, S. hominis hominis and S. lugdunensis, multidrug-
resistant and harboring the mecA gene, were for the first time isolated from ants in
the hospital environment, which poses a risk of contamination to the patient, who, if
immunocompromised, may acquire an infection caused by these pathogens.
Furthermore, these strains can act as a reservoir of resistance genes. The transfer
of resistance genes from S. epidermidis, to S. aureus, was reported.28 This may
explain the fact that in our study, two different species of CoNS were collected in
the same sector, the female post-surgical ward, harboring the gene of methicillin
resistance, and have similar profiles of multidrug resistance.
The production of biofilm by S. hominis hominis, resistant to drugs, can lead
to the persistence of multidrug-resistant strains, acting as a determining factor in
infections caused by CoNS. Some authors report that the production of the biofilm
is more commonly found in isolates associated with sepsis, including bacteremia
associated with intravenous catheters and other implantable devices.16,29 Our study
reports for the first time a species of CoNS producing biofilm being carried by ants
in the hospital environment, an ability that was found in one sample among the 10
samples of S. hominis hominis collected. Found in other studies with CoNS
isolated from blood cultures were respectively 26% and 44% of S. hominis hominis
biofilm producers.14,29
After four decades of the first report of pathogenic bacteria carried by ants in
health institutions, we demonstrated that despite the advances in hygiene in the
hospital environment this problem still occurs and is exacerbated by the acquisition
of virulence factors by these bacteria, such as increased resistance to antibiotics
and production of biofilm. These findings indicate the need for permanent
surveillance and monitoring of insect infestations in hospitals, to avoid the spread
of serious bacterial infections.
Author’s contributions: MCNM, MFFMX, and EENFS conceived and designed
the study; EENFS collected and identified the ants; EENFS e JGC carried out the
bacteria identification; and LAT e CGPTL helped with PCR and biofilm production
assays. JHCD helped to identify the ants. All authors read and approved the final
manuscript. MFFMX and MCNM are guarantors of the paper.
Acknowledgements: We extend our appreciation to Dr. J.R. Lagreca for allowing
the collection of ants in the hospital studied.
Funding: This study was supported by FAPERN (Fundo de Apoio à Pesquisa do
Rio Grande do Norte), Natal, RN, Brazil.
Conflicts of interest: None declared.
Ethical approval: Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, RN,
Brazil.
Figure 1. Gel image of PCR mecA gene products (160pb) to the S. hominis
hominis (3ES4D) and S. lugdunensis (11ES2D) strains. Lane 1, 100 molecular size
marker; Lane 2, meticillin-resistant S. epidermidis (mecA +); Lane 3, S. hominis
hominis (3ES4D strain); Lane 4, S. lugdunensis (11ES2D strain); Lane 5, S.
epidermidis (mecA -).
Figure 2. Biofilm assays. 1A,B,C - absence of strains. 1D,E,F - Staphylococcus
pyogenes 75194 (a biofilm non-producer). 2A,B - S. epidermidis 70d (a biofilm
producer). 2 C,D- Staphylococcus hominis hominis (3ES4D strain). 2E,F -
Staphylococcus lugdunensis (11ES2D strain).
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