AUTARQUIA ASSOCIADA UNIVERSIDADE DE SO PAULO
Avaliao in vivo do potencial regenerativo na degenerao Walleriana de nervos
perifricos - com a utilizao de laser de baixa potncia e composto
polivitamnico -NERVE
Luciana Crepaldi Yazawa Pistarini
Dissertao apresentada como parte dos
requisitos para obteno do Grau de Mestre em
Cincias na rea de Tecnologia Nuclear -
Materiais
Orientadora:
Profa. Dra. Ana Helena de A. Bressiani
So Paulo
2015
INSTITUTO DE PESQUISAS ENERGTICAS E NUCLEARES
Autarquia associada Universidade de So Paulo
Avaliao in vivo do potencial regenerativo na degenerao Walleriana de nervos
perifricos - com a utilizao de laser de baixa potncia e composto
polivitamnico -NERVE
Luciana Crepaldi Yazawa Pistarini
Dissertao apresentada como parte dos
requisitos para obteno do Grau de Mestre em
Cincias na rea de Tecnologia Nuclear -
Materiais
Orientadora:
Profa. Dra. Ana Helena de A. Bressiani
Verso Corrigida
Verso original disponvel no IPEN
So Paulo
2015
AGRADECIMENTOS
Ao Instituto de Pesquisas Energticas e Nucleares (IPEN) pela
oportunidade que me foi dada para o desenvolvimento deste estudo.
minha orientadora Professora e Doutora Ana Helena de Almeida
Bressiani pelo profissionalismo que sempre ofereceu durante toda essa jornada. A
disciplina e o carinho da sua pessoa sempre estiveram presentes durante esses
anos. O dilogo, a pacincia e a orientao foram lapidando o trabalho para que o
resultado final apresentasse um contedo cientfico e enriquecedor.
Ao Professor e Doutor Marcelo Yoshimoto por oferecer a oportunidade
de desenvolver o estudo no IPEN. Pela pacincia de guiar detalhes deste
trabalho, de nunca poupar esforos para estar presente em vrios momentos,
inclusive na parte experimental.
Ao Professor e Doutor Marcos Barbosa Salles pela orientao cientfica
e conversas para guiar propostas do trabalho. Sempre disposto a ajudar e com
imensa pacincia para expor seu grande conhecimento.
Ao Professor e Doutor Srgio Allegrini Junior por oferecer fundamentos
cientficos e criteriosos ao trabalho, proporcionando perspectivas para estudos
futuros.
equipe do Biotrio do IPEN que disponibilizou a infraestrutura e
orientou sobre os cuidados dirios com os animais utilizados no experimento.
tcnica Elisa e sua equipe do Departamento de Patologia da
Faculdade de Odontologia da Universidade de So Paulo pela orientao na
confeco das lminas histolgicas para as anlises em microscopia.
Aos amigos que no cotidiano dividem experincias que sempre nos
ajudam, especialmente, ao Mrcio Mendes que sempre disponibilizou sua
ateno e orientao com grande boa vontade quando eu pedia qualquer ajuda.
Entretanto, agradeo a DEUS pela fora imensa que ilumina a minha
vida a cada dia. Pela sabedoria e discernimento que Ele me oferece em todos os
momentos presentes, sejam eles de alegrias, decises ou at de aceitaes de
situaes que no so da nossa vontade.
minha famlia meu imenso agradecimento, pois sem ela no
conseguiria alcanar as conquistas que tive at aqui, no s do estudo mas na
vida tambm.
Aos meus pais Elizena e Yoschio que sempre me ensinaram a ser uma
pessoa digna e batalhadora. Eles sempre, sempre me deram a fora, a coragem e
a estrutura para chegar at aqui. So eles que iluminam meu caminho.
Agradeo a minha irm Eliana, meu cunhado Aldy e minhas sobrinhas
Anna Letcia e Mariana que sempre estiveram presentes no meu dia a dia,
estimulando e vibrando com as minhas conquistas.
Ao meu esposo Henrique pela pacincia, pelo carinho e pela
cumplicidade durante todo o perodo do trabalho, sem esquecer o quanto esteve
presente com nossos filhos durante os momentos em que estive ausente.
Aos meus filhos: Paulo Henrique, Marcos Paulo e Arthur, presentes de
Deus. A eles dedico todas as minhas conquistas. Os sorrisos que eles oferecem,
as ingenuidades e as brincadeiras de criana do o brilho e fortalecem cada dia.
EPGRAFE
Senhor, d-me serenidade para aceitar as coisas que no posso mudar,
coragem para mudar as que posso e
sabedoria para distinguir entre elas.
(Reinhold Niebuhr)
AVALIAO IN VIVO DO POTENCIAL REGENERATIVO NA DEGENERAO
WALLERIANA DE NERVOS PERIFRICOS - COM A UTILIZAO DE LASER
DE BAIXA POTNCIA E COMPOSTO POLIVITAMNICO -NERVE
Luciana Crepaldi Yazawa Pistarini
RESUMO
Nas reas mdica e odontolgica existem situaes clnicas e
cirrgicas que podem ter, como consequncia, um dano ao tecido conjuntivo
nervoso, chamado de neuropatia. O objetivo deste trabalho avaliar terapias para
tratamento das neuropatias causadas por manipulao do feixe nervoso
perifrico, minimizando ou eliminando sintomas causados pela leso. O estudo foi
feito em 60 ratos machos Wistar, com a avaliao morfolgica da degenerao
Walleriana e da regenerao do tecido nervoso no 15 e 30 dia aps o trauma. A
leso consistiu na exposio e compresso do nervo isquitico da pata direita do
animal, atravs de trs ns consecutivos com fio de sutura e distncia entre eles
de ~ 2mm. Trs tratamentos sobre a leso foram comparados: o uso do
biomaterial - NERVE, a laserterapia de baixa potncia e a associao dos
dois. Os resultados histolgicos revelaram que o biomaterial aumentou o
processo inflamatrio, mas modulou a degenerao inicial, atravs do surgimento
de clulas de neoformao, favorecendo a regenerao nervosa no decorrer dos
trinta dias. A laserterapia foi um tratamento favorvel para a parestesia porque
modulou os danos do processo de degenerao inicial e estimulou o reparo do
tecido desde os 15 primeiros dias. Ao atingir os 30 dias o tecido se apresentou
organizado e com uma quantidade menor de tecido neoformado quando
comparado com o uso do biomaterial. A associao das terapias associou as
propriedades das duas terapias, pois modulou a inflamao inicial, propiciou o
aumento do nmero de clulas de neoformao do tecido nervoso e favoreceu a
regenerao dos feixes nervosos nas amostras de 15 e 30 dias. Conclui-se que o
no tratamento dificulta ou impede a regenerao nervosa, pois qualquer uma das
terapias citadas modula os eventos desencadeados pela leso. A associao do
uso da laserterapia com o -NERVE mostrou melhores resultados.
EVALUATION IN POTENTIAL OF LIVE IN REGENERATIVE WALLERIANA
DEGENERATION PERIPHERAL NERVE - WITH LASER USE LOW POWER
AND COMPOUND MULTIVITAMIN -NERVE
Luciana Crepaldi Yazawa Pistarini
ABSTRACT
In medical and dental areas are clinical and surgical situations that may
have, as a result, damage to the nervous tissue. This is called a neuropathy. The
objective is to support therapies for treatment of neuropathies caused by
manipulation of the peripheral nervous bundle, minimizing or eliminating
symptoms caused by injury. The study was conducted in 60 male Wistar rats by
morphological analysis of Wallerian degeneration and regeneration of nerve tissue
in the 15th and 30th day after the trauma. The lesion consisted of exposure and
sciatic nerve compression of the right paw of the animal through three consecutive
nodes with suture and the distance between them of ~ 2mm. Three treatments on
the injury were compared: the use of -NERVE biomaterial, the low level laser
therapy and their association. Histological findings revealed in samples 15 and 30
days the biomaterial increased inflammation and degeneration of the initial
modulated through the cell neogenesis emergence favored nerve regeneration in
the course of 30 days. Laser therapy was a favorable treatment for paresthesia
because modulates the damage of the initial degeneration process and stimulates
tissue repair since the first 15 days. When reaching the 30 days the tissue was
organized and presented with a smaller amount of neoformed tissue when
compared with the use of the biomaterial. The combination therapies of the
modulated the initial inflammation, led to an increase in the number of cells
neogenesis and promoted nerve tissue regeneration of nerve bundles in the
samples 15 and 30 days. We conclude that no treatment hinders or prevents
nerve regeneration, for any of the therapies mentioned modulate the events
triggered by the injury. The association between the use of laser therapy with
Nerve proved with better results.
SUMRIO
Pgina
1) INTRODUO __________________________________________ 1
2) REVISO DE LITERATURA _______________________________ 4
2.1) Estrutura de uma fibra nervosa normal_______________________ 5
2.2) Definio de clulas de Schwann___________________________ 8
2.3 )Tecido nervoso e trauma _________________________________ 9
2.4) Processo fisiolgico da degenerao Walleriana _______________ 9
2.5) Fisiopatologia da leso ___________________________________ 13
2.6) Caractersticas histolgicas de regenerao de nervos perifricos_ 13
2.7) Terapias que modulam a regenerao nervosa ________________ 14
2.7.1) Laser - definio______________________________________ 14
2.7.1.1) Radiao ionizante e no ionizante_______________________ 14
2.7.1.2) Fundamentos sobre o laser ____________________________ 15
2.7.1.3) Tipos de laser: de baixa e alta potncia ___________________ 15
2.7.1.4) Fotobiologia do tecido ________________________________ 16
2.7.2) Biomaterial __________________________________________ 17
2.7.2.1) O biomaterial utilizado no estudo: composto polivitamnico -
NERVE_________________________________________________ 20
2.7.3) Microscopia eletrnica de varredura (MEV)__________________ 22
3) OBJETIVO_ ____________________________________________ 23
4) MATERIAIS E MTODOS _________________________________ 25
4.1) Grupos experimentais ___________________________________ 26
4.2) Procedimento cirrgico___________________________________ 28
4.3) Terapias ______________________________________________ 30
4.3.1) Composto polivitamnico -NERVE ______________________ 31
4.3.2) Laserterapia __________________________________________ 31
4.3.3) Uso do Composto polivitamnico -NERVE associado a laser __ 33
4.4) Avaliao Morfolgica ___________________________________ 33
5) RESULTADOS E DISCUSSO _____________________________ 36
5.1) Os animais ____________________________________________ 37
5.1.1) Locomoo dos animais_________________________________ 38
5.2) Anlise Morfolgica _____________________________________ 40
5.2.1) Histologia do grupo G1 controle_________________________ 41
5.2.2) Histologia do grupo G2 Sham___________________________ 42
5.2.3) Histologia do grupo G3 Neuropraxia______________________ 43
5.2.4) Histologia do grupo G4 Composto Polivitamnico -NERVE__ 46
5.2.5) Histologia do grupo G5 Laser___________________________ 50
5.2.6) Histologia do grupo G6 Laser e composto polivitamnico -
NERVE associados________________________________________ 54
5.3) Dimenso da rea da degenerao ou regenerao____________ 59
6) CONCLUSES __________________________________________ 62
ANEXOS__________________________________________________ 65
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ____________________________ 66
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 descreve o agrupamento dos animais de acordo com a diviso dos
grupos experimentais, seu nome e procedimento executado, poca da
eutansia................................................................................................................27
TABELA 2 Nmero de animais por grupo de acordo com a evoluo cronolgica do experimento......................................................................................................37
TABELA 3 valores obtidos de trs distncias, em m, entre as extremidades de
uma mesma amostra de cada grupo tratado.........................................................60
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 esquema da diviso do sistema nervoso central e perifrico, com
nfase aos componentes do sistema nervoso perifrico ........................................ 5
FIGURA 2 desenho de um neurnio composto por corpo celular, axnio,
dendritos e terminaes .......................................................................................... 6
FIGURA 3 Microscopia ptica de um corte transversal de nervo isquitico de
rato pertencente ao grupo controle G1. As estruturas, coradas com hematoxilina
e eosina, foram: perineuro, endoneuro e epineuro. ................................................ 7
FIGURA 4- esquema para ilustrar o sentido da degenerao do nervo e a
presena de organelas setas vermelhas - aps uma leso no tecido nervoso
perifrico ............................................................................................................... 10
FIGURA 5 - animais acomodados na gaiola ......................................................... 26
FIGURA 6 - gaiolas organizadas nas prateleiras .................................................. 26
FIGURA 7 Assepsia com gaze e clorexidina 2% na regio a ser incisada ........ 28
FIGURA 8 animal pronto para inciso e posicionado na mesa cirrgica ........... 28
FIGURA 9 foto da lmina de bisturi n 15 da marca Solidor utilizada no
experimento para fazer a inciso no tecido externo do animal. ............................ 28
FIGURA 10 foto da exposio do nervo isquitico da pata direita do animal aps
inciso e separao do tecido muscular. .............................................................. 29
FIGURA 11 - foto ilustrando a exposio e individualizao do nervo isquitico da
pata direita do animal ............................................................................................ 29
FIGURA 12 - nervo isquitico individualizado dos tecidos adjacentes .................. 30
FIGURA 13 foto da execuo do segundo n cirrgico 2x2 no nervo dissecado
.............................................................................................................................. 30
FIGURA 14 foto A ilustra a execuo do terceiro n cirrgico no nervo isquitico
do animal; a foto B o maior aumento dos trs ns sequenciados com distncia
de aproximadamente 2mm entre eles. .................................................................. 30
FIGURA 15 nervo submetido a neuropraxia e o biomaterial sendo adaptado ao
redor do nervo na regio onde foi causada a leso .............................................. 31
FIGURA 16 - recobrimento total dos ns com -NERVE ............................... 31
FIGURA 17 representao da rea irradiada na pata do animal que recebeu a
terapia com laser. A linha vermelha se refere inciso e A, B, C e D a localizao
da ponta do equipamento para a aplicao e entrega da radiao. ...................... 32
FIGURA 18 realizando a aplicao do laser na regio operada nos animais do
grupo G6 aps sutura final do tecido externo....................................................... 33
FIGURA 19 dissecao para remoo do fragmento do nervo isquitico do
animal envolvendo uma distncia de 1 cm a mais tanto do coto proximal e distal 34
FIGURA 20 micrtomo da marca JUNG pertencente ao Instituto de Patologia da
Faculdade de Odontologia da Universidade de So Paulo ................................... 35
FIGURA 21 imagens das amostras do grupo G3 preparadas para microscopia
de varredura. A imagem A representa a amostra desidratada e a B representa as
amostras recobertas com ouro. ............................................................................. 35
FIGURA 22 foto de animal do grupo G3 com comprometimento motor da pata
direita logo aps o ato cirrgico ............................................................................ 38
FIGURA 23 esquema para ilustrar o fragmento removido para a anlise
histolgica ............................................................................................................. 40
FIGURA 24 - imagem de microscopia ptica de um corte longitudinal do grupo G1
revelando feixe ntegro, onde se observa a continuidade das fibras e feixes com a
presena de vasos sanguneos ntegros no mesmo sentido. ............................... 41
FIGURA 25 Imagem A - fragmento do nervo isquitico de rato como parmetro
de normalidade, com perineuro ntegro, sob MEV. Imagem B mostra a parte
interna com viso longitudinal dos fascculos do nervo isquitico do grupo de
animais preservados. Os fascculos possuem um envoltrio de tecido conjuntivo
rico em vasos denominado de epineuro. .............................................................. 42
FIGURA 26 Imagem da amostra do grupo G2 aps 15 dias do procedimento
cirrgico. H tecido muscular (TM) e tecido adiposo (TA) ao redor do feixe ntegro
.............................................................................................................................. 43
FIGURA 27 Imagens obtidas por microscopia ptica de uma amostra do grupo
G3 na eutansia de 15 dias. As imagens A, B, C revelam a descontinuidade do
feixe devido a leso causada pelos trs ns consecutivos (indicados pelas setas).
O coto proximal (A) se apresenta com espaos entre os fascculos, o distal (C)
apresenta espaos vazios de degenerao. ......................................................... 44
FIGURA 28 Imagens de microscopia ptica das amostras do grupo G3 com
eutansia de trinta dias. A imagem A um corte longitudinal da rea da leso
(seta preta) demonstrando a destruio e a descontinuidade das fibras nervosas,
a imagem B um corte transversal do coto distal com desorganizao dos
fascculos e infiltrado inflamatrio. O perineuro est desorganizado em ambas as
imagens. ............................................................................................................... 45
FIGURA 29 imagens obtidas por microscopia eletrnica de varredura de
amostra do grupo G3 revelando nas imagens A e B a destruio da camada
externa (seta) do coto proximal e distal respectivamente, em animal eutanasiado
aps quinze dias; sendo as imagens C e D a destruio da camada externa (seta)
tambm dos cotos proximal e distal em animais eutanasiados aps trinta dias. .. 46
FIGURA 30 grfico da citotoxidade do composto polivitamnico -NERVE ... 47
Figura 31 Microscopia ptica da amostra do grupo G4. A imagem A ilustra o
coto proximal e a seta indica a rea do primeiro n, a imagem B indica com a seta
a rea do segundo n e, a imagem C a desorganizao do coto distal. O infiltrado
inflamatrio (I) est presente em todos os cortes. ................................................ 47
FIGURA 32 Imagem em microscopia ptica do grupo G4 da regio da leso
causada pelo primeiro n, referente ao coto proximal. H espaos vazios (VAZIO)
caracterizando a degenerao, presena de vasos sanguneos (V), rea de
neoformao (NEO) iniciando uma organizao das fibras ( setas vermelhas) e,
com colorao rosada o tecido conjuntivo (TC) .................................................... 48
FIGURA 33 microscopia ptica de amostra do grupo G4 com eutansia de 30
dias, A imagem A representa o coto proximal e a imagem B o coto distal. .......... 49
FIGURA 34 imagens das amostras em microscopia eletrnica de varredura do
grupo G4. As setas brancas indicam a regio dos ns, as setas pretas os cotos.
Imagens A e B so imagens de eutansia de quinze dias sendo que o coto distal
apresenta desorganizao da camada externa; as imagens C e D so das
amostras com eutansia de trinta dias, com destruio do epineuro no coto
proximal na imagem C e caractersticas de regenerao do coto distal em D, pois
a camada externa da estrutura apresenta-se com continuidade........................... 49
FIGURA 35 corte histolgico do grupo G5. A imagem A representa o coto
proximal e a regio do primeiro n, a imagem B representa a regio do segundo
n e, a imagem C representa o coto distal com maior desorganizao do feixe.
Em todas as imagens A, B e C um tecido inflamatrio abundante circunscreve as
trs regies da leso. ............................................................................................ 50
FIGURA 36 - imagem de microscopia ptica do grupo G5. Em maior aumento a
histologia desta amostra demonstra a neoformao na regio intermediria da
leso referente ao segundo n. ............................................................................ 51
FIGURA 37 imagem de microscopia de luz de um corte longitudinal do grupo G5
aps 30 dias do procedimento onde os feixes revelam uma organizao e
direcionamento das fibras revelando a sua neoformao. A regio onde foi dado o
n se apresenta com fechamento total. ................................................................ 51
FIGURA 38 Imagens de microscopia eletrnica de varredura de uma estrutura
do grupo G5. A imagem A e B so fotos sequenciadas envolvendo o coto proximal
em A, o segmento intermedirio e o segundo n. Na figura B temos o coto distal.
As imagens C e D se referem a microscopia eletrnica de varredura de um
segmento do grupoG5 aps 30 dias da cirurgia. A imagem C apresenta a
continuidade da camada externa exibindo apenas uma rea marcada pela regio
do n. J a imagem D demonstra uma pequena rea de rompimento do
perineuro, mas uma integridade da estrutura........................................................ 52
FIGURA 39 - Imagem de microscopia ptica de cortes referentes amostra do
grupo G6 que sofreram eutansia com 15 dias. As imagens A, B e C so
sequenciadas e se referem aos ns (seta preta) do coto proximal para distal, o
tecido inflamatrio (TI) presente na regio das leses, ilhas de neoformao
indicadas pela seta vermelha ................................................................................ 55
FIGURA 40 - Imagem de microscopia ptica de uma amostra do grupo G6, com a
presena de inmeros vasos sanguneos e tecido conjuntivo espesso corado em
rosa ....................................................................................................................... 55
FIGURA 41 Cortes referentes a eutansia de 30 dias. Imagens A e B revelam
ilhas de neoformao, onde em A a leso j se apresenta com as fibras
organizadas fechando a rea vazia da degenerao e a imagem B as ilhas de
neoformao se apresentam bem definidas. ........................................................ 56
FIGURA 42 imagens de microscopia eletrnica de varredura com amostras do
grupo G6. As setas brancas indicam a regio dos ns, sendo que a imagem A
representa a integridade do epineuro do coto proximal de uma amostra que sofreu
eutansia com quinze dias; a imagem B referente ao coto distal da mesma
amostra que apresenta o epineuro com reas de descontinuidade; a imagem C
representa o coto proximal da amostra deste grupo, com reas de integridade e
descontinuidade do epineuro na eutansia de trinta dias; a imagem D desta
amostra apresenta o epineuro com caractersticas de reas de descontinuidade e
reparo do coto distal na eutansia de trinta dias. .................................................. 57
FIGURA 43 imagem de microscopia ptica da amostra do grupo G6 aps trinta
dias do procedimento cirrgico. A imagem um corte transversal prximo ao coto
proximal com a presena de vasos sanguneos e fascculos em reorganizao.
Ilhas de neoformao so identificadas pelas setas vermelhas. .......................... 57
FIGURA 44 Esquema para visualizao da tomada das trs medidas
consecutivas no mesmo fragmento ....................................................................... 59
FIGURA 45 imagem de microscopia ptica de uma amostra do grupo G4. Os
traos em preto so as distncias medidas entre as duas extremidades da leso
referente a um corte longitudinal. .......................................................................... 59
FIGURA 46 Grfico da distncia mdia transversal de uma mesma amostra de
cada grupo para quantificar a regio da regenerao do tecido nervoso na regio
da leso. Os dados das medidas e desvio padro esto na TABELA 3. .............. 60
LISTA DE SIGLAS
AMPc Adenosina Monofosfato Cclico
ATP Adenosina Trifosfato
BMPb Bone Morphogenetic Bovine Protein
Protena ssea Morfogentica Bovina
CEUA Comisso de tica no Uso de Animais
FELASA Federation of European Laboratory Animal Science Associations.
GAP Growth- associated protein
Protena associada ao crescimento
IPEN Instituto de Pesquisa Energtica e Nucleares
LASER Light Amplification By Stimulated Emission of Radiation
Amplificao de Luz por Emisso Estimulada de Radiao
MEV Microscopia Eletrnica de Varredura
NF-Kb Factor Nuclear Kappa B
Fator Nuclear Kappa B
NGF Nerve Growth Factor
Fator de Crescimento Neural
SNC Sistema Nervoso Central
SNP Sistema Nervoso Perifrico
1
INTRODUO
No cotidiano da rea mdica e odontolgica situaes clnicas ou
cirrgicas podem gerar leses em nervos perifricos. Neste captulo so
apresentadas situaes que possam causar essas leses e a descrio do
processo fisiolgico presente no decorrer da degenerao do nervo. So
apresentadas opes de tratamento para regenerar o tecido ou minimizar as
consequncias dessas manipulaes.
2
1) INTRODUO
Na rea mdica em geral, ou na Odontologia especificamente, so
vivenciadas situaes clnicas e cirrgicas que envolvem a manipulao do tecido
nervoso perifrico1.
A origem do processo da degenerao nervosa pode ser um acidente
sofrido pelo paciente ou mesmo por uma manipulao necessria prxima ou
direta na estrutura desse tecido. Assim, danos podem surgir e gerar sintomas
desagradveis ao paciente. Os sintomas neurossensoriais ou neuromotores
geram desconforto, que exige do profissional, iniciativas teraputicas para
tratamento de cura ou minimizao da queixa presente2.
Com isto, terapias so elaboradas e estudadas para tratamento ou a
minimizao de sintomas consequentes desta manipulao. As leses
neurossensoriais causadas no tecido nervoso so estudadas neste experimento,
como neuropatias, especificamente a parestesia3.
Existem procedimentos cirrgicos nas diversas reas mdicas e
odontolgicas que exigem do profissional muita preciso e habilidade, pois na
execuo so manipuladas estruturas nervosas que podem levar parestesia
temporria ou permanente. Alguns exemplos: cirurgias de terceiro molar,
traumatismos da face, implantes odontolgicos prximos a nervos e, at mesmo
cirurgias especficas como a lateralizao de nervo alveolar inferior4. Esta ltima
refere-se instalao de implantes dentais quando no h estrutura ssea em
altura suficiente para a insero de implantes em mandbula posterior, sendo
necessria a manipulao do nervo, afastando-o para a colocao do implante.
Qualquer manipulao do feixe vsculo-nervoso pode levar a um dano
tecidual que comprometa a integridade das fibras nervosas e a conduo de
informaes ao longo desta estrutura. Essa manipulao classificada como
mecnica, mas causas qumicas podem levar a neuropatias, devido toxicidade
do material. Exemplos disso so os sais anestsicos quando associados a
vasoconstritores5, ou a presena de material obturador endodntico6 em contato
com estrutura tecidual nervosa. As consequncias de uma neuropatia podem ser
desde a destruio da bainha de mielina, at a ruptura total do nervo, ambas
podendo levar a parestesia.
3
A parestesia refere-se a sensaes cutneas subjetivas (ex: frio, calor,
formigamento, presso, etc.) que so vivenciadas espontaneamente na ausncia
de estimulao7. O diagnstico da parestesia crnica baseado na determinao
das sensaes de sensibilidade, formigamento, dormncia e outras, segundo
testes clnicos no paciente. O histrico mdico da pessoa, o exame fsico e testes
laboratoriais so essenciais para este diagnstico.
Para compreender essa anlise clnica no paciente de conhecimento
que no estudo histolgico haver evidncias da degenerao Walleriana, pois
dentro de 24 horas aps o trauma a degenerao dos axnios e das suas bainhas
de mielina j esto presentes. O material resultante da degenerao da mielina e
dos axnios tende a formar enovelados de membranas conhecidas como figuras
de mielina. So encontradas tanto no citoplasma das clulas de Schwann como
em macrfagos que afluem ao local para auxiliar na remoo de debris8. A
evoluo da degenerao fator determinante para propiciar ou comprometer a
regenerao que ir se desencadear. Ento, a interveno teraputica nesta
cascata de eventos da degenerao ir determinar o sucesso, ou no, da
regenerao do tecido conjuntivo nervoso.
O tratamento apropriado para a parestesia depende do diagnstico
preciso da sua causa, do tempo de exposio do nervo e do tempo que a leso se
iniciou. O prognstico tambm depende da severidade das sensaes e das
condies sistmicas do paciente. Sabendo que esta situao est presente no
cotidiano da clnica odontolgica e mdica, o estudo proposto foi feito para coletar
resultados que possam embasar terapias que proporcionem um melhor
prognstico para o paciente em menor tempo.
A proposta deste trabalho avaliar a degenerao Walleriana de
nervos perifricos e o potencial regenerativo de terapias aplicadas no tecido
nervoso de 60 ratos machos Wistar. A leso foi causada no nervo isquitico da
pata direita dos animais e grupos foram tratados com laserterapia de baixa
potncia, com o uso do composto polivitamnico -NERVE9 e com a associao
das duas terapias. As anlises utilizadas so microscopia ptica e microscopia
eletrnica de varredura (MEV), juntamente com a avaliao da capacidade de
locomoo (claudicar) dos animais. Os perodos de anlise foram de 15 e 30 dias
aps a data da leso.
http://pt.wikipedia.org/wiki/Pele
4
REVISO DE LITERATURA
Neste captulo so abordados conceitos sobre o tecido nervoso
perifrico e suas caractersticas de normalidades, situaes que possam levar
a leses da estrutura e como ocorre esse processo da degenerao
Walleriana. Alternativas de tratamento so apresentadas: o uso da laserterapia
de baixa potncia, do composto polivitamnico -NERVE e a associao das
mesmas na regenerao nervosa.
5
2) REVISO DE LITERATURA
Neste captulo so abordados conceitos que definem o tecido nervoso
central e perifrico, caractersticas morfolgicas do tecido nervoso perifrico
comparadas entre a normalidade e a neuropraxia e, opes de tratamento
utilizando o laser de baixa potncia, o composto polivitamnico -NERVE e a
associao de ambos.
2.1) Estrutura de uma fibra nervosa normal
Para compreender o processo da degenerao nervosa necessrio
estabelecer conceitos de normalidade do tecido referido. Esta reviso literria
descreve o sistema nervoso e a fibra nervosa normal e, em seguida, os eventos
que sucedem uma leso.
O Sistema Nervoso anatomicamente dividido em Sistema Nervoso
Central (SNC), formado pelo encfalo e pela medula espinhal, e Sistema Nervoso
Perifrico (SNP), formado pelos nervos e gnglios nervosos, FIG.1. A clula
essencial neste sistema o neurnio.
FIGURA 1 esquema da diviso do sistema nervoso central e perifrico, com nfase aos
componentes do sistema nervoso perifrico
Os neurnios so clulas responsveis pelos impulsos nervosos,
altamente especializadas, dotadas de um corpo celular e numerosos
prolongamentos citoplasmticos denominados neurofibras ou fibras nervosas,
FIG.2. Eles tm a capacidade de serem estimulados por substncias qumicas
Nervos espinhais e
cranianos
Gnglios e terminaes
nervosas
SISTEMA NERVOSO
SNC SNP
6
(neurotransmissores) ou estmulos eltricos geralmente originados em outras
clulas, gerando um potencial de ao ("impulso nervoso").10
FIGURA 2 desenho de um neurnio composto por corpo celular, axnio, dendritos e
terminaes11
O corpo celular do neurnio contm um ncleo grande e arredondado.
As mitocndrias so numerosas e o ergastoplasma, bem desenvolvido. Os
prolongamentos do neurnio podem ser de dois tipos:
- dendritos: ramificaes que tm a funo de captar estmulos;
- axnio: o prolongamento da clula nervosa (varia de fraes de milmetro at
cerca de um metro) que transmite os impulsos nervosos.
A membrana celular do neurnio separa dois ambientes que
apresentam composies inicas prprias: o meio intracelular (citoplasma), onde
predominam ons orgnicos com cargas negativas e potssio; e o meio
extracelular, onde predominam sdio e cloro. As cargas eltricas dentro e fora das
clulas so responsveis pelo estabelecimento de um potencial eltrico na
membrana e o movimento de ons atravs da membrana permitem alteraes
deste potencial: ons s atravessam a membrana atravs de canais inicos,
segundo o gradiente de concentrao. Os axnios tipicamente possuem canais
inicos de sdio (Na) e potssio (K), enquanto o corpo celular, dendritos e
terminaes axonais possuem um grande nmero de canais qumicos. O tipo de
resposta obtido por um transmissor depende do tipo de canal associado que
ativado por ele. Os canais inicos so formados por protenas e caracterizam-se
pela seletividade e, alguns deles, pela capacidade de fechar e abrir12.
7
Os nervos espinhais so formados por conjuntos de axnios que
emergem do corno anterior da medula espinhal (motores) e do gnglio da raiz
dorsal (sensitivos), onde esto seus corpos celulares. O axnio a regio do
neurnio responsvel pela conduo do estmulo nervoso tanto no sentido
centrpeto (inputs sensoriais) quanto no sentido centrfugo (outputs motores). Os
conjuntos de axnios so envoltos por membranas conjuntivas que circundam
todo o nervo - epineuro; feixes de fibras - perineuro e cada fibra individualmente
endoneuro, FIG.3. As bainhas conjuntivas so essenciais para a proteo da fibra
nervosa e esto orientadas de forma a limitar o estiramento mecnico do nervo
tanto por movimentos do corpo, como por foras externas aplicadas sobre ele.
Sua integridade importante nos processos de regenerao nervosa13.
FIGURA 3 Microscopia ptica de um corte transversal de nervo isquitico de rato pertencente ao
grupo controle G1. As estruturas, coradas com hematoxilina e eosina, foram: perineuro,
endoneuro e epineuro.
Acompanhando os axnios do sistema nervoso perifrico, esto as
clulas de Schwann, que ao longo do desenvolvimento, elegem axnios de maior
calibre e se enrolam ao seu redor formando a bainha de mielina. reunio de um
axnio com uma clula de Schwann formadora de mielina d-se o nome de fibra
mielnica. Grupos de axnios de menor calibre so envolvidos por clulas de
Schwann que, neste caso no iro formar mielina, constituindo as fibras
amielnicas. A mielina um componente morfofuncional importante, pois est
diretamente relacionada velocidade de conduo do estmulo eltrico do
nervo14, axnios mais calibrosos conduzem mais rapidamente e, por sua vez, o
calibre do axnio diretamente proporcional espessura da bainha de mielina.
Epineuro
Endoneuro
Perineuro
8
Os axnios so inteiramente dependentes dos seus corpos celulares
para sobreviver; pois no sintetizam protenas; eles so constitudos de axolema
e axoplasma. Axolema: a membrana celular do neurnio constituda de vrias
protenas integrais e perifricas, como, protenas de canais, enzimas e molculas
de adeso alm de fosfolipdios. O citoplasma do axnio, denominado axoplasma,
constitudo por citosol, organelas e incluses axoplasmticas, apresenta
organelas citoplasmticas comuns a todos os tipos celulares exceo de
retculo endoplasmtico granular, ribossomos livres, complexo de Golgi
(presentes apenas no corpo celular, nos dendritos e no cone de implantao do
neurnio). A ausncia do retculo endoplasmtico rugoso torna o axnio inbil
para a sntese de protenas, indispensvel sua sobrevivncia. As protenas e
organelas produzidas no corpo celular se locomovem ao longo do eixo do axnio
atravs de um complexo sistema de transporte mediado por componentes do
citoesqueleto15.
Das estruturas axoplasmticas, a mais eminente o citoesqueleto, que
determina o calibre, padro de crescimento, estabiliza o axolema e promove a
dinmica bsica necessria ao transporte axoplasmtico tanto antergrado (do
corpo celular para a periferia) quanto retrgrado (da periferia para o corpo
celular). Ele formado de microtbulos (25 m de espessura), neurofilamentos
(10 m de espessura) e microfilamentos de actina (4 a 6 m de espessura) 16.
2.2) Definio de clulas de Schwann
As clulas de Schawnn so clulas do sistema nervoso que formam a
bainha de mielina do sistema nervoso perifrico17.
O axnio, uma vez em contato com a clula de Schwann chamado de
fibra. As clulas de Schwann no formadoras de mielina se estendem ao longo de
grupos de axnios sendo que cada axnio separado do outro por um sulco
longitudinal18. Essas fibras so conhecidas como amielnicas. Nas fibras
mielnicas, um nico axnio envolvido a cada internodo por uma clula de
Schwann que se enrola ao seu redor formando lamelas concntricas.
A mielinizao comea quando o axnio atinge o dimetro de 1 a 2 m.
Embriologicamente, o processo de mielinizao no se encerra durante a
formao intra-uterina, mas se completa at dois anos de idade em humanos.
9
Qualquer subsequente aumento no comprimento do axnio aps o trmino da
mielinizao, ocorre custa de aumento no comprimento dos internodos j
existentes e no adio de novos internodos19.
2.3)Tecido nervoso e trauma
Segundo Krogh et al20, os nervos perifricos no toleram compresso,
alongamento e angulaes bruscas. O mecanismo de injria parece ser uma
combinao de fatores, incluindo edema endoneural, dano ao sistema
microcirculatrio dentro do nervo, dano s barreiras de difuso, desenvolvimento
de uma miniatura de sndrome de compartimento nos fascculos do nervo e, em
alguns casos, desmielinizao segmental at a degenerao Walleriana.
Cicatrizes intraneurais podem se desenvolver tardiamente e impedir a
regenerao nervosa.
A degenerao do nervo perifrico caracterizada pela destruio do
coto distal quando uma injria causada no corpo da clula. O processo se
caracteriza pela destruio do axnio e da bainha de mielina21. Essa degenerao
denominada degenerao Walleriana.
2.4) Processo fisiolgico da degenerao Walleriana
A Degenerao Walleriana compreende uma srie de eventos22 que se
dividem basicamente em:
o alteraes no citoesqueleto;
o alteraes nas clulas de Schwann e na bainha de mielina;
o alteraes nas barreiras hemato-nervosas;
o respostas dos macrfagos. As alteraes comeam de forma centrpeta ou
centrfuga em relao ao local da leso, ou seja, a degenerao ocorre de
forma simultnea ao longo do axnio, sendo que fibras mielnicas, maiores, ou
menores, degeneram-se ao mesmo tempo.
Poucas horas aps a leso, a maior parte do coto distal apresenta-se
normal exceto pela regio imediatamente distal leso (zona de trauma), a qual
apresenta acmulos de organelas, FIG.4. Este acmulo se deve ao material
transportado retrogradamente.
10
coto proximal coto distal
leso
FIGURA 4- esquema para ilustrar o sentido da degenerao do nervo e a presena de organelas
setas vermelhas - aps uma leso no tecido nervoso perifrico
Outra alterao precoce na zona de trauma o edema endoneural,
refletindo quebra na barreira hemato-nervosa. No restante do coto distal, as
alteraes so sutis: h uma tendncia a acmulo de organelas sob os nodos de
Ranvier (espaamento isento de mielina, internodal), e incisuras de Schmidt-
Lantermann (incisuras do citoplasma da clula de Schwann que percorrem a
bainha de mielina desde a face externa at a face interna)23.
A durao deste estgio inicial varia entre as espcies. Nos
invertebrados a degenerao Walleriana mais lenta do que nos mamferos,
depende do comprimento do coto distal, ou seja quanto maior, mais longa a
sobrevida, e depende da temperatura, a sobrevida maior em tecidos com
temperatura mais baixa, devido a desnaturao de protenas24.
Em condies normais, a concentrao intra-axonal de ons clcio
muito baixa; em fibras amielnicas sua distribuio homognea, mas nas
mielnicas, o clcio parece confinado a domnios especficos (maior concentrao
no axoplasma nodal, menor sob as incisuras de Schmidt-Lanterman e nenhum
clcio associado ao axolema). Em fases precoces de degenerao Walleriana (30
horas aps leso) a precipitao de clcio caracteriza reas de desintegrao do
citoesqueleto, o que definitivamente coloca o clcio como protagonista do
processo25.
Fisiologicamente, a transmisso sinptica interrompida
precocemente, mesmo antes das primeiras alteraes morfolgicas detectveis,
devido degenerao do terminal sinptico. O momento exato em que h esta
falha, no entanto, difcil precisar, j que depende de onde o nervo foi lesado,
uma vez que quanto mais prxima do terminal for leso, mais rapidamente a
transmisso sinptica ser interrompida26.
11
Aps estas alteraes preliminares, segue-se a desintegrao granular
do citoesqueleto, que tem incio em torno de 24 horas aps a leso, quando se
pode observar um pequeno nmero de fibras com degenerao do citoesqueleto
axonal. 30 horas aps a leso, possvel detectar o comprometimento de
aproximadamente 25% das fibras, sendo que as 75% restantes, apresentam-se,
metade normais, e a outra metade em processo inicial de desintegrao27.
Quarenta e oito horas aps a leso restam apenas raras fibras
normais. A desintegrao do citoesqueleto axonal constitui um processo ativo de
degradao por protelise enzimtica possivelmente mediada por calpanas, que
so proteases ativadas por clcio.
Aps a instalao do processo de desintegrao granular do
citoesqueleto iniciam-se as respostas de clulas no neuronais leso, sendo
uma das primeiras, a quebra na barreira hemato-nervosa, que ocorre aps a
desintegrao do citoesqueleto, de 24 a 48 horas ps-trauma. A desintegrao de
um pequeno nmero de axnios j parece ser suficiente para deflagrao deste
evento28.
As clulas de Schwann respondem de forma intensa leso axonal.
Paulatinamente, h uma ampliao dos nodos de Ranvier em virtude da retrao
da mielina paranodal. As alas terminais de mielina separam-se do axolema,
separam-se e vacuolizam-se. O citoplasma da clula de Schwann aumenta seu
volume prximo aos nodos e emite processos que se insinuam entre as alas
terminais de mielina e o axolema, e tambm entre as lamelas, levando a uma
retrao ainda maior da mielina. As alteraes axonais precedem as da mielina,
porm, algumas fibras j as apresentam alteradas 24 horas aps a leso29.
Cerca de 70 horas aps o incio da desintegrao do citoesqueleto (3
dia aps a leso), as clulas de Schwann entram em diviso celular (fase
proliferativa) e atingem o mximo de atividade em quatro dias. As clulas de
Schwann resultantes das divises celulares formam cadeias de clulas que se
sobrepem formando as bandas de Bngner (condutos longitudinais formados
pelas clulas de Schwann em proliferao). Nas fibras amielnicas degeneradas,
tambm ocorre mitose nas clulas de Schwann, juntamente com a replicao das
clulas endoneurais, como por exemplo: fibroblastos, mastcitos e clulas
endoteliais. A diviso celular das clulas de Schwann corresponde a importantes
12
modificaes na sntese protica destas clulas, que incluem sub-regulao da
maior parte das protenas de mielina e associadas mielina30. Esta sub-regulao
dependente da perda axonal. A sntese de fatores neurotrficos, como o fator de
crescimento neural (NGF), protena associada ao crescimento 43 (GAP-43) e
seus receptores, esto sobre-regulados devido sub-regulao dos
neurofilamentos e protenas na regio lesada, em consequncia do aumento dos
nveis de adenosina monofosfato cclico (AMPc)31.
A GAP-43 est associada ao crescimento e mobilidade do cone do
tecido nervoso. Inicialmente foi observada apenas nos axnios, posteriormente
notou-se que as clulas de Schwann tambm liberam esta protena, isto
observado em cones distais de crescimento nervoso32. O papel desta protena
est relacionado notificao do citoesqueleto e adeso entre os cotos de
axnios lesados33.
Os eventos celulares e moleculares envolvidos no processo de
degenerao nervosa aparentemente visam proporcionar caminhos para que
ocorra a regenerao. No sistema nervoso perifrico, diferentemente do sistema
nervoso central, isto muitas vezes possvel e acredita-se que o sucesso da
regenerao aps leso do sistema nervoso perifrico, se deva ao meio ambiente
propcio, especialmente presena das clulas de Schwann34,35.
As leses nervosas so classificadas em trs grupos36 de acordo com a
gravidade do dano:
Neuropraxia: leso onde ocorre alterao da bainha de mielina, sem perda da
continuidade do nervo, no ocorrendo a degenerao deste, onde seu
mecanismo de leso pode ocorrer por contuso ou compresso.
Axoniotmese: mais grave que a neuropraxia, apresenta interrupes tanto na
bainha de mielina quanto no axnio. Basicamente, ocorre a interrupo dos
axnios, permanecendo intacto o tecido conectivo que o rodeia e, portanto,
sem perda da continuidade no nervo. Clinicamente, existe uma perda
completa da funo nervosa, tanto motora como sensitiva.
Neurotmese: caracteriza-se pela perda da continuidade anatmica do nervo
produzida geralmente por seco do mesmo, com a manuteno parcial ou
no do perineuro, sendo a mais frequente e a mais grave das leses nervosas.
13
2.5) Fisiopatologia da leso
A neuropraxia resulta da compresso, promovendo uma anxia local
dos axnios por compresso dos vasos sanguneos. Ocorre um fenmeno de
adelgaamento da fibra nervosa com desmielinizao focal (diminuio
axoplasmtica intensa e localizada)37. A conduo nervosa se mantm
preservada acima e abaixo do local de leso, no ocorrendo degenerao
Walleriana (decomposio qumica da bainha de mielina em material lipdico e
fragmentao das neurofibrilas).
Uma vez removido o processo compressivo, ocorre remielinizao,
reaparecendo a conduo em dias ou semanas, com funo nervosa condutiva
normal.
Na neuropraxia a alterao patolgica presente a desmielinizao
das fibras nervosas. Este fenmeno leva perda da condutividade, mas sem
qualquer degenerao de axnios38.
2.6) Caractersticas histolgicas da regenerao de nervos perifricos
Os nervos perifricos podem se regenerar de trs diferentes maneiras,
dependendo do mecanismo da injria:
Na desmielinizao segmentar, a camada de mielina lesada se recompe num
processo chamado de remielinizao. Esta a forma mais rpida de
recuperao, ocorrendo entre 2 e 12 semanas aps a leso. Nas leses
nervosas onde a continuidade dos axnios interrompida, parcial ou
totalmente, ocorre degenerao axonal distal leso, pois a comunicao com
o corpo celular interrompida. Isto inicia nos primeiros minutos aps a leso.
Aps as primeiras 24 horas, esta degenerao j evidente e a destruio
das bainhas de mielina se inicia. Aps o terceiro dia inicia-se a quebra da
bainha de mielina que se torna mais evidente a partir do quinto dia.
Histologicamente, esse fenmeno conhecido como cmaras de digesto de
mielina. Aps trs semanas da leso axonal ter ocorrido, inicia-se o processo
de regenerao do nervo39.
Nas leses axonais parciais ocorre um processo conhecido como brotamento
axonal, onde axnios vizinhos intactos passam a inervar a rea desnervada
pela injria. Este fenmeno demora de dois a seis meses para ocorrer40.
14
Aps uma leso completa de um nervo perifrico, a regenerao das fibras
proximais somente ocorre se houver preservao do corpo celular, presente
no corno anterior da medula para os axnios motores e no gnglio da raiz
dorsal para os axnios sensoriais.
2.7) Terapias que modulam a regenerao nervosa
2.7.1) Laser - definio
LASER significa Light Amplification By Stimulated Emission of Radiation,
ou seja, dispositivo que gera intenso feixe de luz monocromtico, coerente e
colimado, podendo ter como meio ativo gs, slido ou lquido41.
A radiao laser pode ser refletida, transmitida, absorvida e espalhada por
um sistema biolgico e, depende das micro e macroestruturas do meio42.
2.7.1.1) Radiaes ionizantes e no ionizantes
Radiao ionizante a radiao que possui energia suficiente para
ionizar tomos e molculas, podendo danificar clulas e afetar o material gentico
de seres vivos, causando doenas graves ou at levando a morte. Exemplos de
radiao ionizante: a radiao eletromagntica ultravioleta e partculas como os
eltrons e os prtons que possuem altas energias. As partculas podem ser: alfa,
beta (eltrons e psitrons), os raios gama, raios-x e nutrons.
Esse tipo de radiao pode ser usada para pesquisa, diagnstico e
tratamento na medicina estando todos esses usos sujeitos s regulaes
governamentais. Nas aplicaes das radiaes ionizantes, o planejamento da
dosimetria nos tratamentos que usam feixes de radiao envolve a estimativa da
densidade de energia no tecido, que usada para determinar no apenas a
profundidade de penetrao da radiao, mas o valor e a posio de mxima
energia dentro do tecido.
J para a radiao no-ionizante, como o caso dos lasers, mesmo
conhecendo as propriedades pticas do tecido-alvo, no possvel prever com
preciso quo longe o fton se propagar antes de causar algum tipo de
interao. O motivo que na radiao no-ionizante, o mecanismo de interao
com o tecido varia de acordo com o comprimento de onda incidente e com as
caractersticas pticas do tecido-alvo, que heterogneo e complexo, tornando
http://pt.wikipedia.org/wiki/Radia%C3%A7%C3%A3ohttp://pt.wikipedia.org/wiki/Energiahttp://pt.wikipedia.org/wiki/Ionhttp://pt.wikipedia.org/wiki/%C3%81tomohttp://pt.wikipedia.org/wiki/Mol%C3%A9culahttp://pt.wikipedia.org/wiki/Radia%C3%A7%C3%A3o_eletromagn%C3%A9ticahttp://pt.wikipedia.org/wiki/El%C3%A9tronhttp://pt.wikipedia.org/wiki/Pr%C3%B3tonhttp://pt.wikipedia.org/wiki/Part%C3%ADculas_alfahttp://pt.wikipedia.org/wiki/Part%C3%ADcula_betahttp://pt.wikipedia.org/wiki/Part%C3%ADcula_betahttp://pt.wikipedia.org/wiki/P%C3%B3sitronhttp://pt.wikipedia.org/wiki/Raios_gamahttp://pt.wikipedia.org/wiki/Raios-xhttp://pt.wikipedia.org/wiki/N%C3%AAutrons
15
extremamente difcil modelar todas as possveis interaes e, portanto, a trajetria
dos ftons e o valor mximo da densidade de energia dentro do tecido41
2.7.1.2) Fundamentos sobre o laser
O laser a amplificao de luz e sua emisso depende do meio ativo
utilizado. O meio ativo uma coleo de tomos, molculas ou ons que emitem
radiao eletromagntica. gerado um processo de excitao, chamado
bombeamento, e o meio ativo amplifica a radiao. Praticamente, no existe
disperso ou espalhamento neste feixe. O laser quando acionado pode ser
contnuo ou pulstil. Para atingir o alvo, o laser pode ser entregue por fibra ptica,
que permite contato com o tecido e pode consistir em fibroscpio com sistema de
visualizao; guia de onda oco, que consiste em tubos flexveis com superfcie
interna refletora; brao articulado, que consiste em espelhos localizados nos
cotovelos do brao e que direcionam o feixe ao longo dele; endoscpio, que
pode ser acoplado a um microscpio.
2.7.1.3) Tipos de lasers: de baixa e alta potncia
O laser classificado em: laser de alta potncia ou cirrgicos, com
potencial efeito trmico, apresent propriedades de corte, vaporizao e
hemostasia; e laser de baixa potncia ou teraputicos, apresentando
propriedades analgsicas, anti-inflamatrias e de bioestimulao. Exemplos: o
laser de Hlio-Nenio (He-Ne), cujo comprimento de onda 632,8nm, ou seja, na
faixa de luz visvel (luz vermelha); o laser de Arseneto de Galio-Aluminio (Ga-Al-
As), cujo comprimento de onda se situa fora do espectro de luz visvel (luz
infravermelha), sendo mais comumente 630-980nm, e o laser combinado de
Hlio-Nenio diodo. Alguns dos lasers utilizados em Odontologia esto situados
na faixa de luz visvel e outros na faixa do infravermelho43.
O laser teraputico baseia-se no conceito de bioestimulao. Este
conceito surgiu em 1967 quando Endre Mester estudou a radiao laser em
camundongos. Ele acreditou que o laser poderia causar cncer44. O estudo foi
feito com um laser de rubi de baixa potncia, com comprimento de onda de
694nm em um grupo de camundongos que teve o dorso depilado. O resultado
final no foi o desenvolvimento do cncer, e sim, o crescimento mais rpido de
pelos. Este fato descrito foi precursor, mas com o passar do tempo os
16
conceitos foram se modificando e o uso da laserterapia se tornando cada vez
mais rotineiro na rea mdica. Portanto, entender como a energia de lasers
trabalha nos nveis celulares e quais os parmetros timos de irradiao para os
diferentes usos destas fontes de luz se faz necessrio para seu uso seguro.
A fototerapia utilizada e estudada h muito tempo45, mas atualmente
os estudos buscam entender como a energia de lasers teraputicos atua nos
nveis celulares, ou seja, a fotobiologia do tecido, para que se possa determinar
os parmetros timos de irradiao para os diferentes usos destas fontes de luz.
2.7.1.4) Fotobiologia do tecido
A primeira lei da fotobiologia postula que, para a luz visvel de baixa
potncia ter qualquer efeito em um sistema biolgico vivo, os ftons devem ser
absorvidos pelas bandas de absoro eletrnica ou bandas de vibraes
moleculares pertencentes a alguma molcula que age como um cromforo ou
fotorreceptor46. Um cromforo para a luz visvel uma molcula (ou parte de uma
molcula) na qual a diferena de energia entre os eltrons em dois orbitais
moleculares diferentes coincide com a energia do fton. Numerosos exemplos de
cromforos existem na natureza, tais como clorofila nas plantas, em algas
bacterioclorofila bluegreen, flavoprotenas e de hemoglobina encontrada nas
clulas vermelhas do sangue47.
Um modo de encontrar este cromforo especfico medir o espectro
de absoro. O espectro de absoro em funo do comprimento de onda
indicar quais comprimentos de onda so mais efetivos para um tipo de tecido
biolgico. Em 1989, foi sugerido que o mecanismo de ao da terapia com laser
de baixa potncia em nvel celular era baseado na absoro da radiao
monocromtica visvel e no infravermelho prximo por componentes da cadeia
respiratria celular48.
Como o efeito dessa terapia depende da energia envolvida, a
mitocndria, organela da cadeia respiratria, tem funo relevante no processo. A
mitocndria desempenha um papel importante na gerao de energia e no
metabolismo celular, e se diferenciam por possuir duas membranas e geralmente
tm formato arredondado, com dimenso da ordem de 1 a 10 m. Elas convertem
molculas de glicose em energia na forma de adenosina trifosfato (ATP) por meio
17
do processo de fosforilao oxidativa. As mitocndrias participam do processo de
catabolismo usando caminhos metablicos que incluem o ciclo de Krebs, a
oxidao de cido graxo e a oxidao de aminocidos. Segundo uma reviso
literria de 201049, as mitocndrias so consideradas os fotorreceptores
principais, e o aumento de adenosina trifosfato, o oxignio reativo, o clcio
intracelular, a liberao de xido ntrico so eventos iniciais da cadeia metablica.
Alm do conceito de cromforos, uma considerao importante no uso
da laserterapia so as propriedades pticas do tecido alvo. Tanto a absoro
quanto o espalhamento da luz so dependentes do comprimento de onda, sendo
que na regio azul do espectro maior que no vermelho. Os principais
cromforos do tecido so: gua, hemoglobina e melanina, estas ltimas possuem
alta banda de absoro em comprimentos de onda menores que 600 nm, a gua
comea a absorver significativamente em comprimentos de onda maior do que
1150 nm.. Portanto, embora as luzes azul, verde e amarela possam ter efeitos
significativos sobre clulas em crescimento em meios de cultura opticamente
transparentes, o uso da laserterapia em animais, majoritariamente envolve as
luzes vermelha e infravermelha50.
Muitas das aplicaes dessa terapia esto na neurologia, envolvendo o
sistema nervoso central e perifrico. Muitas doenas ou leses cerebrais graves
podem se tratadas com sucesso com laserterapia, sem necessitar de
procedimentos invasivos. Alm disso, no sistema nervoso perifrico, pode ser
utilizado eficazmente para a regenerao de nervos e para alvio da dor51.
A terapia com o laser modula tambm o fator nuclear transcricional
Kapa B, o NF-kB. Ele um fator de transcrio regulador de expresso gnica52
que pode governar vrias funes celulares, incluindo a resposta inflamatria
induzida por estresse e sobrevivncia53 celular. Entender os mecanismos de
ativao que governam o NF-kB pode ser importante no estudo da reparao do
tecido ou mesmo na progresso do cncer. O NF-kB um fator de transcrio
sensvel a redox54 que tem sido proposto ser o sensor para estresse oxidativo55.
2.7.2) Biomaterial
Segundo a Sociedade Europia de Biomateriais, em 1987, o termo era
definido como um material no vivo utilizado como dispositivo mdico, para
18
interagir com sistemas biolgicos (Consensus Conference on Definitions in
Biomaterials Science of the European Society for Biomaterials). Esse conceito
considerava apenas material no vivo e, foi se modificando de acordo com os
estudos que avaliavam a interao do biomaterial e do tecido receptor. Em 1992
Willians56 designou biomateriais como uma classe de substncias naturais ou
sintticas que em contato, de forma permanente ou no, com tecidos e fluidos de
seres vivos, no causam efeitos deletrios ao organismo.
Em 2007 segundo Park e Lakes57 o conceito de biomaterial pode ser
definido como qualquer material usado na fabricao de dispositivos para
substituir uma parte ou funo do corpo de forma segura, confivel, econmica e
fisiologicamente aceitvel.
Atualmente, o conceito de biomaterial se baseia em um estudo de
2009: biomaterial toda substncia projetada para assumir uma forma que, por si
s ou como parte de um sistema complexo, utilizada para direcionar, atravs do
controle das interaes com os componentes dos sistemas vivos, o percurso de
qualquer procedimento de diagnstico ou teraputico, no ser humano ou na
Medicina Veterinria58.
A origem do biomaterial pode ser de natureza biolgica ou sinttica.
Inicialmente,a procura de tais compostos se deu com a utilizao de materiais de
origem biolgica como autgenos (onde o doador o prprio receptor), algenos
(onde o doador e o receptor so da mesma espcie) e xengenos (onde o doador
de origem animal)59. Com a evoluo da Engenharia dos tecidos trabalhos
foram realizados com o objetivo de dispor de materiais de origem sinttica com
caractersticas adequadas que permitam diminuir e, em alguns casos eliminar o
uso de materiais de origem biolgica.
Para que um biomaterial possa desempenhar uma determinada funo
seja de substituir, aumentar ou suportar uma estrutura, dois princpios fisiolgicos
devem ser considerados: a biofuncionalidade e a biocompatibilidade. Esses
princpios so considerados desde a escolha do material para a sua fabricao
at a determinao da funo a que se destina. O processo de fabricao tem
incio com a seleo do material, podendo este ser metal ou liga, materiais
cermicos, polmeros de natureza variada ou compsitos; com a anlise de
quantidade dos mesmos; e por fim, com a anlise das possveis reaes no
http://pt.wikipedia.org/wiki/Metaishttp://pt.wikipedia.org/wiki/Cer%C3%A2micohttp://pt.wikipedia.org/wiki/Pol%C3%ADmero
19
organismo de acordo com critrios qumicos, fisiolgicos e mecnicos da relao
do biomaterial com o organismo receptor60.
A biocompatibilidade a capacidade do material de gerar uma
resposta, com o mnimo de reaes alrgicas, inflamatrias ou txicas, quando
em contato com os tecidos vivos ou fluidos orgnicos61. A biocompatibilidade
compreende as interaes dos tecidos in vivo, ou em fluidos, incluindo sangue,
com um implante ou biomaterial. As interaes podem ser do meio fisiolgico
sobre o material ou ao do material no tecido, sendo difcil separar estas duas
interaes.
A biofuncionabilidade caracteriza a funo a qual o biomaterial se
destina. Ela se baseia nas propriedades especficas do material sejam elas
mecnicas, qumicas, pticas, eltricas.
Todo material implantado em tecidos vivos causa uma resposta no
organismo hospedeiro. Os biomateriais podem ser classificados de acordo com o
comportamento fisiolgico gerado quando na interao com o hospedeiro..
O biomaterial pode ser bioinerte, biotolervel, biorreabsorvvel e
bioativo. O material bioinerte no libera nenhum tipo de componente ou
quantidade mnima do biomaterial, sendo considerado estvel e mantendo suas
propriedades fsicas e mecnicas. O material bioinerte utilizado para
revestimento de tecidos ou para sustentao mecnica. Exemplos: titnia,
zircnia, alumina62. O biotolervel o material que quando em contato com o
organismo apresenta a formao de tecido fibroso ao seu redor. Esta camada
induzida por meio da liberao de compostos qumicos, ons, produtos de
corroso e outros. atravs da espessura dessa camada fibrosa que a toxicidade
do material determinada. Exemplos: polmeros sintticos e metais. O material
biorreabsorvvel aquele que aps certo perodo de tempo em contato com os
tecidos degradado, solubilizado ou fagocitado pelo organismo. Exemplo: fosfato
triclcico. O material bioativo promove ligaes qumicas com o tecido receptor.
Exemplo: hidroxiapatita63.
Para que um material seja aceito como biomaterial e utilizado em seres
vivos, vrios testes so exigidos primeiramente. O teste de citotoxidade o teste
inicial para avaliar a biocompatibilidade de qualquer material para uso mdico ou
odontolgico. Esse teste pode ser uma avaliao qualitativa e/ou quantitativa. A
http://pt.wikipedia.org/wiki/Organismo
20
avaliao qualitativa observa as mudanas morfolgicas das clulas. A avaliao
quantitativa investiga os parmetros celulares como a morte celular, a inibio do
crescimento, proliferao celular ou formao de colnias64.
De acordo com o rgo Internacional de Padronizao (International
Standard Organization), ISO 1099365, aps a utilizao de testes de citotoxidade
in vitro, e comprovada a sua no toxicidade que o estudo de biocompatibilidade
do produto pode ter continuidade, sendo realizados os ensaios necessrios em
animais de laboratrio.
Vrios mtodos in vitro para avaliar a toxicidade de biomateriais foram
padronizados utilizando culturas celulares. Consistem em colocar o material direta
ou indiretamente em contato com uma cultura de clulas de mamferos,
verificando as alteraes celulares por diferentes mecanismos, entre os quais a
incorporao de corantes vitais ou a inibio da formao de colnias celulares. O
parmetro mais utilizado para avaliar a toxicidade a viabilidade celular, que
pode ser evidenciada com auxlio de corantes vitais como o vermelho neutro,
solvel em gua e que passa atravs da membrana celular, concentrando-se nos
lisossomos, fixando-se por ligaes eletrostticos hidrofbicas em stios aninicos
na matriz lisossomal. Muitas substncias danificam as membranas resultando no
decrscimo de captura e ligao do vermelho neutro. Portanto, possvel
distinguir entre clulas vivas e danificadas ou mortas, pela medida de intensidade
de cor da cultura celular66. O uso de culturas celulares tem como vantagem a
rapidez, o custo, a sensibilidade e so reprodutveis.
No atual trabalho o biomaterial utilizado nomeado como composto
polivitamnico -NERVE e ser descrito a seguir.
2.7.2.1) O biomaterial utilizado no estudo: composto polivitamnico -
NERVE
O biomaterial compreende uma composio de vitaminas e sais
minerais fornecido pela JHS-Biomaterials, Sabar, Brasil. Segundo a empresa, o
biomaterial experimental aplicado diretamente na leso e, tem a capacidade de
limitar a ao dos radicais livres. Dados fornecidos pelo fabricante, segundo a
funo dos componentes: antioxidantes - -caroteno, -tocoferol, sais de selnio
e zinco; atividade metablica - complexo B, calciferol, sais de magnsio, sais de
21
fsforo, cido glutmico e lecitina de soja; agentes aglutinadores colgeno
hidrolisado, sulfato de glicosaminoglicanas e sulfato de condroitina.
O biomaterial apresenta uma consistncia de uma resina epxi que
aplicada ao redor da leso nervosa. A consistncia se d pela presena do
colgeno hidrolisado, do sulfato de glicosaminoglicanas e do sulfato de
condroitina em sua composio.
Segundo o fabricante, este biomaterial recebeu esta nomenclatura para
simbolizar a trade do processo de reparo: proteo celular, fornecimento de
nutrientes ATP e indicao do tecido. De acordo com a descrio, deve
proporcionar a reduo do dano oxidativo e melhorar a sustentao metablica
local para o tecido desejado: sseo ou nervoso. Os resultados histolgicos
realizados em animais indicaram uma preservao ou regenerao do tecido
envolvido67.
Allegrini68 avaliou o efeito da protena morfogentica ssea bovina
(BMPb), do composto polivitamnico e da hidroxiapatita quando inseridos em leito
sseo na tbia de coelho. Nesse estudo a BMPb e o composto no
desencadearam efeitos positivos no processo de deposio ssea em
comparao ao grupo da hidroxiapatita. O composto no foi absorvido pelo
organismo ficando entre o osso e a hidroxiapatita.
Em 2007, Salles69 estudou o estresse oxidativo agudo aps trauma
cirrgico, pela ativao de uma endonuclease sensvel ao estresse, o fator
nuclear kappa-beta (NF-kB), avaliada em cortical ssea de ratos Wistar. As
causas do estresse oxidativo pode ser dividido em duas classes: interna
(inflamao, reao auto-imune, problemas metablicos e isquemia) e externa
(organismos microbiolgicos, radiao eletromagntica ou mecnica, ao
trmica ou qumica), ocasionando falta de habilidade do organismo ou da clula
para se defender contra as espcies reativas do oxignio e ou nitrognio. A NF-kB
considerada um fator de estresse cuja ativao induz a produo de citocinas
pr-inflamatrias, a morte ou adaptao celular. O estresse se apresentou
reduzido indicando a influncia do composto no equilbrio da oxidao no tecido
sseo.
22
2.7.3) Microscopia eletrnica de varredura (MEV)
O microscpio eletrnico de varredura um tipo de microscpio
eletrnico capaz de produzir imagens de alta resoluo da superfcie de uma
amostra. Devido a maneira com que as imagens so criadas, imagens de MEV
tem uma aparncia tridimensional caracterstica e so teis para avaliar a
estrutura superficial de uma dada amostra.
Quando o feixe primrio interage com a amostra, os eltrons perdem
energia por disperso e absorso em um volume em forma de gota, conhecido
como volume de interao, o qual se estende de menos de 100 nm at em torno
de 5 m para dentro da superfcie da amostra. O tamanho do volume de interao
depende da energia dos eltrons, do nmero atmico dos tomos da amostra e
da densidade da amostra. A interao entre o feixe de eltrons e a amostra
resulta na emisso de eltrons secundrios, eltrons retroespalhados, eltrons
Auger, raios-x, radiao eletromagntica na regio do infravermelho, do visvel e
do ultravioleta e fnons, causando o aquecimento da amostra.
O microscpio eletrnico de varredura (MEV) um equipamento capaz
de produzir imagens de altos aumentos (at 300.000 x) e resoluo. As imagens
fornecidas pelo MEV possuem um carter virtual, pois o que visualizado no
monitor do aparelho a transcodificao da energia emitida pelos eltrons, ao
contrrio da radiao de luz. O princpio de funcionamento do MEV consiste na
emisso de feixes de eltrons por um filamento capilar de tungstnio (eletrodo
negativo), mediante a aplicao de uma diferena de potencial que pode variar de
0,5 a 30 KV. Essa variao de voltagem permite controlar a acelerao dos
eltrons. A parte positiva em relao ao filamento do microscpio (eletrodo
positivo) atrai fortemente os eltrons gerados, resultando numa acelerao em
direo ao eletrodo positivo. A correo do percurso dos feixes realizada pelas
lentes condensadoras que alinham os feixes em direo abertura da objetiva. A
objetiva ajusta o foco dos feixes de eltrons antes dos eltrons atingirem a
amostra analisada.
A preparao das amostras depende das caractersticas das mesmas:
slidos no condutivos so recobertos por material condutivo, ouro ou carbono,
ou o material pode ser embutido em resina, amostras biolgicas so desidratadas
e recobertas com material condutivo70.
http://pt.wikipedia.org/wiki/Microsc%C3%B3pio_eletr%C3%B4nicohttp://pt.wikipedia.org/wiki/Microsc%C3%B3pio_eletr%C3%B4nicohttp://pt.wikipedia.org/wiki/F%C3%B4non
23
OBJETIVO
O captulo a seguir apresenta as propostas da tese que
configuram o objetivo do trabalho.
24
3) OBJETIVO
O objetivo do estudo avaliar o potencial regenerativo de terapias para
tratamento de neuropatias do sistema nervoso perifrico, comparando os efeitos
de cada tratamento aplicado em uma determinada leso. O estudo consiste na
compresso do nervo isquitico de ratos Wistar com ns de fio de sutura e
aplicao de terapias para tratamento da mesma: laser de baixa potncia,
biomaterial -NERVE e a associao das duas. A anlise dos resultados da
microscopia ptica e microscopia eletrnica de varredura, juntamente com as
caractersticas de locomoo dos animais, tm como objetivos especficos:
o Identificar, nas amostras histolgicas do experimento, as
caractersticas da degenerao Walleriana;
o Avaliar os efeitos do laser, do biomaterial e da associao de ambos
no processo da degenerao e regenerao tecidual nervosa;
o Comparar grupos de animais tratados e no tratados;
o Analisar as vantagens e desvantagens de cada terapia;
o Eleger uma terapia favorvel para a regenerao do tecido nervoso
perifrico.
25
MATERIAIS E MTODOS
Neste captulo descrita a metodologia para obteno da leso
nervosa causada nos animais, as terapias utilizadas para tratamento, a
manipulao do equipamento de laser de baixa potncia, a descrio do
biomaterial utilizado e dos testes in vitro, a obteno das amostras para estudo
histolgico dos grupos de animais e a coleta dos dados obtidos com a
microscopia ptica e eletrnica de varredura.
26
4) MATERIAIS E MTODOS
Este estudo foi submetido e aprovado pela Comisso de tica no Uso de
Animais (CEUA) do Instituto de Pesquisa Energtica e Nucleares (IPEN), segundo
a numerao 110/12.
4.1) Grupos experimentais
Para este experimento foram utilizados sessenta ratos machos da linhagem
Wistar com massa corprea aproximada de 350g provenientes do prprio Biotrio
do Instituto de Pesquisa Energticas e Nucleares (IPEN).
Os animais ao atingirem a massa corprea desejada foram alojados em
gaiolas de conteno de polipropileno, agrupados em nmeros de trs, ou dois,
animais por gaiola correspondendo aos cinco animais de cada grupo em estudo,
FIG.5. As gaiolas possuem gua e rao ad libitum, mantidos em perodos
claro/escuro de 12 horas, temperatura mdia de 22 2 C, FIG.6, diminuindo o
estresse destes animais71. Estes animais seguiram regra e regulamentos da
FELASA Federation of European Laboratory Animal Science Associations.
FIGURA 5 - animais acomodados na gaiola
FIGURA 6 - gaiolas organizadas nas prateleiras
Os animais foram divididos aleatoriamente em seis grupos com 5
animais em cada, TAB.1:
Grupo 1 (G1) controle, no foi realizado nenhum tipo de tratamento;
Grupo 2 (G2) cirurgia Sham ou simulacro, o feixe nervoso foi exposto
atravs de uma inciso e dissecao at sua visualizao, porm no foi
realizada nenhuma manobra cirrgica;
27
Grupo 3 (G3) cirurgia com exposio e com compresso do nervo;
Grupo 4(G4) cirurgia com compresso do nervo e animais tratados com o
biomaterial -NERVE;
Grupo 5 (G5) cirurgia com compresso do nervo e animais tratados com
laserterapia;
Grupo 6 (G6) cirurgia como compresso do nervo e animais tratados,
simultaneamente, com -NERVE e laserterapia.
TABELA 1 agrupamento dos animais de acordo com a diviso dos grupos
experimentais, seu nome e procedimento executado, poca da eutansia
Nome do grupo
Procedimento cirrgico
Tratamento Eutansia (dias)
N total de animais
15 e 30 G 1 Controle Sem cirurgia Sem
tratamento
5 5 10
G 2 Sham exposio e
visualizao
do feixe
nervoso
Sem
tratamento
posterior
5 5 10
G 3 Neuropraxia
ou
Compresso
Compresso Sem
tratamento
posterior
5 5 10
G 4 Composto Compresso Colocao do
composto
polivitamnico
5 5 10
G 5 Laser Compresso Laserterapia 5 5 10
G 6 Composto e
Laser
Compresso Colocao do
Composto
polivitamnico
e aplicao de
laser
5 5 10
Total 30 30 60
28
4.2) Procedimento cirrgico
Os animais foram previamente anestesiados com ketamina (0,1ml/kg) e
xilazina (0,1ml/kg) atravs de injeo intramuscular. Assepsia com clorexidina 2%
foi realizada na regio operada (dorso e patas posteriores do animal). Seguindo-
se a tricotomia com lmina apropriada e uma segunda assepsia com clorexidina
2% para remoo de fragmentos de pelo, FIG.7 e 8.
FIGURA 7 Assepsia com gaze e clorexidina
2% na regio a ser incisada
FIGURA 8 animal pronto para inciso e
posicionado na mesa cirrgica
Para a inciso foi utilizada lmina de bisturi n15, FIG.9, da marca Solidor
sendo trocada quando o corte estava deficiente, ou de um animal para outro.
FIGURA 9 foto da lmina de bisturi n 15 da marca Solidor utilizada no experimento para fazer
a inciso no tecido externo do animal.
A inciso foi realizada paralela s fibras do msculo bceps femoral da coxa
direita do animal, expondo assim o nervo isquitico direito. A dissecao foi feita
at a exposio do feixe nervoso, FIG.10.
29
FIGURA 10 foto da exposio do nervo isquitico da pata direita do animal aps inciso e
separao do tecido muscular.
Os animais do grupo G2 nomeados como Sham sofreram o
procedimento cirrgico at esta etapa, na qual ocorre apenas a exposio do
nervo. Seguiu-se a sutura do tecido muscular com fio no reabsorvvel, sem a
manipulao do feixe nervoso. Posteriormente, a sntese do tecido externo foi
realizada com fio de sutura mononylon 4.0 da marca Ethicon.
A partir do grupo G3 em diante, aps a dissecao, o nervo ao ser
encontrado foi individualizado como mostra a FIG.11.
FIGURA 11 - foto ilustrando a exposio e individualizao do nervo isquitico da pata direita do
animal
O dano ao tecido nervoso foi induzido por compresso realizada com fio de
sutura mononylon 4.0 em trs regies consecutivas, este procedimento teve como
finalidade promover um dano ao feixe nervoso (isquitico), FIG.12 e 13.
30
FIGURA 12 - nervo isquitico individualizado
dos tecidos adjacentes
FIGURA 13 foto da execuo do segundo n
cirrgico 2x2 no nervo dissecado
O procedimento cirrgico consistiu em realizar a sutura em trs
pontos consecutivos do mesmo feixe nervoso, com intervalos entre os ns de ~2
mm, FIG.14 e15. Proposta esta baseada no trabalho de B Bennett e Xie (1988),
apud Ravi & Bedi, (2004)72.
FIGURA 14 foto A ilustra a execuo do terceiro n cirrgico no nervo isquitico do animal; a
foto B o maior aumento dos trs ns sequenciados com distncia de aproximadamente 2mm
entre eles.
No grupo G3, nomeado como Neuropraxia, os animais sofreram
apenas a compresso descrita no pargrafo anterior e, o procedimento foi
concludo com a sutura do tecido externo.
4.3) Terapias
Nos prximos grupos 4, 5 e 6 (G4, G5, G6) os animais sofreram o
procedimento cirrgico descrito anteriormente e ilustrado para grupo G3, mas
receberam tratamento em seguida. As propostas teraputicas foram aplicadas
31
utilizando o biomaterial no grupo G4, a laserterapia no grupo G5 e a associao
do biomaterial e da laserterapia no grupo G6.
4.3.1) Composto Polivitamnico - NERVE
O biomaterial utilizado o -NERVE fornecido pela empresa JHS-
Biomaterials, Sabar, Brasil. Este composto polivitamnico como todo material
com potencial para uso mdico necessita do teste de citotoxidade para avaliar a
biocompatibilidade. O teste in vitro deste material foi realizado de acordo com a
norma ISO 10993-5, partes 5 e 12, no Centro de Biotecnologia IPEN.
No grupo G4, aps a exposio e compresso do nervo, o biomaterial
foi aplicado diretamente na leso, na regio do nervo comprimida pelo fio de
sutura. Para isto, o frasco foi aberto e retirada uma quantidade de ~ 0,25g do
biomaterial e, este foi inserido ao redor da regio lesada tanto por baixo do nervo,
FIG.16, como recobrindo os trs ns cirrgicos confeccionados no nervo, FIG.17;
seguindo a sutura dos tecidos profundos e superficiais.
FIGURA 15 nervo submetido a neuropraxia e
o biomaterial sendo adaptado ao redor do
nervo na regio onde foi causada a leso
FIGURA 16 - recobrimento total dos ns com
-NERVE
4.3.2) Laserterapia
O equipamento utilizado foi fornecido pela empresa DMC, Photon
Lase III, laser vermelho e infravermelho, com registro ANVISA: 80030810014.
Possui funo luz laser com comprimento de onda entre 630 690nm (laser
vermelho) e entre 790 830nm (laser infravermelho) para bioestimulao nas
reas de odontologia, medicina e fisioterapia, nas quais incluem: alvio de dor
32
(efeito de analgesia), reparao tecidual (efeito bioestimulador do trofismo celular)
e reduo de edema e de hiperemia (efeito antiinflamatrio, antiedematoso e
normalizador circulatrio). Caractersticas estas fornecidas pelo fabricante. As
especificaes tcnicas esto descritas no ANEXO A.
A irradiao laser foi realizada no ato cirrgico diretamente no nervo,
aps a compresso feita com os ns. Aps a sutura final a aplicao foi repetida
agora sobre o tecido externo.
Seguindo a proposta baseada nos estudos de Khadra et al, 200473,
neste trabalho foram utilizados dez dias consecutivos de laserterapia de baixa
potncia. O estudo foi feito para avaliar o efeito da laserterapia de baixa potncia
em implantes sseos; utilizou animais que receberam a terapia por 10 dias e
foram acompanhados por 8 semanas. O resultado foi favorvel para a
osteointegrao.
A aplicao do laser foi orientada pela linha de inciso de,
aproximadamente, 4 cm ( linha vermelha na FIG 17) na pata do animal. A ponta
do equipamento era posicionada verticalmente esta linha a uma distncia de
1cm do tecido. A linha de sutura era dividida em 2 regies ( pontos A e B),
abrangendo a regio operada. A irradiao era feita no ponto A, depois B. Em
seguida, acima e abaixo da linha (C e D).
FIGURA 17 representao da rea irradiada na pata do animal que recebeu a terapia com laser.
A linha vermelha se refere inciso e A, B, C e D a localizao da ponta do equipamento para a
aplicao e entrega da radiao.
A irradiao infravermelha foi de forma pontual em A, B, C e D
abrangendo assim a regio operada. Segundo as caractersticas do equipamento,
a fluncia de 140J/ cm e dose de 4J por ponto por 25 segundos.
Os animais seriam previamente imobilizados em um contensor, mas
no foi necessrio. Os animais foram manipulados calmamente no gerando
estresse a eles, conseguindo assim uma irradiao efetiva, FIG.18. Os grupos G5
Linha de inciso 4cm
A
C
D
B
A
33
e G6 correspondem aos grupos irradiados com laser como determinado pelo
fabricante. No prprio equipamento a opo parestesia j preconizada pela
empresa.
FIGURA 18 realizando a aplicao do laser na regio operada nos animais do grupo G6 aps
sutura final do tecido externo
4.3.3) Uso do Composto Polivitamnico -NERVE associado ao laser
No grupo G6 as terapias foram associadas, simultaneamente foi realizado
a aplicao do laser e a colocao do biomaterial. O nervo foi exposto, a
compresso com o fio de sutura foi realizada, a irradiao laser foi feita
diretamente na regio da leso, o biomaterial foi colocado envolvendo o nervo,
como descrito para o grupo G4 e, em seguida foi feita a sutura por planos. Como
as terapias foram associadas, a aplicao do laser se manteve nos dez dias
consecutivos, como no grupo G5.
4.4) Avaliao morfolgica
A eutansia dos animais foi realizada com uma sobre dosagem de
anestsicos. Foram sacrificados, nos primeiros quinze dias aps o procedimento
cirrgico, cinco animais de cada grupo. Isto se repetiu no trigsimo dia, finalizando
a eutansia dos outros trinta animais.
Conforme o tempo proposto de quinze e trinta dias, os tecidos foram
dissecados e o fragmento do feixe foi coletado. Este segmento compreendia,
aproximadamente, 15mm, sendo 5mm referente a regio comprimida pelo fio de
sutura, 5mm do segmento distal e 5mm do segmento proximal.
34
No grupo G1 a coleta do segmento do feixe obedeceu a dimenso
proposta de aproximadamente 15 mm do feixe ntegro. No grupo G2 foi feita nova
inciso na regio operada que ainda apresentava cicatriz, e o material foi
coletado. Nos grupos G3, G4, G5 e G6 a remoo do segmento do nervo foi feita
juntamente com o fio de sutura que causou dano nervoso, pois este fio de sutura
utilizado no absorvido,FIG19.
FIGURA 19 dissecao para remoo do fragmento do nervo isquitico do animal envolvendo
uma distncia de 1 cm a mais tanto do coto proximal e distal
As amostras foram ento fixadas em soluo de formol tamponado 10%
durante 24 horas, a temperatura ambiente. Posteriormente, o fio de sutura foi
removido para no interferir na confeco das lminas histolgicas. Foi feita uma
marcao no coto utilizando um n na extremidade proximal do segmento lesado,
apenas como referncia de estudos. As amostras foram ento processadas de
forma rotineira para incluso em parafina. Os cortes foram feitos no micrtomo da
marca Jung e na espessura de 5m, FIG.20. A estrutura para a confeco das
lminas histolgicas foi oferecida pelo Departamento de Patologia da Faculdade
de Odontologia da Universidade de So Paulo - FO/USP. Para complementar a
coleta de dados, cortes transversais foram realizados no Instituto de Cincias
Biomdicas da USP (ICB -3).
35
FIGURA 20 micrtomo da marca JUNG pertencente ao Instituto de Patologia da Faculdade de
Odontologia da Universidade de So Paulo
As imagens das lminas foram capturadas utilizando o microscpio e a
cmera acoplada LEICA DFC 310 FX, transmitidas ao computador da Apple
Macintosh.
Foram feitas tambm imagens das amostras dos seis grupos por
microscopia eletrnica de varredura. Foi utilizado o aparelho de microscopia de
varredura da marca Philips XL30. As amostras para a MEV foram desidratadas
em vcuo e recobertas com ouro, FIG.21, imagens A e B, respectivamente.
FIGURA 21 imagens das amostras do grupo G3 preparadas para microscopia de varredura. A
imagem A representa a amostra desidratada e a B representa as amostras recobertas com ouro.
Os parmetros analisados foram:
Quantidade de fibras nervosas;
Dimetro das fibras nervosas;
Integridade do tecido envolvido;
Destruio e neoformao do tecido nervoso.
36
RESULTADOS E DISCUSSO
Este captulo apresenta os resultados e a discusso sobre os dados
obtidos incluindo observao clnica da locomoo dos animais e a anlise
morfolgica sobre a degenerao do tecido nervoso nos seis grupos formados.
37
5) RESULTADOS E DISCUSSO
5.1) Os animais
No procedimento experimental foram utilizados sessenta ratos, sendo
que dez pertenciam ao grupo controle, no receberam nenhum procedimento, e
os outros cinquenta ratos sofreram algum tipo de manipulao. Em vinte e quatro
horas aps o procedimento cirr