26
BAB 4
METODE PENELITIAN
4.1 Desain Penelitian
Penelitian ini menggunakan true experimental laboratory secara in vivo
yang artinya bahwa pada penelitian ini semua variabel yang mempengaruhi
jalannya eksperimen akan dikontrol sehingga validitas internal (kualitas
pelaksanaan rancangan penelitian) ini akan meningkat. Desain penelitian
menggunakan pendekatan Randomized Post Test Only Controlled Group Design
untuk mengetahui pengaruh pemberian ekstrak etanol Tobacco nicotiana pada
nilai resistensi insulin. Penelitian ini dilakukan dengan cara menguji pengaruh dari
pemberian ekstrak etanol Tobacco nicotiana terhadap penurunan nilai resistensi
insulin pada model tikus Wistar (Rattus norvegicus) yang diinduksi HFD dan STZ
dosis rendah.
4.2 Sampel Penelitian
4.2.1 Pemilihan Sampel
Sampel penelitian adalah model tikus Wistar (Rattus norvegicus).
Pemilihan sampel penelitian untuk pengelompokan perlakuan menggunakan cara
acak karena hewan coba, bahan pakan, dan bahan penelitian lainnya dapat
dianggap homogen. Tikus diperoleh dan dipelihara di Laboratorium Farmasi
Fakultas kedokteran Universitas Brawijaya.
Kriteria inklusi untuk dijadikan sampel adalah sebagai berikut :
i. Tikus wistar (Rattus norvegicus)
27
ii. Umur 6-8 minggu
iii. Berat badan 150-200 gram
iv. Kondisi sehat, aktif dan tidak ada kelainan anatomis
Kriteria eksklusi adalah sebagai berikut :
i. Tikus wistar (Rattus norvegicus) yang tidak mau makan seterusnya
selama masa penelitian
ii. Tikus wistar (Rattus norvegicus) yang tidak bergerak aktif atau sakit
selama masa perlakuan
iii. Tikus wistar (Rattus norvegicus) yang mati selama masa perlakuan
4.2.2 Besar Sampel
Sampel penelitian adalah model tikus wistar (Rattus novergicus) jantan
berusia 6-8 minggu. Perhitungan besarnya pengulangan pada sampel adalah
sebagai berikut:
(t-1) (r-1) ≥ 15 [dengan: t = jumlah perlakuan, r = jumlah ulangan]
Pada penelitian ini t = 5 sehingga jumlah pengulangan adalah:
(5-1) (r-1) ≥ 15
r-1 ≥ 15:4
r = 3.75 + 1 = 4.75 (dibulatkan 5)
dari perhitungan tersebut banyaknya pengulangan minimal 5 kali untuk
setiap perlakuan. Pada masing-masing kelompok kontrol tikus diberikan 2 tikus
sebagai cadangan. Sehingga jumlah tikus yang digunakan pada penelitian ini
sejumlah 7x5 kelompok = 35 ekor hewan coba menggunakan simple random
sampling.
28
4.3 Variabel Penelitian
4.3.1 Variabel Bebas
Variabel bebas dalam penelitian ini adalah dosis ekstrak etanol Tobacco
nicotiana, yaitu 90 mg/kg BB, 180 mg/kg BB, 270 mgkg BB yang diberikan per oral
ke tikus wistar (Rattus norvegicus) yang diinduksi menjadi diabetes mellitus tipe 2
dengan injeksi STZ dan HFD.
4.3.2 Variabel Tergantung
Variabel tergantung dalam penelitian ini adalah pengukuran HOMA-IR
(mengukur tingkat resistensi terhadap insulin) yang dinilai dengan kalkulator
HOMA-IR.
4.4 Waktu dan Tempat Penelitian
4.4.1 Waktu Penelitian
Penelitian ini dilakukan dalam rentang waktu 4 bulan (termasuk
penyusunan proposal) terhitung mulai bulan Februari 2016 sampai Juni 2016.
4.4.2 Tempat Penelitian
Penelitian dilakukan di Laboratorium Farmasi, Laboratorium Farmakologi,
Laboratorium Faal, Fakultas Biologi Universitas Brawijaya Malang dan
Laboratorium Materia Medika Batu.
29
4.5 Definisi Operasional
i. Ekstrak etanol berasal dari spesies Tobacco nicotiana, diperoleh dari
Bondowoso, Jawa Timur. Dosis ekstrak etanol Tobacco nicotiana
yang dipakai sebagai perlakuan adalah 90 mg/kg (kelompok
perlakuan 1), 180 mg/kg (kelompok perlakuan 2), dan 270mg/kg
(kelompok perlakuan 3), dengan pemberian ekstrak secara oral.
ii. Hewan coba tikus wistar (Rattus novergicus) yang diinduksi DM tipe
2 dengan diberikan HFD dan STZ. Tikus dinyatakan DM jika tingkat
glukosa darah puasa di atas 130 mg/dl dan glukosa darah acak di
atas 200 mg/dl (Pournaghi et al. 2012)
iii. Berat badan tikus yang diukur menggunakan timbangan digital setiap
minggu dengan satuan gram
iv. Pakan yang diberikan dihitung dengan cara dikurangi dengan sisa
pakan sebelumnya dengan satuan gram
v. High Fat Diet (HFD)
Adalah pakan yang diberikan dengan komposisi berupa pakan
standar (pakan ayam 57.3% dan tepung terigu 31.8%) ditambah
kolesterol 1.9%, asam kolat 0.1%, dan minyak babi 8.9% diberikan
selama 8 minggu.
vi. Glukosa darah
Kadar glukosa di dalam darah sebagai sumber utama energi untuk
sel tubuh. Darah whole blood untuk pemeriksaan menggunakan alat
Blood Glucose Test Meter dengan satuan mg/dl.
30
vii. C – peptide
Produk sampingan yang dibuat ketika insulin diproduksi. Darah whole
blood untuk pemeriksaan menggunakan metode ELISA dengan
satuan ng/ml. Normal range c-peptide dewasa adalah 0.4 sampai 2.1
ng/ml jika dihitung dalam keadaan puasa, sedangkan jika dihitung
dua jam postpradial adalah 1.2 sampai 3.4 ng/ml (Kumar et al. 2013).
viii. HOMA-IR (Homeostasis Model Assessment of Insulin Resistance
Index) adalah salah satu parameter diagnosis utama yang digunakan
untuk mengukur indeks resistensi insulin (Hermanto & Sony 2003).
HOMA-IR adalah nilai yang dihitung dengan rumus berdasarkan hasil
kadar C-peptide puasa dan kadar glukosa puasa dengan cut off 2.9,
yaitu dikatakan resistensi insulin jika HOMA-IR lebih besar dari 2.9
(Xia 2010; Matthews 1985)
HOMA-IR = 1.5 + 𝑔𝑙𝑢𝑘𝑜𝑠𝑎 𝑝𝑙𝑎𝑠𝑚𝑎 𝑝𝑢𝑎𝑠𝑎 𝑥 (𝐶−𝑝𝑒𝑝𝑡𝑖𝑑𝑒 𝑝𝑢𝑎𝑠𝑎
2800)
4.6 Alat dan Bahan Penelitian
4.6.1 Alat dan Bahan untuk Perawatan Tikus
Kandang hewan coba, tutup kandang dari anyaman kawat, botol minum,
tempat makan, batu besar, air minum, sekam, pakan standar dan HFD.
4.6.2 Alat dan Bahan untuk Induksi DM tipe 2
Streptozotocin (STZ), spuit 3cc, normal saline, alkohol 70%.
4.6.3 Alat dan Bahan untuk Ekstrak etanol Tobacco nicotiana
kertas whatman, filtering beaker glass, dan mesin rotary.
31
4.6.4 Alat dan Bahan untuk Pemeriksaan berat badan
Timbangan berat manual SF-400.
4.6.5 Alat dan Bahan Untuk Pemeriksaan Asupan Makanan Tikus
Timbangan berat manual SF-400.
4.6.6 Alat dan Bahan untuk Pemeriksaan Glukosa Darah
Kapas alkohol, lancet, POCT (point of care test), strip glukosa darah.
4.6.7 Alat dan Bahan untuk Pembedahan Tikus
Gunting bedah, steroform, pinset, kapas, jarum pentul, kloroform, spuit
insulin 1 ml, formalin 10%, wadah plastik dan tutup 25 buah, alkohol, vacutainer
35 buah.
4.7 Prosedur Kerja Penelitian
4.7.1 Pengurusan Etik
Dilakukan sebelum melakukan penelitian, untuk memenuhi kelayakan etik
penelitian di Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya.
4.7.2 Perawatan Tikus
Dilakukan persiapan pemeliharaan hewan coba mulai dari kandang
pemeliharaan hewan coba, penutup kandang dengan jaring-jaring kawat, sekam,
botol minum, tempat makan, pakan dan pengecekan awal berat badan tikus. Tikus
diadaptasikan di dalam Laboratorium Farmasi selama 2 minggu dan dibagai
menjadi lima kelompok, yaitiu kontrol negatif (-), kontrol positif (+), perlakuan 1,
perlakuan 2, perlakuan 3.
32
4.7.3 Pembuatan Pakan Tikus Standar dan HFD
Pakan yang diberikan selama masa aklimatisasi atau adaptasi adalah
pakan standar yang terdiri dari pakan ayam/PARS 20 gram, air 10 cc, tepung terigu
10 gram, total pakan standar pertikus 40 gram untuk setiap tikus perharinya. Pakan
standar diberikan kepada semua kelompok, yaitu kontrol negatif (-), kontrol positif
(+), perlakuan 1, perlakuan 2, perlakuan 3 selama 2 minggu. Setelah masa
aklimatisasi atau adaptasi, kelompok kontrol negatif (-) diberikan pakan standar
seberat 40 gram perhari. Untuk kelompok kontrol positif (+), kelompok perlakuan
1, perlakuan 2, dan perlakuan 3 diberikan HFD yang terdiri dari pakan ayam/PARS
20 gram dan tepung terigu 10 gram yang ditambahkan kuning telur bebek 2 gram,
asam kolat 0,05 gram, minyak babi 3,55 gram, lemak kambing 4 gram (4cc),
minyak kelapa 0,4 gram (0,4cc), air 25 ml (25cc). Total HFD pertikus 65 gram untuk
setiap tikus perharinya. Selanjutnya setelah 28 hari pemberian HFD dilanjutkan
pemberian pakan standar.
4.7.4 Pembuatan Tikus model DM tipe 2
Tikus wistar (Rattus norvegicus) dibuat DM tipe 2 menggunakan HFD dan
injeksi STZ. Tikus dipilih berdasarkan kriteria inklusi sebanyak 35 ekor umur 6-8
minggu dengan berat 150-200 gram. Kemudian dikondisikan di kandang tempat
pemeliharaannya selama 2 minggu dengan diberikan pakan standar pada
kelompok kontrol negatif (-), sedangkan pada kelompok kontrol positif (+) diberikan
HFD dengan komposisi pakan (80%), lemak babi (15%) dan kuning telur bebek
(5%). Pemberian HFD dilakukan selama 28 hari, kemudian diinjeksi dengan STZ
low dose 22.5 mg/kgBB intraperitonial (Laboratorium Farmako FKUB). Sebelum
diinjeksi STZ, kadar glukosa darah tikus diukur untuk menentukan apakah tikus
33
tersebut tidak menderita DM sebelum diinduksi. Dosis STZ dihitung untuk setiap
tikus (22.5 mg/kgBB) dan diencerkan dalam aquades. Tingkat pH larutan STZ
harus antara 3.5-4.5. jika tingkat pH larutan STZ belum tercapai maka perlu
ditambahkan asam sitrat hingga tercapai pH larutan 3.5-4.5. (Lenzen 2008; Zhang
et al. 2008).
4.7.5 Prosedur Pengukuran Kadar Glukosa Darah
Kondisi DM dapat dikonfirmasi dengan menggunakan pengecekan glukosa
darah puasa menggunakan alat POCT (point of care test). Setelah 3 hari paska
induksi STZ dilakukan pemeriksaan glukosa darah setelah dipuasakan selama 8
jam. Pemeriksaan kadar glukosa darah melalui pengambilan darah dari vena di
ekor tikus dengan cara melukai sedikit ujung ekor. Kemudian tetesan darah yang
pertama dibuang, tetesan darah berikutnya diperksa dengan menggunakan alat
POCT (point of care test). Reagen strip yang telah ditetesi darah vena dimasukan
ke alat pemeriksa, kemudian hasilnya dibaca pada layar dalam waktu kurang dari
30 detik. Nilai yang tertera pada layar adalah nilai konsentrasi glukosa darah dalam
mg/dl. Tikus dinyatakan DM jika tingkat glukosa darah puasa di atas 130 mg/dl dan
glukosa darah acak di atas 200 mg/dl (Pournaghi et al. 2012). Jika nilai glukosa
darah belum memenuhi kriteria akan diinjeksi ulang dengan STZ dua hari
kemudian.
4.7.6 Persiapan Ekstrak Etanol Tobacco nicotiana
Bahan utama yang digunakan adalah daun tembakau yang sudah
dikeringkan yang berasal dari Bondowoso, Jawa Timur. Daun tembakau kemudian
dipotong tipis-tipis dan digiling kemudian di maserasi dengan etanol selama sehari.
Hasil maserasi kemudian disaring menggunakan kertas whatman filtering. Filtrat
34
kemudian diletakkan di dalam beaker glass dan dirotasi ketika sedang dipanaskan
di mesin rotary sampai semua etanol selesai diuapkan. Ekstrak etanol diperoleh
dari sisa filtrat yang diuapkan. Ekstrak etanol kemudian dianalisis menggunakan
Gas Chromatography Mass Spectometry (GCMS) untuk menentukan substansi
pada ekstrak. Dari analisis didapatkan ekstrak etanol mengandung 57.23% nikotin
dalam 120 gram daun tembakau kering.
4.7.7 Pemberian dan Dosis Ekstrak Etanol Tobacco nicotiana
Dosis Ekstrak Etanol Tobacco nicotiana yang digunakan dalam penelitian
ini adalah 90 mg/kgBB untuk tikus perlakuan 1, 180 mg/kgBB untuk tikus perlakuan
2, dan 270 mg/kgBB untuk tikus perlakuan 3. Penentuan dosis didapatkan dari
hasil eksplorasi dosis dari penelitian tentang penggunaan ekstrak nikotin.
Penggunaan 12 mg/kg/hari ekstrak nikotin dapat memberikan signifikansi
penurunan glukosa darah sebesar 30% dan berat badan tikus sebesar 2% melalui
metode osmitic minipumps. Ekstrak etanol Tobacco nicotiana diberikan secara oral
dengan metode sonde langsung menuju ke lambung tikus. Ekstrak diberikan
setiap satu kali sehari selama 30 hari.
4.7.8 Pengecekan Efek Ekstrak Etanol Tobacco nicotiana terhadap Berat
Badan Tikus
Berat badan tikus diukur secara rutin dalam 3 kondisi, yaitu sebelum
induksi diabetes mellitus, sebelum diberikan ekstrak etanol Tobacco nicotiana, dan
setiap minggu setelah diberikan ekstrak etanol Tobacco nicotiana. Pengukuran
berat-badan tikus dilakukan selama 28 hari.
35
4.7.9 Pembedahan Tikus
Tikus diberi anestesi per inhalasi dengan kloroform dalam wadah tertutup.
Taruh tikus yang sudah diberi anestesi di atas steroform, fiksasi, lalu bedah mulai
dari perut. Ambil darahnya terlebih dahulu dengan spuit 1 ml melalui jantung.
Setelah itu, ambil aortanya dan fiksasi ke dalam formalin 10%.
4.7.10 Prosedur Pengukuran Kadar C-Peptide
Pengukuran kadar insulin plasma dilakukan dengan cara tikus dipuasakan
selama 2 jam karena kadar insulin plasma yang diukur adalah kadar insulin puasa.
Sampel darah yang dipakai untuk pengukuran kadar insulin plasma adalah darah
dari jantung tikus yang diambil pada saat pembedahan tikus. Pengukuran kadar
insulin plasma menggunakan metode ELISA dari Boehringer-Mannheim kit. Darah
yang sudah diambil diberi antikoagulan/EDTA lalu diputar dengan menggunakan
sentrifugator dengan kecepatan 3000 rpm selama 7 menit, nilai normal untuk kadar
insulin plasma <2500 picogram/ml.
4.7.11 Prosedur Perhitungan Nilai Resistensi Insulin
Perhitungan nilai resistensi insulin dilakukan dengan menggunakan
HOMA-IR dengan aplikasi kalkulator HOMA-IR dari Harvard. Untuk mengetahui
nilai HOMA-IR tikus maka diperlukan kadar glukosa puasa yang dihitung
menggunakan alat POCT dan kadar insulin puasa yang dihitung dengan metode
ELISA. Pengukuran nilai HOMA-IR dilakukan setelah prosedur pembedahan tikus
selesai. Perhitungan dapat dilakukan sebagai berikut :
HOMA-IR = 1.5 + 𝑔𝑙𝑢𝑘𝑜𝑠𝑎 𝑝𝑙𝑎𝑠𝑚𝑎 𝑝𝑢𝑎𝑠𝑎 𝑥 (𝐶−𝑝𝑒𝑝𝑡𝑖𝑑𝑒 𝑝𝑢𝑎𝑠𝑎
2800)
36
4.8 Analisis Data
Hasil data pengukuran Homa-IR dari perlakuan dianalisis secara statistik
dengan menggunakan program SPSS versi 23 dengan tingkat signifikansi 0,05 (p
= 0,05) dan taraf kepercayaan 95% (α = 0,05). Langkah-langkah uji hipotesis
komparatif adalah uji normalitas data, uji homogenitas varian, uji One-way ANOVA
dan Post hoc Tukey. Namun apabila syarat One-way ANOVA tidak terpenuhi
karena data tidak normal dan homogen, maka analisa data dapat dilakukan
dengan Uji Kruskal Wallis dan Post hoc Mann Whitney (Dahlan, 2004).
4.9 Alur Penelitian
Gambar 4.1 Alur Penelitian
Keterangan : Kontrol Negatif (Tikus sehat tanpa diberikan perlakuan apapun), Kontrol Positif (Tikus diinduksi menjadi DM tipe 2 tanpa pemberian ekstrak etanol Tobacco nicotiana), Perlakuan 1 (Tikus diinduksi DM tipe 2 dan diberikan ekstrak etanol Tobacco nicotiana 90 mg/kg), Perlakuan 2 (Tikus di induksi menjadi DM tipe 2 dan diberikan ekstrak etanol Tobacco nicotiana 180 mg/kg), Perlakuan 3 (Tikus di induksi menjadi DM tipe 2 dan diberikan ekstrak etanol Tobacco nicotiana 270 mg/kg)
Pengumpulan tikus wistar (Rattus norvegicus)
↓
Seleksi sesuai kriteria inklusi dan eksklusi, randomisasi ke dalam 5 kelompok, aklimatisasi selama 14 hari
↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓
Kontrol negatif
Kontrol Positif
Perlakuan 1 Perlakuan 2 Perlakuan 3
↓ ↓ ↓ ↓
Induksi T2DM Induksi T2DM Induksi T2DM Induksi T2DM
↓ ↓ ↓
Dosis 1 Dosis 2 Dosis 3
↓
Pembedahan dan pengambilan serum tikus setelah 28 hari perlakuan
↓
Pengukuran nilai resistensi insulin melalui metode HOMA-IR
↓
Analisis Data
37
4.10 Jadwal Kegiatan
Gambar 4.2 Jadwal Kegiatan
No Kegiatan Bulan1 Bulan2 Bulan3 Bulan 4
1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4
Tahap Persiapan 1. Mengurus ethical clearance &
perijinan laboratorium
2. Belanja alat dan bahan penelitian 3. Aklimatisasi Hewan Coba Tahap Pelaksanaan 1. Induksi Hewan Coba menjadi DM
tipe 2
2. Pemberian Ekstrak Etanol 3. Pengambilan aorta dan serum 4. Pengukuran kadar HOMA-IR Tahap Penyelesaian 1. Analisis data 2. Penyusunan Laporan akhir