25
BAB 4
METODE PENELITIAN
4.1 Jenis Penelitian
Penelitian ini merupakan penelitian true experimental post test only control
group design.
4.2 Lokasi dan Waktu Penelitian
Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Biomedik Fakultas Kedokteran
Universitas Muhammadiyah Malang selama 1 bulan.
4.3 Populasi dan Sampel Penelitian
4.3.1 Populasi
Populasi dalam penelitian ini adalah jamur T.rubrum biakan murni yang
diperoleh dari Balai Besar Laboratorium Kesehatan Surabaya.
4.3.2 Sampel
Sampel dalam penelitian ini adalah jamur T.rubrum yang telah dibiakkan
dan diambil dengan menggunakan Simple Random Sampling
4.3.3 Besar Sampel
Penentuan pengulangan dihitung dengan rumus Federer
Keterangan :
t = jumlah perlakuan
n = banyak pengulangan tiap perlakuan
(t – 1) (n-1) ≥ 15
26
Penelitian ini menggunakan 8 kelompok perlakuan ekstrak kulit pisang
kepok dan 2 kelompok kontrol sehingga ada 10 kelompok, maka :
( t-1) (n-1) ≥ 15
( 10-1 ) ( n-1 ) ≥ 15
9 ( n-1) ≥ 15
9n – 9 ≥ 15
9n ≥ 24
n ≥ 2,67 ≈ 3
Dari hasil perhitungan di atas, maka diperlukan 3 kali pengulangan untuk
tiap sampel. Jadi diperlukan 30 perlakuan untuk penelitian ini.
4.4 Variabel Penelitian
4.4.1 Variabel Bebas
Variabel bebas pada penelitian ini adalah ekstrak kulit pisang kepok
dengan konsentrasi 50%, 25%, 12,5%, 6,25%, 3,12%, 1,56%, 0,78%, 0,39% dan
2 kontrol yaitu kontrol positif dan kontrol negatif.
4.4.2 Variabel Tergantung
Variabel tergantung pada penelitian ini adalah jumlah koloni jamur T.
rubrum yang dapat dilihat dari KHM dan KBM.
4.5 Definisi Operasional
1. Jumlah konsentrasi ekstrak kulit pisang kepok yang digunakan dalam
penelitian ini adalah 8 konsentrasi dengan konsentrasi 50%, 25%, 12,5%,
27
6,25%, 3,12%, 1,56%, 0,78%, 0,39% dan 2 kontrol yaitu kontrol bahan
sebagai kontrol negatif dan kontrol kuman sebagai kontrol positif. Skala
pengukuran yang digunakan adalah ordinal.
2. Jamur T.rubrum yang digunakan dalam penelitian ini berasal dari biakan
murni yang diperoleh dari Balai Besar Laboratorium Kesehatan Surabaya.
Pertumbuhannya di liat dengan menghitung jumlah koloni pada SDA
menggunakan perhitungan Colony Counter. Skala pengukuran yang
digunakan adalah rasio.
3. KHM adalah konsentrasi larutan ekstrak kulit pisang kepok terendah yang
mampu menghambat pertumbuhan koloni T.rubrum menggunakan metode
dilusi tabung, yang ditandai dengan melihat ada atau tidaknya kekeruhan
pada media Sabouraud Dextrose Broth (SDB).. Skala pengukuran yang
digunakan adalah nominal.
4. KBM adalah konsentrasi larutan ekstrak kulit pisang kepok terendah yang
dapat membunuh T.rubrum, yang ditandai dengan penurunan pertumbuhan
koloni jamur sampai 99,9% dari inokulum asal pada media SDA. Skala
pengukuran yang digunakan adalah rasio.
4.6 Instrumen Penelitian
4.6.1 Alat dan Bahan Pembuatan Ekstrak Kulit Pisang Kepok
1. Alat
a. Blender
b. Kertas saring
c. Tabung ekstraktor
d. Labu destilasi
28
e. Pendingin spiral
f. Water pump
g. Evaporator
h. Vakum pump
i. Neraca analitik
j. Corong gelas
k. Cawan porselem
l. Beaker glass
2. Bahan
a. Kulit pisang kepok kering
b. Etanol 70%
c. Aquades
4.6.2 Alat dan Bahan Uji Antimikroba
1. Alat
a. Tabung reaksi steril
b. Ose lengkung
c. Mikropipet 1 ml
d. Inkubator
e. Lampu spirtus
f. Label
g. Vortex
h. Colony counter
2. Bahan
a. Perbenihan cair jamur T.rumbrum
29
b. Ekstrak kulit pisang kapok
c. Aquades
d. SDB
e. SDA
4.7 Prosedur Penelitian
4.7.1 Sterilisasi Alat
Sterilisasi alat dilakukan dengan:
a. Mencuci semua alat dengan sabun hingga bersih dan membiarkannya
hingga kering.
b. Alat-alat yang bisa disterilisasi dalam autoklaf dibungkus dengan kertas
dan dimasukkan dalam autoklaf pada suhu 121°C dengan tekanan 15
atm, selama 15 menit, sedangkan alat-alat yang tidak bisa disterilisasi
dengan autoklaf disterilkan dengan alkohol 70% selama 20 menit.
4.7.2 Pembuatan Medium SDA
a. Menimbang Sabouraud Dextrose Agar Base sebanyak kebutuhan, lalu
tambahkan aquades sesuai kebutuhan.
b. SDA direbus lalu disterilisasi dalamautoklaf pada tekanan 15 atm pada
suhu 121°C selama 15 menit.
c. SDA yang telah disterilisasi dituangkan kedalam masing-masing cawan
petri sebanyak 20 ml.
4.7.3 Pembuatan Medium SDB
a. Timbang bahan sebanyak kebutuhan, lalu tambahkan aquades sesuai
kebutuhan dan diaduk secara merata.
b. SDB direbus sampai tercampur rata.
30
c. SDB yang sudah direbus disterilisasidalam autoklaf pada tekanan 15
atm pada suhu 121°C selama 15 menit.
d. SDB yang telah disterilisasi dituangkan kedalam masing-masing
tabung.
4.7.4 Pembuatan ekstrak kulit pisang kepok
a) Proses pengolahan kulit pisang kepok
1. Mencuci bersih kulit pisang kepok dengan air mengalir
2. Kulit pisang kepok yang sudah bersih kemudian ditiriskan, dan
dipotong kecil-kecil dengan ketebalan ± <5mm.
3. Kulit pisang yang sudah dipotong dikeringkan di bawah sinar
matahari secara tidak langsung selama ± 2 hari, dilanjutkan dengan
oven selama 2 hari pada suhu 400 C sampai sampel tanaman pisang
kepok benar-benar kering.
4. Setelah kering, sampel dihaluskan dengan blender
5. Bubuk kulit pisang kepok ditimbang dengan menggunakan timbangan
sebanyak 100 gram kemudian dimasukkan dalam gelas Erlenmeyer
ukuran 1 liter.
6. Kemudian direndam di dalam larutan etanol 70% sampai volume 900
ml dan dikocok sampai benar-benar tercampur (± 30 menit).
7. Bahan direndam dan ditutup selama 24 jam sampai mengendap.
b) Proses Evaporasi
1. Mengambil lapisan atas campuran etanol dengan zat aktif yang
sudah terambil kemudian dimasukkan dalam labu evaporasi 1 liter
2. Setelah 24 jam, dilakukan penyaringan bahan dengan kertas saring
31
dan corong gelas sampai tidak ada cairan yang menetes dari bahan.
3. Memindahkan cairan hasil penyaringan pada labu evaporasi 1 liter.
4. Memasang labu evaporasi pada evaporator
5. Evaporator dipasang pada tiang permanen agar dapat
tergantungdengan kemiringan 30-40o
terhadap meja percobaan,
dengan susunan dari atas: alat pemanas air, labu penampung, hasil
evaporasi, rotary evaporator, dan tabung pendingin spiral.
6. Hasil ekstrasi di pindahkan dalam labu pemisahekstraksi.
7. Labu pemisah ekstraksi dihubungkan dengan bagian bawah
evaporator.
8. Tabung pendingin spiral di hubungakan dengan bagian atas
evaporator.
9. Labu penampung hasil bevaporasi dihubungkan dengan bagian atas
evaporator.
10. Tabung pendingin spiral dan pompa vakum dihubungkan dengan
selang plastik.
11. Tabung pendingin dan pompa sirkulasi air dingin dihubungkan
dengan selang plastik.
12. Pompa sirkulasi air dingin ditempatkan dalam bak yang berisi
aquabides.
13. Letakan satu set alat evaporasi sehingga labu pemisah ekstraksi
terendam aquabides pada pompa sirkulasi air dingin.
14. Rotary evaporator, pompa sirkulasi air dingin, dan pompa vakum
dijalankan.
32
15. Alat pemanas air dinyalakan dan diatur suhu sekitar 70-80o
C
(sesuaititik didih etanol) sehingga hasil ekstraksi dalam labu pemisah
ekstraksi mendidih dan pelarut etanol menguap.
16. Hasil penguapan etanol dikondensasi menuju labu penampung
etanol sehingga tidak tercampur dengan hasil evaporasi, sedangkan
uap air tersedot oleh pompa vakum.
17. Proses evaporasi dilakukan hingga volume kecil hasil ekstraksi
berkurang dan menjadi kental.
18. Setelah kental proses evaporasi dihentikan dan hasil evaporasi
diambil.
19. Hasil evaporasi ditampung dalam cawan penguap kemudian dioven
selama ± 2 jam pada suhu 80o
C untuk menguapkan pelarut yang
tersisa, sehingga didapatkan hasil ektrak kulit pisang kepok100%.
Ekstrak tersebut kemudian ditimbang dengan neraca analitik.
4.7.5 Identifikasi T.rubrum
Untuk memastikan bahwa koloni yang tumbuh adalah T.rubrum,
dilakukan pemeriksaan makroskopis dan mikroskopis.
1. Pemeriksaan secara makroskopis
Pemeriksaan ini dilakukan dengan mengamati koloni T.rubrum yang
berupa koloni halus berwarna putih kekuningan dan berbau ragi.
2. Pemeriksaan secara mikroskopis
Pada pemeriksaan ini dilakukan pewarnaan KOH, yaitu dengan cara:
33
Teteskan 1-2 tetes larutan KOH 10% pada kaca objek..
Letakkan bahan yang diperiksa pada tetesan tersebut dengan
menggunakan pinset yang sebelumnya dibasahi dulu dengan
larutan KOH, kemudian tutup dengan kaca penutup.
Biarkan 15 menit atau dihangatkan diatas nyala api selama
beberapa detik untuk mempercepat proses lisis. Periksa dibawah
mikroskop dengan perbesaran dari 10x - 40x.
Carilah bentukan khas T.rubrum.
4.7.6 Pembuatan Perbenihan Cair Jamur
Ambil 1 ose koloni jamur dari media subculture, kemudian suspensikan
kedalam SDB didalam tabung. Tabung kemudian divortex dan disesuaikan
dengan standart McFarland 1x108 CFU/ml.
4.7.7 Uji Kepekaan Ekstrak Kulit Pisang Kepok Terhadap T.rubrum
Metode yang digunakan untuk tes ini adalah metode dilusi tabung dan
difusi cakram. Pada penelitian ini diperlukan kadar beberapa macam konsentrasi
ekstrak kulit pisang kepok untuk dicampurkan atau diinokulasi dengan perbenihan
cair jamur T.rubrum. Dengan cara sebagai berikut:
Hari ke-1 :
a. Sediakan 10 tabung reaksi steril; tabung 1, tabung 2, tabung 3, tabung 4,
tabung 5, tabung 6, tabung 7 dan tabung 8, tabung 9, tabung 10. Masing-
masing di beri perlakuan konsentrasi ekstrak kulit pisang kepok 8
konsentrasi dan 2 tabung kontrol.
34
b. Masukkan 1 ml SDB pada tabung 2,3,4,5,6,7,8,9 dan 2 ml ekstrak kulit
pisang kepok pada tabung 1 serta 2 ml Trichophyton sp. pada tabung 10.
sukkan 1ml ekstrak kulit nanas pada tabung 2 dan 3.
Konsentrasi ekstrak kulit pisang
kepok
Tabung 2 1 ml (100%)
Tabung 3 2 ml (50%)
c. Campurlah hingga rata larutan SDB dan ekstrak kulit pisang kepok pada
tabung 3, kemudian pindahkan sebanyak 1 ml ke dalam tabung 4.
Konsentrasi ekstrak kulit pisang
kepok
Tabung 3 1 ml (50%)
Tabung 4 2 ml (25%)
d. Ulangi hal yang sama terhadap tabung 4, 5, 6, 7, 8, dan 9
e. Pada tabung 9, setelah tercampur rata, larutan dibuang sebanyak 1 ml.
f. Dari pengenceran diatas, maka konsentrasi awal antifungi dari masing-
masing tabung adalah
35
g. Selanjutnya tabung 2 sampai 9 ditambahkan perbenihan cair jamur 1 ml
h. Dengan demikian, volume masing-masing tabung menjadi 2 ml sehingga
konsentrasi akhir antifungi berubah seperti berikut. Kemudian diinkubasi
pada suhu 37˚C selama 36-48 jam
Hari ke-3:
Tabung dikeluarkan dari inkubator, akan di dapatkan KHM dengan cara
melihat kejernihan tabung. Kemudian dari masing-masing tabung diambil 1 ose
dan diinokulasikan pada media SDA. Lalu diinkubasikan lagi 36-48 jam pada
suhu 37˚C
Hari ke-5:
Media SDA dikeluarkan dari inkubator kemudian dilakukan pengamatan
kuantitatif pada masing-masing konsentrasi dengan cara menghitung jumlah
koloni jamur dengan colony counter sehingga didapatkan data KBM.
36
4.8 Alur Penelitian
Identifikasi T.rubrum
secara makroskopis dan
mikroskopis
Pembuatan media cair
T.rubrum
Uji antifungi dengan
Tube Dilution Test
Pembuatan ekstrak kulit
pisang kepok
Inkubasi selama 36-48
jam dengan suhu 37ºC
Amati tingkat kekeruhan
untuk menentukan KHM
Penggoresan pada SDA
Inkubasi selama 36-48
jam dengan suhu 37ºC
Menghitung jumlah
koloni untuk
menentukan KBM
Analisis Data
Gambar 4.1 Alur penelitian
37
4.9. Analisis Data
Pada penelitian ini, data yang akan dianalisis yaitu jumlah koloni
T.rubrum yang tumbuh pada SDA berdasarkan tingkat konsentrasi ekstrak kulit
pisang kepok (Musa paradisiaca L.). Analisis yang digunakan adalah uji one way
ANOVA. Uji ini digunakan untuk membuktikan adanya perbedaan yang
bermakna antara kelompok perlakuan.
Syarat-syarat uji parametrik yang harus dipenuhi dalam menggunakan
uji one way ANOVA adalah (Dahlan,2015) :
1. Terdapat lebih dari dua kelompok yang tidak berpasangan dan skala
pengukuran variabel numerik
2. Sebaran data harus normal (p>0,05), pada penelitian ini dilakukan uji
normalitas menggunakan uji Saphiro Wilk untuk mengetahui apakah
kelompok data penelitian berasal dari populasi berdistribusi normal atau
tidak normal. Jika distribusi data tidak normal, maka diupayakan untuk
melakukan transformasi data supaya distribusi data menjadi normal.
3. Varian data harus sama atau homogen (p>0,05), yang dapat diketahui dari
uji homogenitas Levene. Jika varian data tidak sama atau homogen, maka
diupayakan untuk melakukan transformasi data supaya ragam data menjadi
sama atau homogen.
Apabila data berdistribusi normal dan varian sama maka dilanjutkan dengan
uji Post Hoc Bonferroni untuk mengetahui pada kelompok mana terdapat
perbedaan yang bermakna. Apabila data berdistribusi normal namun variabel
tidak sama (tidak homogen) maka dapat dilanjutkan dengan uji Post Hoc
Tamhane
38
Jika data hasil transformasi tidak terdistribusi normal atau ragam data tetap
tidak sama, maka dipilih uji nonparametrik yaitu Kruskal-Wallis sebagai
alternatifnya dan dilanjutkan dengan uji Post Hoc Mann-Whitney untuk
menentukan pada konsentrasi mana yang memiliki hasil kebermaknaan,
selanjutnya dilakukan uji regresi linear untuk mengetahui seberapa besar dan
memprediksi pengaruh pemberian ekstrak kulit pisang kepok (Musa paradisiaca
L.) dengan jumlah koloni T.rubrum yang tumbuh pada Sabouraud agar
(Dahlan,2015)