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Thèse de Doctorat en Sciences
Option Biotechnologie
Spécialité Intérêt des micro-organismes
Intitulée
Présentée par
LAZREG Louiza
Devant le Jury :
Président : Pr KARAM Nour Eddine Université d’Oran 1
Examinateurs : Pr BELLAHCENE Miloud CU de Ain Témouchent
Pr DRISSI Mourad Université de Tlemcen
Pr AOUES Abdelkader Université d’Oran 1
Directeur de thèse : Pr ZADI KARAM Halima Université d’Oran 1
Co-directeur de thèse : Pr DALACHE Fatiha Université de Mostaganem
Année Universitaire 2016/2017
Bactériocines d’entérocoques
isolés de lait cru et beurre de l’Ouest algérien
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Dédicaces
Je dédie cette thèse ;
A mes parents qui m’ont donné l’exemple d’une règle de vie basée sur des principes très
simples : l’honnêteté et la satisfaction du travail bien fait.
La plus belle marque de reconnaissance que je puisse leur offrir est ma réussite.
A ma sœur Sara ;
A mon frère Abd el Wahid
A ma sœur Hassiba et sa petite famille, Nazim, Amir et Lina
A la famille Lazreg et la famille Gargat
Louiza
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Remerciement
Je tiens tout d’abord à remercier Madame Zadi- Karam Halima, Professeur à l’Université
d’Oran 1 Ahmed Ben Bella, mon directeur de thèse pour m’avoir accueilli dans son
laboratoire. Ma profonde reconnaissance pour vos encouragements votre patience et vos
conseils. Mes remerciements aussi à Madame Dalache Fatiha, Professeur à l’Université
de Mostaganem, mon co-directeur de thèse pour son soutient et ses conseils tout au long
de ce travail.
Je remercie également les membres du Jury d’avoir bien voulu examiner ce travail. Mes
vifs remerciements vont à Mr Karam Nour Eddine, Pr à l’Université d’Oran 1, pour avoir
honoré par sa présence la présidence du jury, Mr Aoues Abdelkader, Pr à l’Université
d’Oran 1, Mr Bellahcene Miloud Pr au Centre Universitaire de Ain Témouchent et Mr
Drissi Mourad, Pr à l’Université de Tlemcen, pour avoir acceptés d’examiner cette thèse.
Lesquels commentaires, me seront immensément précieux lors de la soutenance.
Mes remerciements vont aussi à tous les chercheurs, doctorants, étudiants et techniciens
du laboratoire de Biologie des Microorganismes et Biotechnologie.
Mes remerciements à mes collègues et mes amis de l’université d’Oran 1, l’Université
Hassiba ben Bouali de Chlef et l’université de l’USTO-Mohamed Boudiaf.
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Publication et communication Scientifiques
Publication :
Louiza Lazreg, Fatiha Dalache, Halima Zadi-Karam, Nour-Eddine Karam.
Bacteriocinogenic potential and genotypic characterization of three Enterococcus
faecium isolates from Algerian raw milk and traditional butter. African Journal of
Biotechnology, Volume 14 (32), pp. 2517-2524, 12 August,2015.
Communications:
Louiza Lazreg, Fatiha Dalache, Halima Zadi-Karam, Nour-Eddine Karam. Bactériocines
produites par Enterococcus sp ». 2ème colloque international en biotechnologie,
Université d’Oran, Algérie, 26-29 Avril 2010
Louiza Lazreg, Fatiha Dalache, Halima Zadi-Karam, Nour-Eddine Karam. Inhibitor
Potential of Lactic Acid Bacteria Isolated from Algerian Food. Balkan Agriculture
Congress, 08-11 Septembre 2014
Louiza Lazreg, Fatiha Dalache, Halima Zadi-Karam, Nour-Eddine Karam.
Caractérisation Génotypique de souches d’Enterococcus faecium à Potentiel
bactéricinogène isolées d’aliments algériens..1er Colloque International de la Biologie
Appliquée USTO_MB, 29 Novembre- 01 Décembre 2015
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Sommaire Page
Introduction……………………………….……………………………….…………………… 1
1- Synthèse Bibliographique
1-1 Lait et Beurre traditionnel……………………………….………………………………….. 4
1-1-1 Lait……………………………….……………………………….………………………. 4
1-1-2 Microbiologie du lait cru……………………………….…………………………………. 5
1-1-3 Beurre traditionnel……………………………….……………………………….……… 6
1-1-4 Microbiologie du beurre……………………………….……………………………….…. 7
1-2 Bactéries lactiques…………………………………….……………………………….……. 8
1-2-1 Définition……………………………….……………………………….………………... 8
1-2-2 Caractéristiques générales……………………………….………………………………... 9
1-2-3 Habitat……………………………….……………………………….…………………… 9
1-2-4 Taxonomie et habitats des lactocoques et entérocoques …………………………………. 10
1-2-4-1 Lactococcus ……………………………….……………………………….…………... 12
1-2-4-2 Enterococcus …………………………………………………………………………… 13
1-2-5 Propriétés métaboliques d’intérêt technologie des entérocoques………………………… 15
1-2-5-1 Production d’acide……………………………….……………………………….…….. 16
1-2-5-2 Activité Protéolytique……………………………….………………………………….. 17
1-2-5-3 Activité lipolytique et estérasique ……………………………….…………………….. 17
1-2-5-4 Métabolisme du citrate et pyruvate……………………………….…………………….. 18
1-2-6 Application des entérocoques comme probiotiques………………………………………. 19
1-3 Activité antimicrobienne……………………………….……………………………….…... 20
1-3-1 Acides organiques………………………………….……………………………….…….. 20
1-3-2 Peroxyde d’hydrogène……………………………….…………………………………… 21
1-3-3 Diacétyle, acétaldéyde et acétoïne ……………………………….……………………… 22
1-3-4 Dioxyde de carbone……………………………….……………………………….……... 22
1-4 Bactéricocines et Entérocines ……………………………….……………………………… 23
1-4-1 Classification ……………………………….……………………………….……………. 24
1-4-2 Biosynthèse ……………………………….……………………………….……………... 29
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1-4-3 Génétique et régulation ……………………………….……………………………….…. 31
1-4-4 Immunité ……………………………….……………………………….………………... 34
1-4-5 Mécanisme d’action ……………………………….……………………………….…….. 35
1-4-6 Spectre d’activité……………………………….……………………………….………… 37
1-5 Facteurs influençant la production de bactériocines ……………………………….……… 38
1-5-1 Souche bactérienne……………………………….……………………………….……… 39
1-5-2 Influence du pH……………………………….……………………………….………….. 39
1-5-3 Influence de la température ……………………………….……………………………… 40
1-5-4 Influence des milieux de culture……………………………….………………………… 40
1-6 Application des bactériocines dans l’industrie alimentaire ………………………………… 43
2 Matériel et Méthodes
2-1 Bactéries……………………………….……………………………….…………………… 45
2-2 Milieux de culture, conditions de croissance et conservation des bactéries……………… 45
2-3 Isolement des bactéries lactiques……………………………….…………………………... 46
2-3-1 Isolement de bactéries lactiques à partir du beurre traditionnel………………………… 46
2-3-2 Isolement des entérocoques à partir des échantillons de laits crus……………………… 46
2-4 Identification phénotypique des bactéries lactiques……………………………….………... 47
2-4-1 Caractérisation morphologique……………………………….…………………………... 47
2-4-2 Caractérisation physiologique……………………………….……………………………. 48
2-4-3 Caractérisation biochimique……………………………….……………………………... 49
2-5 Caractérisation moléculaire des bactéries……………………………….………………….. 49
2-5-1 Extraction de l’ADN……………………………….……………………………………... 50
2-5-2 Amplification de l’ADN des entérocoques par PCR…………………………………… 50
2-5-3 Electrophorèse sur gel d’agarose des produits de la PCR………………………………. 51
2-5-4 Analyse phylogénétique des bactéries……………………………….…………………… 52
2-6 Potentiel inhibiteur des bactéries lactiques……………………………….………………… 53
2-7 Détection de bactéries potentiellement bactériocinogenes………………………………….. 54
2-8 Caractérisation de la nature biochimique des métabolites antibactériens ………………….. 54
2-8-1 Sensibilité aux enzymes……………………………….……………………………….… 55
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2-8-2 Effet de la chaleur……………………………….……………………………….……….. 56
2-8-3 Effet au pH……………………………….……………………………….………………. 56
2-9 Influence des milieux de cultures sur la production de métabolites antibactériens………… 56
2-9-1 Influence du tampon du milieu M17 ……………………………….……………………. 56
2-9-2 Influence de différentes concentrations de lait écrémé ajoutées au bouillon M17……….. 57
2-9-3 Influence des sucres ……………………………….……………………………….…….. 57
2-9-4 Influence des milieux M17 et MRS modifiés……………………………….…………… 57
2-10 Cinétique de croissance et de production de métabolites antibactériens………………… 58
2-11 Purification des bactériocines……………………………….……………………………... 58
2-11-1 Précipitation par le sulfate d’ammonium ……………………………….……………… 58
2-11-2 Chromatographie par filtration sur gel de sephadex G-25………………………………. 59
2-11-3 Chromatographie échangeuse d’ions……………………………….…………………… 60
2-11-4 Electrophorèse SDS-PAGE……………………………….……………………………... 61
3-Résultats et discussion
3-1 Isolement des bactéries lactiques……………………………….………………………… 64
3-2 Identification phénotypique des bactéries lactiques……………………………….……….. 65
3-3 Potentiel inhibiteur des bactéries lactiques……………………………….………………… 70
3-4 Détection de bactéries potentiellement bactériocinogènes………………………………….. 76
3-5 Caractérisation moléculaire des bactéries ……………………………….…………………. 82
3-5-1 Amplification de l’ADN des entérocoques……………………………….………………. 82
3-5-2 Analyse phylogénétique……………………………….……………………………….…. 83
3-6 Caractérisation de la nature biochimique des métabolites antibactériens………………… 89
3-6-1 Mise en évidence de l’activité inhibitrice dans le surnageant de culture ………………… 89
3-6-2 Sensibilité aux enzymes ……………………………….…………………………………. 93
3-6-3 Traitement par la chaleur……………………………….………………………………... 95
3-6-4 Effet de différents pH……………………………….……………………………….……. 97
3-7 Influence des milieux de culture sur la production de métabolites antibactériens………….. 103
3-7-1 Influence du tampon du milieu de culture……………………………….………………. 103
-
3-7-2 Influence de différentes concentrations de lait écrémé ajoutées au bouillon M17………. 107
3-7-3 Influence des sucres ……………………………….……………………………….…….. 111
3-7-4 Influence des milieux M17 et MRS modifiés……………………………….……………. 114
3-8 Cinétique de croissance et de production de bactériocines ………………………………… 117
3-9 Purification des bactériocines ………………………………………………………………. 125
3-9-1 Précipitation par le sulfate d’ammonium…………………………………………………. 125
3-9-2 Chromatographie par filtration sur gel de sephadex G-25………………………………. 126
3-9 -3 Chromatographie par échanges d’ions ……………………………….………………… 129
3-9-4 Détermination de la taille moléculaire des bactériocine par SDS-PAGE………………… 132
4 Conclusion……………………………….……………………………….…………………... 138
5 Références Bibliographiques
Annexe I
Annexe II
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Liste des tableaux Page
Tableau 1: Classification de bactéries lactiques couramment utilisées dans le beurre et le
yaourt (Drain, 2016)
7
Tableau 2: Enterococcus et leur répartition en groupes d'espèces (Franz et al., 2006) 15
Tableau 3 : Classification des entérocines (Nes et al., 2007) 28
Tableau 4: Souches cibles utilisées 45
Tableau 5 : Echantillons utilisés et leurs origines 46
Tableau 6 : Composition du mélange réactionnel pour chaque réaction PCR 51
Tableau 7 : composition du gel d’agarose 52
Tableau 8 : Composition des gels de polyacrylamide 62
Tableau 9 : Composition du tampon de migration 62
Tableau 10 : Code des bactéries lactiques isolées à partir du beurre 64
Tableau 11: Code des bactéries lactiques isolées à partir du lait cru 63
Tableau 12 : Identification des bactéries lactiques à l’aide de galerie API 20 Strep 66
Tableau 13 : Identification des bactéries lactiques par caractérisation physiologique et à
l’aide de galeries d’identification API 20 Strep
67
Tableau 14: Inhibitions par les bactéries lactiques 77
Tableau 14 suite : Inhibitions par les bactéries lactiques 78
Tableau 15 : Diamètres des zones d’inhibition des bactéries-tests par les souches d’E
faecium
90
Tableau 16 : Diamètre d’inhibition de bactéries cibles par les extraits concentrés (EC) par
lyophilisation
91
Tableau 17: Effet des enzymes sur l’activité inhibitrice 94
Tableau 18: Diamètre d’inhibition des précipités de surnageant de culture d’Enterococcus
faecium BRO2 et LO12.
125
-
Liste des figures
Page
Figure 1: Position des genres Enterococcus, Lactococcus et Leuconostoc dans
l’arbre phylogénique des bactéries lactiques sur la base de séquences du gène de
l'ARNr 16S. (Holzapfel et al., 2001).
11
Figure 2 : Voie schématique montrant la relation métabolique entre citrate et
glucose (Cabral et al., 2007)
18
Figure 3: Classification universelle de bactériocines construite sur la base de (a)
système de classification originale pour les bactériocines de bactéries lactiques par
Klaenhammer (1993), et incorporant des éléments (b) de la classification révisée de
Cotter et al (2005)
25
Figure 4 : Présentation schématique de la biosynthèse de l’entérocine A. ( Ennahar
et al., 2000; Martínez et al., 2000; Drider et al., 2006)
30
Figure 5: Organisation des déterminants génétiques impliqués dans la synthèse des
bactériocines d’après Skaugen et al., (2003), Drider et al., (2006) et Franz et al.,
(2007).
32
Figure 6: Mode d’action des bactériocines produites par des bactéries lactiques
(Martínez et al.,2000; Cotter et al., (2005); Breukink et De Kruijff., 2006).
36
Figure 7: Effet inhibiteur des isolats du beurre vis-à-vis de la souche Enterococcus
faecium H3 selon la méthode de Fleming et al. (1975)
70
Figure 8: Inhibition des bactéries cibles par les isolats de lait cru 71
Figure 9: Inhibition de bactéries cibles par les souches isolées du beurre et de la
collection du laboratoire
73
Figure 10 : Inhibition d’E. faecium H3 par les ouches E.feacium BRO2, LO4 et
LO12
76
Figure 11 : Inhibition d’Pseudomonas sp par les ouches E. feacium BRO2, LO4 et 76
-
LO12
Figure 12 : Interactions des souches de L. lactis ssp lactis vis-à-vis des bactéries
cibles
79
Figure 13 : Interaction des souches d’Enterococcus vis-à-vis des bactéries cibles 79
Figure 14 :Gel d’électrophorèse des produits PCR. 83
Figure 15 : Alignement de la séquence partielle de l’ARN 16S de la souche BRO2
sur la séquence de l’ARN 16S de la souche de référence d’E. faecium JCM 5804
84
Figure 16 : Alignement de la séquence partielle de l’ARN 16S de la souche LO4
sur la séquence de l’ARN 16S de la souche de référence d’E. faecium JCM 5804
85
Figure 17 : Alignement de la séquence partielle de l’ARN 16S de la souche LO12
sur la séquence de l’ARN 16S de la souche de référence d’E. faecium JCM 5804
86
Figure 18: Arbre phylogénétique construit par la méthode Neighbor-joining
utilisant des séquences 16SrRNA des souches (LO4, LO12 et BRO2) et des
séquences 16SrRNA de 12 souches d’espèces connues d’Enterococcus. L’arbre a
été répété 100 fois.
87
Figure 19 : Effet des enzymes sur le surnageant de culture d’ E faecium LO12. 94
Figure 20 : Activité inhibitrice résiduelle des substances des souches E feacium
BRO2, LO4 et LO12 vis-à-vis d’ E faecium H3.
96
Figure 21: Effet du pH sur l’activité inhibitrice des souches d’E faecium vis-à-vis
d’E.
faecium H3
98
Figure 22: Influence du tampon du milieu de culture sur la production de
métabolites antibactériennes par E. faecium BRO2.
104
Figure 23: Influence du tampon du milieu de culture sur la production de
métabolites antibactériennes par E. faecium LO4.
104
-
Figure 24: Influence du tampon du milieu de culture sur la production de
métabolites antibactériennes par E. faecium LO12.
105
Figure 25 :Influence de la concentration de lait écrémé additionné au milieu de
culture sur la production de métabolites antibactériennes par E.faecium BRO2.
108
Figure 26 :Influence de la concentration de lait écrémé additionné au milieu de
culture sur la production de métabolites antibactériennes par E.faecium LO4.
108
Figure 27 :Influence de la concentration de lait écrémé additionné au milieu de
culture sur la production de métabolites antibactériennes par E.faecium LO12.
109
Figure 28 : Influence des sucres du milieu de culture sur la production de
métabolites antibactériens par E. faecium BRO2
111
Figure 29 : Influence des sucres du milieu de culture sur la production de
métabolites antibactériens par E. faecium LO4
112
Figure 30 : Influence des sucres du milieu de culture sur la production de
métabolites antibactériens par E. faecium LO12
112
Figure 31 : Influence du M17 et du MRS modifiés sur la production de métabolites
antibactériennes par E.faecium BRO2
114
Figure 32 : Influence du M17 et du MRS modifiés sur la production de métabolites
antibactériennes par E.faecium BRO2
115
Figure 33 : Cinétique de croissance et de production de bactériocines d’E. faeciu
BRO2
118
Figure 34 : Cinétique de croissance et de production de bactériocines d’E. faecium
LO12
118
Figure 35 : Vitesse spécifique de croissance et de production de bactériocines
d’E.faecium BRO2
119
Figure 36 : Vitesse spécifique de croissance et de production de bactériocines
d’E.faecium LO12
120
Figure 37 : Chromatographie gel filtration de la fraction active FA1 BRO2 sur 127
-
Séphadex G-25
Figure 38 : Chromatographie gel filtration de la fraction active FA1 LO12 sur
Séphadex G-25
127
Figure 39 : Activité antibactérienne des fractions collectées après filtration sur
chromatographie gel filtration (Sephadex G-25)
128
Figure 40: Chromatographie échangeuse d’ions de la fraction active FA2 BRO2 sur
DEAE-cellulose éluée par divers tampons.
129
Figure 41: Chromatographie échangeuse d’ions de la fraction active FA2 LO12 sur
CM-Séphadex C-25 éluée par un gradient continu de NaCl 0 M à 0,1 M et de 0,1 M
à 1 M.
130
Figure 42 : Activité inhibitrice des fractions obtenues par chromatographie
échangeuse de cations (CM-SéphadexC-25)
131
Figure 43 : Electrophorèse sur gel de polyacrylamide des fractions actives BRO2. 132
Figure 44 : Courbe de calibration SDS PAGE 133
Figure 45 : Analyse électrophorétiques des fractions actives LO12. 134
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Abréviations
ADN : Acide désoxyribonucléique
ARN Acide ribonucléique
BLIS : Bacteriocin Like Inhibitory substances
°C: Degré celsius
CM:CarboxyMethyl
D : Dextrogyre
Da : Dalton
DEAE: DiEthylAminoEthyl
DO : Densité Optique
E: Enterococcus
EDTA: Acide Éthylène Diamine Tétracétique
FAO: Food Agriculture Organisation (Organisation des nations Unies pour l’agriculture et
l’alimentation)
g: Gramme
h : heure
HCl: Acide Chloridrique
ICMSF : International Commision on Microbiological Specification for Food
(Commission internationale pour la définition des caractéristiques microbiologiques
des aliments)
kDa Kilodalton
L: Lactococcus
L : Levogyre
-
nm : Nanomètre
PCR: Polymerase Chain reaction
pH: Potentiel Hydronium
Tr/min : Tours par minute
UA/ml Unité Arbitraire /ml
µl microlitre
µm : micromètre
UFC : Unité Formant Colonies
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Résumé
Les bactéries lactiques sont impliquées dans de nombreux processus de transformation
alimentaire grâce à leurs propriétés technologiques. Elles produisent aussi différentes
substances à activité antimicrobienne exploitées comme conservateurs biologiques. Ce
travail a porté sur l’étude du potentiel bactériocinogène de souches isolées d’aliments
locaux. Les souches de bactéries lactiques isolées du lait cru et du beurre de fabrication
traditionnelle sont phénotypiquement identifiées à L. lactis, L. cremoris, E. faecium, E.
faecalis, L. garviae, E. durans et Enterococcus sp. L’évaluation du potentiel inhibiteur de
ces bactéries lactiques montre que les souches E. faecium BRO2, LO4 et LO12 sont
bactériocinogènes vis-à-vis de Pseudomonas sp, Proteus mirabilis et E. faecium. L’analyse
phylogénétique des souches bactériocinogènes confirme leur identification à E. faecium.
La sensibilité des métabolites antibactériens aux enzymes protéolytiques et leur résistance
à la chaleur et aux différents pH confirme le potentiel bactériocinogène d’E. faecium
BRO2, LO4 et LO12. La production de ces bactériocines nommées entérocines (BRO2,
LO4, LO12) est significativement améliorée en bouillon M17 tamponnée par du tampon
phosphate de sodium par comparaison aux autres tampons testés. L’ajout de lait écrémé au
bouillon M17 augmente significativement la production de l’entérocine LO12. Dans ce
bouillon, la production des entérocines BRO2 et LO4 est aussi améliorée sans être
statistiquement significative. Le glucose par comparaison aux autres sucres testés est le
sucre le plus approprié à la production de ces bactériocines. Le bouillon M17 modifié
permet de produire plus de bactériocines BRO2 et LO12 que le bouillon M17 ou MRS ou
Lait. Les entérocines BRO2 et LO12 sont des métabolites secondaires, thermostables et
cationiques. L’analyse par électrophorèse SDS-PAGE a révélé que l’entérocine BRO2 a
une taille moléculaire comprise entre 5700 à 6900 Da.
Mots clés : Bactéries lactiques, potentiel inhibiteur, bactériocinogène, phylogénétique,
E. faecium, entérocines, M17 modifié, cationiques, métabolite, taille moléculaire.
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ABSTRACT
The lactic acid bacteria are involved in numerous processes of food transformation thanks
to their technological properties. They produce so various substances with antimicrobial
activity exploited as bio-preservatives. This work concerned the study of the
bacteriocinogenic potential of isolates from local food. The lactic acid bacteria isolated
from raw milk and traditional manufacturing butter are phenotypically identified as L.
lactis, L. cremoris, E. faecium, E. faecalis, L. garviae, E. durans and Enterococcus sp. The
evaluation of the inhibitory potential of these lactic acid bacteria shows that E. faecium
BRO2, LO4 and LO12 strains are bacteriocinogenic towards Pseudomonas sp, Proteus
mirabilis and E. faecium. The phylogenetic analysis of bacteriocinogenic strains confirms
their identification to E. faecium. The sensibility of the antibacterial metabolites to
proteolytic enzymes and their resistance at various pH and heat treatment confirms the
bacteriocinogenic potential of E. faecium BRO2, LO4 and LO12. The production of
enterocins (BRO2, LO4, LO12) is significantly improved in broth M17 buffered with
sodium phosphate. The addition of skimmed milk to the M17 broth increases significantly
the production of the enterocin LO12. In this broth, the production of enterocins BRO2 and
LO4 is also improved without being statistically significant. The glucose seems to be the
most suitable sugar to improve the production of these bacteriocins. The modified M17
broth allows to produce more of bacteriocins BRO2 and LO12 than the M17 or MRS broth
or Milk. Enterocins BRO2 and LO12 are secondary metabolites, thermosatbles and
cationics. The analysis by SDS-PAGE revealed that the enterocin BRO2 has a molecular
size between 5700 to 6900 Da.
Keywords: Lactic acid bacteria, Inhibitory potential, bacteriocinogenic, phylogenetic, E.
faecium, enterocin.
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الملخص
في العديد من عمليات تحويل األغذية بفضل خصائصها التكنولوجية. وهي تنتج مواد اللبنتشارك بكتيريا حمض
سالالت ات عزليإمكان كمواد حافظة حيوية. تناول هذا البحث دراسة تستعملمختلفة جدا ذات نشاط مضاد للميكروبات
المعزولة من الحليب الخام والزبدة التقليدية في اللبن كتريا حمضاألغذية المحلية. تم تحديد ب من لبكتريوسين منتجة
التصنيع
L. lactis, L. cremoris, E. faecium, E. faecalis, L. garviae, E. durans and Enterococcus sp.
E. faecium BRO2 ،LO4 E. faeciumبإختيار لنا سمح مثبطة مواد إنتاج اللبن . تقييم إمكانية بكتيريا حمض
L012 E. faecium
. .Pseudomonas sp, Proteus mirabilis and E. faecium مثبطة لبكتريوسين منتجة السالالت هذه
ت الحموضة والمعالجة امختلف درجل ةلالنزيمات ومقاومل حساسة أنها على المنتجة المواد المثبطة تحاليل أثبتت
مع فوسفات M17( بشكل ملحوظ في مرق BRO2 ،LO4 ،LO12) بكتريوسين الحرارية . تم تحسين إنتاج
في هذا المرق، إنتيروسين. LO12يزيد بشكل كبير من إنتاج M17الصوديوم. إضافة الحليب منزوع الدسم إلى مرق
أيضا دون أن تكون ذات داللة إحصائية. ويبدو أن الجلوكوز هو السكر LO4و BRO2بكتريوسينيتم تحسين إنتاج
من LO12و BRO2بكتيريوسين إنتاج لزيادت المعدلة M17. يسمح مرق بكتريوسين لتحسين إنتاج هذهاألنسب
موجبة. كشف شحنة ذات هي األيض الثانوية، LO12و BRO2 بكتريوسين . أو الحليب MRSأو M17مرق
Da 6900حتي 5700جزيئي بين لديه حجم BRO2 األنتيروسين SDS-PAGEالتحليل
: ئيسيهر كلمات ; اللبنبكتيريا حمض ; مضاد للميكروبات سالالت ;بكتريوسين; Enterococcus ; األغذية مرق
M17 المعدلة
-
Introduction
-
Introduction
1
De nos jours les aliments de fabrication traditionnelle sont toujours appréciés par quelques
consommateurs. L’excès d’aliments et la nécessité de les consommer pour survivre
pendant l’hiver et les périodes de sécheresse menèrent l’homme à utiliser depuis longtemps
et empiriquement des procédés de conservation. Ces aliments transformés par nos ancêtres
sont à l’origine des produits des industries alimentaires actuelles. La fermentation avec les
procédés de séchage et de salage, est la plus ancienne des méthodes de conservation des
aliments, elle est ancrée dans les cultures traditionnelles et la vie des villageois (Marshall
et Meijia, 2012).
Certains micro-organismes comme les bactéries lactiques, les moisissures et les levures ont
largement été exploités dans les fermentations alimentaires (Giraffa, 2004). Ils sont
responsables de nombreuses propriétés d’aliments fermentés tels que la flaveur, la durée de
vie, la texture et les effets bénéfiques sur la santé (Giraffa, 2004). La production
d’aliments fermentés est basée sur l’utilisation de ferments, par exemple les bactéries
lactiques qui initient rapidement l’acidification de matières premières (Leroy et DeVuyst,
2004). Ces bactéries acidifient les aliments, générant un goût d’acide lactique piquant,
exerçant des activités protéolytiques et lipolytiques et produisant des composés
arômatiques, par exemple à partir d’acides aminés, en plus de la bioconversion (Van
Kranenburg et al., 2002). Ces ferments ont été isolés et caractérisés à partir d’aliments
transformés par des procédés ancestraux.
Les bactéries lactiques sont économiquement importantes car elles sont largement utilisées
dans les denrées alimentaires et les aliments fermentés. Elles produisent différentes
substances à activité antimicrobienne qui peuvent être utilisées comme bio-conservateurs
(Centeno et al., 1996). L’effet antimicrobien de ces bactéries à travers le processus de
fermentation a été apprécié par l’homme et lui a permis de prolonger la durée de vie de
plusieurs aliments (Savadogo et al., 2004). Les bactéries lactiques sont présentes dans de
nombreux produits alimentaires et elles sont essentielles dans de nombreux processus de
transformation alimentaire conduisant à des changements dans la texture, la saveur et la
conservation des produits fermentés. La capacité de ces bactéries à inhiber la croissance
d'autres bactéries est connue depuis de nombreuses années. Les substances responsables de
cette activité inhibitrice comprennent des acides organiques, le diacétyle, le peroxyde
-
Introduction
2
d'hydrogène, des agents lytiques, et les bactériocines (Tagg et al .,1976).
Les deux dernières décennies ont connu une recherche intensive sur les produits
antimicrobiens naturels synthétisés par des bactéries lactiques qui peuvent être utilisés
comme conservateurs alimentaires à la place de conservateurs chimiques (Gautam et al.,
2014). Le principal effet antimicrobien de ferments lactiques responsable de bio-
conservation est le taux d’acidification. Cependant pour les produits légèrement acidifiés,
l’activité bactériocinogène peut jouer un rôle crucial pour éliminer les micro-organismes
indésirables qui montrent une tolérance à l’acidité (Šušković et al., 2010).
Actuellement, les bactériocines ont attiré l'attention en tant que substituts potentiels, ou en
tant que thérapie combinée utilisant des composés antimicrobiens en raison de leur
puissante activité, leur stabilité et une faible toxicité pour les humains (Joerger, 2003 ;
Hassan et al., 2012; Amer Eglal et al., 2014). Plusieurs bactériocines de bactéries à Gram
positif ont moyennement un large spectre et ont un grand potentiel comme agents
antimicrobiens dans les aliments et production de nourriture (Nigutova et al., 2005). Elles
sont fréquemment retrouvées comme métabolites secondaires, produits par une variété de
micro-organismes tels que les bactéries à Gram-positif du genre Streptomyces, bactéries
lactiques et Bacillus (Klaenhammer, 1988). Les bactériocines sont largement utilisées en
sciences alimentaires pour prolonger la durée de conservation (Ghrairi et al., 2012). Elles
inhibent les infections par les pathogènes chez les animaux (Van Heel et al., 2011). Les
industries pharmaceutiques et les sociétés médicales tentent de les utiliser comme
traitement de cancers malins (Lancaster et al., 2007).
Dans cette étude nous nous sommes intéressés à étudier le potentiel bactérioicinogène des
entérocoques. En effet, les entérocoques connaissent un intérêt croissant quant à leur
utilisation comme producteurs de bactériocines et aussi en tant que probiotiques. Dans
certains fromages, la croissance des entérocoques contribue à la maturation et le
développement de la saveur des aliments (Konings et al., 2000). Les entérocoques sont
souvent utilisés comme probiotiques améliorant l'équilibre microbien de l'intestin ou
comme un agent bénéfique dans le traitement de la gastro-entérite chez les humains et les
animaux (Stiles et Holzapfel, 1997). Plusieurs entérocoques d'origine alimentaire
produisent des bactériocines qui exercent une activité anti Listeria (Laukov et Marekova,
2001).
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Introduction
3
L’utilisation de substances antimicrobiennes produites par les bactéries traditionnellement
utilisées dans la fabrication d’aliments a été intensément étudiée comme moyen
d’amélioration des barrières microbiennes dans les aliments formulés et peu transformés
(Garver et Muriana, 1993). L’aliment fermenté a été identifié comme l’une des sources
importantes de souches productrices de bactériocines (Noojaree Sonsa-Arda et al ., 2015).
De nombreux travaux s’intéressent à la caractérisation de ferments lactiques des produits
dérivés du lait tel que le fromage traditionnel. Cependant le beurre ne fait l’objet que de
peu de travaux en raison de la recrudescence de sa consommation dans les régions
mondaines dont les populations sont en quête de manger moins gras. En région rurales le
beurre de fabrication traditionnelle est très apprécié par les consommateurs. Au beurre
s’ajoute le lait cru qui est la matière première du beurre. Ce dernier est obtenu par
fermentation spontanée du lait cru. Les bactéries lactiques du beurre ou du lait cru (la
matière première des aliments dérivés du lait) sont des ferments empiriques. Il est
intéressant d’étudier ces bactéries lactiques indigènes et de caractériser leur bactériocines.
Dans ce contexte, le Laboratoire de Biologie des Micro-organismes et Biotechnologie
s’intéresse à caractériser des souches isolées de lait de chamelle collecté dans la région de
Timimoun (Karam, 1995 ; Zadi-Karam, 1998) et à étudier le potentiel bactériocinogène
ainsi que la caractérisation de bactériocines de bactéries lactiques isolées d’aliments locaux
(Dalache, 2006 ; Merzoug et al., 2016).
Ce travail de thèse est orienté vers le potentiel bactériocinogène de bactéries lactiques
indigènes isolées de beurre de fabrication traditionnelle et de lait cru. Dans ce contexte,
notre travail à consister à isoler à partir d’échantillons locaux de beurre et de lait cru des
souches de bactéries lactiques indigènes particulièrement les lactocoques et les
entérocoques. Parmi ces derniers, les souches à potentiel bactériocinogène ont été
caractérisées à l’échelle moléculaire. Les métabolites antibactériens ont été caractérisés par
détermination de leur nature et propriétés biochimiques. L’influence de la composition du
milieu de production a été aussi étudiée.
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Synthèse Bibliographique
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Synthèse Bibliographique
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1-1 Lait et Beurre traditionnel
1-1-1 Lait
Le lait est le produit élaboré par les glandes mammaires des femelles de mammifères après
la naissance du jeune. En 1909, le congrès international de la répression des fraudes défini
le lait comme étant le produit intégral de la traite totale et interrompue d’une femelle
laitière bien portante, bien nourrie et non surmenée. Il doit être recueilli proprement et ne
pas contenir de colostrum.
Selon le CODEX STAN 206 (1999), le lait est la sécrétion mammaire normale d’animaux
de traite obtenue à partir d’une ou de plusieurs traites, sans rien y ajouter ou en soustraire,
destiné à la consommation comme lait liquide ou à un traitement ultérieur. Il est décrit
comme étant un liquide opaque blanc mat, légèrement bleuté ou plus au moins jaunâtre à
l’odeur peu marquée et au gout douceâtre, secrété après parturition par la glande
mammaire des animaux mammifères femelles pour nourrir leur nouveau-né.
Le lait est un aliment riche et complet. C’est le premier aliment que consomme un
nouveau-né chez les mammifères. En raison de ses propriétés nutritives, de sa teneur en
vitamines et en minéraux en particulier le calcium le lait ainsi que ses dérivés, ont toujours
été appréciés et largement consommés dans le monde. Selon la FAO 2016, la
consommation moyenne de lait par habitant en Afrique du Nord est de 30 à 150 kg/
habitant/ an. Le lait de vache est de tous le plus connu et les données qui le caractérisent
sont sans doute les plus exactes. La vache assure de loin la plus grande part de la
production mondiale (90 pour cent) même en pays tropicaux (70 pour cent) (FAO, 1990).
Il est logiquement aussi le produit laitier le plus consommé et étudié en nutrition humaine.
En Algérie, le lait occupe une place importante dans la ration alimentaire de chacun, quel
que soit son revenu. Ainsi, pour 1990, on estime que le lait a compté pour 65,5 % dans la
consommation de protéines d’origine animale, devançant largement la viande (22,4 %) et
les œufs (12,1 %) (Amellal, 1995). En 2014, la consommation moyenne de lait en Algérie
est de 130 litres par personne par an, se classant parmi les plus gros consommateurs de lait
au monde. D’après Souki (2009), l’Algérie est le deuxième importateur de lait et dérivés
après le Mexique (la croissance des importations laitières s’élève à 57 % en moyenne par
an entre 1996 et 2004.
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Synthèse Bibliographique
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1-1-2 Microbiologie du lait cru
La riche composition du lait fait de lui un milieu de culture favorable à la croissance de
nombreux micro-organismes. L’activité d’eau élevée, le pH modéré (pH 6,4 - 6,6) et
l’approvisionnement suffisant en nutriments font du lait un excellent milieu.
La composition de la flore microbienne du lait cru est fonction des conditions d’hygiène
lors de la traite, et de l’état de santé de l’animal. La flore du lait cru est composée
d’espèces de contamination provenant de l'étable, de l’alimentation, la surface du trayon ou
de l’équipement laitier (Cousin, 1982). Trois sources contribuent à la présence de micro-
organismes dans le lait : le pis intérieur du trayon extérieur, son environnement immédiat
et l'équipement de traite et de la manutention du lait (Adams et Moss, 2008).
La prise aseptique de lait à partir d’une vache saine contient normalement un faible nombre
de micro-organismes, typiquement moins 102_103 UFC/ml (Adams et Moss, 2008).
Généralement, un nombre élevé de bactéries lactiques peuvent être trouvées dans le lait
cru. Elles appartiennent aux genres Lactococcus, Lactobacillus, Leuconostoc,
Enterococcus, Streptococcus (Richter et al., 1992).
Les microorganismes couramment isolés sont les microcoques, streptocoques et
diphteroides. Les dénombrements de Corynebacterium bovis sont fréquemment élevés due
à la mammite, maladie inflammatoire du tissu mammaire lequel est la cause majeure de la
perte économique en industrie laitière (Adams et Moss, 2008). D’autres bactéries à Gram
positif comme Bacillus, Microbacterium, Micrococcus, Staphylococcus et des bactéries à
Gram négatif telles que Pseudomonas, Aeromonas, Acinetobacter, Stenotrophomonas et
Chryseobacterium ainsi que plusieurs entérobactéries tel Enterobacter, Hafnia et
Klebsiella sont aussi fréquemment trouvés dans le lait cru. Entre les bactéries, quelques
genres de levures comme Candida, Kluyveromyces et Pichia ont aussi été isolés (Fleet;
1990; Delavenne et al., 2011; Quigley et al., 2011).
Petersen et al (2002), ont montré que les levures et les moisissures peuvent contaminer le
lait et le fromage et contribuent à la maturation de fromages.
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Synthèse Bibliographique
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1-1-3 Beurre traditionnel
Le beurre est un produit gras dérivé exclusivement du lait et/ou de produits obtenus à partir
du lait, principalement sous forme d’une émulsion du type eau-dans-huile (FAO, 2011).
La FAO décrit le beurre comme étant un produit gras dérivé exclusivement de la crème, du
lait, ou sous-produits laitiers. En plus de la graisse du lait, le beurre contient des solides
non gras du lait, de l'eau et, parfois, des additifs. A la différence du lait et de la crème, où
les globules de graisse sont dispersés dans la phase aqueuse, le beurre bien travaillé est
constitué d'eau dispersée dans la graisse.
La phase continue est constituée de matière grasse du lait dans lequel des gouttelettes
aqueuse, certains globules gras et de minuscules bulles d'air sont répartis uniformément. En
termes plus pratiques, le beurre est une pâte grasse. Il est doux et tartinable à température
ambiante et plus difficile si elle est froide. Il a une saveur douce légèrement acide.
Le beurre traditionnel est un produit ancestral, connu depuis la nuit des temps dans de
nombreuses civilisations. Parmi les dérivés du lait, le beurre est le moins consommé. Sa
riche teneur en matières grasses en est la cause. En Algérie, le beurre de fabrication
traditionnelle est appelé Zebda et est obtenu à partir de lait fermenté appelé ‘’Raib’’. Les
étapes d’obtention de ce beurre se résument en :
-fermentation spontanée du lait cru : le lait cru est transformé en petit lait (‘’Raib’’) à une
température ambiante. En hiver la fermentation se déroule pendant 2 à 3 jours, alors qu’elle
ne dure qu’une journée en été.
-le barattage : le petit lait est agité fortement dans un contenant (auparavant ‘’chakwa’’)
jusqu’à formation de globules gras. Ces globules étant de faible densité sont récupérés à la
surface.
On distingue deux sortes de beurres, le beurre frais qui correspond à la matière grasse
récupérée après barattage dont la structure est molle en raison de la forte concentration en
eau et le beurre conservé appelé ‘’smen’’ qui a été additionné de sel afin de pouvoir le
conserver.
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Synthèse Bibliographique
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1-1-4 Microbiologie du beurre
La composition de la flore du beurre traditionnel, dépend non seulement de la qualité
microbiologique du lait cru, mais aussi des ustensiles utilisées lors de la fermentation du
lait et lors du barattage. Il peut contenir des bactéries lactiques, des levures et des
moisissures.
Les genres et espèces de bactéries lactiques participant dans la fabrication du beurre sont
des bactéries mésophiles par comparaison aux ferments utilisés en fromagerie (Tableau 1).
Tableau 1: Classification de bactéries lactiques couramment utilisées dans le beurre
et le yaourt (Drain, 2016)
Mésophiles (Croissance à 25-30°C)
Utilisées pour fabriquer par exemple le beurre
et les fromages
Thermophiles (Croissance à 38°C- 45°C)
Utilisées pour fabriquer par exemple le
yaourt ou fromages durs
Types de ferments
• -Type O :
• L. lactis ssp. lactis
• L. lactis ssp. Cremoris
• Produisent principalement de l'acide
lactique à partir du lactose
• Type D
• Plus Type O ;
• L. lactis ssp. lactis biovar
diacetylactis comme producteur
flaveur (ex : diacétyle)
• Type L
• Plus Type O ;
• Ln mesenteroides ssp.
mesenteroides comme producteur de
flaveur (ex : diacetyl, acide acetique)
• Type LD
• Combinaison de type L et D
Exemples :
• Str. salivarius ssp. thermophilus
(Produit de l'acide lactique à partir
du lactose)
• Lb. delbrueckii ssp. bulgaricus
(produit l’acide lactique, aussi bien
que des composés de flaveur
donnant au yaourt son goût et son
arôme
• Lb. acidophilus
• Bifidobacterium animalis
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Synthèse Bibliographique
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En Europe continentale la plupart des beurres traditionnels sont fabriqués à partir de crème
fraîche en utilisant des cultures de démarrage et une phase aqueuse à pH avoisinant 4,6. La
microflore du beurre dérive principalement de la crème utilisée (ICMSF).
La qualité microbiologique de la crème séparée dans la ferme diffère considérablement de
la crème fraîche séparée dans une usine de produits laitiers. Par exemple lorsque la crème
est maintenue dans une ferme pendant une semaine dans des conditions d'hygiène
déplorables et sans réfrigération, l’acidification (la croissance de Lactococcus lactis et
d'autres micro-organismes indésirables) peut avoir eu lieu, la croissance des levures et
moisissures (Geotrichum candidum) peut être abondante et des bactéries à Gram négatif
aérobies (membres des genres Pseudomonas, Alcaligenes, Acinetobacter / Moraxella et
Flavobacterium) peuvent avoir proliféré, entraînant des changements protéolytiques et
lipolytiques (Foster et al., 1957).
1-2 Bactéries lactiques
1-2-1 Définition
Les bactéries lactiques constituent un groupe hétérogène de microorganismes transformant
les hydrates de carbone en acide lactique, d’où leur nom de bactéries. Elles ont été
découvertes en 1782 par le chimiste suédois Scheele (in Thonart, 1997). C’était en 1919
qu’Orla-Jensen a défini pour la première fois le groupe des bactéries lactiques.
Ce groupe réunit plusieurs genres de différentes morphologies ayant pour caractère
commun leur capacité à fermenter le lactose en produisant de l’acide lactique. Ces
bactéries ont été l’un des groupes bactériens les plus utilisés en raison de leurs larges
applications industrielles. Le groupe de bactéries lactiques contient principalement des
souches de Lactobacillus, Weissella, Carnobacterium, Streptococcus, Enterococcus,
Lactococcus, Vagococcus, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus, et Tetragenococcus.
Elles sont impliquées dans un grand nombre de fermentations spontanées de produits
alimentaires (Stiles et Holzapfel, 1997).
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Synthèse Bibliographique
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1-2-2 Caractéristiques générales
Les bactéries lactiques sont des procaryotes hétérotrophes et chimio organotrophes (in De
Roissart, 1986). Elles sont à Gram positif, non sporulantes, non mobiles, anaérobies mais
aérotolérantes et ne possèdent pas de catalase (certaines souches possèdent une
pseudocatalase), de nitrate réductase, ni de cytochrome oxydase.
Toutes les bactéries lactiques possèdent un métabolisme fermentaire leur permettant, en
utilisant des sucres fermentescibles, de produire principalement de l’acide lactique mais
aussi d’autres acides organiques (acide acétique, acide formique.). Certaines espèces ou
certaines souches peuvent en outre produire de l’acide formique ou de l’acide succinique
(De Roissart et Luquet., 1994).
Toutes les bactéries lactiques en utilisant les glucides, peuvent produire soit de :
- l’acide lactique exclusivement (bactéries homolactiques strictes),
- l’acide lactique et de l’acide acétique (bactéries hétérolactiques facultatives),
- l’acide lactique, de l’acide acétique ou de l’éthanol et du CO2 (bactéries hétérolactiques
strictes).
La plupart des bactéries lactiques sont mésophiles; certaines sont psychrotolérantes ou
thermotolérantes. Elles se développent majoritairement à des pH compris entre 4 et 6,5 et
certaines sont encore actives à pH 9,6 ou à pH 3,2. Elles ont des tolérances très variables
vis-à-vis du sel (Dalie-Doguiet, 2010).
1-2-3 Habitat
Les bactéries lactiques sont ubiquistes, Elles colonisent de nombreux produits alimentaires
comme les produits laitiers, la viande, le poisson, les végétaux et les céréales (Drouault et
al., 2001 ; Dortu, 2008). Ces bactéries vivent en association avec un hôte, tel que
l’Homme ou l’animal, dans un écosystème bactérien comme le tractus gastro-intestinal ou
génital des mammifères (Klein et al., 1998). Elles peuvent être isolées de nombreuses
sources, elles sont largement retrouvées à la surface de nombreux aliments crus et sont par
conséquent retrouvées aussi comme contaminants environnementaux lors de la fabrication
d’aliments et donc régulièrement dans les aliments produits. Elles sont aussi présentes dans
le tractus intestinal de l’homme et des animaux et par conséquents dans les fèces, par
lesquelles ces bactéries sont véhiculées et distribuées.
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Synthèse Bibliographique
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1-2-4 Taxonomie et habitats des lactocoques et entérocoques
Depuis la découverte des bactéries lactiques, leur classification a connu plusieurs
modifications. En 1919 Orla Jensen rassembla les membres des bactéries lactiques dans un
même groupe. Les caractères considérés étaient le type de Gram, l’immobilité, l’absence
de spores, la forme allongée ou sphérique et la fermentation des sucres en acide lactique
(Stiles et Holzapfel, 1997). Lancefield en 1933, proposa une classification basée sur la
différentiation sérologique entre les bactéries du groupe. En 1937, Sherman classa les
bactéries lactiques en fonction de leurs caractéristiques physiologiques.
Dans la pratique, les caractéristiques phénotypiques et biochimiques de l'identification
systématique des isolats peuvent ne pas être suffisantes pour attribuer définitivement une
souche à une espèce particulière. Actuellement avec la disponibilité de la technologie
rapide et automatique du séquençage de l'ADN, le séquençage direct du gène ARNr 16S a
émergé comme une méthode puissante et relativement facile permettant en une seule étape
la classification (Axelsson, 2004).
La classification s’appuie sur des données moléculaires comme la comparaison des
séquences codant pour les ARN16S ribosomiques. Carl Woese a montré que la séquence
de l'ARNr 16S est un marqueur phylogénétique utile présent chez tous les procaryotes du
monde (Woese et Fox, 1977). Le gène de l'ARNr 16S est fortement conservé, mais
contient également des régions variables avec des séquences de signature spécifiques à
l'espèce. Les bases de données publiques offrent une énorme quantité de données sur les
séquences du gène ARNr 16S ainsi que des données de qualité contrôlée qui sont
disponibles dans plusieurs bases de données (De Santis et al., 2006 ; Pruesse et al., 2007;
McDonald et al., 2012).
Parmi les bactéries largement étudiées et exploitées les bactéries lactiques se trouvent dans
deux embranchements distincts, à savoir le phylum des Firmicutes et Actinobactéries.
Dans le phylum des Firmicutes les genres les plus importants de bactéries lactiques sont
Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Streptococcus et
Weissella. Ces genres appartiennent à l'ordre des Lactobacillales et ont un contenu en GC
faible (31-49%). au sein du phylum des Actinobactéries, les bactéries lactiques appartenant
au genre Bifidobacterium ont une teneur élevée en GC (58- 61%) (Klaenhammer et al.,
2005).
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Synthèse Bibliographique
11
En plus des genres Enterococcus, Lactococcus et Leuconostoc (Figure 1), les bactéries
lactiques importantes dans les aliments appartiennent aux genres Carnobacterium,
Lactobacillus, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus et
Weissella (Doyle et al., 2013).
Figure 1: Position des genres Enterococcus, Lactococcus et Leuconostoc dans l’arbre
phylogénique des bactéries lactiques sur la base de séquences du gène de l'ARNr 16S.
(Holzapfel et al., 2001).
Les nouveaux outils pour l’identification et la classification des bactéries lactiques
remettent couramment et/ou complètent en cause les méthodologies traditionnelles basées
sur les caractères phénotypiques. Ainsi, l'ancien genre Streptococcus a été divisé en trois
genres: Enterococcus (E.), Lactococcus (L.) et Streptococcus sensu stricto (Alexander et
al., 2001; Zongzhi et al., 2008). Par la suite, certaines bactéries lactiques, ressemblant à
des lactocoques, ont été suggérées pour former un genre distinct, Vagococcus (V.) (Aly et
al., 2004).
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Synthèse Bibliographique
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Les genres Lactobacillus, Leuconostoc et Pediococcus sont restés largement inchangés,
mais certaines bactéries lactiques en forme de bâtonnets, auparavant incluses dans
Lactobacillus, forment le genre Carnobacterium (C.) (Elliot et al., 1991), et les anciennes
espèces Pediococcus halophilus ont été hissées au niveau du genre, formant le genre
Tetragenococcus (T.) (Facklam et al., 1998).
Dans ce travail nous nous sommes intéressés à l’étude de deux genres à savoir Lactococcus
et Enterococcus.
1-2-4-1 Lactococcus
Les lactococoques sont des cocci en paires ou en chaînes, Gram+, non mobiles, catalase
négative, non sporulés et anaérobies facultatifs appartenant au groupe des bactéries
lactiques. Ils ont une température optimale de croissance de 30°C et peuvent survivre à
10°C mais ne peuvent pas croitre à 45°C. Ce genre comprend 5 espèces ; L. lactis, L.
garvieae, L. piscium, L. plantarum et L. raffinolactis et une nouvelle espèce nommée L.
chungangensis (Cho et al., 2008 ; Tanigawa et al., 2010). Cette dernière a été isolée pour
la première fois à partir de mousse de boue (Cho et al., 2008).
Dans l’industrie alimentaire, certaines souches de Streptococcus et Lactococcus sont
utilisées notamment comme agent d’acidification et de coagulation lactique en fromagerie,
en salaison et dans la fabrication de yaourts (Thu, 2008). Les lactocoques sont étroitement
associés aux produits laitiers, mais seul Lactococcus lactis est actuellement utilisé dans la
technologie laitière (Thu, 2008). Lactococcus lactis est le principal constituant de
beaucoup de cultures starter industrielles et artisanales utilisées pour la fabrication d'une
large gamme de produits laitiers fermentés, y compris le lait acidifié et les fromages frais et
doux (Vlieg et al., 2006).
Cette espèce est subdivisée en L. lactis ssp. cremoris, L. lactis ssp. hordniae, L. lactis ssp.
lactis et L. lactis ssp. lactis biovar diacetylactis (Schleifer et al., 1987; Vlieg et al., 2006).
Parmi les espèces de Lactococcus, L. lactis ssp lactis et L. lactis ssp cremoris sont
fréquemment utilisées comme souches starters dans les industries laitières, notamment en
technologie fromagère (Cogan et Hill, 1993).
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Synthèse Bibliographique
13
1-2-4-2 Enterococcus
Les entérocoques sont des bactéries lactiques coccoïdes dont les cellules sont ovoïdes et se
présentent sous forme de cellules isolées, ou en paires ou encore sous forme de chaînettes
(Schleifer et Kilpper-Balz, 1984). Ces bactéries produisent des colonies de couleur
blanchâtre. Elles sont généralement catalase négative, oxydase positive, anaérobies
facultatives, non mobiles et non sporulées.
Les entérocoques ont été isolés et caractérisés il y a 113 ans (Mac Callum et Hastings,
1899). Ces bactéries commensales hautement évoluées ont été largement utilisées en
industries alimentaires et comme probiotiques pour prévenir les maladies (Ramsey et al.,
2014). Ils sont omniprésents dans la nature (Franzetti et al., 2004), et se retrouvent en
grand nombre dans les légumes, le matériel végétal, et dans la nourriture, en particulier
celle d'origine animale tels que les produits laitiers (Giraffa, 2003). Les entérocoques
peuvent contaminer le lait soit directement par les fèces d’animaux soit indirectement par
une source d’eau contaminée ou par l’équipement laitier ou par les tanks de stockage
(Giraffa, 2003).
Des souches d’Enterococcus ont été isolées de l’eau (Oliveira et Pinhata, 2008), de
plantes (Svec et al., 2011), d’animaux (Jung et al., 2007), d’aliments (Gomes et al., 2008)
et du sol probablement comme résultat de la dissémination de sources fécales et de leur
tolérance naturelle aux conditions environnementales (Giraffa, 2002). Leur statut est
considéré généralement comme ambigu quant à la procédure d’évaluation de sa sécurité
(Ogier et Serror, 2008). D’une part les entérocoques sont considérés utiles en
technologies fromagères avec quelques souches utilisées comme culture starter (Giraffa,
2003). D’autre part ils sont considérés comme des pathogènes humains émergeants
(Moellering, 1992).
La majorité des entérocoques sont positifs au test de Voges-Proskauer qui relie la
production d'acétoine à la fermentation du ribose. Ce test est largement utilisé dans la
discrimination entre Enterococcus et Streptococcus. Les entérocoques sont des micro-
organismes mésophiles qui se développent dans une gamme de températures allant de 10 à
45°C, avec une température optimale de 35°C (Higashide et al., 2005). Ces bactéries sont
homofermentaires. Elles produisent essentiellement de l'acide lactique et en quantité
moindre, de l'acétate, du formiate et de l'éthanol ; en anaérobiose, le lactate est le principal
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Synthèse Bibliographique
14
produit du métabolisme du glucose, tandis qu'en condition d'aérobiose, les produits du
métabolisme sont l'acétate et le CO2 (Schleifer et al., 1984 ; LeBlanc, 2006).
Les entérocoques tolèrent les pH extrêmes, les radiations ionisantes, le stress osmotique et
oxydatif, de fortes concentrations de métaux lourds et d’antibiotiques (Ramsey et al.,
2014).
La diversité phénotypique des entérocoques rend leur identification par des tests
physiologiques difficile (Devriese et al., 1993; Park et al., 1999). Sur la base de caractères
phénotypiques, les entérocoques étaient classés par Lancefield dans le groupe des
streptocoques D. En 1984 la classification de ces bactéries a connu des modifications
significatives grâce aux hybridations ADN-ADN et ADN-ARN. Les résultats des
hybridations démontrèrent que les entérocoques sont éloignés des streptocoques. La
plupart des membres du groupe D des Streptococci, y compris Streptococcus faecalis et
Streptococcus faecium ont été inclus dans le nouveau genre Enterococcus (Schleifer et
Kilpper-Balz, 1984).
Le genre Enterococcus appartient à la famille des Enterococcaceae avec le genre
Atopobacter, Catellicoccus, Melissococcus, Pilibacter, Tetragenococcus et Vagococcus
(Devriese et al., 2006, Euzéby, 2010). Les deux espèces les plus fréquemment isolées de
produits laitiers sont E. faecalis et E. faecium (Franz et al., 1999; Gelsomino et al., 2001).
E. durans est rencontré à moindre étendue dans le lait et produits fromagers alors que E.
hirae et E. casseliflavus sont aussi occasionnellement rencontrés (Franz et al., 1999). Il a
été démontré qu’E. durans est aussi fréquemment isolé de produits laitiers (Andrighetto et
al., 2001).
Les entérocoques sont phylogénétiquement plus étroitement apparentés aux genres
Vagococcus, Tetragenococcus et Carnobacterium que les espèces du genre Streptococcus.
Au cours des dix dernières années, le genre a été élargi et 54 espèces d'entérocoques sont
actuellement reconnues (Euzeby, 1997; dernière mise à jour totale 7 Novembre 2014).
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Synthèse Bibliographique
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Sur la base de l'analyse de la séquence du gène d'ARNr 16S, plusieurs groupes
phylogénétiques ont été distingués (Tableau 2) (Enterococcus faecium, Enterococcus
faecalis, Enterococcus avium, Enterococcus casseliflavus, Enterococcus dispar,
Enterococcus saccharolyticus et Enterococcus caecorum) (Williams et al., 1991 ; Klein,
2003).
Tableau 2: Enterococcus et leur répartition en groupes d'espèces (Franz et al., 2006)
Groupe d'espèces basé sur
la similarité du gène de
l'ARNr 16S
Espèces
Groupe E. avium E. avium, E. devriesei, E. gilvus, E. malodoratus, E. pseudoavium.
E. raffinosus
Groupe E. caecorum E. caecorum, E columbae
Groupe E. dispar E. dispar, E. asini, E. canintestini, E. hermanniensis, E. pallens
Groupe E. faecalis E. faecalis, E. caccae, E. haemoperoxidus, E. moraviensis,
E. silesiacus, E. termitis, E. ureasiticus, E. quebecensis
Groupe E. faecium
E. faecium, E. canis, E. durans, E. hirae, E. mundtii,
E. phoeniculicola, E. ratti, E. villorum, E. thailandicus
Groupe E. gallinarum E. gallinarum, E. casseliflavus
Groupe E. saccharolyticus
E. saccharolyticus, E. acquimarinus, E. camelliae,
E. italicus, E. sulfurous
1-2-5 Propriétés métaboliques d’intérêt technologique des entérocoques
Les bactéries lactiques sont impliquées dans la production d'une multitude d'aliments
fermentés (Lasagno et al., 2002), y compris les entérocoques qui grâce à la versatilité de
leur métabolisme et à leur résistance intrinsèque aux conditions hostiles ont la capacité de
coloniser une variété de niches. Ils possèdent de nombreux caractères technologiques et
contribuent aux propriétés organoleptiques de produits fermentés (Ramakrishnan, 2012).
Leur importance, soit comme starters ou culture additive en industrie, est très importante,
ils peuvent produire plusieurs enzymes impliquées dans les transformations biochimiques
tels que l’acidification, l’activité protéolytique/peptidolytique, l’activité
lipolytique/estérolytique, le métabolisme du citrate/pyruvate et la production de
bactériocines (Giraffa, 2003). Les entérocoques produisent une variété de produits tels que
les produits aromatiques (Centeno et al., 1999), des enzymes (Sarantinopoulous et al.,
2001; Ghrairi et al., 2008) et des bactériocines (Cleveland et al., 2001).
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Synthèse Bibliographique
16
Ils contribuent à la texture, la flaveur, l’arôme et la sécurité de différents aliments tels que
le fromage (Handmade) (Andrighetto et al., 2001), les saucisses (Sabia et al., 2002;
Tanasupawat et al., 2008) et d’autres produits fermentés (Gardini et al., 2001; Gomes et
al., 2008).
Dans la région méditerranéenne, les souches d’Enterococcus spp. a joué un rôle important
dans la préparation de divers produits laitiers et carnés fermentés pendant des siècles, et ils
sont essentiels pour la maturation des produits fromagers et au développement de leur
arôme (Foulquié-Moreno et al., 2006; Franz et al., 2011) en raison de la protéolyse, la
lipolyse, et la production de diacétyle (Giraffa, 2003). L’utilisation d’entérocoques dans
les fromages est très controversée. Elle est considérée comme essentielle pour la flaveur
des fromages dans la plupart des pays du sud de l’Europe, alors que les pays du nord de
l’Europe ne considèrent que les aspects négatifs (Ogier et Serror, 2008). Ces bactéries
contribuent à la maturation et au développement d’arôme des fromages tels que Cheddar,
Feta, Water-buffalo, Mozarella, Cebreiro, Venaco et Hispanico par leurs activités
protéolytique et estérolytique, leur production de diacétyl et le métabolisme du citrate
(Centeno et al., 1999). Des études rapportèrent l’influence positive de souches
d’Enterococccus d’aliments dérivés de lait sur la maturation de fromage traditionnel
(Franz et al., 1999; Giraffa, 2003; Foulquié-Moreno et al., 2006).
1-2-5-1 Production d’acide
La production d’acide est une propriété métabolique très appréciée chez les bactéries
lactiques. Elle est la conséquence de la transformation des hydrates de carbone en acide
lactique au cours de la croissance bactérienne (Monnet et al., 2008). Généralement les
entérocoques présentent une faible capacité d’acidification au moins dans le lait
(Sarantinopoulos et al., 2001 ; Giraffa, 2003). Une bonne culture starter productrice
d’acide peut réduire le pH du lait de sa valeur normale d'environ 6,6 à 5,3 en 6 heures
d’incubation en utilisant un inoculum de 10%, généralement les entérocoques présentent
une faible capacité d’acidification du lait. Schirru et al., (2012) ont montré que l’activité
acidifiante de E. faecium isolé à partir de lait de chèvre (de Sardaigne, Italie) est
généralement faible. Récemment Subramanian et al. (2015) rapportèrent que E. faecalis
CBRD01 possède un potentiel élevé pour la production d’acide lactique L(+) à partir de
glucose avec des rendements élevés, des titres et de la productivité avec un minimum de
formation de sous-produits même à l’échelle de bioréacteur.
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Synthèse Bibliographique
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Santos et al. (2015) ont observé que E. faecium EM485 et EM925 se développent dans le
lait et sont capables de changer le pH du lait après 6, 24 et 48 heures d’incubation sans
diminution de la charge bactérienne quand E. faecium EM485 et E. faecium EM925 sont
maintenues dans le lait acidifié à pH 4 ou à pH 5 à 5°C pendant 30 jours. Ces
caractéristiques technologiques sont intéressantes pour une utilisation postérieure dans les
produits tels que le yaourt et le lait acidifié.
1-2-5-2 Activité protéolytique
L’activité protéolytique et peptidolytique est importante pour le développement des
bactéries lactiques dans le lait et pour la maturation du fromage. Cependant la majorité des
souches d'entérocoques présentent une faible activité protéolytique extracellulaire
(Giraffa, 2003), conformément à plusieurs études effectuées par Arizcun et al. (1997),
Tsakalidou et al. (1993), Andrighetto et al. (2001) et Sarantinopoulos et al. (2001). Les
souches les plus actives appartiennent généralement à l'espèce E. faecalis, notamment
d'origine alimentaire (Sarantinopoulos et al., 2001), et à moindre degré des souches d’E.
durans. Une plus faible activité protéolytique est observée chez les souches d’E. faecium
(Sarantinopoulos et al., 2001 ; Giraffa, 2003). Une étude de Schirru et al. (2012) a
montré une faible activité protéolytique dans 2 des 4 souches testées d’E. faecium isolées à
partir de lait de chèvre (de Sardaigne, Italie).
1-2-5-3 Activité lipolytique et estérasique
Les lipides ont un effet majeur sur la saveur et la texture du fromage. Les premiers travaux
concernant les activités lipolytiques et estérolytiques d'entérocoques ont été réalisés par
Lund (1965), qui a déterminé par électrophorèse la présence d'estérases dans les extraits de
surnageant de culture de E. faecalis, E. faecium et E. durans. Sur la base de l'intensité des
bandes estérolytiques, les souches d’E. faecalis ont montré une activité estérolytiques
élevée. Sarantinopoulos et al. (2001) ont montré que toutes les souches d’E. faecalis, E.
faecium et E. durans sont actives indépendamment de l'origine. E. faecium comme étant
l’espèce la plus estérolytique de tous les entérocoques avec une plus large spécificité de
substrat.
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Synthèse Bibliographique
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1-2-5-4 Métabolisme du citrate et pyruvate
Outre la saveur produite par le biais de la conversion des acides aminés et de la lipolyse
bactérienne, le métabolisme du citrate du lait contribue aux propriétés sensorielles de
produits laitiers fermentés (Hugenholtz, 1993). Le citrate est présent dans de nombreuses
matières premières qui sont utilisées dans les fermentations alimentaires tels que les fruits,
les légumes et le lait, et il est également utilisé comme additif pour la fabrication de
saucisses fermentées (Foulquié Moreno et al., 2006).
La glycolyse et le métabolisme du citrate d’E. faecium, E. faecalis et E. durans conduisent
à la formation de l'acétate, l'acétaldéhyde, le diacétyle, l'acétoïne, le 2,3-butanediol et le
pyruvate (Figure 2) et sont donc importants dans la formation de la saveur pendant la
fermentation du lait et de l'affinage des produits laitiers fermentés (Sarantinopoulos et al.,
2001; Rea et Cogan, 2003).
Figure 2 : Voie schématique montrant la relation métabolique entre citrate et glucose
(Cabral et al., 2007) 1 : citrate lyase ; 2 : Oxaloacétate décarboxylase ; 3 : lactate
déhydrogénase ; 4 : α-acétolactate synthase ; 5 : α-acétolactate décarboxylase ; 6 : diacétyl
et/ou acetoine réductase ; 7 : complexe pyruvate déhydrogénase ; 8 : pyruvate formate
lyase ; 9 : acétate kinase ; 10 : alcool déhydrogénase.
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Synthèse Bibliographique
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L’acétate et le diacétyle produits par des souches starters ont un effet marquant sur la
qualité du beurre, le babeurre, et certains fromages tels que le cheddar et emmental; en
particulier, le diacétyle qui contribue principalement à la saveur des produits laitiers
fermentés (Marshall, 1987; Yvon et Rijnen, 2001 ; Tunick, 2007).
Le métabolisme du citrate et la lipolyse par les entérocoques sont supposés être
responsables du développement de l'arôme et de la saveur dans les fromages
méditerranéens (Tsakalidou, 1993 ;Centeno et al., 1996 ; Gardiner et al ; 1999 ;
Giraffa, 2003 ).
En l'absence de glucose E. faecium FAIR-E 198, un isolat de fromage grecque Feta, était
capable de métaboliser le citrate dans une gamme de pH constant (5,0 à 7,0). A pH 8,0, le
citrate n’a pas été métabolisé, bien que la croissance a eu lieu. Les principaux produits
finaux du métabolisme du citrate sont l'acétate, le formate, l'acétoïne et le dioxyde de
carbone, tandis que l'éthanol et le diacétyle étaient présents en petites quantités. En
présence de glucose, le citrate a été co-metabolisé, mais il n’a pas contribué à la croissance.
En outre, plus d'acétate et moins d’acétoïne ont été produits par rapport à la croissance
dans un milieu MRS et en l'absence de glucose. La majeure partie du citrate a été
consommé pendant la phase stationnaire, ce qui indique que l'énergie produite par le
métabolisme du citrate a été utilisé pour l'entretien (Vaningelgem et al., 2006).
1-2-6 Application des entérocoques comme probiotiques
La plupart des cultures probiotiques sont d'origine intestinale et appartiennent aux genres
Lactobacillus et Bifidobacterium, tandis que des espèces d’Enterococcus ne sont
qu’occasionnellement utilisés comme probiotiques (Temmerman et al., 2003). Les
caractéristiques associées aux probiotiques comprennent le maintien de l'équilibre du
microbiote intestinal (Arvola et al., 1999), le contrôle de la diarrhée (Arvola et al., 1999),
la stimulation du système immunitaire (Isolauri et al., 2004), ce qui réduit
l'hypersensibilité aux allergènes et l'eczéma chez les enfants (Kalliomäki et al., 2001), la
prévention des inflammations intestinales (Isolauri et al., 2000; Kalliomäki et al., 2001),
et la modulation des effets indésirables du lactose chez les individus ayant une intolérance
au lactose (Griffin et al., 2002).
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Synthèse Bibliographique
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La résistance au suc gastrique et aux sels biliaires et la production de composés
antimicrobiens tels que les entérocines (Franz et al., 1999; Saarela et al., 2000) font des
entérocoques de bon candidats probiotiques. Beaucoup de ces souches ont fait l’objet
d’étude et sont commercialisées comme probiotiques (Franz et al., 1999).
Par exemple un lait fermenté Gaio contenant un probiotique E. faecium est commercialisé
au Danemark (Tamime, 2002). La souche E. faecium SF68 a été utilisée pour traiter la
diarrhée comme alternative aux traitement par des antibiotiques (Bellomo et al., 1980).
Une autre application comme probiotique des entérocoques est la culture Causido qui
consiste en une souche de Streptococcus thermophilus et une souche d’E. faecium (Franz
et al., 2003).
Des souches de E. faecium et E. faecalis ont été appliquées chez l'homme, des suppléments
de probiotiques, E. faecalis ont été largement utilisés comme compléments alimentaires à
usage vétérinaire (Foulquié Moreno et al., 2006). Les souches probiotiques
d’Enterococcus sont utilisées comme supplément dans les aliments et l’alimentation des
volailles pour remplacer l’utilisation d’antibiotiques (Araujo et de Luces Rortes
Ferreira, 2013). L’utilisation de souches probiotiques E faecium (Cylacin ME 20 Plus R
50g/ T) dans l’alimentation de poulet est efficace pour contrôler et réduire le nombre de
Salmonella minnesota. Il a été démontré que ces probiotiques sont une alternative pour
remplacer l’utilisation d’antibiotiques pour contrôler les pathogènes (Kuritza et al., 2011).
1-3 Activité antimicrobienne
L'effet conservateur exercé par les bactéries lactiques est principalement du à la production
d'acides organiques (tels que l'acide lactique) qui aboutissent à des valeurs de pH
abaissées. Les bactéries lactiques produisent également des composés antimicrobiens, y
compris le peroxyde d'hydrogène, le CO2, le diacétyle, l'acétaldéhyde, des isomères D
d'acides aminés, les bactériocines et la reutérine (Cintas et al., 2001).
1-3-1 Acides organiques
Les métabolites antimicrobiens les plus importants et les mieux caractérisés produits par
les bactéries lactiques sont l'acide lactique et l’acide acétique. La conversion des sucres en
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Synthèse Bibliographique
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acides organiques et la réduction du pH sont les actions de conservation primaires que les
bactéries lactiques fournissent aux aliments fermentés. La quantité et le type des acides
produits durant la fermentation influencent l'activité microbienne. Par exemple, l'acide
acétique est plus antagoniste contre les levures par rapport à l'acide lactique (Suskovic et
al., 2010).
L'effet inhibiteur des acides organiques est principalement causé par la forme de la
molécule non dissociée, qui diffuse à travers la membrane cellulaire vers le cytosol plus
alcalin et interfère avec les fonctions métaboliques essentielles. Les effets toxiques de
l'acide lactique et de l'acide acétique comprennent la réduction du pH intracellulaire et la
dissipation du potentiel de membrane (Lorca et de Valdez, 2009). Dalie-Doguiet et al.
(2010) ont émis l'hypothèse que les acides organiques agissent sur la membrane
cytoplasmique en neutralisant son potentiel électrochimique et en augmentant sa
perméabilité, conduisant ainsi à l’effet bactériostatique et une éventuelle mort de bactéries
sensibles.
1-3-2 Peroxyde d’hydrogène
Dans le lait cru, le peroxyde d'hydrogène produit par des bactéries lactiques peut, après
avoir été catalysée par la lactoperoxydase, oxyder le thiocyanate endogène. Les produits
intermédiaires oxydés sont toxiques pour les différentes bactéries (Daechel, 1989). La
production de peroxyde d'hydrogène a été considérée comme le principal métabolite de
bactéries lactiques qui pourrait protéger contre les infections urogénitales, en particulier
dans le cas de vaginose bactérienne (Reid, 2008).
Moy et al. (2004) ont montré que E. faecium est capable d’éliminer Caenorhabditis
elegans par une toxine diffusible produite après croissance des bactéries dans des
conditions d’anaérobies. La mort du nématode est due au peroxyde d’hydrogène d’E.
faecium libéré en quantités importantes.
L'activité antimicrobienne du peroxyde d'hydrogène est attribuée à son fort effet oxydant
sur la cellule bactérienne et à la destruction des structures moléculaires cellulaire de base
(Lindgren et Dobrogosz, 1990). Son effet inhibiteur consiste en l’oxydation des lipides
membranaires ayant pour conséquence l’augmentation de la perméabilité membranaire. Il
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Synthèse Bibliographique
22
est aussi responsable de l’oxydation des groupes sulfhydrile et donc de la dénaturation de
de plusieurs enzymes (Lindgren et Dobrogosz, 1990).
1-3-3 Diacétyle, acétaldéhyde et acétoïne
Les bactéries lactiques hétérofermentaires produisent de l'acétaldéhyde actif par
décarboxylation du pyruvate. Ce produit se condense avec le pyruvate, formant l’α
acétolactate puis il est converti par l’α acétolactate-synthases en diacétyle. Le produit de
décarboxylation de l’α-acétolactate et la réduction de diacétyle est l’acétoïne (Jyoti et al.,
2003 ; Collins et al., 2009 ).
L'utilisation de diacétyle comme conservateur alimentaire est limitée puisqu’elle nécessite
d’importantes concentrations pour assurer la conservation des aliments. Cependant il peut
inhiber la croissance des bactéries à Gram négatif en affectant l’utilisation de l’arginine
(Jay, 1986). Les bactéries à Gram négatif, les levures et les moisissures sont plus sensibles
au diacétyle que les bactéries à Gram positif (Jay, 1986 ; Motlagh et al., 1991 ; De Vuyst
et Vandamme, 1994).
De même, un acétaldéhyde est habituellement présent dans les produits laitiers fermentés à
des concentrations plus faibles que nécessaire pour l'inhibition des micro-organismes
indésirables et joue donc également un rôle dans le contrôle de la croissance de
contaminants, ainsi que d'autres métabolites antimicrobiens de bactéries lactiques
(Vanderbergh, 1993). L’acétaldéhyde inhibe la croissance de Staphylococcus aureus, de
Salmonella typhimurium et E. coli dans les produits laitiers (Piard et Desmazeaud, 1991).
1-3-4 Dioxyde de carbone
L'influence du dioxyde de carbone sur la conservation des produits est double. A
l'exception de sa propre activité antimicrobienne, elle crée un environnement anaérobie en
remplaçant l'oxygène moléculaire existant. L'activité antifongique du CO2 est due à
l'inhibition de décarboxylations enzymatiques et à son accumulation dans la bicouche
lipidique de la membrane entraînant un dysfonctionnement de la perméabilité (Lindgren
et Dobrogosz, 1990). La croissance de nombreux micro-organismes responsables de la
détérioration des aliments peut être inhibée efficacement par le dioxyde de carbone : c’est
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Synthèse Bibliographique
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le cas de bactéries à Gram négatif psychrotrophes ou encore des espèces de Pseudomonas
contaminants des laits crus (Farber, 1991 ; Hotchkiss, 1999).
1-4 Bactériocines et Entérocines
La sécrétion de peptides antimicrobiens (bactériocines) connus pour leur effet inhibiteur
dirigé contre des virus enveloppés, bactéries, champignons, parasites ainsi que des cellules
cancéreuses a été observée chez quelques bactéries, champignons, plantes, insectes et des
vertébrés (Pálffy et al., 2009). Chez de nombreuses espèces de bactéries à Gram négatif ou
positif, des bactériocines ont été caractérisées mais les plus étudiées sont celles des
bactéries lactiques (Klaenhammer, 1993). Ces bactériocines sont d'un intérêt particulier
pour l'industrie alimentaire (Nettles et Barefoot, 1993), étant donné qu’elles sont produites
par des bactéries lactiques ayant le statut GRAS.
Rodriguez et al. (2000) ont montré que les bactéries lactiques issues de laits crus de
brebis, de chèvres ou de vaches produisent de nombreuses et diverses bactériocines. En
effet les bactériocines des bactéries lactiques offrent des potentielles pour des applications
biotechnologiques puisqu’elles sont (i) exempt d'effets indésirables, (ii) stables à faibles
valeurs de pH, (iii) faciles à produire et (iv) sensibles aux protéases (Todorov, 2009). Elles
peuvent être distinguées des antibiotiques par leur synthèse dans les ribosomes plutôt que
des métabolites secondaires (Hurst, 1981).
Les bactériocines sont des peptides antimicrobiens synthétisés par voie ribosomale
présentant un antagonisme principalement contre des espèces apparentées de bactéries à
Gram positif (Jack et al., 1995). Elles sont produites dans le cadre de leur mécanisme de
défense et sont dans la plupart du temps thermostables (Klaenhammer, 1988 ;
Klaenhammer, 1993 ; Cotter et al., 2005).
A cette définition des bactériocines s’ajoutent d’autres caractéristiques telles que leurs
sensibilités aux protéases dans le tube digestif humain (Cheng et al., 2003) et la présence
de plusieurs résidus de lysine et d'arginine et des molécules amphipathiques qui sont
composées de 10 à 45 acides aminés (Van Belkum et al., 2000) conférant aux peptides le
caractère cationique.
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Synthèse Bibliographique
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En plus de leurs propriétés technologiques et antagonistes citées ci-dessus, beaucoup de
souches d’entérocoques, principalement E faecalis et E faecium, peuvent produire une
variété de bactériocines actives contre Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus,
Clostridium botulinum, Clostridium perfringens, et Vibrio cholerae (Ogier et Serror,
2008).
Depuis la découverte de bactériocines chez les entérocoques par Kjem (1955), un grand
nombre de bactériocines produites par des entérocoques ont été décrites et ont été
complètement caractérisées au niveau biochi