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3. Fabriquer une banque3. Fabriquer une banquedADNdADN
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3. Fabriquer une banque dADN3. Fabriquer une banque dADN
lorigine de lADN
Lensemble des clones obtenus sappelle une banque dADN
Les banques dADN sont classes selon :
le vecteur utilispour la fabriquer
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3.1. Les banques dADN gnomique3.1. Les banques dADN gnomique
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3.2. Les banques dADNc3.2. Les banques dADNc
Dfinition:
ADN "complmentaire :copie ADN d'un ARN
copie dpourvue des
introns squences noncodantes du !ne#
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4. Identifier un gne4. Identifier un gnespcifiquespcifique
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4.1. Utilisation de sondes4.1. Utilisation de sondes
petit morceau dADN s$nt%tis dont la squence correspond
au moins en partie & celle d'un des brins du fra!ment dADN que
lon veut identifier
capable de se fier spcifiquement sur l'autre brin
complmentaire de l'autre brin de lADN
Le terme utilis pour identifier un clone est cribla!e (
)onde :
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4.1. Utilisation de sondes4.1. Utilisation de sondes
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4.2. Identiication directe des clones !ar "#bridation4.2. Identiication directe des clones !ar "#bridation
utilisation dune sonde marquee : radioactivit#
rvlation par autoradio!rap%ie
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4.3. Anal#se de lADN clon !ar squen$age4.3. Anal#se de lADN clon !ar squen$age
Dfinition :
Le squen*a!e de lADN est la dtermination de la succession
des nuclotides le composant(
+ec%nique de routine en laboratoire
+ec%nique base sur le mcanisme de rplication de lADN
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4.3.1. La mt"ode de %a&am et 'ilbert4.3.1. La mt"ode de %a&am et 'ilbert
un tube par t$pe de coupure une
aprs ,- aprs A- aprs +- aprs .#(
/n fonction des concentrations
den0$me et dADN- on obtient une
coupure par molcule avec tous les
cas diffrents prsents(
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4.3.2. La mt"ode de (anger4.3.2. La mt"ode de (anger
s$nt%se dADN avec des arr1ts
de s$nt%se- en utilisant des
didso$nuclotides ddNTP)
c%aque tube contient donc en fin
de raction une population de
fra!ments de taille variable- a$ant
tous la m1me etrmit 2 et se
terminant tous en 3 par le m1meddN+4 & toutes les positions
possibles(
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4.4. Anal#se !ar des tec"niques de transert4.4. Anal#se !ar des tec"niques de transert
4.4.. !e sout"ern blot4.4.. !e sout"ern blot
Di!estion de lADN par les en0$mes de restriction
)paration des fra!ments par lectrop%orse
Dp5t dune membrane absorbante sur le!el
Les bandes dADN sont absorbes parcapillarit
Rvlation par autoradio!rap%ie
6mmersion de la membrane dans unesolution contenant la sonde marque
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4.4.2. Autres tec"niques de transert4.4.2. Autres tec"niques de transert
7lan!e dARN spar dans un !el
+ransfert sur une membrane
.ribla!e par une sonde marque
4rincipale application :
dterminer si un !ne est transcrit dans un tissu donn
ou dans certaines conditions eprimentales(
Nort"e# blot :
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4.4.2. Autres tec"niques de transert4.4.2. Autres tec"niques de transert
7lan!e de protines spares dans un !el
+ransfert sur une membrane
.ribla!e par une sonde marque
8 anticorps marqus diri!s contre la protine & identifier
$estern blot :
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I%. Ingnierie gntique desI%. Ingnierie gntique des
plantesplantes
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1. )rinci!e de la mani!ulation gntique1. )rinci!e de la mani!ulation gntique
&tape : .%oi du !ne et introduction du !ne dans un vecteur
&tape ': 6ntroduction du plasmide recombin dans la bactrie
&tape 3 : )lection des cellules transformes
&tape 4 :+ransfert du !ne dans la plante
7t%ode de transfert direct c%imique- p%$sique9#
7t%ode de transfert indirect A!robactries#
&tape ( : R!nration de la plante
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2. Les mt"odes de transert indirect de g*nes2. Les mt"odes de transert indirect de g*nes
4lusieurs souc%es da!robactries dont les plus connues sont :
A!robactrium r%i0o!enes qui %ber!e le plasmide Ri
8 responsable du c%evelu racinaire
8 dveloppement anormal des racines
A!robactrium tumefaciens qui %ber!e le plasmide +i
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2.1. Agrobacterium tumeaciens2.1. Agrobacterium tumeaciens
+actrie du sol , res!onsable de la galle du collet
Rgion du collet(= zone de liaison entre la tige et la racine)
Agrobacterium tumefaciens
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2.1.1. La galle du collet2.1.1. La galle du collet
dveloppement anarc%ique des tissus & lemplacement dune blessure
!alle du collet apparent & un cancer v!tal
Ncrose de la partie arienne et mort de la plante
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2.1.1. La galle du collet2.1.1. La galle du collet
.ellules de la tumeur fabrique des molcules :les opines
molcules amais prsentes dans les plantes saines
substances nutritives pour les a!robactries
activent la multiplication des bactries
s$nt%se dopines dtourne les voies du mtabolisme normal dela plante
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2.1.1. La galle du collet2.1.1. La galle du collet
Dviation du mtabolisme de ces plantes 8
;pration de ) gnie gntique naturelle *
Responsables :Les agrobactrieset leur !rands plas#idesde b
/emple : le plas#ide +i
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2.1.2. Le !lasmide -i2.1.2. Le !lasmide -i
nomm +ipour +u#or inducing
responsable de la virulence d'Agrobacterium tumefaciens
.e plasmide est utilis de fa*on routinire pour produire desplantes trans!niques(
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arte sim!liie du !lasmide -iarte sim!liie du !lasmide -i
ORI:Origine de rplication
OCC:zone de dgradation des opines par
la bactrie
ADNT:partie trans!re et s"e#pri$ant
uni%ue$ent dans la cellule >ale
'ren!er$e une !onction ONC responsablede la proli!ration
'ren!er$e une !onction OP responsable
de la snt*+se des opinesTaille : ,-- .b
'li$ite par deu# bordures dites /droites
et gauc*es0
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arte sim!liie du !lasmide -iarte sim!liie du !lasmide -i
?one vir :fonction de virulence-responsable du transfert de lADN@+
Taille : ,-- .b
sa capacit 1 reconna2tre des cellules
>ales
1 les in!ecter
1 trans!rer de l"ADNT 3us%u"au noau
1 intgrer cet ADNT au gno$e de
la cellule >ale
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2.1.3. -ransert de lADN dans les cellules /gtales2.1.3. -ransert de lADN dans les cellules /gtales
Lint!ration de lADN@+ au !nome de la cellule v!tale
responsable 8
de la formation de tumeur de la scrtion des opines
4our introduire des !nes nouveau 8
tilisation de la r!ion@+ dun plasmide +i dsarm ne contient
plus les !nes responsables de la tumeur#
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2.1.3. -ransert de lADN dans les cellules /gtales2.1.3. -ransert de lADN dans les cellules /gtales
Les plasmides +i 8
pas de sites uniques de restriction permettant le clona!e
direct de lADN
Avant d1tre transmis &Agrobacterium =
!ne & transfrer doit 1tre introduit dans un vecteure : plasmide#
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a. -ransert de lADN !ar co0intgrationa. -ransert de lADN !ar co0intgration
trans!ert d"un g+ne d"intr4t dans un plas$ided"E.coli
ce plas$ide est appel / inter$diaire 0
le plas$ide est trans!r dans Agrobacteriu$
co$portant un plas$ide dsar$
prsence de s%uence *o$ologue per$et la
reco$binaison des deu# plas$ides
!or$ation d"un grand plas$ide Ti
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b. -ransert de lADN !ar /ecteur binaireb. -ransert de lADN !ar /ecteur binaire
construction d"un &ecteur inter$diaire : 5ordure gauc*e et droite du plas$ide Ti
6e g+ne d"intr4t 7 g+ne de rsistance 1
antibioti%ue
le plas$ide est trans!r dans Agrobacteriu$
co$portant un plas$ide dsar$
pas de s%uence *o$ologue donc pas de
reco$binaison des deu# plas$ides
%uand Agrobacteriu$ parasite la cellule8 elle
ne trans$et %ue le plas$ide inter$diaire
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3. Les mt"odes de transert direct de g*nes3. Les mt"odes de transert direct de g*nes
+ec%niques alternatives au a!robactries
difficile dintroduire de lADN dans des cellules v!tales paroi
cellulosique#
traitement des parois avec des cellulases obtient des protoplastes seulement entours dune membrane
plasmique
,rotoplaste :cellule v!tale artificiellement dbarrasse de samembrane cellulosique ri!ide- !arde ses structures essentielles et son
mtabolisme
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3.1. -ransormation c"imique3.1. -ransormation c"imique
7ise en contact avec certains sels :
.a.l
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3.1. -ransormation c"imique3.1. -ransormation c"imique
,- ou pol/t"/lne gl/col
a!it en prsence de .a
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3.2. -ransormation lectrique , lectro!oration3.2. -ransormation lectrique , lectro!oration
soumettre un mlan!e de protoplastes et dADN & desc%ocs lectriques
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3.3. La micro0inection3.3. La micro0inection
fines pipettes en verre capillaires tirs#
un microscope invers
permet linection dune solution dADN dans le no$au
inconvnient : traitement cellule par cellule
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3.4. La biolistique3.4. La biolistique
bombarder & %aute vitesse des microparticules de tun!stneF de diamtre# enrobes dADN
ADN se r%$drate et peut diffuser
)i la bille a atteint le no$au :
possibilit dint!ration de lADN
dans le !nome(
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3.. Lagrolistique3.. Lagrolistique
drive de la biolistique associe & la transformation indirecte
par les a!robactries
provoque des microblessures dans les tissus
enva%ir avec plus de facilit et de vi!ueur
au!menter le rendement de la transformation
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4. onclusions sur les mt"odes de transerts4. onclusions sur les mt"odes de transerts
!rande batterie de tec%niques de transformation !ntique
facteur limitant : tec%niques de r!nration in vitro
problme : prsence de !nes marqueurs utiliss
!nes de rsistances & des produits c%imiques ou antibiotiques#
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. La rgnration des !lantes !artir de cellules. La rgnration des !lantes !artir de cellules
r!nrer une plante entire & laide de ces cellules transformes
mises dans un milieu de culture %ormones decroissance : des auines et des c$to>ines#
apparition de petites pousses
transfert dans un nouveau milieu de culture permettant ledveloppement des racines
quand racines suffisamment dveloppes : les plantules sontrepiques
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. onirmation de la nature transorme des !lantes. onirmation de la nature transorme des !lantes
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5. A!!lications mdicales5. A!!lications mdicales
1.. -2e#ple du tabac transgnique1.. -2e#ple du tabac transgnique
plants de tabac pour fabriquer des protines
/ : %mo!lobine %umaine
transfert des !nes de l'%mo!lobine %umaine dans un plantde tabac
< !nes interviennent dans la s$nt%se de l%mo!lobine%umaine(
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5.1. 6&em!le du tabac transgnique5.1. 6&em!le du tabac transgnique
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5.1. 6&em!le du tabac transgnique5.1. 6&em!le du tabac transgnique
+ec"nique de llectrop"orse
permet de reprer les allles!nes# dont l'epression donne les
molcules rec%erc%es
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5.2. Autres a!!lications mdicales5.2. Autres a!!lications mdicales
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7. Autres a!!lications7. Autres a!!lications
.. !a protection des cultures
... !a rsistance des plantes au2 insectes
Gaire s$nt%tiser au plantes des protines toiques pour lesinsectes
4roblmes lis au %erbicides
nuisible & l'environnement
populations d'insectes rsistants
parfois inefficaces- suivant le stade de dveloppement de
l'insecte
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7.1.2. La tolrance des !lantes au& "erbicides7.1.2. La tolrance des !lantes au& "erbicides
6ntroduction d'un " !ne de tolrance " dans son !nome
4lante de culture " tolrante " au %erbicides
Hliminer les plantes sauva!es indsirables
soa- betterave- laitue- melon- pomme de terre- bl-col0a- tournesol(((
L'epression du !ne emp1c%e la substance active de dtruirela plante(
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7.1.3. La rsistance au& maladies7.1.3. La rsistance au& maladies
virus
c%ampi!nons
bactries p%$top%at%o!nes
pomme de terre- melon- concombre- betterave- tomate(((
Hviter des pertes de rendements
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7.1.4. La rsistance au& conditions climatiques7.1.4. La rsistance au& conditions climatiques
-spces rsistantes :
au froid
& la sc%eresse
& la salinit9
intr1t pour les pa$s en dveloppement
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7.2. A!!lications industrielles7.2. A!!lications industrielles
4euvent produire par eemple :
des lastomres
des plastiques biod!radables
/: le pol$%$dro$but$rate 4IJ#
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7.3. -ec"nique de d!ollution7.3. -ec"nique de d!ollution
dpollution des sols pollus,lantes utilises co##e agents bio5indicateurs
/ : tabac utilis pour valuer le de!r de pollution par l'o0one 0ones
ncrotiques sur les feuilles#
)biocapteurs*: capacit de pi!er de !randes quantits de polluants :
/ : mtau lourds et autres lments indsirables dans les sols
ammonium- mercure- csium- arsenic9#
/traction des toiques aprs calcination et rductions des cendres