Bâtiment Grégor Mendel - 43, boulevard du 11 novembre 1918 69 622–VILLEURBANNE Cedex tél : 0472431377 - fax : 0472431223
- Symbiose actinorhizienne- Symbiose mycorhizienne- Interactions rhizosphèriques- Transfert de gènes et adaptation bactérienne- Groupes fonctionnelles du cycle de l’azote- Bactéries Pathogènes Opportunistes et Environnement
Université Claude Bernard Lyon 1Université Claude Bernard Lyon 1UMR CNRS 5557UMR CNRS 5557USC INRA 1193USC INRA 1193
Méthylation et métalloïdes toxiques
B. Cournoyer
Les voies de méthylation des métalloïdes toxiques
plusieurs bactéries pathogènes = résistantes au tellurite et/ou sélénite: - P. syringae, Agrobacterium tumefa ciens - P. aeruginosa, E. coli VTEC, Salmonella typhimurium - Staphylococcus aureus
K2TeO3
4ppm
Odeur d’ail
Pourquoi?Quel mécanisme?Méthylation?
réduction
Les voies de méthylation des métalloïdes toxiques
Identification de la bTPMT (Cournoyer, 1996)• P. syringae
Sm
aI1 2
Hin
cII
Eco
RI
Eco
RI
Pst
I
Hin
cII
Xho
I
pSK -E
coR
IpSK -
1.650.92T3
T70
tpmE htpX-likeorfC-like
E. coli TPMT-E
K2TeO3
4ppm
E. coli ::tpmE + sélénite
LB
(Ranjard et al., 2000)Analyse GC-MS
Odeur d’ail = DMTe
Caractérisation de la bTPMT
Sm
aI
1 2
Hin
cII
Eco
RI
Eco
RI
Pst
I
Hin
cII
Xh
oI
pSK -
Eco
RI
pSK -
1.650.92T3
T70
rTelactivity
+
tpm htpX-likeorfC-like
Caractéristique du déterminant: - forte homologie avec la thiopurine méthyle transférase (TPMT) humaine (30% identités; 55% similarités)
- Gmelin (1824): odorous materials obtained from Se et Te during animal experiments; a garlic-like odour (première observation)
- Idem chez l’Homme lors d’intoxication au Se et Te
Krynetski & Evans, Oncogene, 2003
Métabolisme des thiopurines
- Fin des années 80, la TPMT est montrée essentielle pour le métabolisme des pro-drogues « 6-mercaptopurine » et
« thioguanine nucleotides »
HPTR: hypoxanthinephosphoribosyltransferase
Autres fonctions chez l’Homme - détoxication de métalloïdes???
Introductionde toxiques (As, Se, Te, etc)dans l’environnement
Produits volatilsobservés e. g. DMSe, DMDSe,DMSSe, etc
GC-MS
Présence de bTPMT ??
Sol (10 g)
Suite des travaux sur les bTPMT
Détection des gènes de la bTPMT
1 216 AA43 12778 AA234 bp
détection de tpm dans les ADN méta-génomiques des solset des eaux
Stratégie mise en place
- élaboration d’un crible PCR / utilisation des domaines conservésTPMT-E vs huTPMT (30% identités; 55% similarités)
TPMT-E
Diversité des bTPMT
Homme,Rat,Souris
UbiG
UNK TPMT
ABCD
EFGH
IJ
KL
MN
PO
QRSTUVX
( et -proteobacteria)
(eubacteria)
bTPMT
uniquementchez 30% des-proteobacteria
= , Bordetella spp.
- plus de 50% desimilarités- plusieurs allèlespar lignée
*
= sol (7)
Publication: Favre-Bonté et al., 2005 + ms en cours de rédaction
*
14.4
25
35
45
66.2
116
18.4
kDa
Avant
induc
tion
Après
indu
ction
Extrait
solub
le
TPMT G
1
TPMT G
2
Marq
ueur
s
TPMT G
3
Chromatographie d'affinité :TPMT-G : Ni-NTA (élution par 250 mM imidazole)TPMT-E : Glutathione-Sepharose-4B (élution par 10 mM glutathion)
TPMT-G
TPMT-E
Ava
nt
Apr
ès
TP
MT
-E
GS
T
M
Coupure de l’His tag
Affinité des bTPMT pour les métalloïdes
Affinité des bTPMT pour les métalloïdes
Mise au point des tests enzymatiques. tampon de réaction (selon Krynetski et al., 1995). choix du substrat – 6-mercaptopurine
SH . Immuno-suppresseur (lors des greffes). Traitement de la leucémie, et. Maladie auto-immune
TPMT
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
0 10 20 30 40 50 60
DO320
Temps (min)
Courbe 1
Courbe 3
Courbe 2
Courbe 4
Courbe 5
Activité de méthylation de la 6-MP
10 µM TPMT-E
TPMT-E TPMT-G1
TPMT-G2
TMPT-G3
Vm (nmol.min-1.mg-1) 5,6 2,4 3 1.3
Km (µM) 81 46 57 20
Paramètres cinétiques de méthylation de la 6-MP par TPMT-E et les 3-TPMT-G.
huTPMT, Km= 10.6 M
DO 320
Affinité des formes enzymatiques pour les toxiques séléniés
- méthylation de substrats séléniés: 6-séléno-purine, Se-cystine, sélénite etséléniate
. avec des extraits de protéines totales TPMT+- obtention de DMSe à partir de Se-cystine- absence d’activités avec le sélénite
. en cours, comparaison des affinités et vitesse de réaction entremercaptopurine et séléno-purine
SH SeH DO 350
Substrats de la méthyle transférase bTPMT
CH3SeCH3
bTPMTSAM SAH Autres produits:
DMS, DMDS, DMDSeDMSeS, DMTe
S, Se, Te – inorg. et org.
SHMeS bTPMT
Thiopurine (anti-métabolites de la synthèse des purines)
- utilisation répandue pour le traitement de maladies auto-immunitaires, de la leucémie, du cancer et prévention des rejets d’organes transplantés
bTPMT et l’As? La piste des odeurs
-Bartolomeo Gosio (1892): obtained a garlic like odor from microbes growing on a potato mash containing arsenic trioxide
+ Scopulariopsis brevicaulis (Gosio’s fungi): Gosio’s garlic-like gas (TMA) from As mercaptan-like odour (DMSe) from selenite garlic-like odour (DMTe) from tellurite
Méthylation bactérienne de l’As (en aérobiose)
Etat des lieux:- E. coli + DMA = TMAO (trimethylarsine oxide)- Nocardia + MMA = (CH3)nAsH3-n (les méthyle arsines)
Bactéries TPMT +:- Pseudomonas sp. + arséniate = (CH3)2AsH- Aeromonas et Alcaligenes + méthyle arsoniate (MMA)= (CH3)AsH2 et (CH3)2AsH
As dans l’environnement Produits volatils
observés - MeAs, DMeAs,TMeAs
« There are apparently no accounts of the characterization of specific arsenic methyltransferases from microorganisms » (Bentley and Chasteen, 2002)
Autres As métalloïdes-méthyle transférases ?
Les pistes:1. Les proches voisins de la TPMT- UbiG (demethylubiquinone methyltransferase)- « UNK » (putative methyltransferases)
2. Les UbiE et MMT (métalloïdes méthyle transférases)- Découverte simultanée – nouvelle famille de Se/Te-méthyltransférases
UbiE
- Ensembledes eubacteries
MMT
- large distribution- plusieurs duplications- synthèse de métabolitessecondaires dontcertains antibiotiques etcertaines moléculesanti-cancéreuses- présence dans les eaux
pas Se-méthylation
Se-méthylation
Ranjard et al., 2004
Conclusions:
1. Plusieurs observations laissent entrevoir un rôle de la TPMTdans la méthylation de l’As
2. Les formes méthylées de l’As sont obtenues dans les conditions d’expression de la TPMT ou chez des organismes TPMT+
3. D’autres méthyle transférases pourraient jouer un rôle: UbiG, certaines methyle transférases putatives, …et MMT
Même famille - plusieurs lignées (23) chez les -protéobactéries- structures différentes- substrats différents?
Perspectives
Voies de méthylation de l’As - Recrutement d’un étudiant M2e. g. . les formes de bTPMT et la méthylation de substrats arséniés. Analyse comparative des affinités pour les substrats « S », « Se », « Te » et « As »
* Recherche partenaire au sein du GDR-As (co-encadrement du M2) pour le volet chimie analytique (détection/caractérisation des formes méthylées)
Bactéries Pathogènes Opportunistes et Environnement
Remerciements:- ToxNuc-Environnement- CNRS – UCBL - ENVL- Région Rhône-Alpes
Participants:L. ChampierS. Favre-BontéL. RanjardC. Prigent-Combaret+ qqes stagiaires
C. MonnezE. BrothierS. Favre-BontéS. NazaretB. Cournoyer
Méthylation de l’As
arsenate
arsenite
Methyl-arsonate
Methyl-arsonite
Dimethyl-arsinate
Dimethyl-arsinite
Trimethyl-arsine oxide (TMAO)
Trimethyl-Arsine (TMA)
Excrétédans les urines
(According to Challenger (1951))
+
+++
+++
++++
0
0 0 (selon Cullen et Bentley, 2005)
AsH3, +++++ -Inorganic forms of
arsenic are more toxic than organic forms
- Trivalent forms are more toxic than pentavalent
AsH3 gaz, As(-III) > As(III) > As (V) > composés méthylés
MeAs DMeAs
++ (?) ++ (?)