Benoît Schubert
Biologie de la Reproduction
Autoconservation des gamètes
Pr Catherine PoirotAssistance Publique-Hôpitaux de ParisGroupe Hospitalier Pitié-Salpêtrière
AUTOCONSERVATION
Gamètes matures Spermatozoïdes Ovocytes
Tissus gonadiques Ovaire Testicule
Préserver la fertilité
chez l’homme
Historique
1776 - Spallanzani
1940 - Cryoprotecteur/ glycérol
1953 - Grossesse avec sperme congelé
1973 - CECOS en France (G. David)
et - Centres d’AMP intra conjugale
Techniques
Milieux de congélation Glycérol
Agent cryoprotecteur pénétrant Toxique pour la cellule
Contact à basse température
Durée de contact limitée
Ajout en 4 étapes (moins délétère qu’en 1 fois)
Mise en paillettes Extrémités soudés
Techniques
Congélation cristallisation de l’eau extra-cellulaire Concentration relative des solutés augmente Déshydratation du spermatozoïde
Décongélation Retrait du CP en plusieurs étapes Concentration relative des solutés diminue
(milieu hypo-osmotique) Entrée d’eau dans le spermatozoïde Puis sortie du Glycérol Retour à un volume cellulaire normal
Techniques
Congélation ‘lente’: en azote liquide manuelle
Vapeurs d’azote : 8-30 minutes Plonge dans azote liquide
Appareils programmables Descente en température contrôlée
5°C/minute - 10°C 10°C/minute - 25°C 25°C/minute - 150°C
Décongélation rapide -196°C 37°C (en qq minutes)
Effets de la congélation sur les spermatozoïdes
Mobilité : variable, environ 50% Vitalité : variable, environ 50% Membrane :
Gonflements Membrane plasmique Gonflement acrosome perte acrosome
Modification de la composition phospholipidique
Noyau Chromosomes: pas de modification nb, structure, sex ratio Etat de sur-condensation de la chromatine
INDICATIONS
TRAITEMENTS A RISQUES
Chirurgie à risque Pathologies à risque Vasectomie Dégradation caract.
spermatiques Situation à risque …
Cryptozoospermie Spz chirurgicaux Spz médicaux Spz après chirurgie Spz contexte viral …
PREVENTION AMP
L’autoconservation doit être « systématiquement proposée » avant une « thérapeutique ou intervention potentiellement stérilisante »Et peut être proposée « avant ou au cours d’une AMP »
Arrêté du 12/1/1999
0
500
1000
1500
2000
2500
ho
mm
es p
rése
nté
s
Avant Traitement (27182)
Avant vasectomie (7904)
AMP (9618)
Spz chirurgicaux (2662)
FEDERATION DES CECOS : 30 ans d’autoconservation
346
236
884
417
323
124208
1110
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
1992 1994 1996 1998 2000 2002
Hodgkin
cancertesticulaire
autrescancers
affectionsnoncancéreuses
FEDERATION DES CECOS : autoconservation maladie
40
50
60
70
80
90
100
110
1983
1985
1987
1989
1991
1993
1995
1997
1999
2001
Pourcentage d’hommes pour lequel la congélation a pu être réalisée
Avant traitement
Avant vasectomie
%
91%91%
97%97%
65%65%
92%92%
Patient Information autoconservation Accueil du patient personnalisé Consultation avec médecin biologiste Méthodes
Masturbation Recherche spermatozoïdes dans les urines
Urgence du traitement : permanence de l’accueil Information des résultats de la congélation
« Le patient doit être informé de la qualité du sperme et du nombre de paillettes » Arrêté du 12/1/1999
Techniques : rares spermatozoïdes
• Mise en paillettes classiques‘haute sécurité’
• Micro-gouttesGuthauser et al., Andrologie 2002
Intérêts : augmenter le nombre de « doses », faciliter la recherche des spermatozoïdes prêts à l’emploi
SPZ
Sécurité
Identité Traçabilité Consentement Interrogation annuelle‘Renouvelable sur demande
écrite’ Utilisation Résultats Destruction « Seul le déposant peut
demander la restitution ou la destruction »
Sérologies HIV, VHB, VHC, Syphilis
Paillette ‘haute sécurité’ Cuve de quarantaine Cuves spécifiques Accès locaux Sécurité azote
Patient Générale
Problèmes Age
Limites supérieures Limites inférieures
Puberté, possibilités de masturbation
Maladie de l’homme Urgence Etat du patient
Indications autres Vasectomies Professions Sportifs
Information Patients et médecins
Perspectives
Optimisation des méthodes de congélation
Tissu gonadiques
Meilleure information sur l’autoconservation
•…. Lyophilisation du spermatozoïde !!!Wakayama T. Yanagimachi R., Nature Biotechnology 1998
Préserver la fertilité
chez le garçon prépubère
Introduction
Enfant : préservation de la fertilité A partir de 13-14 ans : spermatozoïdes Avant 13-14 ans
Pas de spermatozoïdes éjaculés Cellules souches germinales mâles : spermatogonies
Testicule Spermatogonies
Pool de réserve : régénération
spermatozoïdes : à partir de la puberté
Préserver la fertilité : spermatogonies
Stratégie de Préservation de la Fertilité des garçons prépubères
Avant le début du traitement stérilisant Prélèvement de spermatogonies
Conservation spermatogonies : congélation
Après guérison Greffe Culture Xénogreffe ? Recherche
Préserver la fertilité des garçons : Espoirs
Geens et al., 2008
Questions
Quel volume de tissu à prélever ? Un testicule entier Fragments de testicule
Quel tissu conserver ? Fragments de tissu Suspension cellulaire
Quel protocole de congélation ?
Questions
Contamination cellules malignes Tri cellules malignes/testiculaires
0,4% cellules malignes Seuil inconnu chez l’homme
Contenu en spermatogonies Faible : 3/10 000 cellules germinales (souris) Enrichissement ?
Effets des traitements sur le testicule
Utilisation
Tissu FRAIS : Allogreffe
Injection spermatogonies dans tubules séminifères, rete testis, canaux efférents, …
Production de spermatozoïdes Chez différentes espèces dont primates
Résultats chez la souris Production de spermatozoïdes Naissances
Xénogreffe Tissu humain prépubère frais souris nude (s/c)
4 et 9 mois après greffe : « qq spermatogonies survivantes » (Goossens et al., 2008)
Utilisation
Tissu CONGELE Survie cellulaire (souris, lapin, humain, …) Xénogreffe sous cutané
production de spz (souris) Survie spermatogonies (humain)
Culture Souris
Multiplication des spermatogonies obtention de spermatozoïdes
Peu de résultats dans d’autres espèces
Autoconservations Spermatogonies
Radford et al., 1999 : 11 hommes Bahadur et al., 2000 : 2 garçons (8 et 13 ans) Keros et al., 2005 : 16 hommes Kvist et al., 2006 : 8 garçons (1 à 5 ans 1/2) Keros et al., 2007 : 5 garçons (2 à 14 ans)
France : 3 centres (+ 20 patients)
En pratique
Préservation de la fertilité chez jeune garçon
Conservation de cellules souches spermatogonies
Utilisation A déterminer Dans 20 ans
En pratique
Indications
Multidisciplinarité
Consentements (parents)
Technique expérimentale
Préserver la fertilité
chez la femme
Mise en péril du stock folliculaire Stock de follicules :
Pas de renouvellement 6.106 (intra-utérin) 1.106 (naissance) 0,5.106 (puberté) ……99% des follicules : atrésie
Temps
Chimiothérapie (Alkylants+++) / Radiothérapie Greffe médullaire : chimio+radio ménopause 92% des cas
(Meirow et al., 2001)
Pathologies malignes : Femmes : K sein, K invasifs du col, leucémies, … Enfance : leucémie, neurob., LH, ostéosarc., sarc.d'Ewing, LNH
Ovariectomie totale ou partielle :Endométriose, kystes bénins récurrents, tumeur
Ménopause précoce prévisible :X (Turner, délétion, inversion), génétiques, …
Préserver la fertilité féminine aujourd'hui
Sans gamètes de la patiente : Don ovocytes Accueil d'embryons Adoption
Avec gamètes de la patiente : Transposition ovarienne Traitement aux analogues du GnRH Congélation d'ovocytes : matures ou immatures FIV embryons, congelés transférés après guérison Cryoconservation du tissu ovarien
Combiner plusieurs solutions
CONGELATION D’OVOCYTES
Congélation d’ovocytes Stimulation de l’ovulation : temps, traitement hormonal Pas de conjoint pas de désir d’enfants immédiat
Ovocyte : cellule particulière, différente de l’embryon volumineux cytoplasme membrane plasmique
protocole de congélation particulier
Congélation lente Vitrification
Effets de la congélation/décongélation: Dégranulation prématurée des granules corticaux durcissement de
la Z.P. Dépolymérisation du réseau de tubuline du fuseau méiotique et
repolymérisation aneuploidies, polyploidies ? Incubation de quelques heures pour permettre repolymérisation
Congélation d’ovocytes
Résultats Congélation lente
1ère grossesse : Chen et al., 1986 532 enfants nés (1986-2008)
Implantation/100ovocytes décongelés : 2,2 Naisances/100ovocytes décongelés : 2,3-2,2 (Oktay et al., 2006;2008)
Vitrification 392 enfants nés (1986-2008)
Implantation/100ovocytes décongelés : 6,2 Naisances/100ovocytes décongelés : 4,5-5,8 (Oktay et al., 2006;2008)
Vitrification Technique prometteuse en évaluation
LA FECONDATION IN VITRO
La F.I.V.
Stimulation de l’ovulation Temps Traitement hormonal
Conjoint
Désir d’enfants précipité ?
LA CRYOCONSERVATION DE TISSU OVARIEN
La cryoconservation du tissu ovarien
Pas de stimulation de l’ovulation Pas de conjoint Désir d’enfants différé
Femme < 35 ans Enfant Prélèvement per coelioscopique :
Selon le risque estimé de castration : 1 ovaire entier ou ½ ovaire
Transport au laboratoire dans l’heure
La cryoconservation du tissu ovarien
Garde cortex ovarien uniquement: réserve folliculaire 1-2 mm épaisseur Médullaire ôtée
Découpe en bandelettes (5 x 10 mm) Conservation :
Milieu cryoprotecteur (PROH, sucrose, …) Cryotubes Descente en température
contrôlée -196°C
Utilisation du tissu ovarien congelé
Seuls les follicules primordiaux et primaires résistent à la congélation
Maturation : GREFFE
Autogreffe : Orthotopique, pelvienne : restauration de la fertilité naturelle Hétérotopique : sous cutané, intra-musculaire , … : FIV
Xénogreffe : Souris immunodéprimées (nude, SCID, …)
CULTURE IN VITRO COMBINAISON greffe/culture in vitro ?
Greffe de tissu ovarien congelé/décongelé
Autogreffe : Avantages
"Simple" de réalisation Revascularisation ‘spontanée’ Succès chez animal et l’humain
Inconvénients : Risque de transmission de cellules cancéreuses Destruction folliculaire
Congélation/décongélation (survie 10 à 70%) Ischémie post greffe (+++)
September 24, 2004
5 naissances rapportées à ce jour Donnez et al., 2004 Meirow et al., 2005 Demeestere et al., 2007 Andersen et al., 2008 Silber et al., 2008
Résultats
Culture in vitro Avantages :
Zone pellucide : exclue toute cellule, métastatique
Techniques : plusieurs étapes Fragments de cortex ovarien : initiation de croissance
( follicule préantral) Isole le follicule du cortex ( follicule antral) Isole l'ovocyte ‘immature’ (follicule > 2 mm) maturation
finale
Culture in vitro Résultats :
Follicule primordial ovocyte mature :Une espèce : Souris Eppig and O'Brien, 1996 : 1 souris vivante
décès prématuré troubles neurologiques et hépatiques, obésité
O’Brien et al., 2003 : 48 souriceaux vivants en bonne santé
Femme : Follicule primordial secondaire (2 semaines !) Follicule secondaire antral Follicule antral ovocyte mature fécondable Maturation in vitro : 1ère naissance : Veeck et al., 1983
Association xénogreffe puis culture in vitro ?
Copyright restrictions may apply.
Telfer, E. E. et al. Hum. Reprod. 2008 23:1151-1158; doi:10.1093/humrep/den070
Histological sections of in vitro grown human follicles cultured first in cortical strips for 6 days (Step 1) then subsequently isolated at the pre-antral stage and cultured for a further 4 days (step 2) in the presence (A and B) or absence (C and D) of 100 ng/ml of activin A. TISSU FRAIS
Préserver la fertilité féminine ?
BALANCE: Altération de la fertilité par le traitement
Altération de la fertilité par le prélèvement d’ovaire (ovariectomie unilatérale ne divise pas le stock par deux)
Conjoint ? Désir d’enfants ?
Associer les différentes techniques Congélation cortex ovarien Congélation ovocytes immatures (follicules antraux)
Enfant : information aux parents