Download - Biacore - cpu.edu.cn
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January 2012
1
GE Healthcare Life Sciences
Biacore
现场培训教程
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培训内容
• Biacore的原理与应用
• Biacore的基本实验流程
• DEMO实验
• 数据分析
• 维护保养
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Biacore的原理与应用
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Biacore实时监控分子相互结合、解离的过程
结合 解离
Biacore:实时、无标记、活性分子互作分析
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棱镜
入射光源 反射光能量检测器
微流路液相系统 样品
角度
能量
SPR角度
时间 50nm金膜
表面等离子共振原理 (SPR)
SPR 是一种折光率传感器
响应值反映了SPR角度的改变
响应信号依赖于芯片表面分子的浓度和温度
1RU的响应值大致上相当于芯片表面结合物质的浓度改变了1pg/mm2(蛋白结合与CM5芯片)
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Biacore核心组件
SPR光学组件
IFC 微流路系统
传感芯片 微流控系统 (IFC)
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通过表面等离子共振技术(SPR)测定结合
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Biacore的典型应用 • 特异性分析
–目标分子与靶分子之间是否发生结合?特异性如何?
• 多重结合分析
–哪些分子参与了复合体的形成?顺序是什么?
• 亲和力测定
–配体与分析物之间的结合强弱?
• 动力学分析
–两分子结合和解离的速率快慢?
• 浓度测定
–样品中的目标分子浓度高低?
• 热力学分析
–结合强弱、快慢的结构机理是什么?
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Biacore的基本实验流程
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选择实验策略
进行实验
样品准备
Biacore的基本实验流程
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1.样品准备 分析物和配体的定义
配体 定义为“固定”于芯片表面的生物分子
分析物 Analyte
配体 Ligand
分析物 定义流动相中“流经”芯片表面的分子
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• 样品的均一性
--确保样品充分水溶,样品中没有任何沉淀、颗粒
--保持样品处于均一的、不聚集的状态
• 蛋白纯度(>90%)
• 准确定量样品浓度
• 了解蛋白样品的等电点/分子量信息
• 了解样品成分
--分析物中不能含有甘油、蔗糖、咪唑
1.样品准备 样品的注意点
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• 大多数常用的缓冲液都适用于Biacore,须根据结合活性和真实情况来选择最适buffer,添加剂,辅助因子
• 建议在运行缓冲液中保持一定盐离子强度,加入表面活性剂P20(0.05%),以降低非特异性吸附
• 避免添加蔗糖、甘油、咪唑等高折光率物质
• 必须经0.22 μm膜过滤并抽气(隔日使用需冲洗过滤脱气)
• 如使用有机溶剂,如DMSO,请参考兼容试剂表和小分子手册
1.样品准备 缓冲液的选择
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• 若进行氨基偶联:
--氨基偶联时,配体不能含有Tris,NaN3,甘氨酸等含伯氨
基成分
--极酸性蛋白不能固定于CM系列的芯片,可选择其它芯片或
者捕获方法固定
1.样品准备 氨基偶联的考虑
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稳态的方法用在“快上快下”的结合模式下获得亲和力。
将一系列浓度的
分析物流过配体 获得稳态时的响应值
以浓度为X坐标,稳态响应值为Y值,通过拟合“饱和曲线”获得亲和力KD
2.选择实验策略 通过稳态分析获得亲和力
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亲和力KD由动力学常数ka, kd获得,是结合和解离两个过程的综合结果。
一系列浓度的分析物流过配体,获得结合+解离全过程的响应值。
所有传感图扣除零浓度的响应值 (Double Reference)。
通过拟合所有曲线,获得动力学ka,kd和亲和力KD。KD=kd/ka。
2.选择实验策略 通过动力学方法获得亲和力
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11种不同的芯片类型
CM5, CM4, CM3:芯片 蛋白、肽段、小分子等
CM7:小分子化合物研究
SA芯片:生物素标记的分子,如核酸、糖类等
Biotin CAP芯片:可逆性生物素捕获芯片
NTA芯片:His重组蛋白
L1 芯片:模拟脂质双分子层环境
HPA芯片:实现膜系统相关的互作分析
C1芯片:研究细胞、病毒等大颗粒分子
Au裸金芯片:客户定制表面(材料、高分子等)
30余种不同的试剂盒及缓冲液产品
氨基偶联试剂盒、巯基偶联试剂盒;
GST捕获试剂盒 GST重组蛋白分析;
NTA捕获试剂盒 His 重组蛋白分析 … …
2.选择实验策略 传感芯片的选择
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固定配体
3.实验过程 固定配体
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固定配体
3.实验过程 固定配体
•活化:EDC/NHS注入,发生表面酯化
•配体偶联:与配体蛋白的氨基发生反应
•封闭:用乙醇胺封闭芯片上多余的有活性羧基
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3.实验过程 固定配体:偶联pH的选择
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• 通过实验步骤寻找合适的偶联pH
• 当pH>3.5时,芯片表面葡聚糖基质携带负电荷
• 偶联缓冲液的pH应该高于3.5, 但低于配体蛋白的等电点
• 对于许多蛋白质, 10 mM醋酸钠缓冲液(pH 4.5)较为适合
• 蛋白配体的浓度一般介于10-100μg/ml,初始可尝试20μg/ml
• 当无法获得理想预偶联效果时,请检查样品的pH
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• 预富集的目的:在化学偶联过程,通过静电作用吸附并提高芯片
表面附近的配体浓度,从而提高偶联的效率和减少配体消耗。
+
pH<3.5 3.5<pH<pI
+
-
蛋白带正电,葡聚糖带负电。
通过静电吸附可以富集配体。
pH>pI
-
-
pH太低时,葡聚糖
不带电,无法富集
X 蛋白和葡聚糖带相
同负电,无法富集
X
3.实验过程 固定配体:偶联pH的选择
• 够用原则
• 尽量温和
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• 配体偶联水平决定了芯片表面与分析物间的结合容量
• 不同分析方法所需的偶联水平也不同
--稳态分析、浓度测试、特异性:偶联水平尽量高
--动力学分析:低偶联水平
• 配体偶联水平的计算:
RL = 配体偶联水平
Rmax 描述了芯片表面的最大结合容量,对于动力学低偶联需要Rmax≤100
Sm = 化学计量比 (Analyte:Ligand, 未知时选择Sm=1)
实际偶联量=1.5 RL
mLmax SRMWligand
MWanalyteR
3.实验过程 固定配体:配体偶联水平的计算
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样品进样
再生
数据分析
固定配体
3.实验过程 样品进样
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样品进样
芯片再生
固定配体
3.实验过程 芯片再生
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样品进样
芯片再生
数据分析
固定配体
3.实验过程 循环进样
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样品进样
芯片再生
数据分析
固定配体
3.实验过程 数据分析
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样品进样
芯片再生
数据分析
偶联配体
表面测试
再生条件的选择
3.实验过程 实际实验中的额外考量
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芯片表面测试
• 在实际分析开始前,进行一次进样操作
• 使用常规的分析物浓度
• 传感图能提供有用的分子相互作用信息
结合时间、解离时间、估算大致KD
• 用来评估对照表面上的非特异性吸附的结合水平
-400
-200
0
200
400
600
800
1000
1200
50 100 150 200 250 300
Time s
Re
spo
nse
RU
参比通道 配体通道
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• 预估KD
• 动力学分析中,通过预估的KD设计浓度梯度
• 获得的KD必须落在实验浓度范围内
KD的预估
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再生条件的选择
• 将与配体结合的残留的分析物分子从芯片表面彻底除去
• 必须保持芯片上配体分子的活性
• 有效的再生对获得高质量的分析数据至关重要!
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再生条件的选择-测试
• 有效的再生条件能够去除所有剩余的分析物分子 (Baseline)
• 分析物重复一次进样,以检测是否配体维持了原有的活性 (Binding)
• 重复多次进样和再生,充分确保所选择的再生条件的有效性
Cycle 1 Cycle 2
good
bad
Response
Time
Baseline1
Binding 1
Baseline2
Binding 2
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结合水平的变化
再生条件的选择
基线的变化
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• 理想的再生
• 通过多次的进样,结合水平都基本维持稳定。和第一次进样相比,
结合水平的变化在10%之内
• 过于温和的环境
• 结合水平逐渐降低,基线值逐渐增高
• 过于苛刻的环境
• 结合水平逐渐降低,基线维持稳定或逐渐降低
再生条件的选择-小结
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常用的再生条件
• 最适的再生环境内因样品和组合不同而不同
• 相对于可检测的分子的广泛性,再生条件可选择的范围相对较小
• 当配体分子是蛋白质时,建议可选择的再生起始测试条件
− 低 pH (10 mM glycine-HCl, 从 pH 3 至 pH 1.5)
− 乙烯乙二醇 (Ethylene glycol,50%, 75% 和 100%)
− 高 pH (1-50mM NaOH)
− MgCl2 (1-4 M)
− 参考文献和再生条件筛选试剂盒
− Biacore网站的再生数据库
• 注意再生试剂与运行缓冲液的兼容性
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DEMO实验
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目标 上手实验
获得抗体anti-β2μ-globulin IgG与抗原β2μ-globulin蛋白结合的动力学
常数(ka,kd,KD)
• 配体:IgG, 150KDa
• 分析物: β2μ-globulin, 11.8KDa
• 芯片:CM5
• 配体固定方法:氨基共价偶联
• 运行缓冲液:HBS-EP+ buffer
(0.01M HEPES, pH7.4, 0.15M NaCl, 3mM EDTA, 0.05% (v:v)表面活性剂P20)
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DEMO实验 1. 装入芯片
1. 从冰箱取出CM5芯片包装,恢复至室温(~15分钟)
2. 执行软件命令(Undock chip/Eject chip),取出原有芯片
3. 从包装中取出芯片,按照芯片上的方向指示放入芯片
4. 将芯片舱门推上
5. 使用软件命令装入新芯片(Dock chip)
6. 缓冲液入口管插入到新的运行缓冲液中
7. 使用Prime快速更换缓冲液
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DEMO实验 2. 预富集
配体 Anti-β2μ-globulin IgG
配体稀释 分别将3μl配体+97μl 10 mM NaAc (pH4.5, pH5.0, pH5.5)稀释
运行模式 手动模式
Flowcell FC2
流速 10 μl/min
进样 120 s
再生 50 mM NaOH 30 s
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DEMO实验 2. 预富集:预计结果
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DEMO实验 3. 芯片偶联:Wizard模式
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DEMO实验 3. 芯片偶联:预计结果
冲洗
芯片表面活化
(EDC/NHS)
芯片表面封闭
(乙醇胺)
空芯片静电吸附
测试预富集能力
通过“脉冲式”多次配体进样,最终达到预设的
偶联水平。 (第一针的进样量由预富集测试决定)
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DEMO实验 4. 多循环动力学实验
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DEMO实验 4. 多循环动力学实验
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DEMO实验 4. 多循环动力学实验
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数据分析
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1. 打开Biacore Evaluation Software程序(Start->Program->Biacore->Biacore T200 Evaluation Software)
2. 选择File->Open,打开实验数据结果文件
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数据分析 导入数据
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数据分析 调整导入的数据:将Baseline对齐且归零
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数据分析 选择分析模式
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数据分析 选择需要的曲线,扣除零浓度曲线
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数据分析 动力学分析
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数据分析 拟合
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数据分析 动力学分析:拟合后的结果
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数据分析 导出结果
可以在File->Export导出多种格式的数据 如果要选择图形输出,可以在图片上点击右键,选择Copy Graph,然后直接粘贴到Windows画图工具或Word、PPT软件中
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设备维护
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课程目标
• 了解Biacore维护的重要性
• 每日维护
• 每周维护
• 每月维护
• Standby和关机
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为什么要做维护?
• 日常仔细、彻底的维护对于保持Biacore的性能和获得高
质量数据极为重要!
• 许多报告的“故障”都是由于未做好维护工作而造成的
• 维护工作不到位可能会影响实验的重复性
请遵循推荐的系统维护流程!
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每日维护
• 对缓冲液进行过滤(filter)
- 即使是前一天使用的缓冲液也要进行重新过滤
- 尽量使用新鲜的缓冲液
• 使用Prime对系统进行冲洗
- 换芯片后要用原有的buffer或水prime冲洗系统
• 在每次实验间隙,将系统设定于Standby模式
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每周维护
• 去吸附
- 主菜单Tools->More Tools运行Desorb程序(SDS/甘氨酸)
- SDS必须放置室温下
• 检查进样泵
- 检查末端看是否有渗漏
- 检查末端看是否有污染
- 如果必须进行清洗步骤,Tools -> Service Tools -> Syringe/Tip
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每月维护
• 去吸附和除菌
- 主菜单Tools->More Tools运行Desorb程序
- 主菜单Tools->More Tools运行Sanitize程序
(稀释的次氯酸钠)
• 测试系统性能
- 主菜单Tools-> Test Tools中选择运行System Check
(使用新的 CM5芯片/标准测试溶液/HBS-N buffer)
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• 系统闲置如果小于7天
- 选择Standby模式,使系统内存在稳定的去离子水流
- 经常更换新鲜的去离子水
• 系统闲置如果超过7天
- 执行关机程序(Shutdown),按照指令分步使用水和70%乙醇
- 在关机后将蠕动泵压盖拧松
每次实验结束后,如何设置Biacore?
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芯片的保存
• 半干法保存:
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将芯片盒有字一面朝下放置,推出芯片内片,取大约100μl合适储存蛋白的缓冲液,滴到金膜上,至完全覆盖金膜区域即可。注意:枪头不要接触金膜!将内皮推回芯片盒内,一起装入一只50ml离心管。拧紧离心管盖,放置于4摄氏度冰箱。可选择水平放置,不要剧烈晃动,以免液滴脱落。此方法实际的可存放时间,主要取决于固定的生物分子的性质。 再次使用芯片时,将芯片内片取出,甩干至金膜区域无残留任何液体。注意:不可接触或用水洗金膜区域!检查确保芯片所有区域(包括芯片盒、内片、金膜)没有残留液体、盐析出。将芯片内片推回,即可使用。
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