Londrina
2014
LUCIANA JESUS BERNINI
CENTRO DE CIENCIAS AGRÁRIAS
MESTRADO EM CIÊNCIA E TECNOLOGIA DO LEITE E DERIVADOS
AVALIAÇÃO DO POTENCIAL IMUNOMODULADOR DE
Bifidobacterium lactis “IN VIVO” EM PACIENTES
COM SÍNDROME METABÓLICA
i
LUCIANA JESUS BERNINI
AVALIAÇÃO DO POTENCIAL IMUNOMODULADOR DE
Bifidobacterium lactis “IN VIVO” EM PACIENTES
COM SÍNDROME METABÓLICA
Dissertação apresentada como requisito parcial
para obtenção do título de mestre em Ciência e
Tecnologia do Leite e Derivados.
Orientadora: Profa. Dra. Giselle A. Nobre Costa
Co-orientadora: Profa. Dra. Cínthia Hoch Batista
de Souza
Londrina
2014
ii
AUTORIZO A REPRODUÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.
Dados Internacionais de catalogação-na-publicação Universidade Norte do Paraná
Biblioteca Central
Setor de Tratamento da Informação
Bernini, Luciana Jesus.
B448a Avaliação do potencial imunomodulador do Bifidobacterium
lactis “in vivo” em pacientes com síndrome metabólica / Luciana
Jesus Bernini. Londrina : [s.n], 2014.
viii; 55f.
Dissertação (Mestrado). Ciência e Tecnologia do Leite.
Universidade Norte do Paraná.
Orientador: Profº. Drª Giselle A. Nobre Costa
1- Ciência e tecnologia do leite e derivados - dissertação de
mestrado - UNOPAR 2- Probiótico 3- Bifidobactéria 4-
Trato gastrointestinal 5- Imunomodulação 6- Obesidade I- Costa,
Giselle A. Nobre, orient. II- Universidade Norte do Paraná.
CDU 637.1
iii
LUCIANA JESUS BERNINI
AVALIAÇÃO DO POTENCIAL IMUNOMODULADOR DE
Bifidobacterium lactis “IN VIVO” EM PACIENTES
COM SÍNDROME METABÓLICA
Dissertação apresentada à UNOPAR – Unidade Piza, Centro de Pesquisa em Ciências
Agrárias como requisito parcial para a obtenção do título de mestre em Ciência e Tecnologia do Leite e Derivados, conferido pela banca examinadora constituída pelos
professores:
Profª. Drª. Giselle A. Nobre Costa
Universidade Norte do Paraná - Orientadora
Profª. Drª. Elsa Helena Walter de Santana
Universidade Norte do Paraná - Membro
Prof. Dr. Isaías Dichi.
Universidade Estadual de Londrina - Membro
Londrina, 25 de Agosto de 2014.
iv
AGRADECIMENTOS
Primeiramente a Deus por me impulsionar a trilhar novos caminhos, por cuidar de
mim com tanto carinho e ser presença viva em minha vida.
Ao meu esposo Paulo Vinícius pelo amor, compreensão, paciência, por acreditar
em mim, por estar sempre ao meu lado me incentivando e principalmente por me ajudar a
chegar até aqui. Obrigado por aguentar comigo todo sofrimento, todas as renúncias...
Valeu a pena esperar... Hoje estamos colhendo, juntos, os frutos do nosso empenho! Esta
vitória também é sua!!! Te amo.
Aos meus filhos Maria Fernanda e Vinícius que me fazem esquecer qualquer
problema e dificuldade. É por vocês que procuro ser melhor a cada dia.
Aos meus pais Mauricio e Maria de Lourdes por me ensinarem a cada dia ser uma
pessoa melhor e pelo apoio incondicional neste e em todos os momentos da minha vida.
Além da ajuda incansável da minha mãe em me ajudar a cuidar da minha filha. Mãe te amo
e obrigado por tudo.
A minha irmã Luana e cunhado Victor pela amizade única e suporte indispensável
para eu alcançar meus sonhos.
A minha orientadora, Profa. Dr
a. Giselle Nobre Costa, pela orientação, incentivo,
ensinamento, paciência, amizade, disponibilidade e confiança em mim.
A minha co-orientadora, Profa. Dr
a.Cinthia H. B. de Souza, pela orientação,
disponibilidade, carinho, amizade e atenção.
A todos que contribuíram para o desenvolvimento deste projeto, em especial,
Profa Dr
a. Andréa Name pela colaboração fundamental em disponibilizar o Laboratório de
Imunologia e Análises Clínicas do Hospital Universitário da Universidade Estadual de
Londrina (HU/UEL).
Ao Dr. Isaías Dichi e Dra. Elsa H. W. de Santana pelas valiosas correções e
sugestões neste trabalho.
A todos os funcionários do Posto de Saúde central da cidade de Jatazinho, em
especial ao secretário de saúde Ricardo Alexandre Corsino e a técnica de enfermagem
Wilma Batista, obrigado pelo carinho e colaboração.
Aos amigos do Laboratório, pelos bons momentos, convivência agradável e
auxilio durante estes anos.
A todos os professores que foram muito importantes para o meu aprendizado no
decorrer dessa trajetória acadêmica e conclusão desse curso.
v
Aos participantes do grupo voluntario da pesquisa que, com dedicação e carinho,
contribuíram para o sucesso desse estudo.
vi
A felicidade nos mantêm doces.
Dores nos mantêm humanos.
Quedas nos mantêm humildes.
Sucessos nos mantêm brilhando.
Provações nos mantêm fortes.
Mas somente Deus nos mantêm prosseguindo...
(Autor desconhecido)
vii
BERNINI, Luciana Jesus. Avaliação do potencial imunomodulador do Bifidobacterium
lactis “in vivo” em pacientes com síndrome metabólica. 2014. 56 f. Dissertação
(Mestrado Acadêmico em Ciência e Tecnologia do Leite e Derivados) – Centro de
Ciências Agrárias, Universidade Norte do Paraná, Londrina, 2014.
RESUMO
A literatura científica relata muitos estudos tratando do benefício de microrganismos
probióticos sobre o organismo humano e animal. Dentre esses efeitos, a capacidade de
modular o sistema imunológico e incrementos no tratamento de várias disbioses são
relatados. Este projeto teve como objetivo, produzir um leite probiótico contendo
Bifidobacterium lactis HN019, introduzi-lo na dieta de um grupo de 26 voluntários
humanos caracterizados como portadores de síndrome metabólica (SM). Posteriormente,
os efeitos do probiótico foram avaliados durante o consumo por 0 e 45 dias do tratamento e
comparados à dados de um grupo controle não tratado (25 indivíduos) com síndrome
metabólica (SM). O leite probiótico foi produzido com 8% (P/V) de leite em pó desnatado
reconstituído, 6% (P/V) sacarose, esterilizado a 121ºC/15 min., resfriado à 42°C e
adicionado de 10% (V/V) de inóculo. O produto foi caracterizado físico-quimica e
microbiologicamente de acordo com a Legislação vigente. Paralelamente, a vida de
prateleira do produto pronto para consumo foi avaliada durante 30 dias sob armazenamento
refrigerado (5ºC). Todas as análises físico-químicas e microbiológicas foram efetuadas em
triplicata. Após o cultivo durante 18 h, o produto foi resfriado lentamente à 5ºC,
adicionado de 0,01% (V/V) de aroma de laranja e/ou baunilha e envasado assepticamente.
Os voluntários do grupo tratado receberam diariamente 80 mL do leite probiótico,
contendo em média 3,4 x108 UFC/mL de B. lactis. O produto pronto para o consumo
apresentou acidez titulável de 0,4% de ácido láctico, pH de 5.2, ausência de coliformes
totais e/ou termotolerantes e de bolores e leveduras. Os efeitos do probiótico foram
avaliados em amostras de sangue do grupo controle e do grupo tratado a partir de dados
antropométricos: Índice de massa corporal, Circunferência abdominal, Pressão Arterial
sistólica e Diastólica, triacilglicerídeos, Colesterol, glicose, Insulina e Índice de resistência
à Insulina (HOMA) nos tempos zero e 45 dias de consumo. Dentre os parâmetros
avaliados foi observado redução significativa (p<0,05) do índice de massa corporal (IMC),
colesterol total e LDL (Low Density Lipoprotein), evidenciando o efeito de HN019 sobre
parâmetros da SM. Adicionalmente, também ocorreu a redução das citocinas TNF- (Fator de Necrose Tumoral Alfa) e de interleucina IL-6, ambos mediadores da imunidade inata,
um efeito sobre o sistema imunomodulador. Os dados obtidos, embora preliminares,
sugerem que intervenções clínicas com o uso de algumas linhagens probióticas, podem
alterar positivamente a saúde da população em estudo e evidenciam a importância da
compreensão destes efeitos na evolução da SM.
Palavras-Chave: Probiótico. Bifidobactéria. Trato gastrointestinal. Imunomodulação.
Obesidade.
viii
BERNINI, Luciana Jesus. Avaliação do potencial imunomodulador do Bifidobacterium
lactis “in vivo” em pacientes com síndrome metabólica. 2014. 56 p. Dissertação
(Mestrado Acadêmico em Ciência e Tecnologia do Leite e Derivados) – Centro de
Ciências Agrárias, Universidade Norte do Paraná, Londrina, 2014.
ABSTRACT
The scientific literature has reported many studies relating the beneficial role of probiotic
on human and animal organisms such as the ability to modulate the immune system and to
improve the treatment of various disbioses. This project aimed to produce a probiotic milk
containing Bifidobacterium lactis HN019 and to introduce it in the diet of 26 human
volunteers characterized as having metabolic syndrome (MetS). Then the effects of
probiotic were evaluated during consumption for 0 and 45 days. The data were compared
to those of untreated control group (25 subjects) with MetS. The probiotic milk was
produced with 8% (w / v) skimmed milk powder, 6% (W/V) sucrose, sterilized at 121 ° C /
15 min. Cooled to 42°C and added with 10% inoculum (V/V). The product was
characterized physico-chemically as well and microbiologically in accordance with current
Brazilian Laws. The shelf-life of the product was evaluated for 30 days under refrigerated
storage (5 ° C). All the physicochemical and microbiological analyzes were performed in
triplicate. After culturing for 18 h, the product was slowly cooled to 5° C, added with
0.01% (v / v) of orange and/or vanilla flavor and packed aseptically. Volunteers treated
group received daily 80 mL of probiotic milk containing on average 3.4 x108 CFU/mL of
B. lactis. The final product showed titratable acidity of 0.4% (lactic acid), pH of 5.2,
absence of total and / or fecal coliforms as well yeasts and molds. The effects of the
probiotic were assessed in blood samples from the control group and the group treated
based on anthropometric data: Body mass index, Waist circumference, Systolic and
Diastolic blood pressure, Triglycerides, Cholesterol, Glucose, Insulin and Insulin
resistance index (HOMA) in zero and 45 days of consumption. It has been observed
significant reduction (p <0.05) in body mass index (BMI), total cholesterol and LDL (Low
Density Lipoprotein) showing the effect of HN019 on the MetS parameters. Additionally,
there was a reduction of mediators of innate immunity, cytokines TNF- (Tumor Necrosis
Factor alpha) and interleukin IL-6, indicating a effect on the immune modulatory system.
These data, although preliminary, suggest that clinical interventions such as the use of
probiotic strains could positively change the health of the population under study and
demonstrate the importance of understanding these effects in the evolution of MetS.
Keywords: Probiotic. Bifidobacteria. Gastrointestinal tract. Immunomodulation. Obesity.
ix
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ........................................................................................................ 1
1.1 OBJETIVOS .................................................................................................................. 2
1.1.1 Objetivo Geral............................................................................................................ 2
1.1.2 Objetivos Específicos ................................................................................................ 2
2 FUNDAMENTAÇAO TEÓRICA .......................................................................... 3
2.1 MICRORGANISMOS PROBIÓTICOS ................................................................................ 3
2.1.1 Gênero Bifidobacterium ............................................................................................. 4
2.1.2 Bifidobacterium lactis ................................................................................................ 6
2.2 APLICAÇÃO EM ALIMENTOS ....................................................................................... 6
2.3 LEITE PROBIÓTICO X LEITE FERMENTADO ................................................................. 7
2.4 TRATO GASTROINTESTINAL (TGI) ................................................................................ 8
2.5 SÍNDROME METABÓLICA (SM) ................................................................................. 10
2.5.1 Efeito de Microrganismos Probióticos Sobre o Sistema Cardiocirculatório ........... 11
2.5.2 Efeitos de Microrganismos Probióticos no Sistema Imunomodulador .................. 12
REFERÊNCIAS ................................................................................................................ 15
3 ARTIGO 1 - PRODUÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DO LEITE
PROBIÓTICO ....................................................................................................... 22
4 ARTIGO 2 - EFEITOS DE Bifidobacterium lactis HN019 NA MASSA
CORPORAL, METABOLISMO GLICÍDICO, LIPIDICO E MARCADORES
INFLAMATÓRIOS EM PACIENTES COM SINDROME METABÓLICA . 32
5 CONLUSÕES GERAIS E ÉRSPECTIVAS ............................................................... 46
ANEXOS ................................................................................................................. 47
Anexo 1 - Aprovação do Comitê de Ética .............................................................. 48
1
1. INTRODUÇÃO
O interesse pelo tema probiótico, assim como pelos alimentos funcionais de
maneira geral, está diretamente relacionado à crescente valorização da qualidade de vida e da
prevenção de doenças. Estudos visando a avaliação e comprovação dos efeitos de
microrganismos probióticos em humanos tornam-se um importante alvo de pesquisas, pois
permite, tanto à área de ciência e tecnologia de alimentos como às áreas clínicas, fornecerem
ao consumidor alimentos que aliam a saúde aos hábitos alimentares.
A síndrome metabólica (SM), bem como as doenças ocasionadas em
decorrência desta patologia, é cada vez mais frequente na sociedade atual e é caracterizada
por um conjunto de desordens que incluem fatores de risco metabólicos como a dislipidemia
aterogênica (hipertrigliceridemia, níveis elevados de apolipoproteína B, partículas pequenas e
densas de LDL-colesterol e níveis baixos de HDL-colesterol), hipertensão arterial,
hiperglicemia e um estado pró-inflamatório e pró-trombótico (GRUNDY, et al., 2005). As
características desta doença são diversas e refletem diretamente na qualidade de vida do
indivíduo portador.
A prevenção ou o tratamento dos sintomas da SM utilizando alimentos
funcionais, como aqueles adicionados de microrganismos probióticos, podem ser uma
alternativa viável, já que cada vez mais estudos da modulação da microbiota intestinal são
associados ao metabolismo lipídico, a redução de risco de doenças cardiovasculares e
portanto, à redução e/ou prevenção de SM.
Culturas probióticas têm sido adicionadas em alimentos para conferir
propriedades funcionais e tecnológicas. Bactérias pertencentes aos gêneros Lactobacillus e
Bifidobacterium são mais frequentemente empregadas como suplementos probióticos para
alimentos, uma vez que elas têm sido isoladas do trato gastrintestinal humano saudável
(SAAD, 2006). Pode-se afirmar que, uma linhagem probiótica irá desempenhar melhor seu
efeito benéfico quando estiver em ambiente similar àquele no qual foi isolado, visto que é
geralmente hospedeiro-específica. Portanto, as linhagens probióticas que devem ser
empregadas em produtos lácteos são de origem humana, em função da boa capacidade de
adaptação as necessidades fisiológicas do hospedeiro comparadas com linhagens isoladas de
outros ambientes.
No mercado mundial atual, os leites fermentados são os principais produtos
comercializados com alegação de promover a saúde, entretanto, sobremesas a base de leite,
2
leite em pó destinado a recém-nascidos, sorvetes, maionese, diversos tipos de queijos e
alimentos de origem vegetal fermentados também são utilizados (GOMES; MALCATA,
1999; SHAH, 2007).
Produtos diferenciados tecnológica e sensorialmente e com alta viabilidade
do probiótico utilizado podem ser uma inovação no mercado de produtos lácteos. A aplicação
destes em estudos clínicos é uma ferramenta bastante interessante e vem sendo utilizada com
frequência para comprovação dos efeitos de linhagens potencialmente probióticas. Os dados
oriundos destes estudos possibilitam o entendimento dos modos de ação destes
microrganismos e seus efeitos fisiológicos na saúde humana.
1.1 OBJETIVOS
1.1.1 Objetivo Geral
Avaliar os efeitos de um leite probiótico contendo Bifidobacterium lactis
sobre o metabolismo lipídico, glicídico e o sistema imunomodulador de um grupo de
voluntários humanos portadores de síndrome metabólica.
1.1.2 Objetivos Específicos
Produzir e caracterizar um leite probiótico contendo B. lactis e introduzí-lo
na dieta de grupos de voluntários humanos;
Avaliar a capacidade deste probiótico em incrementar o sistema
imunomodulador, via resposta inespecífica, humoral e celular em amostras sanguíneas;
Avaliar os efeitos deste probiótico sobre parâmetros característicos da
síndrome metabólica;
3
2. FUNDAMENTAÇAO TEÓRICA
2.1 MICRORGANISMOS PROBIÓTICOS
Fuller (1989) definiu probiótico como suplemento alimentar a base de
microrganismos vivos, com efeito benéfico ao hospedeiro por equilibrar a sua microbiota
intestinal.
Lactobacillus e Bifidobacterium são os gêneros mais frequentemente
empregadas como suplementos probióticos para alimentos. Estes microrganismos necessitam
possuir algumas características para serem classificados como probióticos, a saber: ausência
de toxicidade ou patogenicidade, propriedades adequadas a fim de que sejam produzidos e
incorporados em alimentos sem perder sua viabilidade e funcionalidade durante a vida útil do
produto, habilidade de sobreviver às defesas inatas no trato gastrintestinal, incluindo
sobrevivência à acidez gástrica e aos sais biliares; habilidade de colonizar a mucosa intestinal
e capacidade de exercer efeito de melhoria da saúde do hospedeiro (O’MAY;
MACFARLANE, 2005).
Para exercer um impacto benéfico à saúde, a concentração de probióticos no
produto deve atingir níveis adequados (DONKOR et al., 2007; LOURENS-HATTINGH;
VILJEON, 2001). Shah (2000) sugere um mínimo de 106
UFC/mL, mas recomenda 108
UFC/mL para compensar a redução que acontece no número de microrganismos viáveis
durante a passagem pelo trato gastrointestinal. De acordo com a legislação brasileira vigente,
a quantidade mínima viável para caracterização de um alimento como probióticos deve estar
na faixa de 108a 10
9 UFC na porção diária recomendada (BRASIL, 2008).
Microrganismos probióticos apresentam bons efeitos nas diarreias virais,
pois parecem aumentar a quantidade de IgA diminuindo a disseminação viral (BENCHIMOL;
MACK, 2004). Outra forma de ação é a sua ligação às células epiteliais do intestino, onde
competem por nutrientes e sitio de adesão com bactérias patogênicas e vírus impedindo-os de
se instalarem (DODD; GASSON, 1994; O’SULLIVAN et al.,1992).
Controle e estabilização da microbiota intestinal após o uso de antibióticos,
promoção da resistência gastrointestinal à colonização por patógenos, promoção da digestão
da lactose em indivíduos intolerantes são alguns dos benefícios à saúde do hospedeiro
atribuídos à ingestão de culturas probióticas. Outros efeitos atribuídos a essas culturas são a
diminuição do risco de câncer de cólon e de doença cardiovascular. É sugerida, também, a
4
diminuição das concentrações plasmáticas de colesterol, efeitos anti-hipertensivos, redução da
atividade ulcerativa de Helicobacter pylori, controle da colite induzida por rotavírus e por
Clostridium difficile, prevenção de infecções urogenitais, além de efeitos inibitórios sobre a
mutagenicidade (CHARTERIS; KELLY; MORELLI., 1998; JELEN; LUTZ, 1998; KAUR;
CHOPRA; SAINI, 2002; KLAENHAMMER, 2001; LYE et al., 2009; SHAH;
LANKAPUTHRA, 1997; TUOHY et al., 2003).
Atualmente, muitos estudos ilustram a efetividade de ação de alguns
microrganismos probióticos na saúde do hospedeiro, em geral estes benefícios são associados
primariamente à ingestão de microrganismos viáveis que induzem modificações e influências
positivas no intestino. Alguns dos benefícios estão devidamente documentados, enquanto
outros têm demonstrado resultados promissores em estudos com animais. Contudo, estudos
adicionais necessitam ser realizados com humanos para sustentar tais alegações (KWON et
al., 2010; LYE et al., 2009; SHAH, 2007).
Efeitos sobre o sistema imunomodulador e cardiovascular de probióticos em
humanos são alvos de estudos e, embora nem todos os mecanismos de ação sejam bem
esclarecidos, as evidências acumuladas sobre os benefícios decorrentes do uso dos probióticos
justificam o aprofundamento destes estudos (COPPOLA; TURNES, 2004; CROSS, 2002;
KWON et al., 2010). Adicionalmente, é importante salientar que nem todos os probióticos são
efetivos para todas as funções, e é necessário considerar as variações existentes entre as
diferentes espécies e linhagens com relação à funcionalidade (CRITTENDEN et al., 2005;
PINEIRO; STANTON, 2007).
2.1.1 Gênero Bifidobacterium
As bifidobactérias foram isoladas e descritas pela primeira vez, em 1899,
por Tissier, sendo denominadas de Bacillus bifidus communis. O gênero Bifidobacterium sp.
foi proposto originalmente por Orla-Jensen, em 1924, mas somente em 1986 foi aceito e
reconhecido como gênero independente na oitava edição do Manual Bergey’s (TESHIMA,
2001). Caracterizam-se, em geral, como microrganismos Gram-positivos, não formadores de
esporos, desprovidos de flagelos, catalase-negativos e anaeróbios, podem apresentar formas
variadas que incluem bacilos curtos e curvados a bacilos bifurcados (HOLT et al., 1994). A
temperatura ótima de crescimento abrange de 37ºC a 42ºC, não havendo crescimento em
temperaturas abaixo de 25-28ºC e acima de 43º-45ºC (SCARDOVI, 1986).
5
Diferem das bactérias lácticas homo e heterofermentativas na forma de
fermentação da glicose, que ocorre pela via frutose-6-fosfato, produzindo ácido acético e
ácido láctico na forma L(+) na proporção molar de 3:2, respectivamente, A presença de
frutose-6- fosfato- fosfocetolase (F6PPK) distingue o gênero de outros do grupo. Essa enzima
quebra a frutose-6- fosfato em acetil-fosfato e eritrose-4-fosfato, sendo o único gênero
bacteriano de origem intestinal que apresenta essa via fermentativa conhecida como “via
bífida” (MODLER; McKELLAR; YAGUCHI, 1990). Todas as espécies fermentam glicose,
galactose, frutose e lactose, com exceção de B. gallicum que não utiliza lactose. Mais de 30
espécies já foram identificadas, sendo 11 isoladas do trato gastrointestinal humano (WARD;
ROY, 2005).
Bifidobactérias são microrganismos benéficos e existe interesse na
manutenção da predominância desse gênero na microbiota intestinal. Essas bactérias estão
sendo amplamente utilizadas como probióticos (TESHIMA, 2001). É sabido que o TGI de
neonatos e crianças, sobretudo aquelas que recebem amamentação materna regular nos
primeiros dias de vida, é composto majoritariamente de bifidobactérias (BRICZINSKI et al.,
2009) e há comprovações também de que a manutenção desta microbiota ocasiona efeitos
positivos na saúde geral destes indivíduos em fase adulta.
Vários mecanismos são sugeridos para a ação inibitória de bifidobactérias
contra patógenos Gram negativos, incluindo o decréscimo do pH local pela produção de
ácidos orgânicos, a competição por nutrientes e por sítios de adesão, a estimulação da
imunidade intestinal e a produção de substâncias antibacterianas específicas (FULLER, 1989;
GOPAL et al., 2001; MAKRAS; DE VUYST, 2006; SANDERS, 2006; TOURÈ et al.,2003).
Quanto a efeitos clássicos comuns a probióticos, a produção de
bacteriocinas por cepas de bifidobactérias é pouco documentada. Porém, duas bacteriocinas,
bifidina e bifidocina B, produzidas por Bifidobacterium bifidum, foram relatadas, sendo que a
bifidocina B foi purificada, caracterizada e constatada como responsável pela inibição do
crescimento de espécies de Listeria, Enterococcus, Bacillus, Lactobacillus e Pediococcus
(YILDIRIM; WINTERS; JOHNSON, 1999).
As bifidobactérias, assim como quaisquer outros candidatos à probióticos,
devem seguir critérios de seleção, como possuir boa tolerância ao ácido, aos metabólitos
tóxicos e sais biliares, possuir atividade antimicrobiana e quando adicionadas em alimentos ou
fármacos devem ser capazes de gerar um produto final com sabor e textura aceitáveis, além da
6
manutenção de uma população mínima de 106 UFC/mL ou g de produto (GOMES;
MALCATA, 2002).
2.1.2 Bifidobacterium lactis
Muitas discussões à respeito da nomenclatura correta para Bifidobacterium
lactis têm sido disponibilizadas na literatura. De fato, a similaridade molecular entre as
espécies B. animalis e B. lactis evidenciam a inclusão da B. lactis como uma subespécie e não
mais como espécie (MASCO et al., 2004; PRASAD; GOPAL; GIL, 2003). Desta forma, a
linhagem HN019 mantém está denominação comercial, entretanto, sua nomenclatura foi
alterada para B. animalis subsp. Lactis (MASCO et al., 2004). Muitos efeitos são atribuídos à
linhagem HN019. Dentre estes efeitos o incremento no sistema imunomodulador, inibição de
bactérias patogênicas, alterações benéficas no balanço microbiano de adultos e idosos são
relatados (AHMED et al., 2007; PRASAD; GOPAL; GIL, 2003; SANDERS, 2006).
Bifidobacterium lactis HN019 é considerada um probiótico em potencial,
baseada na sua capacidade de resistir a bile e a pH bem ácidos in vitro, essa linhagem se
apresentou capaz de adesão em quantidade elevada em diferentes tipos de células do epitélio
intestinal (GOPAL et al., 2001).
2.2 APLICAÇÃO EM ALIMENTOS
O aumento do valor nutritivo e terapêutico dado pelas bifidobactérias gerou
interesse no sentido de incorporação das mesmas em determinados alimentos, sendo os
veículos mais usuais os alimentos infantis, os leites fermentados, outros produtos lácteos e
algumas preparações farmacêuticas (GOMES; MALCATA, 2002).
As bifidobactérias possuem relevante importância do ponto de vista
industrial, com grande potencial de mercado devido as suas propriedades tecnológicas e seus
efeitos em interação com os mecanismos metabólicos do organismo, por estarem associadas a
diversos efeitos a saúde como, incidências de alergias, melhor digestão da lactose entre outros
benefícios (GONÇALVES; EBERLE, 2009). Para uso em alimentos, as cepas devem ser
selecionadas com base nos processos tecnológicos, visto que as bactérias probióticas devem
exibir resistência às etapas da preparação do alimento (MORI et al., 1997). Muitas
bifidobactérias, adicionadas aos produtos lácteos, podem não resistir à exposição ao ácido
7
durante ou após a fermentação, ou ao oxigênio durante a distribuição e estocagem refrigerada,
e/ou ao ácido estomacal humano após ingestão (MAUS; INGHAM, 2003).
As espécies mais comumente usadas pela indústria de lácteos são
Bifidobacterium bifidum, B. breve, B. infantis, B. animalis e B. longum (DESJARDINS;
ROY; GOULET, 1990). O sucesso dos alimentos contendo bifidobactérias se dá pela sua
viabilidade no produto durante sua vida útil, bem como da sua resistência às condições do
sistema no trato gastrointestinal superior (GOPAL et al., 2001).
2.3 LEITE PROBIÓTICO X LEITE FERMENTADO
Leites fermentados são definidos (BRASIL, 2007) como “os produtos
adicionados ou não de outras substâncias alimentícias, obtidas por coagulação e diminuição
do pH do leite, ou leite reconstituído, adicionado ou não de produtos lácteos, por fermentação
láctica mediante ação de cultivos de microrganismos específicos. Esses microrganismos
devem ser viáveis, ativos e abundantes no produto final durante seu prazo de validade.
Na produção de leites fermentados, o pH final ideal é de aproximadamente
4,7. Este pH deve ser alcançado em no máximo 24 h para garantir a segurança microbiológica
do produto durante a estocagem e para evitar que o pH decresça a valores muito baixos
durante o armazenamento. As bifidobactérias têm baixa capacidade de acidificação, sendo
utilizadas em associação com culturas bioajustadoras, portanto as bifidobactérias são usadas
em fermentações de leite de modo limitado devido ao lento crescimento. Embora o leite seja
um meio satisfatório por conter nutrientes essenciais, aminoácidos e pequenos peptídios estão
presentes em quantidades insuficientes para o crescimento de bifidobactérias. Há, contudo,
relatos de casos de adaptação das bifidobactérias ao leite após sucessivas transferências
(HELLER, 2001).
Ferreira (2003) ressalta que, de um modo geral, as bifidobactérias não
crescem muito bem no leite; produzem pouco ácido, prolongando o tempo de fermentação, e
para iniciar o crescimento, exigem um meio com baixo potencial de oxi-redução, além de
fatores de crescimento. A taxa de produção de ácido é crítica para a qualidade e vida de
prateleira do produto lácteo fermentado, daí a importância desses produtos atingirem pH 4,7
num período máximo de 24 horas, o que geralmente não é possível com as culturas deste
gênero isoladamente.
8
Do ponto de vista econômico, não é viável fermentar o leite usando apenas
bifidobacteria devido ao maior tempo de fermentação requerido para reduzir o pH do leite
para 4,7 e também ao sabor desagradável (DAVE; SHAH, 1997). Já que estas produzem,
durante a fermentação, ácidos acético e lático à taxa de 3:2, seu desenvolvimento excessivo
pode gerar produtos com sabor e aroma acético, dificultando a aceitação do produto pelos
consumidores (SAMONA; ROBINSON; MARAKIS, 1996).
2.4 TRATO GASTROINTESTINAL (TGI)
O intestino é um ecossistema complexo, no qual os componentes estão
permanentemente em contato e interação: as células do hospedeiro, os nutrientes e a
microbiota. As funções intestinais incluem o processo que leva à digestão dos alimentos, à
absorção dos nutrientes, e a uma série de atividades que objetivam a defesa contra agressores
externos. Esta última e importante função do intestino é baseada na microbiota, na barreira
constituída pela mucosa intestinal e no sistema imune local (BOURLIOUX et al., 2003).
O epitélio intestinal intacto e a microbiota normal do intestino representam
barreira a bactérias patogênicas, antígenos e outras substâncias do lúmen intestinal para o
sangue. Em indivíduos saudáveis, esta barreira é estável, protegendo o hospedeiro e
assegurando a função normal do intestino. A alteração na permeabilidade da barreira intestinal
facilita a invasão do sangue por patógenos, antígenos estranhos e outras substâncias nocivas
(GOMES; MALCATA, 1999). Esta alteração pode ocorrer em função do desequilíbrio
microbiano, quando microrganismos prejudiciais ou patógenos dominam o TGI. Segundo
Kwon et al. (2010), a ingestão de bactérias probióticas pode melhorar a resistência do
hospedeiro a microrganismos patogênicos, facilitando assim a exclusão destes no intestino. A
manutenção do equilíbrio microbiano pode ser assegurado com o uso de probióticos na dieta
(BIELECKA; BIEDRZYCKA; MAJKOWSKA, 2002).
A microbiota intestinal é muito diversificada e é responsável pelo
desenvolvimento do sistema imunológico do organismo. Os efeitos podem ser locais ou
sistêmicos, além disso, enzimas produzidas pelos microrganismos podem atuar
metabolicamente no intestino produzindo compostos benéficos ao hospedeiro, esses
compostos podem afetar a nutrição, fisiologia, assim como a resistência do hospedeiro a
infecções (MITSUOKA, 1992).
9
Estudos in vitro mostram que os probióticos competem com as bactérias
patogênicas porque estes se ligam nas células do intestino (enterócitos), onde estimulam a
produção de mucina, uma proteína produtora de muco que impede a aderência dos
microrganismos patogênicos (MACK; MICHAIL; WET, 2004).
Bifidobactérias e lactobacilos também degradam substâncias não
absorvíveis pelo organismo do hospedeiro, o que agrega benefícios à sua saúde (OWEHAND,
2007; SOUZA et al.,2009; CASE; FUNKE; TORTORA, 2005).
A microbiota intestinal está associada ao aumento significativo de
lipopolissacarídeos (LPS) no plasma, ganho de gordura e peso corporal, aumento de
triglicerídeos e aumento do estado inflamatório subclinico, pois os LPS são um fator
importante para o estimulo da imunidade inata, são produzidos no intestino devido a lise de
bactérias Gram negativas e podem desencadear processos inflamatórios e levar à obesidade
(Destacado no Esquema 1). Uma dieta com alto teor de gordura favorece o aumento de
bactérias Gram negativas, ocasionando um desbalanço microbiano, sendo assim, o tipo de
alimento, especialmente os com alto teor de gordura saturada pode ser um importante fator no
desenvolvimento de diabetes tipo 2, ou seja, aumento de risco à obesidade em função da
alteração da microbiota intestinal (BESTED; LOGAN; SELHUB, 2013; CANI et al., 2008).
Esquema1. Principais mecanismos envolvidos na relação entre microbiota intestinal e
doenças metabólicas. Em destaque o metabolismo de lipopolissacarídeos – LPS.
Fonte: Moraes et al., (2014) com adaptações da autora.
10
O equilíbrio intestinal favorecendo a microbiota benéfica por ingestão de
alimentos que contenham estes microrganismos adquirem especial atenção nas pesquisas
científicas quando o efeito destes pode ser observado sobre algumas patologias.
2.5 SÍNDROME METABÓLICA (SM)
A Síndrome metabólica (SM) pode ser definida como um grupo de fatores
de risco interrelacionados, de origem metabólica, que contribuem para o desenvolvimento de
doença cardiovascular e/ou diabetes do tipo 2 (PENALVA, 2008). São considerados como
fatores de risco metabólicos: dislipidemia aterogênica (hipertrigliceridemia, níveis elevados
de apolipoproteína B, partículas pequenas e densas de LDL-colesterol e níveis baixos de
HDL-colesterol), hipertensão arterial, hiperglicemia e um estado pró-inflamatório e pró-
trombótico (GRUNDY et al., 2005).
Existem muitas definições para a Síndrome Metabólica (OMS e IDF),
porém a definição do NCEP/ATP III (Adult Treatment Panel of the National Cholesterol
Education Program) é a mais amplamente usada, tanto na prática clínica como em estudos
epidemiológicos. Trata-se de um guideline com foco no risco cardiovascular, que não usa
como critério obrigatório a evidência de anormalidades na insulina ou na glicemia. Apesar
deste guia considerar a doença cardiovascular como desfecho primário da SM, muitos dos
portadores desta síndrome apresentam resistência à insulina, o que lhes confere um risco
aumentado para o desenvolvimento do diabetes do tipo 2 (NATIONAL CHOLESTEROL
EDUCATION PROGRAM, 2002).
Em 2005, a American Heart Association e o National Heart, Lung and
Blood Institute, revisaram os critérios para definição de SM e recomendaram que a obesidade
seja o alvo principal de tratamento. A perda de peso melhora o perfil lipídico, abaixa a
pressão arterial e a glicemia, além de melhorar a sensibilidade à insulina, reduzindo o risco de
doença aterosclerótica (GRUNDY et al., 2005).
A SM aumentou em proporções epidêmicas no mundo urbanizado
(CORNIER et al., 2008) e é alvo de muitos estudos. Ainda não se estabeleceu uma causa
única ou múltiplas causas para o desenvolvimento da SM, mas sabe-se que a obesidade
abdominal e a resistência à insulina parecem ter um papel fundamental na gênese desta
síndrome (PENALVA, 2008).
11
Dentre os efeitos estudados de microrganismos probióticos sobre o
organismo humano, a atividade sobre o sistema cardiocirculatório e as propriedades
imunomodulatórias adquirem especial atenção, se relacionadas a indivíduos portadores de
síndrome metabólica. Já que a síntese do colesterol ocorre principalmente no intestino.
Alguns estudos associaram a microbiota intestinal aos efeitos benéficos no metabolismo
lipídico, diminuindo os níveis do colesterol sanguíneo e aumentando a resistência da
lipoproteína de baixa densidade (LDL) à oxidação, levando a uma redução da pressão arterial
(GOEL et al., 2006).
2.5.1 Efeito de Microrganismos Probióticos Sobre o Sistema Cardiocirculatório
As doenças cardiovasculares representam grande problema para a saúde
pública, liderando o índice de mortalidade no Brasil e no mundo. De acordo com Barleta e
Braga (2007), o aumento da expectativa de vida de uma população está diretamente
relacionado à prevenção de doenças cardiovasculares (BARLETA; BRAGA, 2007). Deste
modo, a síntese de colesterol e a pressão arterial devem ser sempre observadas. Badaró et al.
(2008) reportaram que a hipercolesterolêmia está intimamente ligada às complicações de
doenças como infarto e aterosclerose. Níveis plasmáticos elevados de lipoproteína de baixa
densidade (LDL) são considerados um dos principais fatores de risco para o desenvolvimento
de doença aterosclerótica cardiovascular (ROSS; GLONSET, 1976; BARLETA; BRAGA,
2007).
Estudos demonstraram que probióticos têm efeito benéfico sobre algumas
desordens metabólicas como a hipertensão e hipercolesterolemia (LYE et al., 2009). Alguns
relatos demonstraram que o consumo de produtos contendo Lactobacillus e Bifidobacterium
podem reduzir o colesterol sérico em humanos e animais. O primeiro relato científico
relacionando bactérias láticas e diminuição do colesterol sérico foi feito em 1974 por Mann e
Spoerry (MAHAN; ESCOTT-STUMP, 1998). Dietschy, Teixeira e Sleiman (2001)
observaram redução de 18% do nível de colesterol sérico total em guerreiros de uma tribo
africana que incluíam na dieta, leite fermentado com uma cepa de Lactobacillus. Outros
autores reportaram experimentos com lactobacilos e/ou bifidobactérias e evidenciaram a
diminuição dos níveis de colesterol sérico total e de lipoproteína de baixa densidade (LDL),
além do aumento da lipoproteína de alta densidade (HDL) (LIONG; SHAH, 2004).
12
Os mecanismos propostos para estes efeitos são associados à assimilação do
colesterol durante a multiplicação bacteriana ou a ligação do colesterol à superfície da parede
celular destas bactérias, tornando indisponível a absorção através do intestino para a corrente
sanguínea (BRASHEARS; GILLILAND; BUCK, 1998; DILMI-BOURAS, 2006; GREANY
et al.,2008; HYEONG-JUN et al., 2004; LIONG; SHAH, 2004; MANZONI et al., 2008).
Além disso, há hipóteses relacionadas à capacidade de alguns
microrganismos probióticos em produzirem hidrolases, enzimas que desconjugam ácidos
biliares. Estes compostos quando desconjugados são reabsorvidos com menor eficiência
quando comparados aos ácidos biliares conjugados, resultando em aumento da sua excreção
nas fezes. Como o colesterol é precursor da síntese de ácidos biliares, à medida que aumenta a
demanda para síntese destes ácidos que devem ser repostos, ocorre redução das concentrações
plasmáticas de colesterol, ou ainda esta redução se daria devido a uma menor absorção, à
medida que há uma co-precipitação do colesterol juntamente com os ácidos biliares
desconjugados, que nesta forma, são menos eficientes na solubilização e absorção de lipídeos
provenientes da dieta (BEGLEY; HILL; GAHAN, 2006).
2.5.2 Efeitos de Microrganismos Probióticos no Sistema Imunomodulador
A microbiota intestinal natural representa um importante modulador da
homeostase intestinal. As interações desta microbiota com a mucosa epitelial e o tecido
linfóide estimulam o sistema imune no hospedeiro (SHI; WALKER, 2004). A alta capacidade
de aderêcia às células do epitélio intestinal demonstrada por Bifidobacterium lactis HN019
tem sido apontada como o fator chave para o efeitos imunomodulatórios desta linhagem
(GILL; PRASAD, 2008; GOPAL et al., 2001; LIU et al., 2010 ).
Os probióticos podem influenciar diretamente na resposta imunológica
induzindo a produção de citocinas anti-inflamatórias ou direcionando o aumento da produção
de IgA secretora. Além disso, a degradação de patógenos por enzimas de probióticos irá
reduzir a taxa de exposição a antígenos. Estes e outros mecanismos contribuem para reduzir a
quantidade de bactérias não benéficas que venham a chegar no trato gastrintestinal
(OWEHAND, 2007).
Além disso, são demonstrados efeitos de probióticos sobre algumas
desordens metabólicas, como a hipertensão e a hipercolesterolemia (LYE et al., 2009).
Linhagens probióticas têm sido promissoramente avaliadas no tratamento clínico relacionado
13
a algumas doenças cardiovasculares e inflamatórias, como colite aguda. Esses
microrganismos podem ser usados como ingredientes funcionais e, quando aliados a
estratégias corretas de rastreamento da linhagem ou dos seus efeitos, resultam em bons
estudos clínicos (SALMINEM; OWEHAND; ISOLAURI, 1998).
Em um sistema imunológico com condições fisiológicas normais,
encontram-se vários tipos de linhagens de células TH ou TCD4+ com função de secreção de
citocinas, responsáveis pela ativação da resposta imunológica. Atualmente, sabe-se que dois
subtipos de células, TH1 e TH2, participam na atividade global do sistema imunológico. As
células TH1 são responsáveis pela imunidade celular e atuam na secreção de citocinas pró-
inflamatórias, tais como a interleucina (IL) 2, o fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) e o
interferon-gama (IFN-γ). As células TH2 produzem IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13, regulando as
respostas imunitárias humorais, modulando a atividade das células TH1, e diminuindo a
inflamação local. Em geral, são associadas a resposta inflamatória excessiva, causando dano
tecidual como nas doenças autoimunes (TINOCO et al., 2007).
Citocinas produzidas pelas células TH1 reduzem a inflamação e estimulam
a tolerância a antígenos comuns (OWEHAND, 2007; SOUZA et al., 2009).
O efeito das interações entre microrganismos e o trato gastrointestinal é
observado em animais mantidos em ambientes isentos de contaminação e posteriormente
colonizados com probióticos. Imediatamente após a exposição aos microrganismos do lúmen,
o número de linfócitos intra-epiteliais aumenta muito. Os centros germinativos com células
produtoras de imunoglobulinas surgem rapidamente nos folículos e na lâmina própria, e as
concentrações de imunoglobulinas aumentam substancialmente no plasma (GUARNER;
MALAGELADA, 2003). Esse efeito também é relacionado à capacidade de microrganismos
probióticos interagirem com folículos linfóides intestinais (placas de Peyer), estimulando a
resposta imune das mucosas por ação das células B, produtoras de IgA, e a migração de
linfócitos ou células T do intestino, um dos principais responsáveis pela imunidade celular
(KWON et al., 2010).
Probióticos também favorecem a atividade fagocítica inespecífica dos
macrófagos alveolares, por ação sistêmica, devido à secreção de mediadores que estimulam o
sistema imuno modulador (CROSS, 2002).
A administração de probióticos ativa a produção de macrófagos que são
responsáveis pela fagocitose que desencadeia precocemente a resposta inflamatória, mesmo
14
antes da produção de anticorpos (ISOLAURI; OWEHAND; LAITINEN, 2001; KWON et al.,
2010).
A ação de probióticos sobre processos patológicos como a diarréia,
(principalmente causada por rotavírus e antibioticoterapia, processos alérgicos e a sua
influência na melhora da resposta imunológica em humanos é associada ao tecido linfóide,
isso eleva os níveis séricos de IgA secretora e a produção de macrófagos o suficiente para
prevenir infecções entéricas (ERICKSON; HUBBARD, 2000; ISOLAURI; OWEHAND;
LAITINEN, 2001; VANDERHOOF, 2001). Pessi et al. (2000) relataram a utilização de
Lactobacillus rhamnosus GG) no alívio dos sintomas de inflamações gastrointestinais e
dermatites atópicas por alergia a alimentos e associou este efeito ao estímulo de células IgA
secretoras e supressão do processo inflamatório (fator de necrose tumoral).
A interação do microrganismo probiótico com as células dendríticas é o
fator que promove a produção de citocinas, principais moléculas do complexo de histo-
compatibilidade principal para apresentação de antígenos, e moléculas co-estimulatórias que
polarizam células T em células T regulatórias e auxiliares tipo 1 e 2. Além disso, bactérias
probióticas podem atingir o tecido linfóide associado ao intestino atravessando células
intestinais chamadas células M, e interagir diretamente com as células dendríticas, modulando
a resposta imune (LEBEER; VANDERLEYDEN; KEERSMAECKER, 2010). A associação
do consumo de probiótico a incrementos do sistema imunomodulador têm sido suportado por
estudos clínicos, e há um consenso quanto ao equilíbrio da microbiota intestinal e estes efeitos
(GILL; PRASAD, 2008; ISOLAURI; OWEHAND; LAITINEN, 2001). Em contrapartida, o
desequílibrio desta interação é diretamente correlacionada à ocorrência de doenças (COSTA;
MIGLIORANZA, 2013). Neste cenário, a escolha do alvo de estudo, cujas características
sejam importantes à saúde pública e a escolha da forma de veiculação do componente a ser
ministrado são essenciais para suportar a obtençao de dados clínicos.
15
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22
3. ARTIGO 1 - PRODUÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE LEITE PROBIÓTICO
Luciana Jesus Bernini1, Cinthia H. Batista de Souza
1, , Gisele Nobre Costa*
1.
1 Universidade Norte do Paraná – UNOPAR – Mestrado em Ciência e Tecnologia de Leite e
Derivados, Rua Marselha, 591, Jardim Piza, 86041-140, Londrina, PR, Brasil.
* Corresponding author: Giselle Nobre Costa
E-mail: [email protected]
Tel.: +55 43 3371-7723
Fax: +55 43 3371-7834
Running headline: Leite Probiótico
23
RESUMO
Bifidobacterium lactis é uma bactéria probiótica, cujos efeitos benéficos à saúde do
hospedeiro têm sido muito bem documentada. Nesta investigação, B. lactis HN019 foi
utilizada para produzir um leite probiótico que foi caracterizado fisico-química e
microbiologicamente, conforme padrões da legislação Brasileira. O leite probiótico foi
produzido com 8% (P/V) de leite em pó desnatado, 6% (P/V) sacarose, esterilizado a
121ºC/15 min., resfriado à temperatura ambiente e adicionado de 10% (V/V) de inóculo
previamente ativado e cultivado a 42ºC/18 horas. pH, acidez e viabilidade (UFC/mL) do
probiótico no produto envasado foram observados durante 30 dias sob armazenamento
refrigerado (5ºC) para acompanhamento da vida de prateleira. O produto pronto para o
consumo apresentou alta contagem do microrganismo probiótico com 3,4 x 108
UFC/mL, teor
de acidez de 0.38%, pH 5.15, conteúdo proteico de 2.80%, carboidratos e extrato seco totais
com 7.54% e 12.08% respectivamente e, 0.48% de cinzas. Não foi detectada a presença de
coliformes totais e/ou termotolerantes, bem como bolores e leveduras. A contagem de B.
lactis variou de 8.5 a 10,4 ciclos logarítmicos, no início e final do armazenamento. Houve
aumento de um ciclo logarítmico na contagem de B. lactis aos 30 dias de armazenagem, e este
parâmetro culminou também na redução do pH e com um pequeno aumento de acidez no
produto. Embora esse dado não tenha apresentado diferença significativa no nível avaliado
(p 0,05), o sabor acético típico do metabolismo de bifidobactérias ao final de 30 dias de
armazenamento foi detectado. O produto atende aos parâmetros da legislação brasileira
vigente e pode ser considerado probiótico, contudo a baixa acidez não o caracteriza como leite
fermentado.
Palavras-chave: Bifidobacterium lactis. Vida de prateleira. Leite probiótico.
ABSTRACT
Bifidobacterium lactis is a probiotic bacteria whose beneficial health effects on the host have
been reported. In this investigation, B. lactis HN019 was used to produce a probiotic milk.
The product was physicochemical and microbiological characterized according the standards
of the Brazilian legislation. The probiotic milk was produced with 8% (w / v) skimmed milk
powder, 6% (w / v) sucrose, sterilized at 121 ° C / 15 min. Cooled to room temperature and
added with 10% (V/V) inoculum and grown at 42 ° C/18 hours. pH, acidity and viability
(CFU/mL) of the probiotic produced was observed for 30 days under refrigerated storage
(5°C) aiming to monitor of the shelf-life. The product ready for consumption showed high
counts of probiotic microorganism with 3.4x 108 CFU/mL, acidity 0.38%, pH 5.15, 2.80%
protein content, carbohydrates and total dry extract with 7.54% and 12.08% respectively and
0.48% ash. We did not detect the presence of total and/or fecal coliforms and yeasts and
molds. The B. lactis counts ranged from 8.5 to 10.4 log cycles at the beginning and end of
storage. There was an increase of one log cycle count of B. lactis after 30 days of storage, and
this parameter also resulted in lowering the pH and a small rise of acidity in the product.
Although these data showed no significant difference in the assessed level (p0.05), the acetic
flavor after 30 days of storage was detected. This is a typical occurrence of the bifidobacteria
metabolism. The product is in accordance with the parameters of the current Brazilian
legislation and can be considered probiotic, although the low acidity on the probiotic milk
does not characterize it as fermented milk.
Keywords: Bifidobacterium lactis. Shelf life. Probiotic milk.
24
INTRODUÇÃO
O interesse pelo tema probiótico, assim como pelos alimentos funcionais de
maneira geral, está diretamente relacionado à crescente valorização da qualidade de vida e da
prevenção de doenças. Atualmente muitos estudos ilustram a efetividade de ação de alguns
microrganismos probióticos na saúde do hospedeiro, dentre esses efeitos a capacidade de
influenciar direta ou indiretamente o sistema imunológico e ou prevenir doenças
cardiovasculares no hospedeiro são importantes alvos de investigações. O aumento do valor
nutritivo e terapêutico trazido pelas bifidobactérias gerou interesse no sentido de incorporação
destas em alimentos, sobretudo os alimentos infantis, os leites fermentados, outros produtos
lácteos e algumas preparações farmacêuticas (GOMES; MALCATA, 2002).
Para uso em alimentos, as linhagens devem ser selecionadas com base nos
processos tecnológicos, visto que as bactérias probióticas devem exibir resistência às etapas
da preparação do alimento (MORI et al., 1997).
Na produção de leites fermentados, o pH final ideal é de aproximadamente
4,7. Este pH deve ser alcançado em, no máximo 24 h para garantir a segurança
microbiológica do produto durante a estocagem e para evitar que o pH decresça a valores
muito baixos durante o armazenamento. De um modo geral, bifidobactérias não crescem
muito bem no leite, pois produzem pouco ácido, prolongando o tempo de fermentação e para
iniciar o crescimento, exigem um meio com baixo potencial de oxi-redução, além de fatores
de crescimento, portanto, estas bactérias são comumente associadas a culturas bioajustadoras
para produção de fermentados (FERREIRA, 2003; HELLER, 2001).
Há, contudo, relatos de casos de adaptação das bifidobactérias ao leite após
sucessivas transferências (HELLER, 2001).
Alguns autores questionam a viabilidade econômica de fermentar o leite
usando microrganismos probióticos sem culturas adjuntas, devido ao maior tempo de
fermentação ou à incapacidade de redução do pH do leite para 4,6. Além disso, a ocorrência
de sabor desagradável no produto final é comum quando se utiliza bifidobactérias (DAVE;
SHAH, 1997; THAMER; PENNA, 2006). Entretanto fórmulas infantis e outros formulados
comerciais ou para estudos clínicos têm sido desenvolvido com variadas espécies de
Bifidobacterium (CHIANG et al., 2000; DEKKER et al., 2009; LUGONJA et al., 2010;
SOUZA, 2011).
25
No Brasil, não há leites probióticos não fermentados (acidez inferior à 6%
ácido láctico) disponíveis no mercado, portanto, a legislação brasileira não preconiza
parâmetros para este tipo de produto, cujo teor de acidez seja inferior a 0,6% (ácido láctico),
já que a acidez característica dos lácteos fermentados ou cultivados é de 0,6 a 2% (BRASIL,
2000).
Os alimentos funcionais foram responsáveis por mais de 40% do mercado
mundial entre 2005 e 2010 (ÖZER; KIRMACI, 2010) e este mercado continua em expansão,
associado à valorização de alimentos versus qualidade de vida. Diante desta perspectiva, a
inserção de um leite probiótico de sabor suave, pouco acidificado, portanto, diferenciado do
que há disponível comercialmente, pode ser uma alternativa inovadora no mercado lácteo.
MATERIAL E MÉTODOS
Foi utilizada a linhagem comercial Bifido HOWARU®
- Bifidobacterium
lactis HN019® (Danisco, Cotia, Brasil- SP). O microrganismo liofilizado foi armazenado em
freezer a -18ºC e foi ativado em leite desnatado reconstituído (LDR) 10% (Molico®, Nestlé,
Araçatuba-SP), esterilizado a 121°C/15 minutos.
Leite Probiótico
Para produção do leite probiótico foram preparados uma base com LDR 8%
(P/V) (Molico®, Nestlé, Araçatuba-SP) e 6% (P/V) sacarose (União, São Paulo, SP) A mistura
foi esterilizada a 121ºC/15 min. e resfriado à temperatura ambiente. Foram previamente
preparados pré-inóculos com 0,25% (P/V) da cultura liofilizada de HN019® LDR 10% (V/V),
ativado durante 6 horas a 41ºC e, posteriormente utilizado para fermentação na proporção de
10% (V/V) para produção do leite probiótico (Esquema 1). Após 18 horas de cultivo, o leite
probiótico foi resfriado em câmara fria (5ºC), o coágulo foi quebrado e adicionado de aromas
idênticos aos naturais: 0,01 % (v/v) laranja (Duas Rodas Industrial, Jaraguá do Sul- SC).
Análises microbiológicas
26
O produto pronto para consumo foi avaliado microbiologicamente por
contagens de bolores e leveduras e determinação de coliformes a 35 e 45°C, conforme
determina a legislação vigente (BRASIL, 2001).
Foi determinada a viabilidade (UFC/mL) do probiótico no produto,
utilizando diluições seriadas em água peptonada tamponada 0,1 % (p/v) (Oxoid, Cambridge,
UK). Diluições de 10-1
a 10-8
plaqueamento em profundidade em ágar MRS LP (De Man
Rogosa e Sharpe) enriquecido com cloreto de lítio 2g/L e propionato de sódio 3g/L e
incubado a 37°C/72h em anaerobiose (LAPIERRE; UNDELAND; COX, 1992).
Paralelamente, para acompanhamento da vida de prateleira, o produto
envasado foi avaliado microbiologicamente nos tempos 01, 07,15, 21 e 30 dias de estocagem
a 5ºC. Todas as análises foram efetuadas em triplicata.
Esquema1 - Etapas de produção do leite probiótico
Fonte: Da autora.
27
Análises físico-químicas
O produto pronto para consumo foi avaliado físico-químicamente. Os
valores de pH foram determinados em potenciômetro digital (Tecnal, modelo Tec-5),
devidamente calibrados com soluções tampão de pH 7,0 e pH 4,0 (INSTITUTO ADOLFO
LUTZ, 2008).
A determinação da acidez total (% ácido lático) foi realizada medindo o teor
de ácido lático presente em 5 mL de amostra pela titulação com NaOH 0,1mol/L na presença
de fenolftaleína como indicador. O teor de cinzas, proteínas, carboidratos totais e extrato seco
total (EST), foram determinadas de acordo com as normas definidas pelo Instituto Adolfo
Lutz (2008). O teor de gordura determinado pelo método do butirômetro de Gerber.
Todas as análises foram efetuadas em triplicata.
Análise Estatística
Todos os resultados foram avaliados pelo teste de Hartley para verificar a
homogeneidade de variâncias seguidos da análise de variâncias (ANOVA) e as médias foram
comparadas entre si pelo teste de Tukey com nível de significância < 5% (p < 0,05), dado
pelo programa Statistica versão 6.0 (STATSOFT, 2001).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Caracterização do leite probiótico
Após testes preliminares as concentrações de ingredientes e tempo de
cultivo do B. lactis HN019 foi definido. Embora, o tempo de cultivo médio tenha sido de 18
horas, considerado longo do ponto de vista industrial, mesmo nestas condições não se obteve
acidificação suficiente para o produto ser considerado fermentado. O leite probiótico pronto
para o consumo apresentou pH de 5,2 e acidez titulável de 0,4 % (ácido láctico) em média.
Segundo Ferreira (2003), de um modo geral, as bifidobactérias não crescem muito bem no
leite; produzem pouco ácido, prolongando o tempo de fermentação. O tempo de fermentação
foi superior à produção de fermentados lácteos tradicionais, cujos processos ocorrem em
média de 3,5 a 6 h (DAVE; SHAH, 1997; THAMER; PENNA, 2006).
28
O pH do leite reconstituído foi em média 6,4; cujo pH foi reduzido para 5,2
no produto final, por ação do metabolismo de B. lactis HN019. O produto pronto para o
consumo apresentou características adequadas ao produto definido como Leite desnatado
adoçado probiótico, entretanto, o teor de ácido láctico não permite classificação como
fermentado, exigindo para tanto um teor de acidez entre 0,6 a 1,5% (BRASIL, 2000). Todos
os demais parâmetros (Tab. 1) se adéquam à legislação Brasileira e dos países do Mercosul
(BRASIL, 2000).
Tabela 1 - Características Físico-químicas e microbiológicas do leite probiótico pronto para o
consumo
Análises Valores
Log (UFC/mL) 8.53±0.11
pH 5.15±0.09
Acidez (%) 0.38±0.05
Proteínas (%) 2.80±0.09
Gordura (%) 0,0±0.00
Carboidratos (%) 7.54±0.05
EST (%) 12.08±0.15
Cinzas (%) 0.48±0.02
EST: Extrato seco total.
Os dados são médias de 3 repetições independentes do produto pronto para consumo após um dia de produção.
Fonte:Da autora.
A viabilidade de B. lactis foi de 2,72 x 1010
UFC/dose de 80 mL no produto
final. As concentrações de células das bifidobactérias mantiveram-se estáveis durante a
estocagem refrigerada (Tabela 2), não havendo variação durante o período de armazenamento
até de 21 dias. Aos 30 dias de armazenamento foi observado variação significativa da
contagem do probiótico, a contagem de células viáveis foi aumentado o que coincidiu com a
detecção de sabor acetificado perceptível ao paladar. Isso pode ser atribuído o metabolismo de
bifidobactérias que produzem ácido lático e ácido acético na proporção 2:3 (SAMONA;
ROBINSON; MARAKIS, 1996).
29
A alta viabilidade da cultura probiótica superior à determinada pela
legislação vigente (BRASIL, 2008), caracteriza o produto como probiótico.
Tabela 2 - pH, acidez do leite probiótico pronto para o consumo e viabilidade de B. lactis
HN019 ao longo de 30 dias estocado a 5°C
Tempo (dias)
Análises 1 7 14 21 30
Log UFC/mL 8.13±0.06a 8.33±0.06
a 8.30±0.05
a 8.29±0.01
a 9.20±0.04
b
pH 5.16±0.07a 5.07±0.09
a 5.23±0.04
a 5.21±0.01
b 4.3±0.30
b
Acidez (%) 0.38±0.02a 0.39±0.03
a 0.35±0.02
a 0.36±0.03
a 0.42±0.02
a
Os dados são médias de 3 repetições independentes
Médias numa linha seguidas pela mesma letra, não diferem estatisticamente entre si (p<0.05)
Fonte: Da autora.
O produto não apresentou coliformes totais e/ou fecais, bem como bolores e
leveduras, um indicativo de condições de manipulação e processamento adequados. Embora a
acidez apresentada no produto seja menor do que a prevista na legislação brasileira, todas as
demais características são adequadas às regulamentações técnicas vigentes.
A baixa acidez e sabor suave do leite probiótico o diferencia dos leites
fermentados disponíveis no mercado nacional, o que pode ser um atrativo para este produto.
30
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32
4 ARTIGO 2 - EFEITOS DE Bifidobacterium lactis HN019 NA MASSA CORPORAL,
METABOLISMO GLICÍDICO, LIPIDICO E MARCADORES INFLAMATÓRIOS
EM PACIENTES COM SINDROME METABÓLICA
Luciana Jesus Bernini1, Andrea Name Colado Simao
2, Cinthia H. Batista de Souza
1,Isaías
Dichi3, Gisele Nobre Costa
1.
1 Universidade Norte do Paraná – UNOPAR – Mestrado em Ciência e Tecnologia de Leite e
Derivados, Rua Marselha, 591, Jardim Piza, 86041-140, Londrina, PR, Brasil.
2 Departamento de Patologia, Análises Clínicas e Toxicologia da Universidade de Londrina,
Av. Robert Koch, 60 - Vila Operária, Londrina - PR, 86038-350, Londrina, PR, Brasil
3 Departamento de Clínica Médica da Universidade de Londrina, Av. Robert Koch, 60 - Vila
Operária, Londrina - PR, 86038-350, Londrina, PR, Brasil
* Corresponding author: Giselle Nobre Costa
E-mail: [email protected]
Tel.: +55 43 3371-7723
Fax: +55 43 3371-7834
Running headline: Efeito B. lactis
33
RESUMO
A síndrome metabólica (SM) tem sido motivo de grande interesse nos últimos anos, ela
agrupa uma série de fatores de riscos cardiovasculares, dentre outros fatores, estão a
deposição de gordura visceral e resistência à insulina. Do ponto de vista clínico é
recomendado o tratamento da obesidade, assim como o tratamento específico dos outros
fatores de risco associados. Sendo assim, a adoção de um plano alimentar saudável é
fundamental no tratamento da SM. Atualmente, estudos em humanos evidenciam efeitos
benéficos de microrganismos probióticos sobre a saúde humana e estes efeitos sobre a SM
têm sido abordados. Compreendendo a importância do tema o objetivo deste estudo foi
avaliar o efeito do consumo de um leite probiótico contendo Bifidobacterium lactis HN019
nos parâmetros clássicos da SM. Para avaliar estes efeitos, cinquenta e um indivíduos com
SM foram selecionados e divididos em dois grupos: grupo controle (n = 25) não tratado e
grupo tratado (n = 26) que consumiu o leite probiótico durante 45 dias. Os efeitos de B. lactis
foram avaliados em amostras sanguíneas dos voluntários nos tempos zero, 45 e 15 dias pós-
consumo. Após ingestão diária de 80 mL do leite probiótico com 2,72 x 1010
UFC/dose de B.
lactis HN019, o grupo probiótico apresentou redução significativa do índice de massa
corporal (p = 0,0166), colesterol total (p = 0,0092) e de lipoproteína de baixa densidade (P =
0,0081) em relação aos valores basais e em comparação com o grupo controle. Além disso,
houve diminuição significativa nas citocinas pró-inflamatórias TNF-( p = 0,0327) e IL-6(p = 0,0438). Em conclusão, estes dados mostraram potenciais efeitos do B. lactis HN019 na
redução da obesidade, lipídeos, bem como em alguns marcadores inflamatórios, o que pode
levar à diminuição dos fatores de risco cardiovasculares e de resistência à insulina em
pacientes com SM.
Palavra Chave: Doenças metabólicas. Efeito de probióticos. Imunomodulação. Obesidade.
ABSTRACT
The metabolic syndrome (MetS) has been of great interest in recent years, it brings together a
number of cardiovascular risk factors, among other factors, are the deposition of visceral fat
and insulin resistance. From a clinical standpoint is the recommended treatment of obesity, as
well as the specific treatment of other associated risk factors. Thus, the adoption of a healthy
diet is essential in the treatment of MetS. Currently, human studies show beneficial effects of
probiotic microorganisms on the parameters of the MetS. Understanding the importance of the
topic the aim of this study was to evaluate the effect of consumption probiotic milk containing
Bifidobacterium lactis HN019 in the classical parameters of the MetS. To assess these effects,
fifty one subjects with MetS were selected and divided into two groups: control group (n =
25) untreated and treated group (n = 26) who consumed the probiotic milk for 0, 45 days of
the consumtion of the probiotic milk and 15 days post-cosumption. The effects of B. lactis,
were assessed in blood samples of subjects. Following daily ingestion of 80 mL of probiotic
milk with 2.72 x 1010
CFU/ daily of B. lactis HN019, the probiotic group showed significant
reduction in body mass index (P = 0.0166), total cholesterol (P = 0, 0092) and low-density
lipoprotein (p = 0.0081) compared to baseline and compared with the control group.
Furthermore, a significant decrease in TNF- (p = 0.0327) and IL-6 (p = 0.0438) pro-
inflammatory cytokines. In conclusion, these data showed potential effects of B. lactis HN019
in reducing obesity, lipids as well as certain inflammatory markers, which may reduce
cardiovascular risk and insulin resistance in patients with MetS.
Keyword: Metabolic. Effectof probiotics. Immunomodulation. Obesity.
34
INTRODUÇÃO
A microbiota intestinal é cada vez mais associada às funções metabólicas de
proteção do organismo do hospedeiro (GUARNER; MALAGELADA, 2003; OWEHAND et
al., 2002). Atualmente, o estado de saúde geral de um indivíduo tem sido atribuído ao
equilíbrio ou a disbiose desta microbiota que é vista como um importante modulador da
homeostase intestinal. As interações desta microbiota com a mucosa epitelial e o tecido
linfóide, estimulam o sistema imunomodulador no hospedeiro (JANKOVIC et al., 2010; SHI;
WALKER, 2004). Além disso, a composição da microbiota do TGI vem sendo discutida e
considerada um importante fator na regulação do peso corporal e de doenças associadas à
obesidade (SANZ; SANTACRUZ; DALMAU, 2009).
A Síndrome Metabólica (SM) é descrita como um conjunto de desordens no
organismo, cujos fatores de risco metabólicos são a dislipidemia aterogênica (hiper-
trigliceridemia, níveis elevados de apolipoproteína B, partículas pequenas e densas de LDL-
colesterol e níveis baixos de HDL-colesterol), hipertensão arterial, hiperglicemia e um estado
pró-inflamatório e pró-trombótico (GRUNDY et al., 2005). A I Diretriz Brasileira de
Diagnóstico e Tratamento da Síndrome Metabólica acompanha as definições propostas pelo
Adult Treatment Panel of the National Cholesterol Education Program-NCEP/ATP III
(GRUNDY et al., 2004; NATIONAL CHOLESTEROL EDUCATION PROGRAM, 2002).
que caracteriza a SM como a combinação de pelo menos três componentes desses listados
anteriormente. As Pessoas portadoras da SM têm alto risco de desenvolver diabetes tipo 2 e
doença cardiovascular aterosclerótica (CORNIER et al., 2008).
A obesidade é uma das doenças que mais crescem no mundo (PISTELLI;
COSTA, 2010). Neste contexto, é considerada um problema de saúde pública, devido ao
aumento rápido da prevalência e sua alta correlação com doenças como síndrome metabólica,
diabetes e doenças cardiovasculares (MILLION et al., 2013; SANZ; SANTACRUZ;
DALMAU, 2009; SANTA CRUZ et al., 2010).
Há vários fatores genéticos e ambientais, tais como dieta, comportamento
cultural e status sócio-econômico, que influênciam a ocorrência de obesidade (SANTA CRUZ
et al., 2010). Além disso, a composição da microbiota do TGI tem sido fortemente associada
àobesidade (MILLION et al., 2013; SANZ; SANTACRUZ; DALMAU, 2009). A adoção de
uma dieta saudável é fundamental no tratamento da síndrome metabólica e segundo Pistelli e
Costa (2010), o desenvolvimento da obesidade nos seres humanos pode ser influenciado pelas
35
proporções relativas de alguns filos principais de bactérias da microbiota intestinal,
Bacteroidetes, Firmicutes e Actinobacterias, sugerindo que a atividade metabólica destes
microbióticos intestinais facilita a extração e/ou a estocagem das calorias ingeridas.Por outro
lado, o desequilíbrio neste ecossistema pode levar não só a obesidade, mas também ao
desenvolvimento da resistência à insulina (MILLION et al., 2013; SANZ; SANTACRUZ;
DALMAU, 2009; SANTA CRUZ et al., 2010).
Atualmente o TGI deixou de ser visto apenas como um tubo digestivo para
ser reconhecido como o principal alvo de respostas imunes, adicionalmente, a associação do
consumo de probiótico a incrementos do sistema imunomodulador têm sido bem suportado
por estudos clínicos (OWEHAND, 2007; PESSI et al., 2000) e há um consenso quanto ao
equilíbrio da microbiota intestinal e estes efeitos. Em contrapartida o desequílibrio desta
interação é diretamente correlacionada à ocorrência de doenças (COSTA; MIGLIORANZA,
2013).
A utilização de bifidobactérias relacionadas à incrementos no sistema
imunomodulador humano, inibição de bactérias patogênicas, alterações benéficas no balanço
microbiano de adultos e idosos são relatados (AHMED et al., 2007; GOPAL; PRASAD; GIL,
2003; SANDERS, 2006). A interação entre probióticos e enterócitostem sido descrito como
fator chave da imunomodulação e a alta capacidade de adesão de B. lactis HN019 pode ser
um dos fatores que associam seus efeitos benéficos no sistema imune(GOPAL et al., 2001).
Desta forma, o objetivo deste estudo foi avaliar a influência de um leite
probiótico com B. lactis HN019 nos parâmetros relacionados com a SM bem como fatores
relacionados a risco de doenças cardiovasculares.
MATERIAL E MÉTODOS
Seleção do grupo teste
O projeto de pesquisa foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa com
Seres Humanos da Universidade Estadual de Londrina sob protocolo Nº 185/2013.
Os voluntários à pesquisa foram selecionados na cidade de Jataizinho,
Paraná. Foram convocados indivíduos portadores de Síndrome Metabólica (SM) de acordo
com os critérios propostos pelo NCEP/ATP III. (NATIONAL CHOLESTEROL
EDUCATION PROGRAM, 2002). Foram excluídos pacientes com doenças crônicas ou
36
indivíduos com uso de medicamentos que interfiram no perfil lipídico e/ou glicêmico,
antibióticos e anti-inflamatórios, vitaminas e suplementos alimentares e alimentos nos quais
contenham microrganismos probióticos. Após a avaliação, 51 indivíduos foram selecionados
para integrar o grupo clinico em avaliação. O grupo selecionado foi orientado a não modificar
seus hábitos alimentares e/ou atividades físicas durante a vigência do estudo.
Indivíduos e delineamento do estudo
O estudo teve um tempo de duração de 60 dias (Esquema 1). Os voluntários
foram divididos em dois grupos distintos. Grupo controle com 25 indivíduos (G1) que não
receberam tratamento e grupo tratado com 26 indivíduos que ingeriram, diariamente durante
45dias, 80 mL de leite probiótico com contagem (UFC/mL) não inferior a 2,72x1010
UFC/dose
de Bifidobacterium lactis HN019. Durante o tratamento foram coletadas amostras de sangue
aos 0 e 45 dias de tratamento, além de 15 dias pós- tratamento para avaliação dos efeitos do
probiótico.
Esquema 1 - Delineamento do estudo composto por 51 indivíduos voluntários e respectivos
tempos de coleta de amostras sanguíneas para o grupo controle (não tratado) e grupo
probiótico (tratado).
Fonte: Da autora.
Análises laboratoriais
Coleta e preparo das amostras sanguíneas
As amostras de sangue,controle de peso, pressão arteriale circunferência
abdominal foram obtidas nos tempos previamente determinados (Esquema 1), após 12 horas
de jejum, no posto de saúde Central da cidade de Jataizinho-PR. A coleta foi efetuada pela
equipe de saúde e bem estar social da cidade de Jataizinho com acompanhamento da
37
Farmacêutica/Bioquímica Luciana Jesus Bernini, discente do programa de mestrado em
Ciência e Tecnologia do Leite e Derivados da Unopar.
As amostras coletadas em cada período proposto, foram conduzidas ao
Laboratório de Imunologia Clínica do Hospital Universitário de Londrina para análises. O
plasma e soro foram aliquotados e armazenados em freezer a - 70ºC (Indrel) até a realização
das dosagens de citocinas. Para as demais análises as amostras seguiram o fluxo normal de
realização de exames no referido laboratório.
Parâmetros bioquímicos, imunológicos e hematológicos
O perfil lipídico e glicêmico foi obtido por análises de colesterol total e
frações, triacilglicerol, ácido úrico, - glutamil transferase (GGT), alanino amino transferase
(ALT), aspartato amino transferase (AST), glicose, proteínas totais e frações, efetuadas em
um auto-analisador bioquímico (Dade AR), utilizando-se kits Dade Behring
( Illinois, USA).
Dosagem de CD45, CD3, CD4 e CD8
Foi realizada a contagem por citometria de fluxo de leucócitos totais
(CD45), linfócitos totais (CD3), e a subpopulações de linfócitos auxiliares T CD4+ e
CD8+,utilizando citômetro de fluxo FACS Calibur (BD – Bioscience)
Dosagem de citocinas
As dosagens das citocinas, IL-1, IL-6 e TNF- foram realizadas por enzima
imunoensaio (ELISA), utilizando kit da R&D System.
Análise estatística
As análises estatísticas foram avaliadas utilizando o teste Wilcoxon para
verificar mudanças na linha de base (mudanças intra-grupos). O teste de Dunn (post-hoc) para
observar as diferenças entre os tratamentos (p<0,05). Os dados foram apresentados como
médias Todas as análises foram realizadas utilizando o programa estatístico GraphPadPrism
versão 4.0.
38
RESULTADO E DISCUSSÃO
O leite probiótico foi produzido e caracterizado no Laboratório do Mestrado
em Ciência e Tecnologia do Leite e Derivados, Jardim Piza. O produto pronto para o consumo
apresentou alta contagem do microrganismo probiótico com 3,4 x 108 UFC/mL, teor de acidez
de 0.38%, pH 5.15, conteúdo proteico de 2.80%, carboidratos e extrato seco totais com 7.54%
e 12.08% respectivamente e, 0.48% de cinzas. Não foi detectada microrganismos patogênicos,
conforme preconiza a legislação (BRASIL, 2001), portanto, o produto se caracteriza como
adequado para consumo. Após análises de rotina um lote com 7 frascos de 80 mL foi
distribuído a cada voluntário semanalmente até completarem 45 dias de ingestão.
Durante o período proposto para o estudo, apenas um dos voluntários do
grupo tratado deixou de participar do grupo, alegando efeitos típicos de intolerância à lactose.
Embora o questionário de recrutamento excluísse indivíduos com esta característica.
Neste período de avaliação não houve diferença significativa intra-grupos
ou inter-grupos para as medidas de circunferência abdominal, nos níveis de pressão arterial
sistólica, diastólica, níveis de triglicerídeos, HDL colesterol, glicose, insulina, bem como no
HOMA (Homeostatic Model Assessment) (Tabela 2). Entretanto, o IMC, colesterol total e
LDL colesterol apresentaram diferenças significativas (p<0,05) tanto intra quanto inter-grupos
se comparando ao grupo controle (não tratado). Esses dados são bastante importantes, pois
associam o efeito de B. lactis HN019 ao metabolismo lipídico do hospedeiro.
Alguns estudos associam filos e até especies da microbiota intestinal à
tendencia a obesidade ou perda de peso em humanos. Nestes estudos a presença de altos
níveis de bifidobacterias no trato gastrointestinal (TGI) é relacionada à perda de peso (LEY et
al., 2005; MILLION et al., 2013; SANTACRUZ et al., 2010). Embora neste estudo não
ocorra caracterização da microbiota fecal, a ingestão diária de alta contagem do
microrganismo B. lactis como microbiótoca alóctone, pode influenciar positivamente no
balanço microbiano (ISOLAURI; SALMINEN; OWEHAND, 2004; SAARELA, et al., 2000)
culminando na melhora do metabolismo lipidico bem como na perda de peso.
39
Tabela 2- Dados antropométricos, pressão sanguínea e parâmetros laboratoriais do grupo
controle e grupo tratado que consumiram leite probiótico durante 45 dias. Parâmetros Controles (n=25) Probiótico (n=26)
T0 T45 P T0 T45 p
IMC (kg/m2) * #
35.8
(33.4-44.5)
35.5
(32.2-40.7)
0.9658 30.8
(27.2-33.7)
29.5
(25.9-33.3)
0.0166
CA (cm) 107.0
(101.0-128.0)
109.0
(99.5-124.5)
0.0840 105.0
(98.5-112.5)
107.0
(98.5-115.0)
0.2077
PAS (mmHg) 125.0
(112.8-139.0)
121.0
(110.0-131.0)
0.1349 130.0
(120.0-150.0)
140.0
(127.5-150.0)
0.9739
PAD (mmHg) 77.5
(70.0-90.0)
72.5
(63.5-82.3)
0.1906 80.0
(80.0-97.5)
90.0
(80.0-100.0)
0.8422
Triacilglicerol
(mg/dL)
199.0
(103.3-251.3)
168.5
(113.5-221.3)
0.5971 163.0
(128.0-314.5)
174.0
(124.0-296.0)
0.8077
Colesterol
(mg/dL) # *
199.0
(166.5-208.5)
205.0
(173.0-220.5)
0.5056 209.0
(183.8-249.8)
194.0
(168.0-251.0)
0.0092
HDL (mg/dL) * 42,0
(35.0-47.5)
39.0
(35.5-47.0)
0.6165 40.5
(30.0-49.5)
38.5
(31.3-46.0)
0.8196
LDL (mg/dL) *# 117.0
(83.0-142.0)
115.0
(95.0-146.0)
0.8195 128.5
(103.0-152.8)
111.0
(93.6-134.6)
0.0081
Glicose (mg/dL) 98.0
(94.0-115.5)
99.0
(91.0-113.0)
1.0000 94.0
(82.5-115.5)
97.0
(88.3-124.3)
0.4236
Insulina (uU/mL) 13.90
(9.93-17.78)
13.65
(9.46-21.78)
0.1065 13.4
(8.18-17.3)
15.3
(10.2-17.4)
0.1711
HOMA 3.63
(2.09-4.44)
3.23
(2.33-5.55)
0.1194 3.43
(2.29-4.77)
4.09
(3.37-5.87)
0.1961
Teste de Wilcoxonem pares para verificar alterações da linha de base (variaçõesintra-grupo). Teste de Mann-
Whitney para comparar as diferenças entre as linhas de base e entre os grupos de tratamento (alterações inter-
grupo). Os dados são apresentados como média (25% -75%). CA: Circunferência abdominal; PAS: pressão
arterial sistólica; PAD: pressão arterial diastólica. *Diferenças entre grupos controle (linha de base) p <0,05.
#
Diferença entre os grupos de tratamento (p <0,05).
Fonte: Da autora.
A redução do colestrol total e lipoproteína de baixa densidade (LDL) no
grupo probiótico, corrobora com alguns dados da literatura (DIETSCHY; TEIXEIRA;
SLEIMAN, 2001; LIONG; SHAH, 2004). Embora, o primeiro relato científico relacionando à
diminuição do colesterol sérico tenha sido reportado em 1974 (MAHAN; ESCOTT-STUMP,
1998) outros estudos têm focado nesta abordagem.
Os mecanismos propostos para estes efeitos são associados a assimilação do
40
colesterol durante a multiplicação bacteriana ou a ligação do colesterol à superfície da parede
celular destas bactérias, tornando indisponível a absorção através do intestino para a corrente
sanguínea (BRASHEARS; GILLILAND; BUCK, 1998; DILMI-BOURAS, 2006; GREANY
et al.,2008; HYEONG-JUN; KIM; LEE, 2004; LIONG; SHAH, 2004; MANZONI et al.,
2008). Há também mecanismos relacionados à capacidade de alguns microrganismos
probióticos em produzir hidrolases que desconjugam ácidos biliares. Estes compostos quando
desconjugados são reabsorvidos com menor eficiência resultando em aumento da sua
excreção nas fezes. Como o colesterol é precursor da síntese de ácidos biliares, à medida que
aumenta a demanda para síntese destes ácidos que devem ser repostos, ocorre redução das
concentrações plasmáticas de colesterol. Outra hipótese associa a redução do colesterol
plasmático a uma menor absorção de lipídeos devido à co-precipitação do colesterol
juntamente com os ácidos biliares desconjugados, menos eficientes na solubilização e
absorção de lipídeos provenientes da dieta (BEGLEY; HILL; GAHAN, 2006).
O consumo de probióticos tem sido associado ao aumento da concentração
de ácidos graxos de cadeia curta (AGCC) que melhoram o metabolismo dos lipídios, agindo
diretamente no fígado e inibindo a lipogênese (ZHAO; YANG, 2005).
No estudo de Diamant, Blaak e Vos (2010), os autores sugerem que a
atividade metabólica intestinal facilita a extração e estocagem de calorias ingeridas e
associam a ocorrência de respostas inflamatórias à dietas ricas em gorduras que atuariam
como gatilho desencadeando este processo. Lipopolissarídeos bacterianos derivados de
microrganismos intestinais podem atuar neste processo desencadeando resposta inflamatória e
consequentemente síndrome metabólica.
As citocinas TNF- e IL6, mediadores da imunidade inata, diminuíram
(p<0,05) com 45 dias de ingestão do probiótico (Figuras 1A e B). Estas citocinas são
comumente relacionadas a reações inflamatórias.
Dentre as principais citocinas relacionadas à obesidade, as adipocinas:
adiponectina, o TNF-α e a IL-6 vêm sendo largamente estudadas. O acúmulo de tecido
adiposo causado pela obesidade acarreta um aumento da produção destas adipocinas, que ao
estimular a produção de proteínas de fase aguda pelo fígado, conduzem a um estado
inflamatório subclínico, associado ao surgimento das comorbidades presentes na obesidade
como resistência à insulina (ORTIZ, 2007). Portanto, a redução dos níveis de TNF-α e IL-6
(Figuras 1 A e B), podem ser diretamente relacionadas à redução do IMC no grupo tratado
durante 45 dias de consumo do probiótico B. lactis HN019.
41
Figura1 - Concentração das citocinas Fator de necrose tumoral alfa (TNF-) e interleucina-6
(IL-6) no grupo controle e grupo probiótico avaliados nos tempos zero e 45 dias de
ingestão do probiótico.
A B Fonte: Da autora.
Em um sistema imunológico com condições fisiológicas normais,
encontram-se vários tipos de linhagens de células T com função de secreção de citocinas,
responsáveis pela ativação da resposta imunológica. Os dados de quantificação de CD3, CD4
e CD8 não apresentaram diferença significativa no nível avaliado em 45 dias de uso do leite
probiótico, embora CD4 e CD8 se mostrem aumentados com relação à linha de base (Figura
2).
Figura 2 - Dosagens dos linfócitos T (CD3, CD4 e CD8), associados à imunidade celular, nos
tempos 0 e 45 dias de tratamento no grupo probiótico.
CONT T
0
CONT T
45
PROB T
0
PROB T
45
0
1
2
3
4
5
p=0.0327
TN
F-a
lph
a (
pg
/mL
)
CO
NT T
0
CO
NT T
45
PRO
B T
0
PRO
B T
45
0
5
10
15
20
p=0.0438
IL-6
(p
g/m
L)
TO T
45
0
500
1000
1500
2000
CD
4 (
uL
)
TOT45
0
200
400
600
800
CD
8 (
uL
)
Fonte: Da autora
TO T
45
0
500
1000
1500
2000
2500
CD
3 (
uL
)
42
Os nosso dados evidenciam que o consumo regular de B. lactis HN019, pode ser
favorável à redução dos parâmentros característicos da SM e obesidade.
Estudos têm mostrado efeitos positivos do uso de probióticos nas desordens
metabólicas e regulação do peso corpóreo, Neste contexto, a relação entre microbiota,
obesidade, diabetes e SM são cada vez mais evidentes, entretanto, ainda existem muitos
efeitos e mecanismos a serem esclarecidos.
O principal desafio, atualmente, está em identificar bactérias benéficas que
ajudem no controle da obesidade e desordens metabólicas relacionadas.
43
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5 CONCLUSÕES GERAIS E PERSPECTIVAS
Neste estudo, a formulação de um leite probiótico e introdução deste
produto na dieta de um grupo clinico cujos indivíduos são portadores de SM, possibilitou a
avaliação de alguns efeitos do probiótico na população em estudo.
O leite contendo B. lactis HN019, foi caracterizado como probiótico
devido à alta viabilidade, 3,4 x 108 UFC/mL, da linhagem no produto pronto
para consumo e durante 30 dias de estocagem refrigerada;
O leite probiótico não apresentou crescimento de microrganismos
potencialmente patogênicos ou deteriorantes, como bolores e leveduras,
portanto, se mostrou seguro para consumo humano, nas condições
estabelecidas;
Do ponto de vista físico- químico o produto se adéqua como um leite
desnatado adoçado, probiótico, entretanto a legislação Brasileira não
preconiza padrões de identidade para este tipo de produto com acidez
inferior à 0,6% de ácido láctico;
Quanto aos efeitos do probiótico na população em estudo:
Foi observado o efeito de B. lactis HN019 na redução da massa
corporal no grupo tratado após 45 dias de consumo;
Ocorreu redução nos níveis de colesterol total e LDL colesterol no
grupo tratado, indicando o potencial do produto no controle de desordens
metabólicas como a SM;
A redução nos índices de TNF- e IL6 podem ser relacionadas à
redução do IMC no grupo tratado durante 45 dias de consumo do probiótico
B. lactis HN019.
Até o momento os nossos dados, sugerem que intervenções clínicas como o
uso de algumas linhagens probióticas, podem alterar positivamente a saúde da população em
estudo e ilustram a importância da compreensão destes efeitos na evolução da SM.
O principal desafio, atualmente, está em identificar bactérias benéficas que
ajudem no controle da obesidade e desordens metabólicas relacionadas. Os resultados obtidos
nesse estudo mostram que o consumo regular de B. lactis HN019, pode ser favorável à
redução de alguns parâmentros característicos da SM e obesidade.