Bijzondere integratie-manipulatiemogelijkheden
Homologe recombinatie : recA-afhankelijk (zie Deel 3 : klonering in bacteriën)
Lysogene faag integratie-systemen : (vereisen extra proteïnen)
E. coli (Int)
Pseudomonas CTX (Vibrio cholerae) (cytotoxin)
Faag P1 : Cre-lox systeem Cre recombinase (Cyclisation recombinase)
lox (locus of cross-over(x))
S. cerevisiae : Flp-FRT systeem Flp recombinase of "flippase"
van het 2-mu plasmide
(Cre en Flp werken zonder accessory proteïnen)
Circulair DNA : insertieLineaire DNA's : omwisseling van DNA segmenten
Doelwit : loxP en FRT
34-bp box : 13-bp inverted repeats + 8-bp ertussen
Homologe DNA sequenties op eenzelfde DNA molecule
Directe herhaling Omgekeerde herhaling
=> excisie van tussenliggende sequentie => omkering van tussenliggende sequentie
Resultaat van recombinatie met doelwitten op verschillende DNA-moleculen
Insertie van circulair molecule Uitwisseling tussen lineaire moleculen
Integratie van faag DNA in het E. coli chromosoom
de uiterste gedeelten van attP en attB zijn sterk verschillend het binnenste gedeelte (15 bp) waar de recombinatie gebeurt, is nagenoeg identisch
de combinatie van P + B' en P' + B vormen attL en attR in de profaag.
Integratie in bvb. Pseudomonas aeruginosa
attB
attP
attRattL
P : phageB : bacterieelL : linksR : rechts
XerC en XerD : twee chromosoom-gecodeerde recombinasen, die normaal chromosoomdimeren bij de dif recombinatieplaats resolveren.
De CTX integratieplaats overlapt met dif. De faag codeert geen eigen integrase. De bacteriële XerCD recombinasen blijken de faaggenomen te kunnenintegreren in dif-gelijkende plaatsen in diverse bacteriële species.
(nb. resolutie van ColE1 multimeren tot monomeren gebeurt bij de cer locus met het E. coli XecC. )
Chromosomale lokalisatie voor transcriptieanalyse
• Transfer van E. coli naar P. aeruginosa (een niet-replicatief plasmide (pMB1 afgeleid)) integrase actief – insertie ter hoogte van attB plaats gekloneerd gen geïnsereerd in neutrale plaats Flp recombinase doelwitsequenties (FRT, Flp ‘recombinase target sites’)
voor in vivo verwijdering van plasmidesequenties – in aanwezigheid van Flp recombinase
Chromosomale lokalisatie voor transcriptieanalyse
- Integratie van niet-replicatief plasmide selectiedruk vereist (zie eerder) (TcR)- Integratie van genfusie op een neutrale plaats
Voorbeelden: Integratieve vectoren voor P. aeruginosa- pMB1-afgeleide ori- tetracycline-resistentiemerker- oriT voor conjugatieve overdracht (van E. coli naar P. aeruginosa)- att (“attachment sites”) voor P. aeruginosa faag CTX - faag CTX integrase (int gen op vector)- MCS, geflankeerd door faag T4 transcriptieterminatiesequenties ()
- Flp recombinase doelwitsequenties (FRT, = Flp recombinase target sites)voor in vivo verwijdering van plasmidesequenties – in aanwezigheid
van Flp recombinase
Nut ?- Functieanalyse expressiestudies door eiwitten te fusioneren aan
reportereiwitten zoals -galactosidase, luciferase
- Op plasmide = geen natuurlijke situatie : daarom overdragen naar chromosoom
Chromosomale lokalisatie voor transcriptieanalyse
De FRT herkenningssequentie voor Flp recombinasen
consensus sequenties (a, b, c) : omgekeerde herhaling (a, b) waartussen hetrecombinatie doelwit ligt (8 bp). (c is niet-essentieel)
Analoog voor loxP, de herkenningssequentie van het Cre recombinase(heeft niet het c gedeelte) (FIG 15.7)
Klonering van PCR-product door in vitro recombinatie
Sequentie van loxP plaats ; excisie of inversie naargelang 2 loxP plaatsen in directe of omgekeerde herhaling staan
nb. Cre-lox werkt efficientst voor excisie ; integratie vereist bijzondere interventies.
"Recombineering"
(bvb. de Gateway vectoren)
NB. gebruik van SceI voor excisie.