Biogenèse de latélomérase chez l’humain.
Christian Trahan
Centre BioMed, Département des
sciences biologiques, UQÀM.
Aplasie de la moelle osseuse (86%)Aplasie de la moelle osseuse (86%)
Pathologie qui affecte principalement les tissus à haut renouvellement
diagnostique difficile en raison des désordres variés:
Hyperpigmentation de la peau (89%)
Dysplasie des ongles (88%)
Leucoplasies des muqueuses (78%)
Pathologies pulmonaires (20%)
Perte prématurée des cheveux (16%)
Tendance à la malignité (10%)
Ostéoporose (10%)
Dyskératose congénitale (DC)
Dyskératose congénitale (DC)
Petite stature /retard de développement Microcéphalie
Épiphora
Hypoplasie cérébellaireNécrose avasculaire des articulations
Problèmes gastroentériqueDéficiences immunologique
Perte prématurée des dentsAutres désordres:
autres…
Des mutations dans 6 gènes sont responsables de la moitié des cas répertoriés au DCR (Londres).
Ces gènes ont en commun une fonction dans la biologie des télomères.
Autres désordres:
Gènes reliés à la DC
TIN2 (AD)– composante du complexe shelterin qui protège et régule les télomères.
hTERT (AD-AR)– transcriptase inverse de la télomérase.
hTR (AD)– RNA de la télomérase.
Dyskérine (XR)NOP10 (AR)NHP2 (AR)
protéines communes à la télomérase, ainsi qu’aux petits RNA H/ACA (snoRNA/scaRNA).
La DC est donc principalement considérée comme un défaut dans la biologie des télomères.
Les sujets atteints de DC ont des télomères critiquement courts.
[TTAGGG]n
[AATCCC]n
2-30 kpb50-300 b
3’5’
[TTAGGG]n
[AATCCC]n
T-loop
D-loop5’
3’
Problème de réplication des extrémités chromosomiques
fourche de réplication 3’
5’
synthèse dubrin avancé
3’5’
Synthèse dubrin retardé
3’5’
5’3’
3’5’
Extension et dégradationdes amorces
Télomères et problème de réplication
DNA télomérique
Transcriptase inverse (hTERT)
ARN (hTR)
3’
5’
CAAUCCCAAUC
Transcriptase inverse (hTERT)
ARN (hTR)
3’
5’
CAAUCCCAAUC
50-300 b
GGTTAGGGTTAGGGTTAGnGGTTAG
Extension des télomères par la télomérase
Structure secondaire de hTR et mutations causant la DC.
rRNA (ribosome) snRNA (spliceosome)
ψ ψ
snoRNA scaRNA
GAR1
GAR1
NAF1
Nucléole ou Corps de Cajal
Noyau
Site de transcription des ARN H/ACA
Modèle de la biogénèse des RNA H/ACA in vivo.
Cytoplasme
dyskérine
NAF1
NOP10
NHP2
Pré-RNP
RNP active
Problématique et hypothèses
Problématique
Peu ou pas d’étude sur l’assemblage de complexes H/ACA en relations aux:
Hypothèses
• mutations reliées à la DC dans le domaine H/ACA de hTR.
2. Des mutations dans dyskérine, NOP10 et NHP2 peuvent affecterl’assemblage de d’autres pré-RNP en plus de l’assemblageprécoce de la télomérase.
• mutations dans les protéines dyskérine, NOP10 et NHP2.
Les mutations dans dyskérine, NOP10 et NHP2 pourraient-elles affecter d’autres RNP en plus d’affecter la télomérase?
1. Des mutations dans le domaine H/ACA de hTR interfèrentavec l’assemblage de ce domaine en pré-RNP.
1er volet
Christian Trahan and François Dragon, 2009. Dyskeratosis congenita mutations in the H/ACA domain of human telomerase RNA affect its assembly into a pre-RNP. RNA 15 :235-243
Des mutations reliées à la DC dans le domaine H/ACA de hTR affecte son assemblage en pré-RNP.
Domaine H/ACA de hTR et ses dérivés utilisés.
NAF1
dyskérine
NOP10NHP2
Inv 4
13-416
C408G
Méthodologie; Reconstitution et analyse de complexes H/ACA in vitro.
Transcription/traductionin vitro (35S-méthionine)
NAF1DyskérineFibrillarine CTRL-NHP2NOP10
IP dyskérine ou NAF1
Gel d’acrylamideBis-Tris 4-12%
fixation, séchage sur papier à chromatographie et analyse sur un Molecular Imager FX.
Analyse des RNA sur Molecular Imager FX
35Stransparent
Analyse surnageantsGel d’acrylamide urée
Gel d’acrylamideBis-Tris 4-12%
Transcription in vitro (32P-CTP)
hTR204 hTR204 mutésU3 RNA CTRL-
Purification sur gel
IP dyskérine ou NAF1
Le tétramère NAF1-dyskérine-NOP10-NHP2 s’assemble correctement.
NAF1
dyskérine
NOP10NHP2
T IP T IP T IP T IP T IP
- NAF
1
- NHP2
- NOP1
0
- dys
k.
Tout
es
IP dyskérine
NAF1dyskérine
NOP10
NHP2
fibrillarine
Le tétramère lie spécifiquement le domaine H/ACA de hTR.
NAF1
dyskérine
NOP10NHP2
T IP T IP T IP T IP
hTR204
- dys
k.
- dys
k.
Tout
es
Tout
es
RN
A
NAF1dyskérine
NOP10
NHP2
fibrillarine
hTR204 IP
IP dyskérine
RN
A
T IP T IP T IP T IP RN
A
RN
A
- NAF
1
- NAF
1
Tout
es
Tout
es
hTR204 U3
IP NAF1
hTR204 sng
U3
dyskérine-NOP10-NHP2; un minimum requis pour lier hTR204.
NAF1
dyskérine
NOP10NHP2
IP dyskérine
T IP T IP T IP T IP T IP T IP T IP
- NAF
1
- NHP2
- NOP1
0- N
AF1,
NOP1
0- N
AF1,
NHP2
- dys
k.
NAF1dyskérine
NOP10
NHP2To
utes
hTR204 IP
hTR204 sng
NAF1 requiert la présence du trimère pour s’associer à hTR204.
NAF1
dyskérine
NOP10NHP2
T IP T IP T IP T IP T IP T IP T IP
- dys
k., N
OP1
0-d
ysk.
, NOP1
0,
- N
HP2
- NAF
1- d
ysk.
- NOP1
0- N
HP2
Tout
es
IP NAF1
NAF1dyskérine
NOP10
NHP2
hTR204 IP
hTR204 sng
NAF1 requiert la présence du trimère pour s’associer aux RNA H/ACA.
NAF1
dyskérine
NOP10NHP2
IP NAF1
IP NAF1
inv413-416
Les boîtes H et ACA dans hTR sont essentielles à la formation de pré-RNP.
Les mutations C408G et ∆378-451 empêchent la formation de RNP.
IP NAF1
Conclusions
Notre système de reconstitution in vitro est spécifique et récapitule l’assemblage précoce du domaine H/ACA de hTR tel que rapporté in vivo. Ce système nous a permis d’analyser l’effet de mutations dans ce domaine sur l’assemblage de la pré-RNP.
Contrairement à la boîte CAB, les boîtes H et ACA sont indispensables à la formation de pré-RNP avec hTR204.
Nos résultats suggèrent que ces mutations engendrent également des défauts d’assemblage in vivo, ce qui entraîne probablement la dégradation de hTR et conduit tout droit à la DC.
Les deux mutations reliées à la DC testées abolissent la formation de pré-RNP avec hTR204 alors que la mutation G450A reliée à l’anémie aplasique n’a aucun effet.
2e volet
Analyse de l’effet des mutations associées à la DC dans les protéines dyskérine, NHP2 et NOP10 sur l’assemblage de pré-RNP H/ACA
Christian Trahan, Caroline Martel and François Dragon, 2009. Effects of dyskeratosis congenita mutations in dyskerin, NHP2 and NOP10 on assembly of H/ACA pre-RNPs. Human Molecular Genetics 19 :825-836
Structure d’une RNP H/ACA d’archaebactérie
R65TT66AT67IH68QL72Y
Q31EF36VL37delI38TK39EP40RE41KK43ET49M
A2V
N-terminal
P384LP384SA386TL398PG402EG402RT408IP409LS420Y
C-terminal493-514del
Extensions dyskérine
Mutations dans dyskérine reliées à la DC
IP NAF1
Mutations dans dyskérine reliées à la DC
IP NAF1
Mutations dans NHP2 reliées à la DC
IP NAF1
NAF1
dyskérine
NOP10NHP2
Mutations dans NHP2 reliées à la DC
Mutation dans NOP10 reliée à la DC
IP NAF1
NAF1
dyskérine
NOP10NHP2
Mutation dans NOP10 reliée à la DC
Conclusion
hTR est plus sensible que les autres RNA H/ACA à la mutation A353V dans dyskérine lors de l’assemblage de pré-RNP.
La mutation R34W dans NOP10 cause un défaut majeur d’assemblage de pré-RNP H/ACA ¨classiques¨, alors qu’elle n’a aucun effet sur l’assemblage de pré-RNP H/ACA encodant des miRNA.
L’association de NOP10 aux mutants V126M / Y139H de NHP2 est compromise, ce qui engendre par conséquent des défauts majeurs d’assemblage de tous les RNA H/ACA.
Conclusion
Nos résultats démontrent que les mutations dans dyskérine, NOP10 et NHP2 reliées à la DC affectent différentes populations de RNP H/ACA en plus de la télomérase.
Cela suggère que certains désordres entre individus atteints de DC pourraient être reliés à différentes populations de RNP H/ACA affectées en plus de la télomérase.
Notre étude rend possible le criblage et le développement de petites molécules thérapeutiques personnalisées afin de traiter la DC.
3e volet
Maturation de hTR.
En préparation Christian Trahan, Amed Hossain et François Dragon
hTR possède son propre promoteur, est transcrit par la Pol II (présence d’une coiffe), et ne possède pas de séquence 5’ immature.
Tous les ARN sont synthétisés sous forme de précurseurs plus longs in vivo. Extrémités 5’ et 3’ ou seulement 3’.
Généralités
Une étude démontre que la séquence du domaine H/ACA de hTR contient tous les éléments nécessaires à sa maturation 3’ (Fu et Collins, Mol Cell 2003).
La longueur de l’extrémité 3’ de transcrits précurseurs de hTR est toujours indéterminée.
Cette même étude fait mention de la présence d’un transcrit > 1000 nt amplifié par RT-PCR à partir d’ARN de cellules HeLa (¨data not shown¨.
…
Anémie aplasique reliées à la mutation G450A dans hTR
…
Hypothèse de départ
A AGTTCGCT…
Méthodologie: 3’ RLM-RACE
cellules VA-13 (hTR négatives)Transfections
RNA total (QIAGEN RNeasy)DNase RNase free (sur colonne)
Ligation d’un adaptateur miRCAT-33rApp ddC
RNase DNase free
RT
PCR EcoRI pBS
EcoRV EcoRI
T4 RNA ligase 2 tronquée
EcoRI
Prom-hTR+500
Prom-hTRG450A+500Prom-hTRA446G+500
hTR+500 hTRG450A+500
Mature
3’-end
3’ flanking
sequence
Mature
3’-end
3’ flanking
sequence
ACAUGC AGUUCGCUU… Frequency ACAUAC AGUUCGCUU… Frequency
ACAUGC 1/23 ACAUAC 5/20
ACAUGC A 6/23 ACAUAC A 3/20
ACAUGC AA 1/23 ACAUAC AAAA 1/20
ACAUGC AAAA 1/23 ACAUAC AG 3/20
ACAUGC AGAAA 3/23 ACAUAC AGAA 1/20
ACAUGC AGUA 2/23 ACAUAC AGAAA 1/20
ACAUGC AGUUA 1/23 ACAUAC AGUA 1/20
ACAUGC AGUUAAAAA 1/23 ACAUAC AGUUA 2/20
ACAUGC AGUUC 1/23 ACAUAC AGUUC 1/20
ACAUGC AGUUCGA 1/23 ACAUAC AGUUCGCU 1/20
ACAUGC AGUUCGCU 2/23 ACAUAC AGUUCGCUU 1/20
ACAUGC AGUUCGCUAA 1/23
ACAUGC AGUUCGCUU 1/23
ACAUGC AGUUCGCUUA 1/23
Le mutant G450A de hTR n’influence pas la maturation de son extrémité 3’
L’absence de formation de pré-RNP mène à la dégradation des transcrits
Oligo-adénylation de hTR dans des cellules HeLa et BeWo.
HeLa BeWo
Mature
3’-end
3’ flanking
sequence
Mature
3’-end
3’ flanking
sequence
ACAUGC AGUUCGCUU… Frequency ACAUGC AGUUCGCUU… Frequency
ACAUGC 12/18 ACAUGC 21/26
ACAUGC A 3/18 ACAUGC A 1/26
ACAUGC AG 1/18 ACAUGC AA 1/26
ACAUGC AGAAAAA 1/18 ACAUGC AGUA 1/26
ACAUGC AAAAAA 1/18 ACAUGC AAAAA 1/26
ACAUGC AAAAG 1/26
Conclusions
La mutation G450A dans hTR ne semble pas influencer la maturation de son extrémité 3’.
Des transcrits de hTR subissent une oligo-adénylation en 3’ de la séquence codante, à proximité de la séquence mature de hTR.
L’implication de cette oligo-adénylation demeure spéculative:maturation ou dégradation?
Les résultats du 3’ RLM-RACE du mutant A446G supportent l’idée qu’en absence de formation de pré-RNP, les transcrits naissants sont rapidement dégradés.
Des fragments mesurant entre 1000 et 3000 nt ont été amplifiés par 3’ RLM-RACE, mais se sont avérés êtres non-spécifiques.
Un ou des éléments situés à plus de 500 pb en aval de la séquence codante de hTR contribuent à l’efficacité de maturation de l’extrémité 3’ de hTR.
Perspectives des études 1 et 2
Déterminer si le mutant NHP2-X154R est présent dans les RNP H/ACA matures et fonctionnelles in vivo (hTR et autres RNA H/ACA).
Vérifier si le mutant NOP10-R34W peut former des RNP active (pseudouridylation) avec les RNA H/ACA codant pour des miRNA in vivo (ACA36B et U92), et vérifier si ces miRNA sont toujours générés dans un tel contexte.
Tester d’autres mutations dans le domaine H/ACA de hTR ou de dérivés de ce dernier sur l’assemblage de pré-RNP.
Si des miRNA sont effectivement produits, identifier leurs cibles permettrait de mieux connaître l’impact des mutations dans NHP2 qui affectent tous les pré-RNP H/ACA.
Perspectives 3e volet
Possibilité de combiner une immunopurification de NAF1 la purification par affinité MS2 n’est pas suffisante.
Utiliser des constructions ayant des séquences 3’ flanquantes de plus en plus longues de hTR qui sont transfectées dans des cellules VA-13, dont l’efficacité de maturation serait comparée à celle obtenue dans des cellules HeLa et BeWo par RLM-RACE
Produire des ARN synthétiques presque matures oligo-adénylés dans lesquelles le pseudonoeud de hTR est remplacé par 2 petites tiges-boucles ayant une forte affinité pour la protéine MS2.
Transfecter des siRNA contre les candidats identifiés en MS dans des cellules VA-13 et procéder au 3’ RLM-RACE de hTR.
Purifier ces RNP par affinité (agarose-MS2) et identifier des candidats par MS.
Incuber ces ARN avec des extraits nucléaires ou les transfecter dans des cellules.
Conclusion
Remerciements
François Dragon, Directeurles membres du laboratoire
Yves Henry, CNRS Toulouse.
Caroline Martel, assistante de recherche.
Chantal Autexier, McGill.
Steve Reichow et Gabriele Varani,Université de Washington
Kathleen Collins, Berkeley UC.
Amed Hossain, étudiant M. Sc.
Maturation de snoRNA H/ACA chez S. cerevisiae
Grzechnik & Kufel, Mol Cell 2008
3000
13001200
Transcrits précurseurs de hTR dans des cellules HeLa?
1kb+ RT+ RT-
NetGene2
Donor splice sites, direct strand--------------------------------- pos 5'->3' confidence 5' exon intron 3' 1160 0.81 TCACGACAAG^GTAATTCCGT
Box et al., Nature 2008
S. pombe
1000
850
650
500
400
1650
2000
3000
Perspectives 3e volet
Utiliser des siRNA contre:
RRP6 (accumulation de précurseurs? polyadénylés/oligo-adénylés?)TRF4/5 (perte de l’oligo-adénylation)PAP1 (perte de polyadénylation)
Inhiber le spliceosome (isoginkgetin):Accumulation de long transcrits précurseurs?
3’ RLM-RACEen parallèle