2018.11.12. Bioinformatika 2
Bioinformatika 2 − 10. előadás
Prof. Poppe László
BME Szerves Kémia és Technológia Tsz.
Bioinformatika – proteomika
Előadás és gyakorlat
Bioinformatika 22018.11.12.
Genomika vs. proteomika
A genomika módszereivel nem a tényleges fehérjéket vizsgáljuk, hanem azokat az expresszálódott
géneket, amelyek transzlációja az adott fehérjét eredményezi. A proteomika módszereivel a ténylegesen
képződött fehérjéket vizsgáljuk.
Az előző ábrán látható DNS chip az expresszálódott génekről szolgáltat információkat, így tehát csak
közvetett adatokhoz juthatunk a tényleges fehérje termékekről. A genomikai megközelítés előnye, hogy a
gének kisérletileg jobban hozzáférhetőek és egyszerűbben kezelhetőek, mint a fehérjék. Ennek
köszönhetően napjainkban a genomikai módszerek elterjedtebbek, mint a proteomikai eljárások. A
kísérleti technikák fejlődésével párhuzamosan előre jelezhető a proteomika egyre nagyobb térnyerése.
Tisztában kell lennünk azonban a genomikai megközelítés hátrányaival is. Első az, hogy egy gén
expressziós szintje nem feltétlenül felel meg a megfelelő protein magas sejtbéli koncentrációjának, holott
ez fontosabb ha a tényleges protein expresszió mértékére és az ezzel összefüggő betegségre vagyunk
kíváncsiak.
Talán még fontosabb az, hogy a fehérjék jelentős része a transzlációt követően módosul (post-
translational modifications). Ilyen módosulások a glikozilálások (összetett cukor egységek fehérje
felszínhez kötődése) és foszforilálások (foszfát egységek kötödése a fehérjéhez). Ezek a transzlációt
követő módosulások az azonos primer aminosav szekvenciával rendelkező proteinek számos eltérő
változatához vezethetnek. A genomika nem képes ezen módosulások követésére, amelyek számos
esetben alapvető fontosságűak lehetnek.
Bioinformatika 22018.11.12.
Proteomika jelentősége
A fehérjék tejes szekvenciája csak részben következtethető ki a nekik megfelelő
genetikai szekvenciából.
Sokszor fordulnak elő a transzlációt követően módosulások: pl. alternatív lánc
összekapcsolódás, N-terminális rövidülés, poszt-transzlációs módosulások (PTM). A
proteomika tehát e módosulásokat előidéző körülmények leírását is jelenti.
Mindezeken túl a fehérjék funkciója és aktivitása függ a koncentrációjuktól, még
általánosabban a környezetüktől. Előfordulhat, hogy fehérjék aktiválnak másik
fehérjéket, vagy az aktivitáshoz nem-fehérje kofaktorok vagy egyéb anyagok /
szubsztrátok kellhetnek. Fehérjék pH-függő folyamatokban a sejt egyik részéból a
másikba transzportálódhatnak, vagy a PTM folyamata a sejt állapotától függően
dinamikusan változhat, stb.
Bioinformatika 22018.11.12.
Proteomika - összetettebb, mint a genomika
A fehérjék igen változó koncentrációban fordulhatnak elő: a koncentráció 1012
tartományt fog át a transzkripciós faktoroktól az albuminig.
Egy adott gén egy adott szövetben akár 20 feletti protein formában expresszálódhat: pl. a
humán plazmában az -1-antitripszinnek legalább különbözó 22 protein formája ismert.
A fehérjék fiziko-kémiai sajátságai extrém módon különbözhetnek: molekula tömegük a
néhány ezertől akár egymillió Dalton-ig terjedhet. Az oldhatóságuk, izoelektromos
pontjuk (pI) és PTM hajlamuk is igen eltérő lehet.
Az emberi szervezetben (a becsült mintegy 40 000 gén expressziós termékeként)
vélhetően előforduló fél-egy millió protein elemzése igazi kihívás mint technológiai,
mind bioinformatikai szempontból.
A vizsgálatok nagyfelbontású fehérjeelválasztási módszereket, a mintaelőkészítés / a
kísérleti módszerek és az adatbázis kezelés nagyfokú automatizálását / parallelizációját
igénylik. Igen fontosak a feljett vizualizációs technikák.
Bioinformatika 22018.11.12.
Proteomika – kölcsönhatások / módszerek
Az azonosított és jellemzett fehérjék funkcióját is meg kell határozni, ami sokszor nem
egyszerű.
A fehérjék igen gyakran protein komplexeket képezve kölcsönhatásban állnak egymással,
vagy más fontos biomolekulákkal, mint a DNS. Aktivitásuk kapcsolódhat kisebb,
molekulákkal pl. kofaktorokkal, hormonokkal történő kölcsönhatásokhoz, így tehát érthető,
hogy igen változatos kísérleti technikák lehetnek szükségesek az új diagnosztikus tesztek
kifejlesztéséhez.
A proteom amely a genom egy adott szervezet adott szövétben egy adott időben
exprimálódó proteinjeinek összességeként írható le analízise számos módszer
kombinációját igényli. A módszerek lehetnek kísérleti (wet-lab experiments) és
bioinformatikai (dry-lab experiments) eljárások. Figyelembe véve a proteomban előforduló
proteinek kémiai és fizikai komplexitását, változatos módszerek felhasználását kell
megfontolni. A következő ábra lineáris ”útvonala” a proteom elemzéséhez szükséges
”nedves” és ”száraz” lépéseket tartalmazza.
Bioinformatika 22018.11.12.
A proteomika “útvonala”
MintaElválasztás
Folt kiválasztása
Elválasztás
analízis utáni
AzonosításAdatbázisok
Bioinformatika 22018.11.12.
Profilkészítés
Azonosítás
Validálás
Gél elektroforézis
1- és 2-dimenziós elválasztások, nagy érzékenység, nagy áteresztőképesség
Proteomika területei és eszközei
Gél-mentes elválsztás jelölésekkel
Protein / peptid szinten – Többdimenziós LC – Izobár / izotóp jelölés
Tömegspektrometria (MS)
“Peptide mass fingerprint” – azonosítás
LC-MS és LC-MS/MS – azonosítás és kvantifikálás
MALDI-TOF/TOF – azonosítás és kvantifikálás
Bioinformatika
Differenciális proteinexpresszió azonosítása
Szekvencia-analízis
Biológiai funkció / relevancia elemzése
Tesztek fejlesztése
Immunoanalízis – ELISA, western blot, immunohisztokémia
MS módszerek – TMT referenciaanyagok, MRM
Bioinformatika 22018.11.12.
Proteomika - mintaelőkészítés
Elsőként a megfelelő mintát és mintaelkészítési módszert kell kiválasztani. A minta lehet a
nyers biológiai folyadék, egy sejt extraktum, előkezelt minta, stb. A minta megválasztása
alapvető fontosságú, mivel ez erősen függ az elválasztásra használni kívánt módszertől. A
minta komplexitásának mind a komponensek számát, mind az átfogott tartományok
szélességének tekintve megfelelőnek kell lennia a kiválasztott elválasztási módszerhez.
Bioinformatika 22018.11.12.
Proteomika
A minta fehérjéit el kell választani egymástól. A proteomika az 1D de még inkább a 2D
elektroforézis technikákat preferálja (1-DE) / (2-DE).
Bioinformatika 22018.11.12.
Proteomika – foltok kiválasztása
A következő lépés az elválasztás eredményének analízise gél-vizualizációs /
alakfelismerő szoftverek segítségével történik (megjelenítés, gélek összehasonlítása,
statisztikai elemzések). Ezek segítenek a szignifikáns foltok kiválasztásában.
Bioinformatika 22018.11.12.
Proteomika – vizualizációs szoftver
Melanie https://world-2dpage.expasy.org/melanie/
Bioinformatika 22018.11.12.
Proteomika – vizualizációs szoftver
Melanie https://world-2dpage.expasy.org/melanie/
Bioinformatika 22018.11.12.
Proteomika – elválasztás utáni analízis
A további elemzésekhez a kiválasztott proteineket elválasztás
utáni elemzésnek vetik alá. Ez a specifikus fehérje-sajátságok
mint az aminosav-összetétel, szekvencia információ
kísérleti meghatározásához endoproteázokkal végzett hasítási
lépést igényel.
Ezen endoproteázokkal végzett hasítások során a proteineket
tipikusan olyan enzimekkel inkubálják, melyek egy adott
aminosavat felismerve a polipeptid-láncot specifikusan
hasítják.
Bioinformatika 22018.11.12.
Proteomika – MS analízis
Ez egy rövidebb peptidekből álló ún. emésztett proteineket tartalmazó elgyet eredményez.
A standard eljárás tripszint alkalmaz és a képződőtt fragmenseket gyakran LC
elválasztást követően Matrix Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI) vagy
Electrospray Ionization (ESI) MS (TOF) módszerekkel vizsgálja.
Bioinformatika 22018.11.12.
Proteomika – (Szekvencia)adatok elemzése
A tömegspektrumból meghatározott (szekvencia)adatokat a megfelelő adatbázisokkal
összevetve megtalálható a kísérletileg meghatározott és a „in-silico” emésztett protein
szekvencia-adatbázis közötti legjobb egyezés, ami felhasználható a fehérje azonosítására és
karakterizálására. (Ld. korábban: „mass fingerprinting”)
ExPASy – poszt-transzlációs módosulások
Expasy Tools: https://www.expasy.org/proteomics/post-translational_modification
2018.11.12. Bioinformatics16
17
ExPASy – MS és 2D-E adatok
Expasy Tools: http://www.expasy. org/proteomics/mass_spectrometry_and_2-DE_data
2018.11.12. Bioinformatics
Bioinformatika 22018.11.12.
Proteomika – 2DPage adatbázis
Swiss 2D Page https://world-2dpage.expasy.org/swiss-2dpage/
Bioinformatika 22018.11.12.
Proteomika – 2DPage adatbázis
Swiss 2D Page https://world-2dpage.expasy.org/swiss-2dpage/
Bioinformatika 22018.11.12.
Proteomika – 2DPage adatbázis
Swiss 2D Page https://world-2dpage.expasy.org/swiss-2dpage/