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Biotechnologie végétale
Cultures in vitro de plantules Suspensions cellulaires et protoplastes : Des outils pour la recherche fondamentale
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Exemples d’utilisation en recherche fondamentale
Cultures de plantules in vitro Approches pharmacologiques et toxicologiques
Suspensions cellulaires et protoplastes Échanges membranaires, mécanismes
signalétiques Adressage protéique Dédifférenciation, Différenciation Contrôle du métabolisme
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Approches pharmacologiques sur plantules
Déterminisme hormonal de la formation de racines secondaires
Zhu et al.
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Utilisation des suspensions cellulaires dans un contexte de signalisation cellulaire
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Hypersensitive Response (HR)
Interactions plantes / pathogènes
HR
Mort cellulaire
Circonscription du pathogène
SAR
Systemic Acquired Resistance :
« Immunisation des plantes »
Réaction rapide
À plus long terme …
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Exemple typique : infection par le virus de la mosaïque du Tabac
3 jours d’infection
Nécroses = mort cellulaire
Restriction de la propagation du virus
Lam et al. (2001) Nature
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Ehrenfeld et al. 2005 Mol. Cells
Composés phénoliques(autofluorescence)
Mort cellulaire(Bleu Evans)
Callose
H2O2
Caractéristiques histologiques de la réaction hypersensible
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Inconvénients du modèle plante entière
Culture des plantes : En serre : dépendance des saisons Chambres de culture : coûteux Variabilité importante
Dosages enzymatiques difficiles Problèmes de pigments
Mesures de flux difficiles Utilisation difficile d’inhibiteurs
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Utilisation de suspensions cellulaires
Quantification de la mort cellulaire
Utilisation d’inhibiteurs Petites quantités Rapidité d’absorption
Facilités d’extraction et dosages Métabolites (SA, phénylpropanoides ROS,
NO…) Activités enzymatiques Extractions d’ARN
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Estimation de la mort cellulaire
Colorants des cellules vivantes :
Fluoresceine diacétate Rouge neutre
des cellules mortes Bleu Evans, Bleu Trypan, Iodure de
propidium
Comptages sous microsope Comptages par fluorimétrie
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Mort cellulaire : Nicotiana tabacum/ Phytophtora cryptogea
H2O Cryptogéine
Prélèvements et comptage de la mort
cellulaire au cours du traitement
Cryptogéine
heures
% mortalité
Témoin
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Recherche d’évènements précoces
Cryptogéine
heures
% mortalité
Témoin
Que se passe-t-il pendant ces premières heures?
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Synthèse des composés phénoliques
H2O
Cry 50 µM
Transcription du gène codant la PAL
Zhang et al. 1998 Plant Cell
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Suivi des concentrations ioniques intracellulaires
Exemple du calcium
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Sondes calciques
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Pénétration des sondes
Problème : sondes chargées négativement, imperméantes
Solution : dérivation avec un groupement acétométhylester (AM)
Les molécules pénètrent les cellules Action d’esterases endogènes Libération des formes actives dans le
cytoplasme
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Inconvénients
Sensibilité au pH : Compartimentation ? Changements de pH cytoplasmique
plus qualitatif que réellement quantitatif
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Suivi du calcium intracellulaire
Système Nicotiana plumbaginifolia / apoaequorine
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Ca2+
Ca2+
Ca2+
coelentérazine
apoaequorine
++ O2
Ca2+
Ca2+
Ca2+
+ CO2
+λ=469nm
calcium
Mode d’action de la coelentérazine
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Fluctuations de la concentration cytosolique de calcium
Temps (min)
Cry (0.5 mM Ca2+)
Cry (0.4 mM Ca2+)
Cry (0.3 mM Ca2+)
Cry (0.2 mM Ca2+)
Cry (0.1 mM Ca2+)Cry (0.1 mM Ca2+)
0 10 20 30 40
2,4
[Ca
2+]
cyt
(µM
)
Lecourieux et al. 2002 Plant Cell
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Elaboration d’un modèle de signalisation cellulaire
Modèle très simplifié d’une voie de transduction du signal entre la perception de la cryptogéine et la mort cellulaire (Nicotiana)
Cry Ca2+
Phosphorylations (kinases)
NO3-
NADPH NADP
H2O2
Mort cellulaire
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Utilisation de protoplastes en recherche
Transport membranaire Adressage protéique Protoplastes tissu-spécifiques
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Étude de transports membranaires
Minéraux, H2O
Absorption racinaire
Trafic vasculaire
Relations Source / Puit
Photoassimilats
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Étude de transports membranaires
Problème des suspensions cellulaires: Agrégats Paroi végétale
Les protoplastes : un modèle simple et pertinent
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Étude de transports membranaires
Traceurs isotopiques
Sondes fluorescentes
Electrophysiologie
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Traceurs isotopiques
Ni
Ni
Ni
Ni
Incubation protoplastes +
63Ni 10 µM
5 mn
CaCa
Ca
Ca
Filtration et rinçage CaCl2 2 mM s
Filtre 0.45µM
Comptage 63Ni dans le filtre = Ni intracellulaire
Ni
Ni
NiNi
![Page 27: Biotechnologie végétale Cultures in vitro de plantules Suspensions cellulaires et protoplastes : Des outils pour la recherche fondamentale](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062219/551d9d8e497959293b8c31b2/html5/thumbnails/27.jpg)
Sondes fluorescentes
Protoplastes de blé chargés avec du BTC-5N (spécifique du Cd)
Lindberg et al. (2004) Planta
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Utilisation des protoplastes en électrophysiologie
![Page 29: Biotechnologie végétale Cultures in vitro de plantules Suspensions cellulaires et protoplastes : Des outils pour la recherche fondamentale](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062219/551d9d8e497959293b8c31b2/html5/thumbnails/29.jpg)
Caractérisation de canaux voltage- dépendants
Voltage Clamp
Patch Clamp
Les solutés diffusent selon le gradient électrochimique. Comment caractériser la régulation électrique de canaux ?
![Page 30: Biotechnologie végétale Cultures in vitro de plantules Suspensions cellulaires et protoplastes : Des outils pour la recherche fondamentale](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062219/551d9d8e497959293b8c31b2/html5/thumbnails/30.jpg)
Voltage Clamp
Une électrode enregistre les modifications de tensions
La seconde impose une tension et corrige les variations
Protoplaste
Enregistrement des courants ioniques
![Page 31: Biotechnologie végétale Cultures in vitro de plantules Suspensions cellulaires et protoplastes : Des outils pour la recherche fondamentale](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062219/551d9d8e497959293b8c31b2/html5/thumbnails/31.jpg)
Patch Clamp
Mesure des courants sur une surface membranaire très réduite
•forte résistance : mesure de courants faibles
•étude d’un petit nombre de canaux
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Patch Clamp : principes
•Imposition d’un potentiel membranaire
•Mesure d’un courant100 pA
75 ms
Assmann (2001) Plant Physiol.
mV
pA
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Adressage des protéines
Expression transitoire en protoplastes de protéines fusionnées avec une GFP
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Canaux et transporteurs membranaires
Souvent : faible niveau d’expression
Fonction définie essentiellement par : Spécificité de substrat Expression tissulaire Adressage membranaire
![Page 35: Biotechnologie végétale Cultures in vitro de plantules Suspensions cellulaires et protoplastes : Des outils pour la recherche fondamentale](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062219/551d9d8e497959293b8c31b2/html5/thumbnails/35.jpg)
Exemple d’une P-ATPase
ATP
ADPP
N
CPC
N
CPC
GFP Greffage d’une GFP sur une partie soluble
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Green Fluorescent Protein
Aequorea victoria
Stucture « cannette de feuillets β »
Spécificité de la GFP:
pas de groupement prosthétique synthétisé séparément
modification d’acides aminés de la chaîne polypeptidique
![Page 37: Biotechnologie végétale Cultures in vitro de plantules Suspensions cellulaires et protoplastes : Des outils pour la recherche fondamentale](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062219/551d9d8e497959293b8c31b2/html5/thumbnails/37.jpg)
Hexapeptide :FSYGVQ
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![Page 39: Biotechnologie végétale Cultures in vitro de plantules Suspensions cellulaires et protoplastes : Des outils pour la recherche fondamentale](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062219/551d9d8e497959293b8c31b2/html5/thumbnails/39.jpg)
Expression transitoire : principe
Insérer un fragment d’ADN codant un protéine dans un protoplaste Plasmide DNA double brin ou simple brin
Observation directe de l’expression
Pas forcément d’intégration chromosomique
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Construction HMA4::GFP
HMA4GFP2x35S
Ori coliAmpi
Réplication et sélection dans E. coli
Protéine de fusionPromoteur
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Transformation de protoplaste
Préparer de grandes quantités de plasmide
Transformation MaMg :
Mannitol (0.5 M) MES-KOH (5 mM) pH 5,6 MgCl2 (15 mM)
Polyethylène Glycol déstabilisation de la membrane
![Page 42: Biotechnologie végétale Cultures in vitro de plantules Suspensions cellulaires et protoplastes : Des outils pour la recherche fondamentale](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062219/551d9d8e497959293b8c31b2/html5/thumbnails/42.jpg)
Transformation de protoplastes
Dans 300 µl de tampon
106 protoplastes
10 µg de plasmide
100 µg de « DNA carrier »
0-2 °C
300 µl PEG 40%
30 min sur glace
Rinçage par dilution /
sédimentation :
NaCl, CaCl2,
Glucose
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Expression
Étaler les protoplastes rincés sur boite de Pétri
Incuber 4-48 heures à l’obscurité
Observations (Ex 495 nm / Em 515 nm)
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Un transporteur du plasmalemme : AtHMA4
Témoin : GFP soluble
AtHMA4::GFP
Verret et al. (2004) FEBS Lett.
![Page 45: Biotechnologie végétale Cultures in vitro de plantules Suspensions cellulaires et protoplastes : Des outils pour la recherche fondamentale](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062219/551d9d8e497959293b8c31b2/html5/thumbnails/45.jpg)
Thomine et al. (2003) Plant J.
Un transporteur de la membrane tonoplastique: AtNRAMP3
![Page 46: Biotechnologie végétale Cultures in vitro de plantules Suspensions cellulaires et protoplastes : Des outils pour la recherche fondamentale](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062219/551d9d8e497959293b8c31b2/html5/thumbnails/46.jpg)
Isolation de protoplastes spécifiques d’une assise tissulaire
Gène rapporteur GFP sous le contrôle d’un promoteur spécifique d’une assise tissulaire
Prom GFP
![Page 47: Biotechnologie végétale Cultures in vitro de plantules Suspensions cellulaires et protoplastes : Des outils pour la recherche fondamentale](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062219/551d9d8e497959293b8c31b2/html5/thumbnails/47.jpg)
Tri des protoplastes
exprimant la GFP par cytométrie en
flux
Isolement de protoplastes de racines
Birnbaum et Bernfey 2004 Curr. Opin. Plant Biol.
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Les protoplastes tissu-spécifiques: un outil de recherche polyvalent
Electrophysiologie
Transcriptomique
Protéomique
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Exemple : transcriptome des cellules du centre quiescent
Tri par cytométrie en flux
Fluorescence GFP
Contre marquage IP
Nawy et al. 2005 Plant Cell
![Page 50: Biotechnologie végétale Cultures in vitro de plantules Suspensions cellulaires et protoplastes : Des outils pour la recherche fondamentale](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062219/551d9d8e497959293b8c31b2/html5/thumbnails/50.jpg)
Hybridation sur puces à ADN
Nawy et al. 2005 Plant Cell