Download - Biotoxinas Marinas en Moluscos: Introducción de una … · –Monitorizacion de multiples condiciones
Biotoxinas Marinas en Moluscos:
Introducción de una nueva regulación
José Juan RiveroEspecialista de Producto
GC y GCMS
Agilent Technologies
Febrero 2011
Biotoxinas marinas: Por que analizarlas?
Las enfermedades relacionadas con la ingesta de Biotoxinas
van desde los simples dolores de cabeza, vómitos y diarreas
hasta problemas neurológicos y en casos extremos la
muerte.
La situación actual en cuanto a regulación
Las empresas de alimentación que suministran moluscos bivalvos vivos en
mercados para el consumo humano, deben asegurarse que no deben contener
biotoxinas marinas que excedan los siguientes limites:
• 800 microgramos por kilogramo para las paralizantes (PSP),
• 20 milligramos de ácido domoico por kilogramo para las anextesiantes (ASP)
• 160 microgramos de ácido okadoico por kilogramo equivalente para ácido
okadoico, dinofisistoxina y pectenotoxina combinado.
• 1 milligramo de yessotoxina equivalente por kilogramo,
• 160 microgramos of azaspiracida equivalente por kilogramo.
Dos alertas muy recientes (Agosto’10).
Clases de Toxinas (Reguladas)
Saxitoxina STX PSP
Acido Domóico DA ASP
Grupo del ácido Okadaico OA DSP Acido Okadaico
Toxinas Dinophysis
Pectenotoxina PTX DSP
Yesotoxina YTX DSP
Azaspirazida AZA AZP
Todas son analizadas actualmente por tecnicas MBA
dando resultados aprobados por la UE
Acidos Okadaicos
Azaspiracidas
Pectenotoxinas
Yesotoxinas y adriatoxina
Clases de toxinas (no reguladas)
brevetoxin BTX
cyclic imines CI SPX (12: eg 13-desmethyl SPX C) Spirolides
GYM (4: A-C) gymnodimines
PnTX (7: A-G) pinnatoxins
PtTXs (3 characterized: A-C) pteriatoxins
Not yet studied in Europe prorocentrolides
Not yet studied in Europe
spiroprorocentrimine
s
palytoxinas P1TX
ciguatoxinas CTX
¿Que tiene que ver todo esto con el LCMS?
MBA (Mouse Bioassay)Bioensayos con ratones es la forma
estandar hoy dia de analizar las
Biotoxinas
Desde los 80’s .....
Las toxinas son extraidas del tejido del
molusco usando acetona y despues
de una evaporación es inyectada
intraperitonealmente en ratones y
aquellos que sobrevivan dentro de las
24-48 horas. Una unidad raton (MU)
se defina como la minima cantidad de
toxina que es necesaria para matar a
un raton dentro de las primeras 24
horas.
Algunos compuestos no son muy sensibles a la
tecnica MBA
= Falsos positivos y negativos
Toxinas Lipofilicas:
Compound Tox factor
OA 1
DTX1 1
DTX2 0.6
AZA1: 1
AZA2: 1.8
AZA3: 1.4
Compound Tox factor
PTX1: 1
PTX2: 1
YTX: 1
Homo-YTX: 1
OH-YTX: 1
OH-homo-YTX: 1
¿Quien está trabajando con este analisis ya?
Dr. Ana Gago-Martinez
Prof. at the Department of Analytical and Food
Chemistry, University of Vigo, Spain
EURLMB Director
We have this system installed at my laboratory on the Faculty of Chemistry (University of
Vigo Spain). One of my priority field of research is the analysis of Marine toxins and in this
field I am also the Director of the European Reference Laboratory for Marine Biotoxins.
We have been using this equipment to participate on the interlaboratory validation for
Diarrhetic shellfish poisoning and the previous results have been pretty good, the system
have been working well for this particular analysis and in fact our results have allowed us to
participate on the main study which is being carried out at this precise moment.
We have been also using this system to analyse emergent toxins such as Brevetoxins and
Ciguatoxins and the performace and sensitivity of the equipment is very good.
Oliver Keuth
Chemisches und Veterinäruntersuchungsamt
Münsterland-Emscher-Lippe (CVUA-MEL) – AöR
Münster, Germany
For analyzing samples on lipophilic marine biotxins we mainly use the Agilent 6460 QQQ
with the ESI JetStream source as the mass spectrometer. The LC part is the Agilent Infinity
1290. Additionally we also use an Agilent 6410 QQQ with an Agilent Series 1200SL for the
LC part.
According to our experiences we are very satisfied with the stability and reproducibility of the
system (both parts, MS and LC part).
The sensitivity of the system is very good, refer to our calibration curve.
Also the software (we use Agilent MassHunter) is very easy to use and there are many
practical tools included in the software for data analysis. Based on our own experiences it
does not take many time to learn the MassHunter software, if you are know working with
another type of software.
¿Quien está trabajando con este analisis ya?
UE N-15/2011 ( En vigor desde el 1 de Julio de 2011)
Determinación de biotoxinas marinas lipofilicas en
moluscos usando Triple Cuadrupolo LC/MS/MS
Datos experimentales suministrados por:
Begoña Ben Gigirey, Prof. Dr. Ana Gago-MartinezDept. Química Analitica y Alimentación, Facultad de Químicas, Universidad de Vigo
Agenda:
1. Revisión del analisis de las Biotoxinas lipofílicas
2. Optimización del método
3. Metodología – desde la extracción hasta la cuantificación
Revisión del análisis de Biotoxinas lipofilicas:
• Existen dos métodos LC-MS/MS propuestos para el analisis de este tipo
de biotoxinas ambos métodos están siendo evaluados:
• Metodo Ácido (McNabb et al., 2005)
– Condiciones en fase reversa
– Fases móviles ácidas
– La ionización por ESI con polaridad +/-
– Monitorizacion de multiples condiciones (MRM)
• Metodo Alcalino (Gerssen et al., 2009)
– Condiciones en fase reversa
– Fases moniles básicas (pH 11)
– Ionización por ESI con segmentos en polaridad negativa y positiva
– Monitorizacion de multiples condiciones (MRM)
Influencia del valor del pH de la fase movil:
DTX-1:
O
O
OH
CH3OH
CH3OH
OH
H
CH3O
O
O
CH2
CH3
O
O
OHOH
CH3
H
H
H
H
O
O
OH
CH3OH
CH3O
-
OH
H
CH3O
O
O
CH2
CH3
O
O
OHOH
CH3
H
H
H
H+H+
Gerssen et al., J. Chromatogr. A, 1216 (2009) 1421-1430
Comportamiento cromatográfico de las toxinas:
45 O
H-Y
TX
/
45 O
H-h
om
o-Y
TX
YT
X/H
om
o-Y
TX
OA D
TX
-2
AZ
A-3
AZ
A-1
AZ
A-2
DT
X-1
PT
X-2
PT
X-2
sa
**
Método ácido:• Excelente forma de picos
para la mayoría de los
compuestos
• YTX muestran picos
ligeramente mas anchos
• Buena sensibilidad
• Requiere cambios de
polaridad rápidos
Negative ionization Positive ionization4
5 O
H-Y
TX
/
45 O
H-h
om
o-Y
TX
YT
X/H
om
o-Y
TX
OA DT
X-2
AZ
A-3
AZ
A-1
AZ
A-2
DT
X-1
PT
X-2
Método alcalino:• Excelente forma de los
picos de YTXs
• Separación cromatografica
delos compuestos
ionizados en pos y neg
• Incrementa la sensibilidad
para OA y DTXs
• Forma de picos para
azaspirazidas se ven
negativamente afectados
Ionización de las toxinas lipofilicas en la electrospray
Compound class Formula ESI mode Precursor ion
Okadaic acid group
OA
DTX-1
DTX-2
C44H68O13
C45H70O13
C44H68O13
negative
positive
negative
positive
negative
positive
[M-H]- = 803.5
[M+Na]+ = 827.5
[M-H]- = 817.6
[M+Na]+ = 841.5
[M-H]- = 803.5
[M+Na]+ = 827.5
Azaspiracids
AZA-1
AZA-2
AZA-3
C47H71NO12
C48H73NO12
C46H69NO12
positive
positive
positive
[M+H]+ = 842.6
[M+H]+ = 856.5
[M+H]+ = 828.5
Pectenotoxins
PTX-1
PTX-2
C47H70O15
C47H70O14
positive
positive
positive
positive
[M+NH4]+ = 892.5
[M+Na]+ = 897.5
[M+NH4]+ = 876.6
[M+Na]+ = 881.5
Yessotoxin group
YTX
homo-YTX
OH-YTX
OH-homo-YTX
C55H82O21S2
C56H84O21S2
C55H82O22S2
C56H84O22S2
negative
negative
negative
negative
negative
negative
[M-2H]2- = 570.3
[M-H]- = 1141.5
[M-2H]2- = 577.4
[M-2H]2- = 578.4
[M-H]- = 1157.4
[M-2H]2- = 585.4
PTX-2
AZA-1
YTX
CID para OA
CE 45 V
CE 60 V
positive
negative
0.00E+00
2.00E+05
4.00E+05
6.00E+05
8.00E+05
1.00E+06
1.20E+06
1.40E+06
200 210 220 230 240 250 260
Pe
ak a
rea
in c
ou
nts
Fragmentor voltage in V
SIM 842.6
Optimización del voltaje de fragmentación para AZA-1
• Azaspiracid-1
• SIM 842.6 @ FragV 150 to 350 V
(coarse, step 40V)
• SIM 842.6 @ FragV 205 to 250 V
(step 5V)
FragV 150 V
FragV 190 V
FragV 230 V
FragV 270 V
FragV 310 V
FragV 350 V
0
40000
80000
120000
160000
200000
25 35 45 55 65 75
Pe
ak h
eig
hts
in
co
un
ts
Collision energies in V
842.6 -> 824.6
842.6 -> 806.6
842.6 -> 362.3
842.6 -> 672.4
Optimización de las energías de colisión para AZA-1
• Azaspiracid-1
• Frag 1: 842.6 824.6
• Frag 2: 842.6 806.6
• Frag 3: 842.6 362.3
• Frag 4: 842.6 672.4
842.6 824.6 @ CE 29 V
842.6 806.6 @ CE 45 V
842.6 362.3 @ CE 61 V
842.6 672.4 @ CE 53 V
Metodología – Preparación de la muestra:
2 g tejido de molusco cocido y molido
LC-MS/MS
Extracción con disolvente acuoso
(80 % metanol)
Agitación para homogenizar
Centrifugar
Repetir la extracción,
El sobrenadante se decanta en un
matraz, rellenando hasta 50 ml
Se filtra el extracto, usando un filtro de
membrana de 0.45 µm
Injectar 10 µl
Metodología – condiciones del HPLC:
Columna: Phenomenex Luna C-18, 150 x 2 mm, 5 µm (modo positive)
Agilent ZORBAX Eclipse Plus C-8, 75 x 4.6 mm, 3.5 µm (modo negativo)
Flujo: 0.2 mL/min
Temp Columna: 30°C
Volumen de inyección: 10 μL (needle wash in flush port 5 seconds)
Disolvente Canal A: 0.1% formic acid (positive mode)
2 mM ammonium acetate (negative mode)
Disolvente Canal B: methanol
Gradiente: Time (min) A (%) B (%)
0.0 90 5
10.0 10 85
22.0 10 85
23.0 90 5
30.0 90 5
Tiempo total: 30.0 min
Metodología – Condiciones del Agilent Jet Stream:
Temp gas de secado: 300°C
Flujo de gas: 5 L/min
Presión del nebulizador: 45 psi
Temp del gas de Jet Stream: 250°C
Flujod de gas: 11 L/min
Voltaje de Aguja: +/- 500 V
delta EMV: 400 V
Voltaje de Capilar: +/- 3500 V
Nebulizer N2 gas
(near sonic
velocity)
Super-heated N2
sheath gas
LC flow
Thermal focusing
Electrospray
* Transitions based on literature information
Metodología – Condiciones de adquisición MRM:
Analyte Polarity Prec Ion
m/z
Prod Ion
m/z
Frag
[V]
CE
[eV]
Quantifier
OA and DTX-2 pos
pos
827.5
827.5
723.4
809.2
220
220
55
45
X
DTX-1 pos
pos
841.5
841.5
737.2
823.2
220
220
55
45
X
PTX-1 pos
pos
897.5
897.5
555.3
853.5
230
230
70
60
X
PTX-2 pos
pos
881.5
881.5
539.3
837.5
230
230
70
60
X
PTX-2sa * pos
pos
899.5
899.5
855.5
557.3
230
230
60
70
X
YTX neg
neg
1141.5
1141.5
1061.3
925.5
135
135
35
60
X
Homo-YTX * neg 1155.4 1075.5 135 35 X
OH-YTX neg 1157.4 1077.5 135 35 X
OH-Homo-YTX * neg 1171.4 1091.5 135 35 X
AZA-1 pos
pos
842.5
842.5
824.5
806.5
200
200
40
55
X
AZA-2 pos
pos
856.5
856.5
838.5
820.5
200
200
40
55
X
AZA-3 pos
pos
828.5
828.5
810.5
792.5
200
200
40
55
X
Cromatogramas de un extracto de mejillón y QC
Blue mussel extractAZA-1 to AZA-3: < 20 µg/kg
OA: 37 μg/kg
DTX-2: 120 μg/kg
DTX-1: 69 μg/kg
QC-sampleAZA-1: 15 µg/kg
OA: 15 μg/kg
PTX-2: 15 μg/kg
Curvas de calibración sobre matriz
Calibration curve (matrix matched)
AZA-1, OA, PTX-2, and YTX reference
standards spiked into blue mussel extract
Calibration range:
AZA-1: 2.5 to 25 ng/mL
OA : 1 to 38 ng/mL
Cuantificación de Biotoxinas
• Existen tan solo cuatro estandares disponibles (AZA-1, OA, PTX-2, YTX) the
National Research Council, Institute for Marine Biosciences (NRC-CNRC),
Halifax, Canada
• Todos los demas deben ser cuantificados basándose por la respuesta de la
calibración de compuestos relacionados.
OA reference standard
(10 ng/ml)
Blue mussel extract
containing OA and DTX-2
(isomeric compounds)
Uso de “CopyCalibrationLevel.quant.script”
• Este especial script sirve para copiar la respuesta de la calibración de un compuesto de referencia
a otro del que no existe material de referencia disponible:
– Copiar “CopyCalibrationLevel.quant.script” en la dirección D:\MassHunter\Scripts\Quant
– Definir el compuesto de referencia en el campo de „Compound group“
– Ejecutar el script en el „Edit method“
– Los niveles de calibración incluyen el nombre del nivel, concentración y la respuesta del
compuesto de referencia y serán copiados automáticamente a los compuestos targets
– Cuantificación de los compuestos targets usando el comando „Quantitate Batch“.
Cuantificación de DTX-2 basado en la calibración del OA
• DTX-2 en muestra es cuantificada basado en la calibración del OA
• La separación a linea base es obligatoria si el compuesto es isomero; Se necesita
una buena separación para obtenero optimos resultados de cuantificación.
Validación del método
• El método has sido validado dentro de un estudio colaborativo internacional.
• El estudio de intercomparación fue dirigido por el grupo de trabajo LFGB
“Phycotoxins”, el cual está dentro del la oficina federal de protección al consumidor
y seguridad alimentaria Europea (BVL).
• LODs y LOQs en moluscos cocinados y molidos fueron:
Compound LOD LOQ
1OA 6 μg/kg 20 μg/kg
1DTX-1 & 2 6 μg/kg 20 μg/kg
2AZA-1 to 3 6 μg/kg 20 μg/kg
1PTX-1 & 2 6 μg/kg 20 μg/kg
3YTX 10 μg/kg 35 μg/kg
1MRL in raw mussel material for sum of OA, DTX-1 & 2, PTX-1 & 2: 160 μg/kg OA equivalents2MRL in raw mussel material for sum of azaspiracids: 160 μg/kg AZA-1 equivalents3MRL in raw mussel material for sum of yessotoxins: 1000 μg/kg YTX equivalents
Gracias por su
atención
José Juan RiveroEspecialista de Producto
GC y GCMS
Agilent Technologies
Email: [email protected]
Tlf: 609426811 o 901116890