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C A U Christian-Albrechts-Universität zu Kiel
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Entwicklung stammspezifischer PCR-Systeme mittels subtraktiver
Hybridisierung anhand verschiedener Stämme von Milchsäurebakterien
Von Christian Stelter
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Überblick
1. „Subtraktive Hybridisierung“
Ziel der Methode?
Welche Vorteile?
2. Prinzipieller Ablauf der Methode
3. Praktische Ergebnisse
4. Ausblick
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Entwicklung
„Subtractive Hybridization“ als Basis, um
• genetische Unterschiede zu identifizieren.
Identifizierung von Genaktivität für
• Embryonalentwicklung
• Krebsentstehung
Identifizieren von Unterschieden im Genom
• verschiedener Stämme von Bakterien
• komplexer eukaryotischer Lebewesen
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Biotechnologie in menschlichen Kulturen
• unkontrollierte Fermentation
• 6000 v. Chr. Alkoholische Getränke im Zweistromland
Milchwirtschaft durch Nomaden in Zentralasien
Ziel: Konservierung und Veredelung von Lebensmitteln
D a m als
H e u te
Star
terk
ultu
ren
1 . G e n e ra tio n
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Notwendigkeit zur Diagnose
D a m als
H e u te
Star
terk
ultu
ren
1 . G e n e ra tio n
2 . G e n e ra tio n
3 . G e n e ra tio n
• genetische Identität
• Stabilität von Starterkulturen
• hygienische Risiken
• wirtschaftliche Effizienz
routinemäßige Verifikation
durch genetische Fingerabdrücke
![Page 7: C A U Christian-Albrechts-Universität zu Kiel. Entwicklung stammspezifischer PCR- Systeme mittels subtraktiver Hybridisierung anhand verschiedener Stämme](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062512/55204d7d49795902118cd017/html5/thumbnails/7.jpg)
Notwendigkeit zur Diagnose
D a m als
H e u te
Star
terk
ultu
ren
1 . G e n e ra tio n
2 . G e n e ra tio n
3 . G e n e ra tio n
• Fingerprinting
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Notwendigkeit zur Diagnose
D a m als
H e u te
Star
terk
ultu
ren
1 . G e n e ra tio n
2 . G e n e ra tio n
3 . G e n e ra tio n
4 . G e n e ra tio n • Verständnis probiotischer Eigenschaften
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Anwendbarkeit der SSH
Genomische Unterschiede identifizieren/isolieren
Um darauf aufbauend
a) Funktion der unterschiedlichen DNA zu analysieren
b) PCR-basierende Nachweissysteme zu erstellen
c) Eigenschaften in weiteren MOs zu detektieren
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Subtraktive Hybridisierung
dominante Quelle der genomischen Variation: Insertionen oder Deletionen großer (10 bis 50 kb) DNA-Regionen
S ta m m A S ta m m B
=
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Subtraktive Hybridisierung
gezielte Identifikation von Unterschiedenbesonders vorteilhaft
S ta m m A S ta m m B
=
![Page 12: C A U Christian-Albrechts-Universität zu Kiel. Entwicklung stammspezifischer PCR- Systeme mittels subtraktiver Hybridisierung anhand verschiedener Stämme](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062512/55204d7d49795902118cd017/html5/thumbnails/12.jpg)
Subtraktive Hybridisierung
S ta m m A S ta m m B
- =sp ez ifisch e F ra g m en tefü r S ta m m A
![Page 13: C A U Christian-Albrechts-Universität zu Kiel. Entwicklung stammspezifischer PCR- Systeme mittels subtraktiver Hybridisierung anhand verschiedener Stämme](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062512/55204d7d49795902118cd017/html5/thumbnails/13.jpg)
Subtraktive Hybridisierung
S ta m m B S ta m m A
- =sp ez ifisch e F ra g m en tefü r S ta m m B
![Page 14: C A U Christian-Albrechts-Universität zu Kiel. Entwicklung stammspezifischer PCR- Systeme mittels subtraktiver Hybridisierung anhand verschiedener Stämme](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062512/55204d7d49795902118cd017/html5/thumbnails/14.jpg)
Subtraktive Hybridisierung
Ausgangs-material
S ta m m A S ta m m B
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Ablauf der Subtraktiven Hybridisierung
Fragmentieren
S ta m m A S ta m m B
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Ablauf der Subtraktiven Hybridisierung
Mischen
S ta m m A S ta m m B+
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Ablauf der Subtraktiven Hybridisierung
Denaturieren
S ta m m A S ta m m B+
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Ablauf der Subtraktiven Hybridisierung
Hybridisieren
S ta m m A S ta m m B+
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Ablauf der Subtraktiven Hybridisierung
Isolieren
h o m o lo g e B ere ich e A n re ich e ru n gs tam m sp ez ifisch e r
F rag m e n te
+
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wichtige Entwicklungsschritte
Entwicklungen innerhalb der „Subtraktiven
Hybridisierung“ betrafen die Isolierung der
stammspezifischen, einzelsträngigen DNA
a) Immobilisierung
b) Suppression Effekt
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Isolierung durch Immobilisierung
ImmobilisierteSubtraktor-DNA
S ta m m B
![Page 22: C A U Christian-Albrechts-Universität zu Kiel. Entwicklung stammspezifischer PCR- Systeme mittels subtraktiver Hybridisierung anhand verschiedener Stämme](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062512/55204d7d49795902118cd017/html5/thumbnails/22.jpg)
Isolierung durch Immobilisierung
Zugegebene,denaturierteProben-DNA
S ta m m A
S ta m m B
![Page 23: C A U Christian-Albrechts-Universität zu Kiel. Entwicklung stammspezifischer PCR- Systeme mittels subtraktiver Hybridisierung anhand verschiedener Stämme](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062512/55204d7d49795902118cd017/html5/thumbnails/23.jpg)
Isolierung durch Immobilisierung
HomologeDNA-Fragmente
werden demÜberstandentzogen
S ta m m A
S ta m m B
![Page 24: C A U Christian-Albrechts-Universität zu Kiel. Entwicklung stammspezifischer PCR- Systeme mittels subtraktiver Hybridisierung anhand verschiedener Stämme](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062512/55204d7d49795902118cd017/html5/thumbnails/24.jpg)
Suppression Subtractive Hybridization
Verwendung von Adaptoren
Vorteile:1) Geringste Mengen2) Suppression Effekt
s tam m sp ez if isc h e
F rag m e n te
F rag m e n te , d ie in b e id enS tä m m e n v o rh a n d en s in d
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Suppression Effekt
P C R -A m p lifik a tio n
U n te rd rü c k u n g
“H aa rn ad e l” -S ch le ife
Ve rv ie lfa ch u n g
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Vorteile der SH/SSH
• Geringe Materialanforderungen (PCR)
• bis zu 96% der Unterschiede identifizierbar
• Verzicht auf die Sequenzierung vollständiger Genome
• Reduktion des zeitlichen und finanziellen Aufwandes
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Bisherige Anwendung
Genomanalysen im medizinischen Bereich:
• Identifikation von Virulenzgenen
• neuartigen Restriktions-Modifikationssystemen
• Antibiotikaresistenzen
• Oberflächenstrukturen
• PAIs: „pathogenicity islands“
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Praktische Ergebnisse
Anwendung auf Milchsäurebakterien
Lactococcus St. 1760-1526
Lactococcus St. 1526-1760
• Isolierung der unterschiedlichen Regionen:
• Funktionen der unterschiedlichen Regionen
• Stammspezifische PCR-Systeme
• Suche nach Eigenschaften in anderen MOs
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Anreicherung stammspezifischer Fragmente
1526 – 1760 = ? 1760 – 1526 = ?
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Gefundene Unterschiede
Lactococcus Stamm 1760
• A2: Bacteriocin-Produktion
• A5: Funktion unbekannt
Lactococcus Stamm 1526
• A22: zellwandassoziierte Proteinase
• A23: Restriktionsmodifikationssystem
[subunit (hsdS) gene]
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PCR-Systeme auf die verwendeten Stämme
A2: Nisin
A5: ?
A22: Proteinase
A23: hsdSNisin
?
Proteinase
hsdS
1526 1760
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PCR-Systeme auf weitere Stämme
89 bp: ?
166 bp: Proteinase
271 bp: hsdS
322 bp: Nisin
![Page 33: C A U Christian-Albrechts-Universität zu Kiel. Entwicklung stammspezifischer PCR- Systeme mittels subtraktiver Hybridisierung anhand verschiedener Stämme](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062512/55204d7d49795902118cd017/html5/thumbnails/33.jpg)
Weitergehende Anwendungen
Identifizieren von probiotischen Eigenschaften
• größere Überlebensrate
• dauerhafte Ansiedlung
• Reduktion von mutagenen Enzymen
• Stimulation von Makrophagen
Identifikation von gentechnisch veränderten Organismen
ehemalige Systementwicklung: Reaktionen auf Stress
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Danke
Danisco Cultor Niebüll GmbH
Dr. Udo Friedrich
PD Dr. Winfried Hausner
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Noch Fragen?
Wir haben einen Überschussan einfachen Fragenund einen Mangel
an einfachen Antworten.
Lothar Schmidt
![Page 36: C A U Christian-Albrechts-Universität zu Kiel. Entwicklung stammspezifischer PCR- Systeme mittels subtraktiver Hybridisierung anhand verschiedener Stämme](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062512/55204d7d49795902118cd017/html5/thumbnails/36.jpg)
Immer noch Fragen?
Gott weiß alles,sagt es aber nicht.
Ich weiß nichtsund sage alles.
unbekannt
![Page 37: C A U Christian-Albrechts-Universität zu Kiel. Entwicklung stammspezifischer PCR- Systeme mittels subtraktiver Hybridisierung anhand verschiedener Stämme](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062512/55204d7d49795902118cd017/html5/thumbnails/37.jpg)
Suppression Subtractive Hybridization
Ligation vonAdaptor 2
Tester DNA m it Adaptor 2Driver DNA (im Überschuss)
Erste Hybridisierungm it Denaturierung
Tester DNA m it Adaptor 1
Ligation vonAdaptor 1
Tester DNADriver DNA
EnzymatischerVerdau
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Suppression Subtractive Hybridization
Zweite Hybridisierung ohne Denaturierung
Tester-Tester Hom ohybride
Tester-Tester Heterohybride
Tester-Driver Heterohybride
ds-Driver
ss-Driver
ss-Tester
Auffüllen der Enden
A A
C C
B B
D D
E
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Suppression Subtractive Hybridization
Zugabe der PrimerPCR-Amplifikation
Zugabe der PrimerPCR-Amplifikation
Nested PCR
E
A
C
B
DAufschm elzen
“Haarnadel”-Schleife
Elongation
Prim er-Annealing
Self-Annealing
ern
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ter
PC
R-Z
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PC
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Tester-TesterHom ohybride
ITRITR