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FILTRACION POR MEMBRANA
CALIDAD DEL AGUAENUMERACIN DEESCHERICHIA COLI Y BACTERIAS
COLIFORMES- PARTE 1: MTODO DEFILTRACION POR MEMBRANA PARA AGUAS
CON FLORA BACTERIANA BAJA.
NCh ISO 9308/1
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FILTRACION POR MEMBRANA
NORMA QUE SE APLICA AL AGUA CON UNBAJO NUMERO DE BACTERIAS.
ESPECIAL PARA AGUAS CON MENOS DE 100COLONIAS TOTALES EN EL AGARCROMOGNICO PARA COLIFORMES (CCA).
http://www.yarethquimicos.uuuq.com/FOTOS%20DE%20EQUIPOS/EQUIPO%20DE%20FILTRACION%20DESECHABLE%20NALGENE%20MF75%20MEMBRANA%20EN%20PES-POLIETERSULFONA.jpghttp://2.bp.blogspot.com/_1o2f9bOfYR4/S1gHAEXrq9I/AAAAAAAAGao/IueDlfT6_lw/s400/PRL+OBLIGACION+agua+potable.jpghttp://radio.rpp.com.pe/saludenrpp/files/2010/07/AGUA-POTABLE.jpg -
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ESPECIAL PARA AGUAS CON MENOS DE 100COLONIAS TOTALES EN EL AGARCROMOGNICO PARA COLIFORMES (CCA).
LAS AGUAS PUEDEN SER AGUAS POTABLES,AGUA DE PISCINA DESINFECTADA, O AGUATRATADA PROVENIENTES DE PLANTAS DE
TRATAMIENTO DE AGUA POTABLE.
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FILTRACION POR MEMBRANA
PRINCIPIO: SE BASA EN LA FILTRACIN DEUNA PORCIN DE LA MUESTRA A TRAVSDE UN FILTRO DE MEMBRANA, LA CUAL
RETIENE LOS ORGANISMOS, Y UBICACINDEL FILTRO DE MEMBRANA SOBRE UNAPLACA DE AGAR CROMOGNICO PARACOLIFORMES. INCUBACIN DEL FILTRO DE
MEMBRANA A 36 2C DURANTE 21 3 H.
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RECUENTO DE COLONIAS -D-GALACTOSIDASA POSITIVAS ( de color rosadoa rojo) como bacterias coliformes presuntivas
que no son E.coli. Para evitar resultados falsospositivos, causados por bacterias oxidasapositivas, como por ejemplo, Aeromonas spp,
las cuales deben ser confirmadas por unareaccin oxidasa negativa.
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Recuento de las colonias -D-galactosidasa y-D- glucuronidasa positivas (de color azuloscuraa violeta.) como E.coli.
Las bacterias coliformes totales son la sumade las colonias oxidasa negativas con un colorrosado a rojo y todas las colonias de color azul
oscuroa violeta.
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REACTIVOS Y MEDIOS DE CULTIVO AGUA DESTILADA
AGUA TAMPONADA PARA DILUCIN:
SOLUCIN STOCK DE FOSFATO MONOPOTSICO: 34 gKH2PO4 en 500 ml de agua destilada, ajustar pH a 7.2 +/- 0.5con NaOH 1N y diluir a 1 l.
SOLUCIN STOCK DE SULFATO DE MAGNESIO: 50 g MgSO4 en1 l de agua destilada.
SOLUCIN STOCK DE CLORURO DE MAGNESIO: 38 g MgCl2en 1 l de agua destilada.
Se agrega 1.25 ml de solucin stock de fosfato mono potsicoy 5 ml de sulfato de magnesio o solucin stock de cloruro demagnesio a 1 l de agua destilada. Esterilizar en autoclave a121c por 15 min.
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REACTIVOS Y MEDIOS DE CULTIVO
AGAR CROMOGENICO PARA COLIFORMES(CCA):
SUSPENDER EL MEDIO EN AGUA PORCALENTAMIENTO CON AGITACIN FRECUENTEHASTA QUE SE DISUELVA POR COMPLETO (35MIN). NO AUTOCLAVAR.
DISPENSAR EN PLACAS A UNA PROFUNDIDAD
DE AL MENOS 4 mm.
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LAS PLACAS SE PUEDEN ALMACENAR A
5 3C EN LA OSCURIDAD, DURANTE 1 MES.
(ISO/TS11133-1:2000 NCh3162/1.Of2008 4.4.4.) ANTES DEL USO DE LAS PLACAS NO DEBE
HABER HUMEDAD VISIBLE.
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REACTIVO OXIDASA.
AGAR TRIPTONA SOYA (TSA). LAS PLACAS SEPUEDEN ALMACENAR A 5 3C EN LAOSCURIDAD Y PROTEGER DE LA EVAPORACINDURANTE AL MENOS OCHO SEMANAS.
(ISO/TS11133-1:2000 NCh3162/1.Of20084.4.4.)
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APARATOS PIPETAS PASTEUR
AUTOCLAVE BOMBA PARA HACER VACO EQUIPO DE FILTRACIN POR MEMBRANA, ESTRIL, DE
VIDRIO, PLSTICO ESTERILIZABLE O ACERO INOXIDABLE.
PEACHMETRO ESTUFA DE CULTIVO ESTERILIZADOR FILTROS DE MEMBRANAS DE STERES DE CELULOSA
POLIMERIZADOS, CUADRICULADAS, ESTRILES, DE 47 mm
DE DIMETRO Y DE 0.45 un DE POROSIDAD. PINZAS DE BORDES LISOS PLACAS DE PETRI DE 50 mm DE DIMETRO POR 12 ml DE
PROFUNDIDAD.
http://img86.imageshack.us/img86/1425/pinzasanatomicayquirurgicacopy.gifhttp://beltec.com.pe/beltec/images/bomba%20vacio.jpg -
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PROCEDIMIENTO
FILTRACION:
Armar el equipo de filtracin. Revisar que seencuentre esterilizado.
http://www.teknokroma.es/Usr/Productos/Img/662-1.jpg -
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PROCEDIMIENTO
Con ayuda de una pinza esterilizada porflameo, tomar una membrana y colocarlasobre el portafiltro con la parte cuadriculadahacia arriba.
Colocar cuidadosamente sobre el portafiltro elembudo y cerrar.
http://www.labotienda.com/es/catalogo/separacion-filtracion_filtracion_papel-de-filtro_Membranas-cuadriculadas-25-mm-poro-0.45-c-100.aspx -
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PROCEDIMIENTO
Agregar agua tamponada para dilucin(MADILHL) a la membrana para humedecerla,filtrndola bajo vaco parcial.
http://www.google.cl/imgres?imgurl=http://www.auxilab.es/imagenes/fotos/filtracion/15002310.jpg&imgrefurl=http://www.auxilab.es/es/catalogo/separacion-filtracion_filtracion.aspx&usg=__2BhSmHM1pyZ-GfeqDbIfzrXtQ_s=&h=567&w=400&sz=63&hl=es&start=122&zoom=1&um=1&itbs=1&tbnid=4xh2vblkivqnOM:&tbnh=134&tbnw=95&prev=/images?q=filtracion&start=120&um=1&hl=es&sa=N&rlz=1T4RNSN_esCL394CL394&ndsp=20&tbs=isch:1http://www.aguanorsur.com.ar/agua-potable.jpg -
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PROCEDIMIENTO
Agitar vigorosamente durante algunos
segundos el frasco que contiene la muestra,destaparlo y flamear la boca del frasco.
http://cidbimena.desastres.hn/docum/ops/publicaciones/who91s/p037e.jpghttp://www.madrimasd.org/madridporlaciencia/Feria_VIII/gestion/files/img/actividades/67_1.jpg -
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PROCEDIMIENTO
En una probeta estril medir 100 ml de
muestra a filtrar y vaciarla dentro del embudo.
http://www.labotienda.com/imagenes/fotos/filtracion/18002301.jpghttp://www.google.cl/imgres?imgurl=http://es.unsbiz.com/MOUNT/ES/upload/supply/2009/02/18/1D4B3C69FD9DD52A9EEEEFBA6C9D88FD_1234928073246827.jpg&imgrefurl=http://es.unsbiz.com/companySite/findGoods.do?method=detail&id=213953&flag=0&usg=__tzZ_9Iw2IY9r6mt0de6XSS6_wok=&h=829&w=400&sz=51&hl=es&start=8&zoom=1&um=1&itbs=1&tbnid=LC5GcqIZWJaR0M:&tbnh=144&tbnw=69&prev=/images?q=probetas&um=1&hl=es&rlz=1T4RNSN_esCL394CL394&tbs=isch:1http://www.motordehidrogeno.net/sites/motordehidrogeno.net/files/imagenes/agua.jpg -
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PROCEDIMIENTO
Filtrar la muestra bajo vaco parcial.
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PROCEDIMIENTO
LAVAR EL EMBUDO CON ELFILTRO DE MEMBRANA, CONTRES PORCIONES DE 20 A 30 ml
DE AGUA DE DILUCIN ESTRIL,APLICANDO VACO.
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20 A 30 ml LAVAR 3 VECES.
http://www.kalipedia.com/kalipediamedia/cienciasnaturales/media/200709/24/fisicayquimica/20070924klpcnafyq_16.Ges.SCO.pnghttp://img137.imageshack.us/img137/2706/71074450.jpghttp://www.kalipedia.com/kalipediamedia/cienciasnaturales/media/200709/24/fisicayquimica/20070924klpcnafyq_16.Ges.SCO.png -
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PROCEDIMIENTO
Sacar el embudo y en forma inmediata tomarel filtro con la ayuda de las pinzas estriles ycolocarlo con la parte cuadriculada haciaarriba sobre una placa de petri con AGAR
CROMOGNICO PARA COLIFORMES (CCA).
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PROCEDIMIENTO INCUBACIN: Colocar el filtro de membrana
sobre AGAR CCA mediante movimientorotatorio sobre la superficie del medio paraevitar atrapamiento de aire.
Incubar las placas en posicin invertida, a
36c 2C por 21 3 h. (Equipo 79)
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CONTAR TODAS LAS COLONIAS QUEPROPORCIONES UNA REACCIN -D-GALACTOSIDASA Y -D-GLUCURONIDASA
POSITIVA (DE COLOR AZUL OSCURO AVIOLETA) COMO E.COLI.
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UNA VEZ CONTADAS ANOTAR EN HOJA DERESULTADOS RM 21.4 EN LA FILA QUE DICE:
NMERO DE COLONIAS DE COLOR AZUL
OSCURO A VIOLETA (E.COLI).
Y LUEGO EN LA FILA QUE DICE:
RESULTADOS DE E.COLI NMERO/100 ml
EXPRESION DE RESULTADOS
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EXPRESION DE RESULTADOS
Ejemplo:
Al sacar las placas de MACCA, se contaron 74colonias de color azul oscuro a violeta.
Por lo tanto:
RESULTADO DE E.COLI NMERO/100 ml= 74
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EXAMINAR LOS FILTROS DE MEMBRANA YCONTAR TODAS LAS COLONIAS QUEPROPORCIONEN UNA REACCIN -D-
GALACTOSIDASA POSITIVA (DE ROSADOAROJO) COMO BACTERIAS COLIFORMESPRESUNTIVAS QUE NO SON E.COLI.
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Preparar subcultivo:
Si muchas colonias han crecido en el filtro demembrana.
O si la colonias presuntivas est ubicada juntoa otras colonias.
O si las colonias presuntivas son muypequeas para un desempeo confiable delensayo de oxidasa.
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Realizar aislacin en el agar TSA 36C 2Cpor 21 3 h.
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Para confirmar las bacterias coliformespresuntivas que no son E.coli, se debe realizarun ensayo de oxidasa.
Testear todas o al menos 10 colonias de colorrosadoa rojo.
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REALIZAR EL TEST DE OXIDASA A LASCOLONIAS PRESUNTIVAS O AL MENOS A 10.
SE MUESTRA UNA REACCIN POSITIVA POR LAAPARICIN DE UN COLOR AZUL OSCURODENTRO DE 30 s.
ESTO NO SE DEBE OBSERVAR PARA LAS
BACTERIAS COLIFORMES YA QUE SONOXIDASA NEGATIVA.
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SI SE OBTIENE EN EL CONTEO 60 COLONIAS,60 DE COLOR ROSADO A ROJO PRESUNTIVASPARA COLIFORMES.
SE DEBEN PASAR DE LAS 60 COLONIAS, 10COLONIAS A CONFIRMACION.
EN LA HOJA DE RESULTADO RM21.4 SE ANOTA
EL CONTEO DE LAS COLONIAS 60 COLONIASEN LA FILA DONDE SE ENCUENTRA EL MEDIOMACCA.
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DE LAS 60 COLONIAS DE COLIFORMES SETRASPASAN 10 COLONIAS A CONFIRMACION. Y SEANOTAN 10 EN LA FILA NMERO DE COLONIASDE COLOR ROSADO A ROJO.
DE LAS COLONIAS TRASPASADAS SE REALIZA TESTDE OXIDASA Y SI DA EN TODAS LAS COLONIASOXIDASA NEGATIVA SIGNIFICA QUE SE
CONFIRMAN LAS 10 COLONIAS , POR LO TANTOEL TOTAL DE COLONIAS, ES DECIR LAS 60COLONIAS.
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EXPRESIN DE RESULTADOS
EN EL CASO EN QUE EL MTODO USADOREQUIERA UNA IDENTIFICACIN, INOCULARUN NMERO DETERMINADO,A,
(generalmente 10 colonias) DE COLONIAS DELA PLACA SELECCIONADA PARA EL RECUENTODE COLONIAS.
DESPUS DE IDENTIFICAR, CALCULAR PARACADA PLACA, EL NMERO DE M.O.IDENTIFICADOS, a, USANDO:
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EXPRESIN DE RESULTADOS
=
xC donde: A= nmero de colonias inoculadas
B= nmero de colonias que cumple con los criterios deidentificacin
C= nmero total de colonias contadas
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EXPRESIN DE RESULTADOS
Ejemplo:
Se cuentan en placas de agar MACCA, 60colonias de color rosado a rojo, y se pasan a
confirmacin 10 colonias.
De las 10 colonias sometidas a test de oxidasa,7 dan oxidasa (-) y 3 oxidasa (+).
Calcular el resultado de colonias decoliformes, para este caso.
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EXPRESIN DE RESULTADOS
A= colonias inoculadas, 10 colonias
b= nmero de colonias que cumple con elcriterio de identificacin, 7 colonias.
C= nmero total de colonias contadas, 60colonias.
Aplico:
A= _7_ x 60 A= 42 colonias
10
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42 COLONIAS CONFIRMADAS PARA COLIFORMES. LAS CUALES SE DEBEN ANOTAR EN LA FILA QUE
DICE:NMERO DE COLONIAS DE COLOR ROSADO
A ROJO CONFIRMADAS Y EN LA FILA QUE DICE.
RESULTADOS DE COLIFORMES: ES LA SUMA DELAS COLONIAS CONFIRMADAS DE COLIFORMES +
LAS COLONIAS DE E.COLI. 42+74= 116 COLONIAS DE COLIFORMES.
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La cantidad de bacterias coliformes es la sumade todas las colonias oxidasa negativas decolor rosadoa rojoms todas las colonias de
color azul oscuro a violeta.
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EXPRESIN DE RESULTADOS
De las cantidades de colonias confirmadascontadas en el filtro de membranas calcular lacantidad de E.coli y bacterias coliformes
presentes en 100 ml de la muestra.
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La cantidad de E.coli corresponde a todas lascolonias de color azul oscuro a violeta.
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CONTROL DEL MTODO
CONTROLES POSITIVOS:
E.COLI Y E. AEROGENES
CONTROL NEGATIVO: E.FAECALIS
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CONTROL DE CALIDAD
CONTROL DE MADIL L
FILTRO MADIL
BLANCO CCA
PLACA ABIERTA
PLACA CERRADA
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EJERCICIOS
En un conteo en medio MACCA se encontr losiguiente:
16 colonias rosadas a roja y 7 colonias azules
oscura a violeta. De las 16 colonias dieron 8colonias oxidasa negativa.
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16 colonias presuntivas de coliformes.
a= _8_ x 16 = 12,8 = 13 colonias
10
13 colonias de coliformes + 7 colonias de e.coli
Total de coliformes: 20 nmero/100 ml E.coli: 7 nmero/100 ml
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EJERCICIOS
Se encuentran en una placa de MACCA 7colonias rojas y oxidasa negativa y 12 azules.Calcular resultado de e.coli y coliformes.
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EJERCICIOS
Resultado de coliformes nmero/ml= 19
Resultado de e.coli nmero /ml= 12
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EJERCICIOS
En una placa de agar MACCA se encuentran 43colonias azules y 53 colonias rosadas, de lascuales se confirmaron 9 colonias.
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43 nmero/ml de e.coli.
= _9_ x 53 = 47,7 = 48 nmero/ml de coliformes
10
48 + 43 = 91 nmero / ml de colonias de
coliformes.
http://3.bp.blogspot.com/_WKM9uuEHCu0/ScOaESPcORI/AAAAAAAAAgk/yRMnmuIwl1I/s400/agua+potable+3.jpg -
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