Inmunopatología de la Infección por VIH-1
Prof. Edwin Escobar [email protected]
Universidad Central de Venezuela
Facultad de Medicina
Escuela de Medicina “José María Vargas”
Cátedra de Inmunología
Tema 24 2017-2018
• Recuento Histórico •Primeros Reportes •Grupos de Riesgo •Vías de Transmisión •Aislamiento del Virus
• Aspectos Clínicos •Curso Clínico de la Infección •Diagnóstico
•ELISA •Western Blot
•Seguimiento •Carga Viral •Subpoblaciones de Linfocitos T
• Inmunopatogénesis •Afección del Sistema Inmunitario •Resultados en Nuestros Pacientes
• El Virus •Proceso de Invasión Celular •Células Susceptibles a la Infección •Ciclo de Replicación •Tratamiento •Cuasiespecies
Inmunopatología de la
Infección por VIH-1
• Epidemiología •Global •Latinoamérica •Venezuela
1er. Reporte de la Inmunodeficiencia
5 de Junio de 1981
Gottlieb et al; Mor Mrt Wkly Rep 1981; 30(21): 250-252
Grupos de Riesgo
Adictos a Drogas Intravenosas
An outbreak of community-acquired Pneumocystis
carinii pneumonia:
initial manifestation of cellular immune dysfunction
Masur et al, N Engl J Med 1981 Dec 10; 305(24):1431-8
Grupos de Riesgo
Receptores de
Derivados Sanguíneos
Pneumocystis carinii Pneumonia among Persons
with Hemophilia A CDC, MMWR Morb Mortal Wkly Rep 1982 Jul 16; 31(27):365-7.
Possible Transfusion-Associated Acquired Immune
Deficiency Syndrome (AIDS) - California CDC, MMWR Morb Mortal Wkly Rep 1982 Dec 10; 31(48):652-4.
Grupos de Riesgo
Mujeres Parejas Sexuales de Hombres en Riesgo
Opportunistic infection in previously healthy women. Initial
manifestations of a community-acquired cellular
immunodeficiency Masur H et al; Ann Intern Med 1982 Oct; 97(4):533-9
Immunodeficiency among Female Sexual Partners of Males
with Acquired Immune Deficiency Syndrome (AIDS) - New York CDC, MMWR Morb Mortal Wkly Rep 1983 Jan 7; 31(52):697-8
Unexplained Immunodeficiency and Opportunistic
Infections in Infants - New York, New Jersey, California CDC, MMWR Morb Mortal Wkly Rep 1982 Dec 17; 31(49):665-7
Grupos de Riesgo
Recién Nacidos: Hijos de Madres en Grupos de Riesgo
Grupos de Riesgo
África: Población Heterosexual Promiscua
Adquired immune deficiency syndrome in Black Africans Clumeck et al, Lancet 1983 Mar 19; 1(8325):642
Adquired immune deficiency syndrome in a heterosexual
population in Zaire Piot et al, Lancet 1984 Jul 14; 2(8394):65-69
• Población Heterosexual Promiscua
• Pacientes Homosexuales Masculinos
• Mujeres, Parejas Sexuales de Hombres en Riesgo
• Receptores de Derivados Sanguíneos
• Adictos a Drogas Intravenosas
• Recién Nacidos, Hijos de Madres en Grupos de Riesgo
Grupos de Riesgo y
Vías de Trasmisión
Relaciones
Sexuales
Vía Sexual
Trasmisión Vertical
De Madre a Feto
Vía Sanguínea
Presente en
Sangre
Isolation of a T-Lymphotropic Retrovirus from a Patient
at Risk for Acquired Immune Deficiency Syndrome (AIDS) Barré-Sinoussi et al, Science 1983; 220:868-871
20 de Mayo de 1983
1er. Reporte del
Aislamiento del Virus
Hallazgos confirmatorios
VIH-1: Agente Causal del SIDA
Frequent detection and isolation of cytopathic retroviruses
(HTLV-III) from patients with AIDS and at risk of AIDS Gallo et al, Science 1984; 224(4648):500-503
Isolation of lymphocytopathic retroviruses from San
Francisco patients with AIDS Hoffman et al, Science 1984; 225(4664):840-842
4 de Mayo de 1984
Determinación de Anticuerpos Específicos
Pruebas Diagnósticas (ELISA, Western Blot)
Antibodies reactive with Human T-Lymphotropic
Retroviruses (HTLV-III) in serum of patients with AIDS Sarngadharan et al, Science 1984; 224(4648):506-508
Serological analysis of a subgroup of Human T-
Lymphotropic Retroviruses (HTLV-III) associated with AIDS Shupbach et al, Science 1984; 224(4648):503-505
Epidemia del SIDA 2016
http://www.unaids.org/en/resources/documents/2017/20170720_Core_epidemiology_slides
Personas Infectadas
36.7 millones [30.8–42.9 millones]
Personas Infectadas con VIH-1 1990 - 2016
http://www.unaids.org/en/resources/documents/2017/2017_data_book
Adultos y Niños Infectados con VIH-1 (estimación)
Rango de Incertidumbre
Global
Nuevas Infecciones por VIH-1 1990 - 2016
http://www.unaids.org/en/resources/documents/2017/2017_data_book
Nuevas Infecciones por VIH-1 en Adultos y Niños (estimación)
Rango de Incertidumbre
Global
Muertes Asociadas con el VIH-1 1990 - 2016
http://www.unaids.org/en/resources/documents/2017/2017_data_book
Muertes Asociadas al VIH-1 en Adultos y Niños (estimación)
Rango de Incertidumbre
Global
Epidemia del SIDA
http://www.unaids.org/en/resources/documents/2017/2017_data_book
2017
Personas Infectadas
Global: 36,7 millones
Latinoamérica: 1,8 millones
Venezuela: 120.000
Nuevas Infecciones
Global: 1,8 millones Latinoamérica: 97.000
Venezuela: 6.500
Muertes Relacionadas con el VIH-1
Global: 1,0 millón
Latinoamérica: 36.000
Venezuela: 2.500
(30,8 – 42,9 millones)
(1,4 – 2,1 millones)
(110.000-130.000)
(1,6 – 2,1 millones)
(79.000 – 120.000)
(5.800-7.100)
(830.000 – 1,2 millones)
(28.000-45.000)
(2.100-2.900)
Trabajadores Sexuales
Adictos a
Drogas Intravenosas
Contacto
Homosexual Masculino
Transgénero
Parejas Sexuales
De Grupos en Riesgo
Resto de
La Población
Población en Mayor Riesgo de Infección por VIH-1 A Nivel Mundial
http://www.unaids.org/en/resources/documents/2017/2017_data_book
Excluyendo a África Sub-Sahariana
Estructura del VIH-1
http://commons.wikimedia.org/wiki/File:HIV_Virion-en.png
Familia: Retroviridae Subfamilia: Lentivirinae Género: Lentivirus
Organización Genética del VIH-1
Emerman M; Current Biology 1996; 6(9):1096-1103
Proteínas Estructurales •Gag: nucleocápside (p7), cápside (p24), matriz (p17)
•Pol: transcriptasa inversa, integrasa, proteasa
•Env: glicoproteínas de envoltura (gp120, gp41)
Proteínas Reguladoras •Tat: trans-activador viral de transcripción
•Rev: regulador de expresión de proteínas virales
Proteínas Accesorias •Nef: factor negativo
•Vif: factor viral de infectividad
•Vpr: proteína viral r
•Vpu: proteína viral u
Proceso de Invasión Viral
Membrana
Célula Blanco
Membrana
Viral
Receptor
CD4
Correceptores
CCR5, CXCR4
Infección por VIH-1
Células Susceptibles
• Interacción Virus-Célula Blanco – Molécula Receptora: CD4
– Moléculas Co-receptoras: CCR5, CXCR4
• Células Susceptibles
–Linfocitos T CD4+
–Monocitos/Macrófagos
–Células Dendríticas
Ciclo de Replicación del VIH-1
Barré-Sinoussi F et al.; Nat Rev Microbiol 2013; 11:877–883
CD4
CCR5 CXCR4
Variabilidad Genética del VIH-1
Cuasiespecies
Secuencia Consenso
Ciclo de
Replicación
Secuencia Consenso
Ciclo de
Replicación
Secuencia Consenso
Microbio Mol Biol Rev 2012; 76(2):159-216
Microbio Mol Biol Rev 2012; 76(2):159-216
Enorme Reto
• Sistema Inmunitario: Evasión de la respuesta
• Tratamiento Anti-Retroviral: Resistencia
Variante Viral
Predominante
(Fitness)
Variabilidad Genética del VIH-1
Cuasiespecies
Curso Clínico de la Infección por VIH-1
Modificado de: Fauci AS et al.: Harrison: Principios de Medicina Interna, 17ª Edición
Infección por VIH-1
Diagnóstico y Seguimiento • Diagnóstico: confirmar la infección por VIH-1
– Detección de Anticuerpos* Específicos
• ELISA (1ra, 2da, 3ra y 4ta Generación): *4ta. también detecta Ag virales (p24)
• Western Blot (Prueba Confirmatoria, hacia el desuso)
• Seguimiento: evaluar la progresión de la infección
– Carga Viral: cantidad de virus en circulación
• PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa): cuantificación de ARN Viral
– Subpoblaciones de Linfocitos T: determinación de
Linfocitos T CD4+ y T CD8+
• Citometría de Flujo
– Clínica: evaluación general, signos y síntomas del paciente
Infección por VIH-1
http://www.cdc.gov/hiv/pdf/hivtestingalgorithmrecommendation-final.pdf
Infección por VIH-1
p24 de VIH-1
ARN de VIH-1 Anticuerpos
anti-VIH-1
Días de Infección
Infección Aguda Infección Crónica
Ventana de
Seroconversión
Período de
Eclipse
Diagnóstico de Infección por VIH-1
ELISA de 1ra. Generación
http://www.cdc.gov/hiv/pdf/hivtestingalgorithmrecommendation-final.pdf
Sensibilidad Limitada
Proteínas Celulares Contaminantes
Reactividad Cruzada
Fase de
Captura
Ag de VIH-1 Lisado Viral
(Cultivo Celular)
Marcador
Identificado
IgG anti-VIH-1 Anticuerpos en
Sangre del Paciente
Fase de
Detección
Anti-IgG Conjugados a
Enzima
Revelado
Reacción de Color Sustrato Apropiado
ARN de VIH-1 Anticuerpos
anti-VIH-1
Infección por VIH-1
p24 de VIH-1
ARN de VIH-1 Anticuerpos
anti-VIH-1
Días de Infección
Infección Aguda Infección Crónica
Ventana de
Seroconversión
Período de
Eclipse
IgG anti-VIH-1 ELISA 1G
Diagnóstico de la Infección por VIH-1
http://www.cdc.gov/hiv/pdf/hivtestingalgorithmrecommendation-final.pdf
Diagnóstico de Infección por VIH-1
ELISA de 2da. Generación
http://www.cdc.gov/hiv/pdf/hivtestingalgorithmrecommendation-final.pdf
Fase de
Captura
Ag de VIH-1/VIH-2 Péptidos Sintéticos
Proteínas Recombinantes
Marcador
Identificado
IgG anti-VIH-1/VIH-2 Anticuerpos en
Sangre del Paciente
Fase de
Detección
Anti-IgG
Proteína A Conjugados a
Enzima
Revelado
Reacción de Color Sustrato Apropiado
VIH-1, VIH-2
Mejora Sensibilidad
No Proteínas Celulares Contaminantes
Mejora Especificidad
ARN de VIH-1 Anticuerpos
anti-VIH-1
Infección por VIH-1
p24 de VIH-1
ARN de VIH-1 Anticuerpos
anti-VIH-1
Días de Infección
Infección Aguda Infección Crónica
Ventana de
Seroconversión
Período de
Eclipse
IgG anti-VIH-1 ELISA 1G
IgG anti-VIH-1 / VIH-2
ELISA 2G
Diagnóstico de la Infección por VIH-1
http://www.cdc.gov/hiv/pdf/hivtestingalgorithmrecommendation-final.pdf
Diagnóstico de Infección por VIH-1
ELISA de 3ra. Generación
http://www.cdc.gov/hiv/pdf/hivtestingalgorithmrecommendation-final.pdf
Fase de
Captura
Ag de VIH-1/VIH-2 Péptidos Sintéticos
Proteínas Recombinantes
Marcador
Identificado
IgM e IgG
anti-VIH-1/VIH-2 Anticuerpos en
Sangre del Paciente
Fase de
Detección
Ag Virales Conjugados a
Enzima
Revelado
Reacción de Color Sustrato Apropiado
VIH-1, VIH-2
Detecta IgM e IgG
Detección más Temprana
ARN de VIH-1 Anticuerpos
anti-VIH-1
Infección por VIH-1
p24 de VIH-1
ARN de VIH-1 Anticuerpos
anti-VIH-1
Días de Infección
Infección Aguda Infección Crónica
Ventana de
Seroconversión
Período de
Eclipse
IgG anti-VIH-1 ELISA 1G
IgG anti-VIH-1 / VIH-2
ELISA 2G
IgM / IgG anti-VIH-1 / VIH-2
ELISA 3G
Diagnóstico de la Infección por VIH-1
http://www.cdc.gov/hiv/pdf/hivtestingalgorithmrecommendation-final.pdf
Diagnóstico de Infección por VIH-1
ELISA de 4ta. Generación
http://www.cdc.gov/hiv/pdf/hivtestingalgorithmrecommendation-final.pdf
Revelado
Reacción de Color Sustrato Apropiado
Fase de
Captura
Anti-p24
Ag de VIH-1/VIH-2 Péptidos Sintéticos
Proteínas Recombinantes
Marcador
Identificado
Ag p24
IgM e IgG anti-VIH-1/VIH-2
Ac y Ag en
Sangre del Paciente
VIH-1, VIH-2
Detecta Antígeno Viral (p24)
Detecta IgM e IgG
Detección más Temprana
Fase de
Detección
Anti-p24
Ag Virales Conjugados a Enzima
E
ARN de VIH-1 Anticuerpos
anti-VIH-1
Infección por VIH-1
p24 de VIH-1
ARN de VIH-1 Anticuerpos
anti-VIH-1
Días de Infección
Infección Aguda Infección Crónica
Ventana de
Seroconversión
Período de
Eclipse
Acs: IgG anti-VIH-1 ELISA 1G
Acs: IgG anti-VIH-1 / VIH-2 ELISA 2G
Acs: IgM / IgG anti-VIH-1 / VIH-2 ELISA 3G
Acs: IgM / IgG anti-VIH-1 / VIH-2; Ags: p24 ELISA 4G
Carga Viral PCR
Diagnóstico de la Infección por VIH-1
http://www.cdc.gov/hiv/pdf/hivtestingalgorithmrecommendation-final.pdf Neonatos
de madres infectadas
Diagnóstico de la Infección por VIH-1
Algoritmo Recomendado – CDC 2014
http://www.cdc.gov/hiv/pdf/hivtestingalgorithmrecommendation-final.pdf
• Cuantificación del virus presente (Copias de ARN de VIH-1)
– PCR Cuantitativo (<2 x 102 – 1 x 106)
• Más sensible para bajos valores de Carga viral
• Requiere 200 ul de muestra
– ADN de Cadena Ramificada (<5 x 102 – 1 x 106)
• Más preciso para altos valores de Carga Viral
• Requiere 2 ul de muestra
– NASBA (Nucleic Acid Sequence Based Amplification) (<4 x 103 – 1 x 106)
• Interpretación Clínica – Tomar en cuenta el tipo de ensayo utilizado
– Diferencias inter-ensayo de hasta 0,5 Log
Seguimiento de la Infección por VIH-1
Determinación de la Carga Viral
FSC
m
Población de Leucocitos Sangre Periférica
Granulocitos
Linfocitos
Monocitos
Monocito
Laser (Fuente de
Luz)
SSC
FSC
Citometría de Flujo
http://www.bdbiosciences.com
Dreamstime.com
Histograma
CD3 Intensidad de Fluorescencia (FL1 Log)
Análisis de Datos Intensidad de Fluorescencia
72%
Células Positivas para FL-1 (CD3)
Linfocitos T
Subpoblaciones de Linfocitos T
Porcentaje (%)
Recuento (Cél./µL)
Valores de Referencia
Leucocitos 7.400 4.100 – 10.900
Linfocitos Totales 25 1.850 2.200 – 4.200
Linfocitos T Totales 72 1.332 1.500 – 3.000
Linfocitos T CD4+ 12 222 800 – 1.900
Linfocitos T CD8+ 57 1.055 500 – 1.000
Relación CD4/CD8 0.21 1.5 – 2.4
VIH-1 afecta al Linfocito T
Activación Celular HLA-DR, CD38
Señales de Supervivencia IL-7Rα
Virgen / Memoria CD45RA / CD45RO
Funciones Efectoras Perforina
Coestimulación Negativa PD-1
Apoptosis CD95 Proliferación Celular
Producción de Citoquinas IFN-, IL-2
Linfocitos T Funcionalidad
• Destrucción de Células por Efectos Citopáticos • Destrucción Masiva de Linfocitos T CD4+ en Mucosas (CCR5+, Memoria Efectora)
• Disminución de la Vida Media de Linfocitos T (Turnover)
• Menor Producción de Linfocitos T (Timo, M.O., Ganglios)
• Aumento de Apoptosis (CD95)
• Menos Receptores de Supervivencia (IL-7, IL-7Rα)
• Aumento de Co-estimulación Negativa (PD-1)
• Activación Crónica (CD38, HLA-DR)
• Estimulación Antigénica Persistente • Daño a la mucosa intestinal – LPS Bacteriano
• Proteínas Virales (gp120, gp41)
• Agotamiento Funcional / Desacoplamiento Linf. T CD4 / T CD8
Inmunopatología de la Infección por VIH-1
Estudio de la funcionalidad de los linfocitos T en pacientes infectados con el VIH-1
Producción de Citoquinas in vitro
Producción de Citoquinas in vitro
Diseño Experimental
• Población Estudiada
– Grupo Control (C): individuos no infectados con VIH-1, asintomáticos (n=14)
– Pacientes: infectados con VIH-1, sin tratamiento anti-retroviral
• PA: Recuento de Linfocitos T CD4+ >350/μL (n=13)
• PB/C: Recuento de Linfocitos T CD4+ <350/μL (n=19)
• Muestra: Células Mononucleares de Sangre Periférica
• Condiciones de Cultivo: 72 horas
– Medio: Condiciones basales, sin estimulación
– PHA (Fitohemaglutinina): estimulación policlonal
– Env (gp41): estimulación específica con antígeno viral
• Determinaciones: IL-6, IL-10, TNF-α, IFN-γ
Producción de IL-6(CMSP Cultivadas por 72 Horas)
Co
ncen
tració
n d
e IL
-6 (
pg
/ml)
0
1500
3000
4500
6000
7500
C (VIH-) (n=14)
PA (VIH+; CD4>350/uL) (n= 13)
PB/C (VIH+; CD4<350/uL) (n=19)
PHA EnvMedioCondiciones de Cultivo
(Estímulos)
p<0.05:
: vs. Medio
: vs. C
IL-6 Citoquina Pro-Inflamatoria
Producción de TNF-(CMSP Cultivadas por 72 Horas)
Co
ncen
tració
n d
e T
NF
- (p
g/m
l)
0
10
20
500
1000
1500
2000
2500
C (VIH-) (n=12)
PA (VIH+; CD4>350/uL) (n=9)
PB/C (VIH+; CS4<350/uL) (n=17)
PHA EnvMedioCondiciones de Cultivo
(Estímulos)
p<0.05:
: vs. Medio
: vs. C
TNF-α Citoquina Pro-Inflamatoria
Producción de IFN-(CMSP Cultivadas por 72 Horas)
Co
ncen
tració
n d
e IF
N-
(pg
/ml)
0
100
200
300
400
500
10000
20000
30000
40000
50000
60000
C (VIH-) (n=12)
PA (VIH+; CD4>350/uL) (n=11)
PB/C (VIH+; CD4<350/uL) (n=17)
PHA EnvMedioCondiciones de Cultivo
(Estímulos)
p<0.05:
: vs. Medio
: vs. C
: vs. PA
IFN-γ Respuesta Citotóxica Antiviral
Producción de IL-10(CMSP Cultivadas por 72 Horas)
Co
ncen
tració
n d
e IL
-10
(p
g/m
l)
0
25
50
75
100
125
500
1000
1500
2000C (VIH-) (n=10)
PA (VIH+; CD4>350/uL) (n=10)
PB/C (VIH+; CD4<350/uL) (n=17)
PHA EnvMedioCondiciones de Cultivo
(Estímulos)
p<0.05:
: vs. Medio
: vs. C
: vs. PA
IL-10 Citoquina Inmunomoduladora
Estimulación Policlonal
Pacientes tienen capacidad de Producir IL-6, IL-10, TNF-α, IFN-γ
¿Es posible recuperar la Respuesta Antiviral?
Producción Espontánea
TNF-α: Efecto Pro-Inflamatorio
¿Activación Crónica?
IL-10 : Efecto Inmunomodulador
¿Inhibición de la Respuesta Antiviral?
Estimulación Específica
TNF-α, IL-6 e IL-10: Efectos Antagónicos
IFN-γ: No hay producción
Respuesta Antiviral Comprometida la Respuesta Antiviral
Producción de Citoquinas
Conclusiones
Producción de Citoquinas in vitro
Una compleja combinación de citoquinas en la respuesta anti-VIH-1 en pacientes puede asociarse a:
– Un ambiente pro-inflamatorio que podría relacionarse con el estado de activación crónico del sistema inmunitario observado en pacientes
– Una respuesta antiviral no eficiente para controlar la progresión de la infección
– Es relevante que los pacientes mantienen la capacidad funcional de producción de citoquinas, lo cual abre la posibilidad de intervención terapéutica para generar una respuesta anti-VIH-1 efectiva
• Laboratorio de Inmunofisiología Celular - Escuela “JM Vargas”, UCV
– Dr. Miguel Alfonzo (Investigador Principal, Director de la Tesis)
– Miembros del Laboratorio:
• Laboratorio de Fisiopatología – IVIC
– Dra. Mercedes Fernández (Tutora de la Tesis)
• Servicio de Infectología - Hospital “José Ignacio Baldó”, El Algodonal
– Dra. Yhajaira Roldán: pacientes referidos
• Servicio de Inmunología - Instituto de Medicina Tropical, UCV
– Dra. Belkisyolé Alarcón de Noya: pacientes referidos
• Laboratorio Clinifar – Escuela “JM Vargas”, UCV
– Dra. Mélida Bermúdez: citómetro de flujo
•Gustavo Rico •Ydelys Fuentes •José Abelardo Carrero •Wolfgang Vivas •Eduardo Navarro
•Alexandra Díaz •Josibel Camacho •Riward Campelo •Alexandra Díaz
Reconocimientos