Chemische Kanzerogenese: Tumorpromotion
Michael Schwarz
Institut für Pharmakologie u. ToxikologieAbteilung für Toxikologie
Eberhardt-Karls-Universität Tübingen
Metabolische Aktivierung von DMBA
CH3
CH3
DMBA
CH3
CH3
DMBA
CH3
CH3
OCYP-450 CH3
CH3
OH
OHEH
Kovalente Binding an DNA
CH3
CH3
OH
OHO
CYP-450
ultimates Kanzerogen
proximales Karzinogen
Kovalente Bindung von DMBA-Metaboliten an DNA
G
C
A
T
Erzeugung von Punktmutationen durch DMBA-induzierte Adenin-Addukte in DNA
---CAA---
---GTT---
---CAA---
---GTT---
---CAA---
---GTT---
?
---CAA---
---GAT---
1. Runde von DNA-Synthese
---CAA---
---GTT---
Repair
Punktmutation
---GAT---
---CTA---
2. Runde von DNA-Synthese
Ha-ras-Mutationen in DMBA-induziertenHauttumoren der Maus
Onkogen Haut Pap./Carc. Inzidenz
Codon Mutation
Ha-ras 45/50 61 A:T->T:A
Quintallina, Balmain et al., 1986
Ras-Gap-Komplex
Scheffzek et al., Science 277, 333 (1997)
The switch function of Ras
Dank an Alfred Wittinghofer
MPI Dortmund
Schalterfunktion von Ras
Operationale Definition von Tumor- Initiatoren und Tumor-Promotoren im Zweistufen-Initiations-
Promotions-Experiment„Hautpinselungsexperimente“ (Mottram, Berenblum, Shubik)
Tumor
kein Tumor
kein Tumor
Tumor
Initiator
Promotor
TPA(irritierend und
tumorpromovierend)
O
O
O
HOH
H
O
O
4
12 13
OHOH
C PA14:4
(’Ti8’)(nur irritierend)
O
O
O
HOH
H
O
O12 13
OHOH
RPA(nur irritierend)
O
O
O
HOH
H
O
O12 13
OHOH
TPAIrritierend und
tumorpromovierend
C14:4PA (“TI8“)nur irritierend
RPAnur irritierend
Agonist
Receptor G-Protein PLC
DAGIP3 PKC
Calcium-Mobilisierung
Protein-Phosphorylierung
Zellproliferation
PIP2
PIP : Phosphatidyl-inositol-bisphosphat2
IP : Inositol-triphosphat
PLC: Phospholipase C
DAG: Diacylglycerol
PKC: Proteinkinase C
TPA: 12-O-Tetradecanoyl-phorbolacetat
3
TPA
Calcium-Mobilisierung
Protein-Phosphorylierung
Zellproliferation
C-Raf
MEK
ERK
EGFRRas
TPA
Tumorpromotion in der Leber
Einige Leber-Tumorpomotoren und ihre Rezeptoren
ChlorinierteBiozide
Dioxine und einige andere PCBs
Peroxisomen-proliferatoren
2,3,7,8-TCDD3,3‘,4,4‘-TCB
ClofibrateWY-14,643DEHP
AhR
PPAR
Arnt
RXR
CYP1A1, 1A2, 1B1 UGT1A1, NQO1
Acyl CoA Oxidase, CYP4A
pS2, VitellogeninSynthetische Hormone
Ethinyl-estradiol
ER ER
Barbiturate
einige PCBs
Gruppe
DDTDieldrin-HCH
CAR? RXR ““
PhenobarbitalCAR
(PXR) RXR CYP2B, 3A, 2C, 2H
2,2‘,4,5‘-TCB CAR RXR ““
Modell-Verbindung
Rezeptor Dimerisierungs-Partner
Einige Target-Gene
Effekt von Leber-Tumorpromotoren in der normalen Leber
Induktion von Hyperplasie und Hypertrophie
Effekt voll reversibel nach Absetzen der Behandlung
Adaptive Antwort; endet wenn neuessteady state erreicht ist
Effekt von Leber- Tumorpromotoren auf Hepatomazellen
Induktion von gesteigerter mitotischerAktivität und erniedrigte Apoptoseraten
Gleichbleibende Antwort bei kontinuierlicher Exposition
Teilweise reversibel nach Absetzen der Behandlung
Tumorpromotion in der Leber:
Beispiel 1:
Phenobarbital
Tumorpromovierende Wirkung von Phenobarbitalin der Rattenleber
PERC
ENTA
GE
OF
RATS
WIT
H TU
MO
RS P
ER G
ROUP
(TUM
OR
SIZE
> 1
0 m
m)
100
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100 120 140 160 180 200 220 240 260
DAYS
PhenobarbitalAAF Phenobarbital (0.05% im Futter)AAF Kontrollfutter
AAF = 2-Acetylaminofluoren
AAF PHENOBARBITAL
AAF CONTROL
Peraino et al., Cancer Res. 33, 2701-05, 1973.
Promovierender Effekt von Phenobarbitalauf die Tumorbildung in der Rattenleber
Verkürzung der Latenzzeit
Phenobarbital
Enzymveränderte Foci in der Rattenleber(GST-P = Glutathion-S-Transferase P)
GST-P-positive Tumorvorläuferzellein der Rattenleber
GST-P-positiver Focusin der Rattenleber
Phenobarbital promoviert das Wachstum präneoplastischer Foci in der Rattenleber
Goldsworthy, Pitot et al., Carcinogenesis 5, 67 (1984)
DENPhenobarbital
Kontrolldiät
plus PB
minus PB
Tumorpromotion durch PB benötigt CAR
Phenobarbital promoviert die Entstehung von Lebertumoren in der Maus
DEN
Alter: 6 Wochen 42 Wochen
PB im Futter(0.05%)
Kontrolldiät
Analyse von Mutationen
Ha-ras
ß-Catenin (Ctnnb1)
Phenobarbital-vermittelte Änderungen in der PrävalenzHa-ras- and ß-Catenin-mutierter Maus-Lebertumoren
0
10
30
20
40
50Ha-ras
6/20
minusPB
ß-Cat.
0
100
20
40
80
60
Präv
alen
zde
r Mut
atio
nen
(%) Prävalenz
der Mutationen (%
)
Aydinlik et al., Oncogene 20, 7812 (2001)
0/13
minusPB
37/46
plusPB
0/32
plusPB
Phenobarbital-vermittelte Selektion für Ctnnb1- (ß-Cat.) mutierte Maushepatozyten
Ha-ras-mutiert
ß-Cat.-mutiert
minus Phenobarbital plus Phenobarbital
Leber-Tumorpromotion durch PCB-153 (PB-Typ)
Cl
Cl Cl
Cl
ClCl
2,2‘,4,4‘,5,5‘-HexachlorobiphenylPCB-153
Cl
Cl ClCl
Cl
Cl NH
NH
O
O
O
CH3
Phenobarbital
DEN
Alter: 6 Wochen 64 Wochen
20 2-wöchentl. Injektionen
Kornöl
PCB 153
PCB 153 selektioniert für Glutaminsynthetase-positive Hepatome mit aktiviertem ß-Catenin
Genmutation0
.23
0
Vol
umen
ante
il in
d. L
eber
(%)
GS-negative Tumoren
GS-positive Tumore
Ctnnb1 unbekanntB-raf Ha-ras
**
DEN/Kornöl
DEN/PCB 153
100
Verlust der Tumorpromotionswirkung von PB in der Leber von Ctnnb1-knockout-Mäusen
90% der Tumoren von PB-behandelten WT-Mäusensind Ctnnb1-mutiert und GS-positiv
Rignall et al., Carcinogenesis 2010WT WT-PB KO KO-PB
Tum
or m
ultip
lizitä
t
Promotion durch PB benötigtfuntionelles β-Catenin
Der kanonische β-Catenin-Signalweg
See: http://www.wormbook.org
Stahl et al., Hepatology 42, 353 (2005)
low expressionhigh expression
normalliver
β-Cat.-mut.
Ha-ras-mut.
Maus
Mensch
Genexpression in Maustumoren gleicht der von humanen β-Catenin-mutierten HCCs
Ctnnb1-mutierte Tumoren zeigen charakteristische Änderungen in Enzymen des Intermediär-Metabolismus
β-Cat.-mutierte Tumoren: gesteigerte Glutaminsynthese, erniedrigte Aktivität des Harnstoffzyklus
Stahl et al., Hepatology 42, 353 (2005)
A
Glutamin wird u.a. für die Purin-Biosynthesebenötigt
Hohe Gehalte an Glutamin wären für Ctnnb1-mutierte Hepatozyten von Vorteil, aber……
GlutamineGlutamin
Gap junction Kanal
Glutamin akkumuliert in Ctnnb1-mutierten Tumorzellen(Konsequenz: Selektiver Proliferationsvorteil)
Cx32-positiver Tumor(Ha-ras-mutiert)
Cx32-negativer Tumor(Ctnnb1-mutiert)
Connexin32: häufigstes Gap Junction-Protein i.d. Mausleber
In absence of PB, single isolated hepatocytes withactivated -catenin express Cx32 and do not
proliferate
Mouse strain:
Tglox(pA)S33Y-ß-Cat X Alb-Cre
(S. Loeppen)
Tumorpromotoren inhibieren gap junctionalcommunication
Metabolische Kooperation
Zell-Zell Kommunikation
For review see: Yamasaki and Naus, Carcinogenesis 17, 1199 (1996)
Trosko and Ruch, Front. Biosci. 3, 208 (1996)
Verlust der promovierenden Aktivität von PB in Cx32-knockout-Mäusen
Moennikes et al., Cancer Res. 60, 5087 (2000)
0
20
40 Cx32 wt Cx32 null -+ PB* G6Pase-
defiziente Läsionen
Tumor prevalenceTumor multiplicity
wtCx32 Cx32 null
G-6-Pase-defiziente Läsionen Kein Anstieg
Volu
men
frak
tion
in d
er L
eber
(%)
Kein AnstiegKein Anstieg
GS
GJIC
-Catenin
Glutamin
CAR
PB
Aber: Cx32 mRNA unverändertTumoren in Cx32-Null-Mäusen nicht Ctnnb1-mutiert
Proliferation
Tumorpromotion durch PB
CAR
GJIC
Mechanistische Verbindung?
?β-Catenin
Leber-Tumorpromotion:
Beispiel 2:
2,3,7,8-TCDD
TCDD wirkt vermutlich über den AhR
DEN TCDD oder Kornöl
17 31 73 115Behandlung (Tage)
Experimentelles Design
Relativer Volumenanteil (%)
Quantitative Bestimmung der Leberfoci
KontrolleTCDD
0
1
2
3
4
17 31 73 115TCDD-Behandlung (Tage)
Vol
umen
ante
il in
der
Leb
er
(%)
Tumorpromovierende Wirkung von TCDD in der Rattenleber
Effekt von TCDD auf die Zellteilung (BrdU-labeling index)und auf den Apoptoseindex in GST-P-positiven Leberfoci
Apoptosen
H&E/GST-P Eosin-Fluoreszenz
BrdU-Markierung
TCDD-Behandlung (Tage)
Kontrolle
TCDD
0
10
20
30
31 73 115
BrdU
-Mar
kier
ungs
-in
dex
(%)
TCDD-Behandlung (Tage)
Kontrolle
TCDD
0
4
8
12
31 73 115
Apo
ptos
ein
dex
(%)
Viele Leber-Tumorpromotoren inhibieren TGFβ-induzierte Apoptose von FTO2B-Hepatomzellen (Ratte)
% of TGFß control20 µm
Pheno Insulin
Dexa
DieldrinTGFß
+ ++ + + ++ +-- - -
Dexa
0
50
10052
7**
6 *
4**
8**
6**
15**
24** 36**
Phen
o
Insu
lin
Dield
rin
+ TGFß
Dexa
Clofib
rate
DDT
Solv
ents
Inhi
bito
rsHoechst 33258-Färbung
Apoptose-Figuren “DNA-laddering” Caspase-3 Aktivität
% o
f TG
F/s
olve
ntco
ntro
l
TGFß
Buchmann et al., Cell Death Diff 6, 190 (1999)
Leber-Tumorpromotion:
Beispiel 3:
WY-14,643
(Peroxisomenproliferator)
Leber-Tumorpromotion durch den PeroxisomenproliferatorWy-14,643 benötigt PPAR
PPAR (-/-) + Wy-14,643
PPAR (+/+) + Wy-14,643
PPAR-aktivierte Signalkaskade
PPARLigand
Inhibition of let-7c expression
C-MycÜberexpression
Überexpression des
mir-17-92 clusters
RXR
Gesteigerte Zellproliferation
Suppression von Apoptose
Zellproliferation in „humanisierten“ PPAR-Mäusen
Tumorantwort in „humanisierten“ PPAR-Mäusen
mPPAR
mPPAR
hPPAR
hPPAR
Kontrolle
Kontrolle
Wy 14,643
Wy 14,643
0/9 (0%)
5/7 (71%)
0/10 (0%)
1/20 (5%)
Genotyp Tumor-Antwort
Diät
mPPAR
hPPAR
Liver tumor promotion: Beispiel 4
4-Dimethylaminoazobenzol
(„Buttergelb“)
NDEOL0.2
0.4
300
600
4-DAB0.2
0.4
300
600
Behandlung (Wochen)
0 6 8 14 17
relati
ver V
olumen
-
antei
l (%)
Zahl p
ro cc
m
Lebe
rgeweb
e
4-DAB NDEOL0.2
0.4
300
600
4-DAB0.2
0.4
300
600
NDEOL0.2
0.4
300
600
NDEOL 4-DAB0.2
0.4
300
600
Behandlung (Wochen)
0 6 8 14 17Volumen
frakti
on
(%)
Zahl p
ro cm
3
Leberg
eweb
e
Schwarz et al.,Carcinogenesis 5, 725-730, 1984.
Promovierende Aktivität von 4-DAB auf NDEOL-induzierte Leberfoci in der Ratte
Mechanismus?
4-DAB
NDEOL
Expression von fremdstoffmetabolisierendenEnzymen in Ratten-Leberfoci
Hypothese der selektiven Toxinresistenz
Zellteilung
Normale Leberzellen EnzymveränderteTumorvorläuferzellen
Cytochrom P450-System
toxische Metaboliten
Hepatotoxisches Agensz.B. 4-DAB
Zelltod
benigneTumorzelle
initiierte Zelle
normaleSoma-Zellen
Initiation
Promotion
Maligne ProgressionmaligneTumorzelle
Karzinogen
Bindung an DNA
Mutation
Inaktivierung
Reparatur
Immunantwort
Mutation
Mutation
Zelltod
metabolische Aktivierung
Effekt von Tumorpromotoren
Tumor-Promotor
Zelltod
Initiierte
Zelle
Mutation
Direkter Effekt Rezeptorvermittelt
Indirekter Effekt Selektive Toxin-Resistenz
Chronische Irritation
Induktion von regenerativem Wachstum
Zellproliferation