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1 1
Universität Wien Fakultät Chemie
Institut für Biologische Chemie
Prof. Dr. Christian Becker Währinger Str. 38
1090 Wien, Austria
http://biologischechemie.univie.ac.at
Biological Chemistry
Chemische Proteinmodifikation - Im Wettbewerb mit der Natur
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Biological Chemistry 2
- Was sind Proteine?
- Ribosomale Proteinsynthese
- Spezifische Modifikationen & Ihre Herausforderungen
- Chemische Proteinsynthese (Historische & Aktuelle Möglichkeiten)
- Beispielsysteme
Inhalt
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Biological Chemistry 3
Was sind Proteine?
Proteine = Eiweiße Makromoleküle, die linear aus Aminosäuren aufgebaut werden und unterschiedlich lang sein können (von 2 bis zu 30.000 Aminosäuren). Sehr viele Kombinationsmöglichkeiten: Kettenlänge von 100 Aminosäuren = 20100 (= 10130) Verknüpfungsmöglichkeiten
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Biological Chemistry 4
- Enzyme katalysieren praktisch alle chemische Reaktionen - Hormone dienen als Signalstoffe - Rezeptoren leiten Signale in das Zellinnere weiter - Ionenkanäle leiten Ionen durch biologische Membranen,
- Transporter befördern ihr Substrat über die Membran,
- Hämoglobin transportiert Sauerstoff - Antikörper binden an Fremdstoffe - Gerüstproteine des Zytoskeletts sorgen für Form und Organisation der Zelle - Faserproteine verleihen Festigkeit - Histone verpacken die DNA - DNA- und (z.B. Polymerase, Transkriptionsfaktoren) RNA-bindende Proteine vermitteln die Replikation des Erbguts und die Expression von Genen
Funktionen von Proteinen
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Biological Chemistry 5
Ribosomale Proteinsynthese
1. Transkription – Umschreiben
der DNA in mRNA durch RNA
Polymerase
2. Translation – Übersetzen der
mRNA in ein Poylpeptid mit Hilfe
der Ribosomen
(ca. 15 AS/s in Bakterien, aber nur
ca. 2 AS/s in Eukaryonten)
3. Einführung von posttranslationalen
Modifikationen, wie Glykosylierung,
Lipidierung, Acetylierung etc.
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Biological Chemistry 6
Crystal Structure of Dihydrofolate Reductase-Thymidylate Synthase
from Cryptosporidium hominis
Rap-RBD complex Nassar et al. (1995) Nature 375, 554-560.
Modeled structure of ternary REP-1: RabGGTase:Rab7 complex
Proteinbiosynthese
- Proteine beliebiger Größe mit höchster Präzision - Korrekte Faltung - Menge pro Zelle variiert stark
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Protein Chemistry 7
Posttranslationale Modifikationen in Proteinen
Becker, BioSpektrum 3/2011, 291-291.
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Biological Chemistry 8
Warum chemische Proteinmodifikation & Synthese?
- Einführen komplexer Modifikationen / Zugang zu homogenen Proteinpräparationen
- Direkter Zugang zu Proteinen für biophysikalische und strukturelle Untersuchungen
- Freie Variation der Polypeptidkette / Proteine mit neuen Eigenschaften
- Ortspezifische Markierung von Proteinen / Active Site Modifikationen
- Entwicklung von Medikamenten auf Peptid- und Proteinbasis
- Verknüpfung von Proteinen mit anderen (Bio-) Polymeren
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Biological Chemistry 9
Recombinante Expression
Chemische Synthese
Chemische Synthese - Synthese von Bausteinen - Automatische Peptidsynthese - Bioaktive Peptide
Recombinante Expression - Molekularbiologie - Proteinreinugung - Selektive Modifikation
Funktionale Proteine
Analyse Massenspektrometrie
in vitro Analyse (CD, Fluoreszenz, Lichtstreuung, Kalorimetrie)
Zell-basierte Assays
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Biological Chemistry 10
Festphasensynthese von Peptiden (SPPS) - Peptide mit bis zu ~100 Aminosäuren
- Chemische Synthese vom C- zum N-Terminus
Linker O NH2
O
R1HO
HN Boc
O
R2
Kopplungs-reagenz
Linker OHN
O
R1
NH
Boc
O
R2
Reinigung,Waschen & Filtrieren
Linker OHN
O
R1
NH2O
R2Entfernender Boc-Gruppe
HOHN Boc
O
R3
Linker OHN
O
R1
NHO
R2 HN Boc
O
R3
Wiederholen
Abspaltung +Seitenkettenentschützung
Aufreinigung
Reinigung,Waschen & Filtrieren
Kopplungs-reagenz
Reinigung,Waschen & Filtrieren
Entfernender Boc-Gruppe
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Biological Chemistry 11
Flüssigkeiten
Stickstoff
Vakuum
Flüssigkeiten
Durchführung der Festphasensynthese
Manuell Automatisch
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Biological Chemistry 12
Reaktionseffizienz und Ausbeute
Ausbeuten pro Kopplungsschritt: 99%
Gesamtausbeute für ein Peptid aus 50 Aminosäuren: 61%
Gesamtausbeute für ein Peptid aus 100 Aminosäuren: 37%
Ausbeuten pro Kopplungsschritt: 98%
Gesamtausbeute für ein Peptid aus 50 Aminosäuren: 37%
Gesamtausbeute für ein Peptid aus 100 Aminosäuren: 13,5%
Typische Ausbeute bei modernen Kopplungsmethoden: >99,9%
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Biological Chemistry 13
Größenlimitierung der Peptidsynthese
Kent, S. B. H.; Dawson, P. Annu. Rev. Biochem 2000, 69: 925-962.
Durchschnittliche Größe von Proteinen
Proteindomänen
Prot
eing
röße
Chemische Ligation
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Biological Chemistry 14
My entire yearning is directed towards the first synthetic enzyme.
(Letter to Adolf v. Baeyer, 1905)
Wie es begann?
Emil Fischer (1852-1919) Nobel Prize in Chemistry 1902
H-CYIQNCPLG-NH2
Synthesis of Oxytocin
Vincent du Vigneaud (1901-1978) Nobel Prize in Chemistry 1955
1905
1953
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Biological Chemistry 15
First Chemical Protein Synthesis
Synthesis of Insulin (51 aa) in 1963
Helmut Zahn (1916-2004) Panayotis Katsoyannis
Meienhofer et al., Zeitschrift für Naturforschung, 18b,1963.
Wie es begann?
1963
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Biological Chemistry 16
The first synthetic enzyme:
Ribonuclease A (124 aa)
Gutte & Merrifield, JBC, 246, 1922-1941, 1971.
Bruce Merrifield (1921-2006) Nobel Prize in Chemistry 1984
Ralph Hirschmann (1922-2009)
Wie es begann?
1971
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Biological Chemistry 17 Schneider & Kent, Cell 1988, 54, 363-368.
Synthetische HIV Protease (99 AS)
Steve Kent
1988
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Biological Chemistry 18
Green Fluorescent Protein (GFP, 238 AS)
Nichiuchi et al. (1998) PNAS, 95:13549
Shumpei Sakakibara
1998
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Biological Chemistry 19
Größenlimitierung der chemischen Proteinsynthese
- Ligationsreaktionen nicht beliebig oft nacheinander anwendbar
- Problematische Aufreinigung
- Ausbeuteverluste
- Synthese wird „unrentabel“
- Bisher keine Synthese von nicht-repeptitiven Proteinen > 250 Aminosäuren
Lösung:
Kombination von chemischer Protein- / Peptidsynthese
mit Biosynthese von Proteinen (z.B. in E. coli).
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Biological Chemistry 20
Eigene Beispielsysteme
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21
Transmissible spongiform encephalopathies (TSE) are fatal neurodegenerative diseases Prion diseases are exceptional: Spontaneous, hereditary and transmissible forms are recognized
Size
Bacteria Virus
10-1 µm 100-10 nm
Protein-only hypotheses: Resistant to nucleic acid inactivation Sensitive to protein modifying procedures
⇒ Proteinaceous infectious particles (prion); 1982 Prusiner
Prion
Übetragbare Spongiforme Enzephalopathien (TSE)
Biological Chemistry
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22
Prozessierung von PrPC und Umwandlung in PrPSc
Tatzelt & Winklhofer, Amyloid-Journal of Protein Folding Disorders (2004) 11, 16212 Biological Chemistry
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Protein Chemistry 23
Semisynthetischer Ansatz für membrangebundenes PrPc
octarepeats PrP90-231 ER
signal GPI
signal N181 N197
Glycan Glycan
S S
C179 C214 GPI anchor
+ lipid
anchor
Semisynthesis
recombinant PrP
PrP90-231 N181 N197
S S
C179 C214
lipid anchor PrP90-231 N181 N197
S S
C179 C214
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24
Aggregation von lipidiertem PrP
Proteinase K digestion
AFM
Thioflavin T Assay
+ liposomes - liposomes
Membrane-associated rPrPPalm shows an extended lag-phase.
Biological Chemistry
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25
Zusammenfassung
- Lipidiertes Prion Protein durch Kombination chemischer & molekularbiologischer Methoden
Homogen hergestellt werden.
- Dieses Prion Protein ermöglicht die Untersuchung der membranabhängigen Umwandlung in
eine toxische Variante des Proteins
- Komplexe Strukturen wie GPI-Anker können so in Proteine eingebracht werden und helfen
Krankheitsprozesse zu verstehen
- Nächste Schritte: In vivo Untersuchungen
Biological Chemistry
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Silaffin-induzierte Biomineralisation von Kieselsäure
M. Sumper, E. Brunner, ChemBioChem 2008, 9, 1187-1194.
diatoms are unicellular algae
highly elaborate, nanopatternd cell walls
consisting mainly of hydrated SiO2
long chain polyamines and silaffin peptides
have been identified as constituents of
biosilica and to be involved in the silica
deposition process
Biological Chemistry 26
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Natürliche posttranslationale Modifikationen von Silaffinen
H2N NH
HN N
H
HN N
H
HN N
H
HN N
H
HN N
H
HN N
H
HN
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
N
HO
O
NO
POHO
O
P
OHO O
O
P
OHO O
O
P
OHO O
O
P
OHO O
O
P
OHO O
O
POHO
OCH3H3C CH3H3C
CH3
HO
n = 4-9
N
NH
HN
CH3
NH3C CH3n = 4-9
N
NH
HN
CH3
NH3C CH3
OH
Chemical Structure of natSil-1A1
N. Kröger, S. Lorenz, E. Brunner, M. Sumper, Science 2002, 298, 584-586.
ε-N,N-dimethyllysine ε-N,N,N-trimethyl-δ-hydroxylysine
phosphoserine
Polyamine modified lysine (6-11 N-methylpropyleneimine units)
Biological Chemistry 27
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Zusammenfassung
Synthese unterschiedlich modifizierter Silaffin-Peptide
Proof of Principle:
eGFP Verknüpfung mit Silaffin führt zur selektiven Verkapselung von GFP in Silikatmatrix
Immobilisierung biotechnologisch interessanter Proteine
Einfluß der Silaffin-Modifikationen auf die Silikat-Abscheidung
Biological Chemistry 28
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Biological Chemistry 29
Alex Kravchuk
Claudia Bello
Carolin Lechner
Firouzeh Aladini
Manuel Brehs
Nam Ky Chu
Karine Farbiarz
Can Araman
Former Group Members:
Diana Olschewski Sunanda Lahiri
…
Collaborations
Financial Support CIPSM
DFG
Wacker Chemie
BMBF
Johannes Buchner (TU München)
Tilo Schwientek (Uni Köln)
Roger Goody (MPI Dortmund)
Martin Engelhard (MPI Dortmund)
Jörg Tatzelt (LMU München)
Peter Seeberger (MPI Golm)
Uni Wien
Danksagung