11
hie
I
Vaso
ld
atog
raph
11/1
2 R
.
HPLCHPLCHPLCHPLCChromatographie IChromatographie I
Chr
oma
WS
201 HPLC HPLC VorlesungVorlesungHPLC HPLC VorlesungVorlesung
22
R. R. VasoldVasold
A l tikA l tik Abt ilAbt ilAnalytik Analytik -- Abteilung Abteilung
Institut für Organische ChemieInstitut für Organische Chemie
hie
I
Vaso
ld
Institut für Organische ChemieInstitut für Organische Chemie
Prof. B. KönigProf. B. König
atog
raph
11/1
2 R
. gg
Chr
oma
WS
201
33
KapitelKapitel I:I: EinführungEinführungKapitelKapitel I: I: EinführungEinführung
KapitelKapitel II:II: GrundprinzipienGrundprinzipienKapitel Kapitel II: II: GrundprinzipienGrundprinzipien
K i lK i l IIIIII D h hi hD h hi hKapitel Kapitel III: III: Der chromatographische Der chromatographische ProzeßProzeß
hie
I
Vaso
ld
Kapitel Kapitel IV: IV: Das ChromatogrammDas Chromatogramm
atog
raph
11/1
2 R
.
Kapitel V: Literatur
Chr
oma
WS
201 ap te te atu
44
hie
I
Vaso
ld
atog
raph
11/1
2 R
.
Kapitel I: EinführungKapitel I: Einführung
Chr
oma
WS
201 Kapitel I: EinführungKapitel I: Einführung
55I EinführungI EinführungI 1I 1 Was heißtWas heißt HPLCHPLC ??
HHHHI.1I.1 Was heißt Was heißt HPLCHPLC ??
HH ighighHH ighighPP PPPP erformanceerformance--PPressureressureLLLL iquidiquidCC
hie
I
Vaso
ld CC hromatographyhromatography
atog
raph
11/1
2 R
.
( = Hochleistungs/Druck( = Hochleistungs/Druck
Chr
oma
WS
201 ( g( g
--FlüssigFlüssig--ChromatographieChromatographie))
66I EinführungI EinführungI 2I 2 Was bedeutetWas bedeutet HPLCHPLC ??I.2I.2 Was bedeutet Was bedeutet HPLCHPLC ??
Unterschied zwischen Unterschied zwischen moderner HPLCmoderner HPLC undundkl i hkl i h Sä lSä l Ch t hiCh t hi ??klassischer klassischer SäulenSäulen--ChromatographieChromatographie ??
wesentlich wesentlich höhere Auflösunghöhere Auflösung bei Trennungbei Trennung(Trennung von bis zu 100 Komponenten/Lauf u. mehr)(Trennung von bis zu 100 Komponenten/Lauf u. mehr)
hie
I
Vaso
ld
Drastische Drastische Verkürzung der AnalysendauerVerkürzung der Analysendauer(h (h →→ Bereich von Minuten) Bereich von Minuten)
atog
raph
11/1
2 R
.
Erhebliche Verbesserung der Erhebliche Verbesserung der EmpfindlichkeitEmpfindlichkeit(ca. 10(ca. 10--9 9 g [ng] bis 10g [ng] bis 10--1212 g [pg]) g [pg])
Chr
oma
WS
201 (( g [ g]g [ g] g [pg])g [pg])
77I EinführungI EinführungI 3I 3 Wann wirdWann wird HPLCHPLC angewendet ?angewendet ?I.3I.3 Wann wird Wann wird HPLCHPLC angewendet ?angewendet ?
Notwendige Notwendige VoraussetzungVoraussetzung ist die ist die LöslichkeitLöslichkeitder zu analysierenden Substanz in einem der zu analysierenden Substanz in einem yygeeignetem Solvens geeignetem Solvens
DieDie HPLCHPLC wird eingesetzt wenn:wird eingesetzt wenn:Die Die HPLCHPLC wird eingesetzt, wenn:wird eingesetzt, wenn:
Substanzen Substanzen schwer flüchtigschwer flüchtig oder oder nicht flüchtignicht flüchtig
hie
I
Vaso
ld
Substanzen mit rel. Substanzen mit rel. hohem Molekulargewichthohem Molekulargewichtli (MWli (MW 500)500)
sind (sonst alternativ Einsatz von GC)sind (sonst alternativ Einsatz von GC)
atog
raph
11/1
2 R
. vorliegen (MW vorliegen (MW > 500)> 500)es sich um es sich um thermisch instabilethermisch instabile(leicht zersetzliche) Substanzen handelt(leicht zersetzliche) Substanzen handelt
Chr
oma
WS
201 (leicht zersetzliche) Substanzen handelt.(leicht zersetzliche) Substanzen handelt.
88I EinführungI EinführungI 4I 4 Wo wirdWo wird HPLCHPLC eingesetzt ?eingesetzt ?I.4I.4 Wo wird Wo wird HPLC HPLC eingesetzt ?eingesetzt ?
Zur Zur ReinheitsReinheits-- und Produktkontrolleund Produktkontrolle chem. Substanzenchem. Substanzen
Zur Zur AnalyseAnalyse von von ArzneistoffenArzneistoffen
ZZ B tiB ti S h d t ffS h d t ff (U lt l tik)(U lt l tik)
Zur Zur BestimmungBestimmung von von WirkstoffenWirkstoffen in in biolog. Matricesbiolog. Matrices
hie
I
Vaso
ld Zur Zur BestimmungBestimmung von von SchadstoffenSchadstoffen (Umweltanalytik)(Umweltanalytik)
Zur Zur TrennungTrennung und und ReinigungReinigung von von BiopolymerenBiopolymeren
atog
raph
11/1
2 R
. (Enzymen, Nukleinsäuren, Peptiden ...)(Enzymen, Nukleinsäuren, Peptiden ...)
StandardmethodeStandardmethode in fast allen in fast allen chem. Laboratorienchem. Laboratorien
Chr
oma
WS
201
99I EinführungI EinführungI 5I 5 Wie wird dieWie wird die HPLCHPLC durchgeführt ?durchgeführt ?I.5I.5 Wie wird die Wie wird die HPLC HPLC durchgeführt ?durchgeführt ?
Injektor
P
22 33
Säule
Pumpe
44
hie
I
Vaso
ld
Mobile Computergesteuerte1155
atog
raph
11/1
2 R
.
Detektor
MobilePhasen Auswertesoftware11
Chr
oma
WS
201
Abb. 1:Abb. 1: Schematische Darstellung einer HPLCSchematische Darstellung einer HPLC--AnlageAnlage
1010I EinführungI EinführungI 5I 5 Wie wird dieWie wird die HPLCHPLC durchgeführt ?durchgeführt ?I.5I.5 Wie wird die Wie wird die HPLC HPLC durchgeführt ?durchgeführt ?hi
e I
Vaso
ld
atog
raph
11/1
2 R
.
Abb 2:Abb 2: Moderner HPLCModerner HPLC--ArbeitsplatzArbeitsplatz
Chr
oma
WS
201 Abb. 2:Abb. 2: Moderner HPLCModerner HPLC--ArbeitsplatzArbeitsplatz
1111
hie
I
Vaso
ld
atog
raph
11/1
2 R
.
Kapitel II: GrundprinzipienKapitel II: Grundprinzipien
Chr
oma
WS
201 Kapitel II: GrundprinzipienKapitel II: Grundprinzipien
1212
II 1II 1 Grundbegriff:Grundbegriff: ChromatographieChromatographieII GrundprinzipienII GrundprinzipienII.1II.1 Grundbegriff: Grundbegriff: ChromatographieChromatographiehi
e I
Vaso
ld
atog
raph
11/1
2 R
.
Chr
oma
WS
201
AbbAbb 3.:3.: Durchführen einer SäulenchromatographieDurchführen einer Säulenchromatographie
1313
II 1II 1 Grundbegriff:Grundbegriff: ChromatographieChromatographieII GrundprinzipienII GrundprinzipienII.1II.1 Grundbegriff: Grundbegriff: ChromatographieChromatographie
Historie: M Tswett (1906)Historie: M. Tswett (1906)Der Begriff „Chromatographie“ wurde 1906 bei der Beobachtung geprägt, als sich ein Extrakt aus grünen Blättern auf einer mit
l t Z k füllt Sä l i hi d fä btgepulvertem Zucker gefüllten Säule in verschieden gefärbte Einzelfarbstoffe ( Chlorophyll, Carotin etc. ) auftrennen ließ.
Chroma = Farbe / Graphein = schreiben
D fi itiD fi iti Ch t hiCh t hi
hie
I
Vaso
ld Definition: Definition: ChromatographieChromatographieMit dem Ausdruck Mit dem Ausdruck „Chromatographie“„Chromatographie“ bezeichnet man einen bezeichnet man einen TrennprozessTrennprozess bei welchem das Probengemisch zwischen zweibei welchem das Probengemisch zwischen zwei
atog
raph
11/1
2 R
. TrennprozessTrennprozess, bei welchem das Probengemisch zwischen zwei, bei welchem das Probengemisch zwischen zweinicht miteinander mischbarennicht miteinander mischbaren Phasen im sog. chromatographiPhasen im sog. chromatographi--schen Bett (Trennsäule oder Ebene) verteilt wird. Eine schen Bett (Trennsäule oder Ebene) verteilt wird. Eine HilfsphaseHilfsphase(stationäre Phase)(stationäre Phase) ruht dabei während die andereruht dabei während die andere HilfsphaseHilfsphase
Chr
oma
WS
201 (stationäre Phase)(stationäre Phase) ruht dabei, während die andere ruht dabei, während die andere HilfsphaseHilfsphase
(mobile Phase)(mobile Phase) an ihr vorbei strömt. an ihr vorbei strömt. Michail Semjonowitsch Tswett (Zwet)Michail Semjonowitsch Tswett (Zwet)
1872 1872 -- 19191919
1414
II 2 Grundbegriff:II 2 Grundbegriff: HilfsphasenHilfsphasenII GrundprinzipienII GrundprinzipienII.2 Grundbegriff: II.2 Grundbegriff: HilfsphasenHilfsphasenStationäre Phase:Stationäre Phase:
MeistMeist ist in der Chromatographie die stationäre Phase ist in der Chromatographie die stationäre Phase festfest(Chromatographiebett).(Chromatographiebett).SeltenSelten ist die stationäre Phase ist die stationäre Phase flüssigflüssig(dann aber als unbeweglicher „stationärer“ , flüssiger Film auf (dann aber als unbeweglicher „stationärer“ , flüssiger Film auf der Oberfläche eines Feststoffes aufgebrachtder Oberfläche eines Feststoffes aufgebrachtggz.B. als adsorbierter Wasserfilm auf Cellulose), oder als z.B. als adsorbierter Wasserfilm auf Cellulose), oder als unbewegliche flüssige, sog. quasistationäre Phase im Inneren unbewegliche flüssige, sog. quasistationäre Phase im Inneren von porösen Kugeln (Gelpermeationschromatographie)von porösen Kugeln (Gelpermeationschromatographie)
hie
I
Vaso
ld
von porösen Kugeln (Gelpermeationschromatographie).von porösen Kugeln (Gelpermeationschromatographie).
Mobile Phase:Mobile Phase:Die mobile Phase kann sein:Die mobile Phase kann sein:
atog
raph
11/1
2 R
. Die mobile Phase kann sein:Die mobile Phase kann sein:gasförmiggasförmigflüssigflüssig LC/HPLCLC/HPLCLiquidchromatographieLiquidchromatographie
GaschromatographieGaschromatographie GCGC
Chr
oma
WS
201 flüssigflüssig LC/HPLCLC/HPLCLiquidchromatographieLiquidchromatographie
1515
II 3 Grundbegriff:II 3 Grundbegriff: VerteilungskoeffizientVerteilungskoeffizient KKII GrundprinzipienII GrundprinzipienII.3 Grundbegriff: II.3 Grundbegriff: Verteilungskoeffizient Verteilungskoeffizient KK
beschreibt die unterschiedliche Verteilung der Substanzenbeschreibt die unterschiedliche Verteilung der Substanzen zwischen stationärerstationärer Phase und mobilermobiler Phase:
KK ccss(X)(X)
cc (X)(X)(1)(1)ccmm(X)(X)
hie
I
Vaso
ld
ccss(X)(X) = = StoffmengenkonzenztrationStoffmengenkonzenztration der der
= Verteilungskoeffizient= VerteilungskoeffizientKK
atog
raph
11/1
2 R
. ss( )( )Substanz X in der stationären PhaseSubstanz X in der stationären Phase
ccmm(X)(X) = = StoffmengenkonzentrationStoffmengenkonzentration der der
Chr
oma
WS
201 Substanz X in der mobilen PhaseSubstanz X in der mobilen Phase
1616
II 4 Grundbegriff:II 4 Grundbegriff: KapazitätsfaktorKapazitätsfaktor kkII GrundprinzipienII GrundprinzipienII.4 Grundbegriff: II.4 Grundbegriff: Kapazitätsfaktor Kapazitätsfaktor kk
beschreibt die unterschiedliche Verteilung der Substanzenbeschreibt die unterschiedliche Verteilung der Substanzen zwischen stationärerstationärer Phase und mobilermobiler Phase :
kknnnn
ss(X)(X)
(X)(X)(2)(2)
nnmm (X)(X)
k
hie
I
Vaso
ld
= = StoffmengeStoffmenge der Substanz X in/an der der Substanz X in/an der
= Kapazitäts= Kapazitäts-- oder Retentionsfaktoroder Retentionsfaktorknnss (X)(X)
atog
raph
11/1
2 R
. ggstationären Phasestationären Phase
== StoffmengeStoffmenge der Substanz X in der mobilender Substanz X in der mobilen
ss ( )( )
nnmm(X)(X)
Chr
oma
WS
201 StoffmengeStoffmenge der Substanz X in der mobilen der Substanz X in der mobilen
PhasePhasemm
1717
II 4 1 Zusammenhang zwischenII 4 1 Zusammenhang zwischen kk undund KKII GrundprinzipienII GrundprinzipienII.4.1 Zusammenhang zwischen II.4.1 Zusammenhang zwischen kk und und KK
da da n = c n = c · · V V
KapazitätsfaktorKapazitätsfaktor VerteilungskoeffizientVerteilungskoeffizient
KKVV
ststkknn
ss(X)(X) cc VVss stst(X)(X)(3)KK
VVmobmobkk
nnmm(X)(X) cc VVmm mobmob(X)(X) (3)
hie
I
Vaso
ld VVstst = Volumen der stationären Phase i. d. SäuleVolumen der stationären Phase i. d. SäuleVVmobmob = Volumen der mobilen Phase i. d. Säule= Volumen der mobilen Phase i. d. Säule
atog
raph
11/1
2 R
. mobmob
Die Die unterschiedliche Wechselwirkungunterschiedliche Wechselwirkung von Substanzen in zwei von Substanzen in zwei nicht miteinander mischbaren Phasen ergibt eine Vielzahl nicht miteinander mischbaren Phasen ergibt eine Vielzahl
Chr
oma
WS
201 gg
unterschiedlicher unterschiedlicher ChromatographieartenChromatographiearten::
1818
II 5 Chromatographiearten (Auswahl)II 5 Chromatographiearten (Auswahl)II GrundprinzipienII GrundprinzipienII.5 Chromatographiearten (Auswahl)II.5 Chromatographiearten (Auswahl)
Trennung durch AdsorptionTrennung durch Adsorption Stationäre Stationäre
Ad i Ch hi
Trennung durch AdsorptionTrennung durch AdsorptionPhasePhase
Adsorptions-Chromatographieflüssig / fest
(NP/RP-HPLC) mobile mobile PhasePhasePhasePhase
hie
I
Vaso
ld Trennung durch LöslichkeitTrennung durch Löslichkeit
StationäreStationäre
atog
raph
11/1
2 R
.
Verteilungs-Chromatographieflüssig / flüssig
Stationäre Stationäre PhasePhase
Chr
oma
WS
201
1919
II 5 Chromatographiearten (Auswahl)II 5 Chromatographiearten (Auswahl)II GrundprinzipienII GrundprinzipienII.5 Chromatographiearten (Auswahl)II.5 Chromatographiearten (Auswahl)
T d h L dT d h L d Stationäre Stationäre Trennung durch LadungTrennung durch Ladung(vereinfacht)(vereinfacht)
PhasePhase
Ionenaustausch-Chromatographie
hie
I
Vaso
ld Trennung durch LadungTrennung durch Ladung(realistisch)(realistisch)
Stationäre Stationäre PhasePhase
atog
raph
11/1
2 R
.
Ionenaustausch-Chromatographie
Chr
oma
WS
201
2020
II 5 Chromatographiearten (Auswahl)II 5 Chromatographiearten (Auswahl)II GrundprinzipienII GrundprinzipienII.5 Chromatographiearten (Auswahl)II.5 Chromatographiearten (Auswahl)
Trennung durch Größe/GestaltTrennung durch Größe/Gestalt Stationäre Stationäre Trennung durch Größe/GestaltTrennung durch Größe/GestaltPhasePhase
Ausschluß-ChromatographieSEC, GPC
hie
I
Vaso
ld Trennung durch AffinitätTrennung durch Affinität Stationäre Stationäre PhasePhase
atog
raph
11/1
2 R
.
Affinitäts-Chromatographiez.B. Antigen/Antikörper
Chr
oma
WS
201
2121
hie
I
Vaso
ld
Kapitel III:Kapitel III:
atog
raph
11/1
2 R
. Kapitel III:Kapitel III:Der chromatographische Der chromatographische
Chr
oma
WS
201 ProzeßProzeß
2222
III 1 Der TrennvorgangIII 1 Der TrennvorgangIII Der chromatographische ProzeßIII Der chromatographische ProzeßIII.1 Der TrennvorgangIII.1 Der Trennvorgang
1 i1 i1 min1 min
A5 min5 min
A
B10 min10 min
hie
I
Vaso
ld B15 min15 min
atog
raph
11/1
2 R
.
C20 min20 min
Chr
oma
WS
201
Abb. 4: Zeitlicher Verlauf einer chromatographischen Trennung
2323
III 2 DefinitionenIII 2 DefinitionenIII Der chromatographische ProzeßIII Der chromatographische ProzeßIII.2 DefinitionenIII.2 Definitionen
Definition: Definition: ChromatogrammChromatogrammMit dem Ausdruck Mit dem Ausdruck „Chromatogramm“„Chromatogramm“ bezeichnet man die bezeichnet man die graphische Auftragung der graphische Auftragung der GrößenwerteGrößenwerte einer Größe (z.B. der einer Größe (z.B. der Absorption) die am Ende der stationären Phase also z B amAbsorption) die am Ende der stationären Phase also z B amAbsorption), die am Ende der stationären Phase, also z.B. am Absorption), die am Ende der stationären Phase, also z.B. am Säulenausgang, in der mobilen Phase gemessen werden, gegen Säulenausgang, in der mobilen Phase gemessen werden, gegen die die ZeitZeit oder das oder das VolumenVolumen der mobilen Phase.der mobilen Phase.
Definition: Definition: Retentionsvolumen / Retentionsvolumen / --ZeitZeitDD V lV l d bil Ph d di t ti ä Phd bil Ph d di t ti ä Ph
hie
I
Vaso
ld Das Das VolumenVolumen der mobilen Phase, das die stationäre Phase vom der mobilen Phase, das die stationäre Phase vom Moment der Probenaufgabe bis zum Erscheinen der Substanz Moment der Probenaufgabe bis zum Erscheinen der Substanz XXals Peak im Chromatogramm passiert hat, nennt man das als Peak im Chromatogramm passiert hat, nennt man das
atog
raph
11/1
2 R
.
RetentionsvolumenRetentionsvolumen der Substanz X: der Substanz X: VVRR(X)(X)Die zugehörige Zeit nennt man die Die zugehörige Zeit nennt man die RetentionszeitRetentionszeit: : ttRR(X)(X)..
Chr
oma
WS
201
2424III Der chromatographische ProzeßIII Der chromatographische ProzeßIII 3 Das RetentionsvolumenIII 3 Das Retentionsvolumen (X)(X)VIII.3 Das RetentionsvolumenIII.3 Das Retentionsvolumen (X)(X)RV
(X)(X)ttFFVV (X)(X)(X)(X) RRRR ttFFVV ••== (4)(4)
Retentionsvolumen [ml] Retentionszeit [min]
hie
I
Vaso
ld
Retentionsvolumen [ml]
atog
raph
11/1
2 R
. Volumenfließgeschwindigkeit [ml·min-1]
Chr
oma
WS
201
2525III Der chromatographische ProzeßIII Der chromatographische ProzeßIII 4 Die lineare FließgeschwindigkeitIII 4 Die lineare Fließgeschwindigkeit UUIII.4 Die lineare FließgeschwindigkeitIII.4 Die lineare Fließgeschwindigkeit UUmm
(5)(5)uuFFAA
FFAA
FF
rrmm
22AA AA rr ff 22
li Fli ß h i di k it d bil Phli Fli ß h i di k it d bil Phuumm :: lineare Fließgeschwindigkeit der mobilen Phase lineare Fließgeschwindigkeit der mobilen Phase [cm·s[cm·s--11]]
FF V l fli ß h i di k it [ lV l fli ß h i di k it [ l 11]]
hie
I
Vaso
ld FF :: Volumenfließgeschwindigkeit [ml·sVolumenfließgeschwindigkeit [ml·s--11]]Af : freie Säulenquerschnittsfläche [cm2]
atog
raph
11/1
2 R
. A A :: SäulenquerschnittsflächeSäulenquerschnittsfläche [[cmcm22]]
r r :: Säulenradius [cm]Säulenradius [cm]
Chr
oma
WS
201
:: InterpartikelInterpartikel--Porosität der Säule ( Kieselgel Porosität der Säule ( Kieselgel 0.8)0.8)
2626III Der chromatographische ProzeßIII Der chromatographische ProzeßuuIII 5 ZusammenhangIII 5 Zusammenhang zwischen undund u(X)(X)
DieDie linearelineare WanderungsgeschwindigkeitWanderungsgeschwindigkeit u(X)u(X)
uuIII.5 ZusammenhangIII.5 Zusammenhang zwischen mm undund u(X)(X)
Die Die linearelineare Wanderungsgeschwindigkeit Wanderungsgeschwindigkeit u(X)u(X)der Substanz der Substanz XX mußmuß der der linearenlinearenWanderungsWanderungs--(Fließ)(Fließ)--Geschwindigkeit der Geschwindigkeit der gg ( )( ) ggmobilen Phase mobilen Phase uumm direkt proportional seindirekt proportional sein..
d hd h (X)(X) i di d i kl ii kl i d hö h td hö h td.h.d.h. u(X)u(X) wirdwird immer kleinerimmer kleiner uumm oder höchstens oder höchstens gleich gleich uumm sein.sein.
hie
I
Vaso
ld
(6)(6)undunduu uu(X)(X) mm uu uu(X)(X) mm
atog
raph
11/1
2 R
. (6)(6)undunduu uu(X)(X) mm uu uu(X)(X) mm
Chr
oma
WS
201
2727III Der chromatographische ProzeßIII Der chromatographische ProzeßuuIII 5 ZusammenhangIII 5 Zusammenhang zwischen undund u(X)(X)uuIII.5 ZusammenhangIII.5 Zusammenhang zwischen mm undund u(X)(X)
hie
I
Vaso
ld
uu(X)(X)uu(X)(X)
atog
raph
11/1
2 R
.
uumm
Chr
oma
WS
201
2828
III 5 1 Der ProportionalitätsfaktorIII 5 1 Der Proportionalitätsfaktor (X)(X)III Der chromatographische ProzeßIII Der chromatographische ProzeßIII.5.1 Der Proportionalitätsfaktor III.5.1 Der Proportionalitätsfaktor mm(X)(X)
Der ProportionalitätsfaktorDer Proportionalitätsfaktor (X)(X) mußmuß alsoalsoDer ProportionalitätsfaktorDer Proportionalitätsfaktor mm(X)(X) mußmuß also also zwischen zwischen 00 und und 11 liegen.liegen.
(X)(X)== uu uu(X)(X) ·· (7)(7)mm(X)(X)== uu uu(X)(X) mm·· (7)(7)
hie
I
Vaso
ld Es kann sich bei Es kann sich bei mm(X)(X) nur um den nur um den StoffmengenanteilStoffmengenanteil der Substanz der Substanz XX in der in der mobilenmobilen
PhPh h d l il j di S b th d l il j di S b t XX dd
atog
raph
11/1
2 R
. PhasePhase handeln, weil ja die Substanz handeln, weil ja die Substanz XX nur dann nur dann überhaupt mit der Geschwindigkeitüberhaupt mit der Geschwindigkeit uumm transportiert transportiert
(d h mitgenommen) werden kann(d h mitgenommen) werden kann
Chr
oma
WS
201 (d.h. mitgenommen) werden kann. (d.h. mitgenommen) werden kann.
Dieser Dieser StoffmengenanteilStoffmengenanteil ist wie folgt definiert:ist wie folgt definiert:
2929III Der chromatographische ProzeßIII Der chromatographische ProzeßIII 6 ZusammenhangIII 6 Zusammenhang (X)(X) undund kk
11 11
III.6 Zusammenhang III.6 Zusammenhang mm(X)(X) und und kk
mm(X)(X) mm(X)(X)nn
ss(X)(X) mm (X)(X)nn nn11
ss(X)(X)nn kk11
11 (8)(8)ss(X)(X) mm (X)(X)nn ss( )( )
mm(X)(X)
nn11
kk 11 ( )( )
(X)(X)== uu uu(X)(X) mm·· ==11
uu (9)(9)
hie
I
Vaso
ld mm(X)(X)== uu ( )( ) mm == 11kk ++ uumm (9)(9)
atog
raph
11/1
2 R
.
uu
uukkmm
(X)(X)11 (10)(10)
Chr
oma
WS
201 uu(X)(X) (10)(10)
kk == RetentionsRetentions--/Kapazitätsfaktor/Kapazitätsfaktor
3030
III 6 1 GrenzfälleIII 6 1 GrenzfälleIII Der chromatographische ProzeßIII Der chromatographische ProzeßIII.6.1 GrenzfälleIII.6.1 Grenzfälle
uu(X)(X)11
uumm(X)(X)== uu uu(X)(X) mm·· == 11kk ++uumm (11)(11)
Erhält man zwei Grenzfälle:
Da für jeden Stoffmengenanteil gilt: Da für jeden Stoffmengenanteil gilt: mm00 11(X)(X)Erhält man zwei Grenzfälle:
mm1.)1.) FürFür (X)(X) = 0= 0 uu (X)(X) = 0= 0
hie
I
Vaso
ld
112 )2 ) uu(X)(X)
d.h. es befindet sich d.h. es befindet sich keinekeine Substanz Substanz XX in der mobilen Phase in der mobilen Phase -- allesalles ist an ist an die die stationärestationäre Phase gebunden, d.h. Phase gebunden, d.h. keine Wanderungkeine Wanderung der Substanzder Substanz
atog
raph
11/1
2 R
. = 1= 1FürFür mm(X)(X)2.)2.) uuuu (X)(X) = = mmd.h. es befindet sich die d.h. es befindet sich die gesamtegesamte Substanz Substanz XX in der in der mobilenmobilen Phase Phase ––die Substanzdie Substanz XX hat somit keine Wechselwirkung mit der stationärehat somit keine Wechselwirkung mit der stationäre
Chr
oma
WS
201 die Substanz die Substanz XX hat somit keine Wechselwirkung mit der stationäre hat somit keine Wechselwirkung mit der stationäre
Phase, d.h. Phase, d.h. WanderungsgeschwindigkeitWanderungsgeschwindigkeit von von XX gleich der der gleich der der mobilen Phasemobilen Phase..
3131
III 7 Die TotzeitIII 7 Die Totzeit ttIII Der chromatographische ProzeßIII Der chromatographische ProzeßIII.7 Die Totzeit III.7 Die Totzeit tt00
Die Zeit zwischen dem Aufbringen der SubstanzDie Zeit zwischen dem Aufbringen der Substanz XX aufaufDie Zeit zwischen dem Aufbringen der Substanz Die Zeit zwischen dem Aufbringen der Substanz XX auf auf die Säule und dem Auftauchen der Substanz die Säule und dem Auftauchen der Substanz XX im im Detektor, die im Detektor, die im 2. Fall2. Fall verstreicht, wenn also verstreicht, wenn also keine keine WechselwirkungWechselwirkung der Substanz der Substanz XX mit der stationären mit der stationären Phase stattfindet, bezeichnet man häufig als sog. Phase stattfindet, bezeichnet man häufig als sog. T t it“T t it“ d Sä ld Sä l tt„Totzeit“„Totzeit“ der Säule der Säule tt00..
Analog dazu wird das zugehörige Volumen als sog. Analog dazu wird das zugehörige Volumen als sog.
hie
I
Vaso
ld „Totvolumen“„Totvolumen“ VV00 der Säule bezeichnetder Säule bezeichnet..
tt
atog
raph
11/1
2 R
. Der Gebrauch dieser Bezeichnungen Der Gebrauch dieser Bezeichnungen VV0, 0, tt00 wird von wird von der der IUPACIUPAC jedoch wegen vieler jedoch wegen vieler VerwechslungsmöglichkeitenVerwechslungsmöglichkeiten heuteheute nicht mehrnicht mehr
Chr
oma
WS
201 VerwechslungsmöglichkeitenVerwechslungsmöglichkeiten heute heute nicht mehrnicht mehr
empfohlenempfohlen..
3232
III 8 Die DurchbruchszeitIII 8 Die Durchbruchszeit ttIII Der chromatographische ProzeßIII Der chromatographische ProzeßIII.8 Die Durchbruchszeit III.8 Die Durchbruchszeit ttmm
So ist mit dem sog. So ist mit dem sog. „Totvolumen“„Totvolumen“ VV00 oft nicht nur das oft nicht nur das eigentliche Totvolumeneigentliche Totvolumen der der SäuleSäule gemeint gewesen, gemeint gewesen, sondern zudem das sondern zudem das „„Totvolumen“Totvolumen“,, das durch das das durch das apparative Chromatographiesystem verursacht wird (z Bapparative Chromatographiesystem verursacht wird (z Bapparative Chromatographiesystem verursacht wird (z.B. apparative Chromatographiesystem verursacht wird (z.B. durch die Volumina der durch die Volumina der VerbindungskapillarenVerbindungskapillaren, der , der AnschlüsseAnschlüsse, der, der KonnektorenKonnektoren etc.)etc.)AnschlüsseAnschlüsse, der , der KonnektorenKonnektoren etc.)etc.)Dies wird alles berücksichtigt in den Ausdrücken:
hie
I
Vaso
ld DurchbruchsDurchbruchsvolumen bzw. DurchbruchsDurchbruchszeit
atog
raph
11/1
2 R
.
Als Symbole von der IUPAC empfohlen:
Chr
oma
WS
201
Vm und tm
3333
III 8 1 DurchbruchsvolumenIII 8 1 Durchbruchsvolumen VV undund zeitzeit ttIII Der chromatographische ProzeßIII Der chromatographische ProzeßIII.8.1 Durchbruchsvolumen III.8.1 Durchbruchsvolumen VVmm und und --zeitzeit ttmm
Definition: Definition: Durchbruchsvolumen / Durchbruchsvolumen / --zeitzeitAls Als DurchbruchsvolumenDurchbruchsvolumen VVmm bzw. bzw. --zeitzeit ttmm wird dasjenige wird dasjenige VolumenVolumen (bzw. die dazu (bzw. die dazu korrespondierende Zeitkorrespondierende Zeit) bezeichnet, ) bezeichnet, das benötigt wird, um einedas benötigt wird, um eine nichtnicht--retardierenderetardierende Substanz von derSubstanz von derdas benötigt wird, um eine das benötigt wird, um eine nichtnicht retardierenderetardierende Substanz von der Substanz von der InjektionsstelleInjektionsstelle bis zur bis zur DetektionsstelleDetektionsstelle zu befördern. Dieses zu befördern. Dieses Volumen umfaßt also genau genommen zusätzlich zum Volumen umfaßt also genau genommen zusätzlich zum Volumen Volumen der mobilen Phase im Säulenbettder mobilen Phase im Säulenbett VV diedie Totvolumina“Totvolumina“ desdesder mobilen Phase im Säulenbettder mobilen Phase im Säulenbett VVmobmob die die „„Totvolumina Totvolumina desdesGerätesGerätes z.B. im Einspritzventil, in den Verbindungskapillaren, im z.B. im Einspritzventil, in den Verbindungskapillaren, im Detektor etc..Detektor etc..
hie
I
Vaso
ld ttmm Ist für alle Substanzen im System Ist für alle Substanzen im System gleichgleichDi A ft t hi dli h S b t k tDi A ft t hi dli h S b t k t
atog
raph
11/1
2 R
. Die Auftrennung unterschiedlicher Substanzen kommt Die Auftrennung unterschiedlicher Substanzen kommt ausschließlich dadurch zustande, daß sich diese auf Grund ihrer ausschließlich dadurch zustande, daß sich diese auf Grund ihrer chemischen Beschaffenheit chemischen Beschaffenheit unterschiedlich langeunterschiedlich lange in der in der
Chr
oma
WS
201 stationären Phasestationären Phase aufhalten und somit zu unterschiedlichen aufhalten und somit zu unterschiedlichen
RetentionszeitenRetentionszeiten eluieren, d.h. getrennt werden eluieren, d.h. getrennt werden
3434
III 8 1 DurchbruchsvolumenIII 8 1 Durchbruchsvolumen VV undund zeitzeit ttIII Der chromatographische ProzeßIII Der chromatographische ProzeßIII.8.1 Durchbruchsvolumen III.8.1 Durchbruchsvolumen VVmm und und --zeitzeit ttmm
Da beiDa bei modernen HPLCmodernen HPLC AnlagenAnlagen diesediese eigentlicheneigentlichen
Anmerkung !Anmerkung !Da bei Da bei modernen HPLCmodernen HPLC--AnlagenAnlagen diese diese eigentlichen eigentlichen
„Totvolumina„Totvolumina des apparativen Systems“des apparativen Systems“ auf ein auf ein MinimumMinimum reduziert sind (durch minimale reduziert sind (durch minimale
hie
I
Vaso
ld Kapillardurchmesser, optimierte Gerätegeometrie etc. ), Kapillardurchmesser, optimierte Gerätegeometrie etc. ), können diese Parameter zur können diese Parameter zur Vereinfachung der Vereinfachung der
ProblematikProblematik hier hier vernachlässigtvernachlässigt werden, und es wird im werden, und es wird im
atog
raph
11/1
2 R
.
Folgenden davon ausgegangen, daß Folgenden davon ausgegangen, daß ttmm ausschließlich von ausschließlich von der der SäulenlängeSäulenlänge beeinflußt wird, und sich die beeinflußt wird, und sich die
WanderungsgeschwindigkeitenWanderungsgeschwindigkeiten u(u(x)x) umum uu beibei
Chr
oma
WS
201 WanderungsgeschwindigkeitenWanderungsgeschwindigkeiten u(u(x)x) um um uumm bei bei
konstanter Flußrate auf die konstanter Flußrate auf die SäulenlängeSäulenlänge beziehen. beziehen.
3535III Der chromatographische ProzeßIII Der chromatographische ProzeßIII 8 2 ZusammenhangIII 8 2 Zusammenhang tt tt (X)(X) undund tt
tt tt ttRR (X)(X) SS(X)(X)
III.8.2 Zusammenhang III.8.2 Zusammenhang ttm m , , ttRR(X) (X) und und ttSS
ttRR(X(X11))
ttRR(X(X22))tt tt ttRR (X)(X) SS(X)(X) mm
ttRR(X(X11))
ttmm
hie
I
Vaso
ld
atog
raph
11/1
2 R
. Zeit [s]Zeit [s]ttSS(X(X11))ttSS(X(X22))
Chr
oma
WS
201
Abb. 5:Abb. 5: MusterchromatogrammMusterchromatogramm mit mit ttSS(X)(X) als Aufenthaltszeit der als Aufenthaltszeit der Komponente Komponente XX in der stationären Phasein der stationären Phase
3636III Der chromatographische ProzeßIII Der chromatographische ProzeßIII 8 3 Bestimmung vonIII 8 3 Bestimmung von tt undund tt (X)(X)III.8.3 Bestimmung von III.8.3 Bestimmung von ttmm und und ttRR(X)(X)
Wovon sind Wovon sind DurchbruchszeitDurchbruchszeit ttmm und und RetentionszeitRetentionszeit ttRR(X) (X) abhängig ?abhängig ?
von den Abmessungen der Säule von den Abmessungen der Säule ((Länge:Länge: LL))gg (( gg ))von den Wanderungsgeschwindigkeiten von den Wanderungsgeschwindigkeiten uumm, , uu(X)(X)
D hb h lD hb h l R t ti lR t ti l
hie
I
Vaso
ld
LL VVmm LL VVRR(X)(X)
DurchbruchsvolumenDurchbruchsvolumen RetentionsvolumenRetentionsvolumen
atog
raph
11/1
2 R
. LLttmm uumm
FF
VVmm LLuu (x)(x)
ttRR(X)(X)VV
FFRR(X)(X)
Chr
oma
WS
201
(12)(12) (13)(13)
3737III Der chromatographische ProzeßIII Der chromatographische ProzeßIII 8 4 ZusammenhangIII 8 4 Zusammenhang tt tt (X)(X) undund kkIII.8.4 Zusammenhang III.8.4 Zusammenhang ttmm , , ttRR(X)(X) undund kk
(14)(14)tt RR (X)(X) VVRR (X)(X) uumm (14)(14)
ttmm VVmm uu(X)(X)
berücksichtigt man die bekannte Beziehungberücksichtigt man die bekannte Beziehung
hie
I
Vaso
ld
mm(X)(X)== uu uu(X)(X) mm·· == 1111
kk ++ uumm (11)(11)
atog
raph
11/1
2 R
. 11kk ++
Chr
oma
WS
201
ergibt sich:ergibt sich:
3838III Der chromatographische ProzeßIII Der chromatographische ProzeßIII 8 4 ZusammenhangIII 8 4 Zusammenhang tt tt (X)(X) undund kkIII.8.4 Zusammenhang III.8.4 Zusammenhang ttmm , , ttRR(X)(X) undund kk
tt VVtttt
VVVV
kkRR (X)(X)
mm
RR (X)(X)
mm 11
(15)(15)tt VVmm mm (15)(15)
Auflösen von Gleichung Auflösen von Gleichung (17)(17) nach nach k k dem dem KapazitätsKapazitäts-- oder oder RetentionsfaktorfaktorRetentionsfaktorfaktor liefert:liefert:
hie
I
Vaso
ld
ttRR (X)(X)
atog
raph
11/1
2 R
. kktt
RR
mm
( )( )11 (16)(16)
Chr
oma
WS
201
3939III Der chromatographische ProzeßIII Der chromatographische ProzeßIII 9 1 B d t d K ität f ktIII 9 1 B d t d K ität f kt kkIII.9.1 Bedeutung des Kapazitätsfaktors III.9.1 Bedeutung des Kapazitätsfaktors kk
kktt
tt RR (X)(X)
11 (16)(16)
D fi itiD fi iti K itätK ität (R t ti )f kt(R t ti )f kt
ttmm
Definition: Definition: KapazitätsKapazitäts--(Retentions)faktor(Retentions)faktor
Um Um „Chromatogramme“„Chromatogramme“ , die z.B. an verschieden, die z.B. an verschieden langenlangen oder oder t hi dli ht hi dli h di kdi k Sä l d b i t hi dli hSä l d b i t hi dli h
hie
I
Vaso
ld unterschiedlich unterschiedlich dickendicken Säulen oder bei unterschiedlicherSäulen oder bei unterschiedlicherFlußgeschwindigkeitFlußgeschwindigkeit gemessen wurden, vergleichen zu gemessen wurden, vergleichen zu können, bedient man sich einer können, bedient man sich einer dimensionslosen Größedimensionslosen Größe, dem , dem
atog
raph
11/1
2 R
. KapazitätsKapazitäts--(Retentions)faktor (Retentions)faktor kk. . Der Der KapazitätsKapazitäts--(Retentions)faktor (Retentions)faktor kk einer Substanz einer Substanz XX ist eine ist eine auf die auf die Durchbruchszeit „normierte Elutionsgröße“Durchbruchszeit „normierte Elutionsgröße“. .
Chr
oma
WS
201 „ g„ g
4040III Der chromatographische ProzeßIII Der chromatographische ProzeßIII 9 2 BeispieleIII 9 2 BeispieleIII.9.2 BeispieleIII.9.2 Beispiele
tt (X)(X)tt tt kkRR (X)(X) mm (( ))11kk
tttt
RR
mm
(X)(X)11
(16)(16) (17)(17)
Substanz eluiert unverzögert Substanz eluiert unverzögert ttRR = = ttmm k =0k =0
hie
I
Vaso
ld
Literaturangabe k = 5Literaturangabe k = 5 zuzu
atog
raph
11/1
2 R
.
mit eigener Säule (gleiches mit eigener Säule (gleiches Material aber andere Material aber andere
erwarten erwarten ttRR = 15 min= 15 min
Chr
oma
WS
201
Dimensionen) z.B. Dimensionen) z.B. ttm m = 2.5 min= 2.5 min
4141III. Der chromatographische ProzeßIII. Der chromatographische ProzeßIII 10 DieIII 10 Die Theorie der BödenTheorie der Böden
Es gibt mehrere Möglichkeiten den
III.10 Die III.10 Die Theorie der BödenTheorie der Böden
Es gibt mehrere Möglichkeiten, den chromatographischen Trennprozess genauer zu beschreiben.
AA BB CC
Z itZ it
hie
I
Vaso
ld Zeit Zeit Ziel:Ziel:
Die PositionDie Position jeder einzelnen Komponentejeder einzelnen Komponente imim
atog
raph
11/1
2 R
. Die Position Die Position jeder einzelnen Komponentejeder einzelnen Komponente im im chromatographischen Trennsystem und ihre dortige chromatographischen Trennsystem und ihre dortige KonzentrationsverteilungKonzentrationsverteilung in Abhängigkeit von derin Abhängigkeit von der
Chr
oma
WS
201 KonzentrationsverteilungKonzentrationsverteilung in Abhängigkeit von der in Abhängigkeit von der
ZeitZeit bestimmt zu können.bestimmt zu können.
4242III. Der chromatographische ProzeßIII. Der chromatographische ProzeßIII 10 DieIII 10 Die Theorie der BödenTheorie der Böden
Ein möglicher Ansatz:Ein möglicher Ansatz:
III.10 Die III.10 Die Theorie der BödenTheorie der Böden
Ein möglicher Ansatz:Ein möglicher Ansatz:
Theorie der BödenTheorie der Böden(th ti h T t f d ll)(th ti h T t f d ll)(theoretisches Trennstufenmodell)(theoretisches Trennstufenmodell)
Übertragung der Übertragung der Theorie der fraktionierten Theorie der fraktionierten g gg gDestillationDestillation auf die Säulenchromatographieauf die Säulenchromatographie
Übernimmt Begriffe vonÜbernimmt Begriffe von BodenhöheBodenhöhe undund
hie
I
Vaso
ld
Übernimmt Begriffe von Übernimmt Begriffe von BodenhöheBodenhöhe und und BodenzahlBodenzahl
atog
raph
11/1
2 R
.
Anschaulich, aber natürlich nur Anschaulich, aber natürlich nur näherungsweisenäherungsweise richtig, da richtig, da die Annahme einer die Annahme einer wiederholten Einstellung separaterwiederholten Einstellung separater
GleichgewichteGleichgewichte beim Vorliegen einerbeim Vorliegen einer bewegten mobilenbewegten mobilen
Chr
oma
WS
201 GleichgewichteGleichgewichte beim Vorliegen einer beim Vorliegen einer bewegten mobilenbewegten mobilen
PhasePhase eher unrealistisch isteher unrealistisch ist
4343III Der chromatographische ProzeßIII Der chromatographische ProzeßIII 10 DieIII 10 Die Theorie der BödenTheorie der BödenIII.10 Die III.10 Die Theorie der BödenTheorie der Böden
BodenhöheBodenhöhe
BodenBoden
BodenhöheBodenhöhe
hie
I
Vaso
ld
atog
raph
11/1
2 R
.
Chr
oma
WS
201
Abb. 6:Abb. 6: Beispiel eines DestillationsturmsBeispiel eines Destillationsturms
4444
III 10 1III 10 1 TrennstufenhöheTrennstufenhöhe undund TrennstufenzahlTrennstufenzahlIII Der chromatographische ProzeßIII Der chromatographische ProzeßIII.10.1 III.10.1 TrennstufenhöheTrennstufenhöhe und und TrennstufenzahlTrennstufenzahl
BodenhöheBodenhöhe == TrennstufenhöheTrennstufenhöhe HHBodenhöheBodenhöhe = = TrennstufenhöheTrennstufenhöhe HHBodenzahlBodenzahl = = TrennstufenzahlTrennstufenzahl NNzz
Definition: Definition: TrennstufenhöheTrennstufenhöheDie Trennstufenhöhe HH (die Höhe eines Theoretischen Bodens), ( )oder HETPHETP (height equivalent to one theoretical plate)(height equivalent to one theoretical plate) ist die Strecke, auf der sich beim Fließen der mobilen Phase das Gleichgewicht einmal einstellt
hie
I
Vaso
ld
Gleichgewicht einmal einstellt.
W i dW i d T t f höhT t f höh HH dd
atog
raph
11/1
2 R
. Wovon sind Wovon sind TrennstufenhöheTrennstufenhöhe HH und und TrennstufenzahlTrennstufenzahl NNzz in der in der Chromatographie abhängig ?Chromatographie abhängig ?
Chr
oma
WS
201 Chromatographie abhängig ?Chromatographie abhängig ?
4545
III 10 1 1III 10 1 1 Beeinflussung vonBeeinflussung von HH undund NNIII Der chromatographische ProzeßIII Der chromatographische ProzeßIII.10.1.1III.10.1.1 Beeinflussung von Beeinflussung von HH und und NNZZ
TrennstufenhöheTrennstufenhöhe und und TrennstufenzahlTrennstufenzahl werden werden beeinflußt von:beeinflußt von:
LängeLänge der Säuleder Säule
HHLL
NNLL
hie
I
Vaso
ld HHNNzz
NNHHzz
atog
raph
11/1
2 R
.
(18)(18) (18a)(18a)
Chr
oma
WS
201
4646III Der chromatographische ProzeßIII Der chromatographische ProzeßIII 10 1 2III 10 1 2 Bedeutung vonBedeutung von HH undund NNIII.10.1.2 III.10.1.2 Bedeutung von Bedeutung von HH und und NNZZ
Bedeutung:Bedeutung:
HH minimalminimal Trennung Trennung optimaloptimalpp
NNZZ maximalmaximal
hie
I
Vaso
ld NNZZ charakterisiert somit die charakterisiert somit die LeistungsfähigkeitLeistungsfähigkeit einer einer Trennsäule. Je besser die Säule gepackt wurde (kleine Trennsäule. Je besser die Säule gepackt wurde (kleine
T t f höh ) d j lä i i t d t öß i t diT t f höh ) d j lä i i t d t öß i t di
atog
raph
11/1
2 R
. Trennstufenhöhe), und je länger sie ist, desto größer ist die Trennstufenhöhe), und je länger sie ist, desto größer ist die TrennstufenzahlTrennstufenzahl und somit die und somit die TrennleistungTrennleistung..
Chr
oma
WS
201
4747
III 10 1 3III 10 1 3 Einfluß vonEinfluß von uu aufauf HH undund NNIII Der chromatographische ProzeßIII Der chromatographische ProzeßIII.10.1.3III.10.1.3 Einfluß von Einfluß von uumm auf auf HH und und NNZZ
Gegeben sind z.B.:Gegeben sind z.B.:Gegeben sind z.B.:Gegeben sind z.B.:
Dimensionen d. Säule: (Länge, Dicke)Dimensionen d. Säule: (Länge, Dicke)
Füllung d. Säule (Material, Füllung d. Säule (Material, Porenweite Partikelgröße etc.)Porenweite Partikelgröße etc.)
Für den Experimentator einzig Für den Experimentator einzig variierbarvariierbar soll sein: soll sein: FlußFluß, bzw. die Fließgewschwindigkeit , bzw. die Fließgewschwindigkeit uumm der der
hie
I
Vaso
ld
, g g, g g mmmobilen Phase durch die Säule.mobilen Phase durch die Säule.
JeJe größergrößer der Fluß destoder Fluß desto weniger oftweniger oft kann sich daskann sich das
atog
raph
11/1
2 R
. Je Je größergrößer der Fluß, desto der Fluß, desto weniger oftweniger oft kann sich das kann sich das GleichgewichtGleichgewicht einstellen einstellen --> > Trennung schlechter !!!Trennung schlechter !!!
JeJe niedrigerniedriger derder FlußFluß destodesto mehrmehr kommen z Bkommen z B
Chr
oma
WS
201 Je Je niedrigerniedriger der der FlußFluß, desto , desto mehrmehr kommen z.B. kommen z.B.
DiffusionsvorgängeDiffusionsvorgänge ins Spiel ins Spiel --> > Trennung schlechter !!!Trennung schlechter !!!
4848
III 10 1 4 DasIII 10 1 4 Das H/uH/u DiagrammDiagrammIII Der chromatographische ProzeßIII Der chromatographische ProzeßIII.10.1.4 Das III.10.1.4 Das H/uH/u--DiagrammDiagramm
]]H/uH/u--KurveKurvee H
[µm
]e
H [µ
m]
H/uH/u--KurveKurvefe
nhöh
efe
nhöh
e
5050
3030 MinimumMinimum
enns
tuf
enns
tuf
hie
I
Vaso
ld
1010
Tre
Tre
atog
raph
11/1
2 R
.
FließgeschwindigkeitFließgeschwindigkeit u [ cm/s ]u [ cm/s ]1,01,00,50,5 1,51,5
Chr
oma
WS
201
Abb. 7:Abb. 7: H/uH/u--DiagrammDiagramm zur Bestimmung des optimalen Flusseszur Bestimmung des optimalen Flusses
4949
III 11 DieIII 11 Die van Deemtervan Deemter--GleichungGleichungIII Der chromatographische ProzeßIII Der chromatographische ProzeßIII.11 Die III.11 Die van Deemtervan Deemter--GleichungGleichungHierbei handelt es sich um eine Hierbei handelt es sich um eine empirischeempirische Gleichung mit Gleichung mit folgenden Größen:folgenden Größen:
BBfolgenden Größen:folgenden Größen:
HH AAuu
CC uumm
mm (19)(19)
hie
I
Vaso
ld
atog
raph
11/1
2 R
.
EddyEddy--DiffusionDiffusion(Wirbeldiffusion)(Wirbeldiffusion)
LongitudinalLongitudinal--DiffusionDiffusion
StoffaustauschStoffaustausch--AnteilAnteil
Chr
oma
WS
201 AA--TermTerm BB--TermTerm CC--TermTerm
5050
III 11 DieIII 11 Die van Deemtervan Deemter--GleichungGleichungIII Der chromatographische ProzeßIII Der chromatographische ProzeßIII.11 Die III.11 Die van Deemtervan Deemter--GleichungGleichung
EddyEddy DiffusionDiffusionEddyEddy--DiffusionDiffusion(Wirbeldiffusion)(Wirbeldiffusion)
AA--TermTermAA TermTermbeschreibt die beschreibt die BandenverbreiterungBandenverbreiterung, die von , die von derder GeometrieGeometrie derder FestphasenteilchenFestphasenteilchen und vonund von
hie
I
Vaso
ld
der der GeometrieGeometrie der der FestphasenteilchenFestphasenteilchen und von und von der der PackungPackung dieser Teilchen in der Säule dieser Teilchen in der Säule herrührt.herrührt.
atog
raph
11/1
2 R
. StatistischStatistisch gesehen haben einige gesehen haben einige Probenmoleküle einen relativ Probenmoleküle einen relativ kurzenkurzen Weg, Weg, während andere gezwungen sind einenwährend andere gezwungen sind einen
Chr
oma
WS
201 während andere gezwungen sind, einen während andere gezwungen sind, einen
„Umweg“„Umweg“ zu machen.zu machen.
5151
III 11 DieIII 11 Die van Deemtervan Deemter--GleichungGleichungIII Der chromatographische ProzeßIII Der chromatographische ProzeßIII.11 Die III.11 Die van Deemtervan Deemter--GleichungGleichung
LongitudinalLongitudinalLongitudinalLongitudinal--DiffusionDiffusionBB--TermTerm
berücksichtigt:berücksichtigt: Strömungsverteilung !Strömungsverteilung !Laminare StrömungLaminare Strömung (Molekültransport) ist in der(Molekültransport) ist in der
hie
I
Vaso
ld
Laminare StrömungLaminare Strömung (Molekültransport) ist in der (Molekültransport) ist in der MitteMitte zwischen zwei Partikeln zwischen zwei Partikeln größergrößer als in der als in der NäheNähe der Packungspartikel.der Packungspartikel.
atog
raph
11/1
2 R
.
berücksichtigt:berücksichtigt: Diffusion der Moleküle !Diffusion der Moleküle !beschreibt im beschreibt im H/uH/u--DiagrammDiagramm eine eine HyperbelHyperbel
Chr
oma
WS
201
und ist in der und ist in der LCLC zu zu vernachlässigenvernachlässigen..
5252
III 11 DieIII 11 Die van Deemtervan Deemter--GleichungGleichungIII Der chromatographische ProzeßIII Der chromatographische ProzeßIII.11 Die III.11 Die van Deemtervan Deemter--GleichungGleichung
StoffaustauschStoffaustausch--AnteilAnteilCC TT
berücksichtigt:berücksichtigt: Kinetische Beiträge!Kinetische Beiträge!
CC--TermTerm
hie
I
Vaso
ld Geschwindigkeit Geschwindigkeit desdes Stoffaustausches Stoffaustausches zwischen stationärer und mobiler Phase.zwischen stationärer und mobiler Phase.
atog
raph
11/1
2 R
.
GeschwindigkeitGeschwindigkeit des des MassentransportesMassentransportes der der Probenmoleküle Probenmoleküle in die Porenin die Poren der stat. Phase der stat. Phase
Chr
oma
WS
201
und und ausaus ihnenihnen herausheraus ..
5353III Der chromatographische ProzeßIII 11 DieIII 11 Die van Deemtervan Deemter--GleichungGleichungDie Die H/uH/u--KurveKurve erhält man nach Addition aller drei Terme dererhält man nach Addition aller drei Terme dervanvan DeemterDeemter GleichungGleichung:
III.11 Die III.11 Die van Deemtervan Deemter--GleichungGleichung
vanvan--DeemterDeemter-- GleichungGleichung:
µm]
µm]
H/uH/u--KurveKurveöh
e H
[µöh
e H
[µ
BB TermTerm
CC--TermTerm
stuf
enhö
stuf
enhö
5050
hie
I
Vaso
ld
1010
3030
AA--TermTerm
BB--TermTerm
Tren
nTr
enn
atog
raph
11/1
2 R
.
1,01,00,50,5
1010
Fließgeschwindigkeit u [cm/s]Fließgeschwindigkeit u [cm/s]1,51,5
Chr
oma
WS
201
Abb. 8:Abb. 8: H/uH/u--Diagramm mit den Termen der Diagramm mit den Termen der VanVan--DeemterDeemter--GleichungGleichung
5454
III 12 Facit der vanvan Deemter GleichungDeemter GleichungIII Der chromatographische ProzeßIII.12 Facit der vanvan Deemter GleichungDeemter Gleichung
I d Ch t hi i t b t btI d Ch t hi i t b t bt t Tt TIn der Chromatographie ist man bestrebt, In der Chromatographie ist man bestrebt, gute Trennungengute Trennungenin in relativ kurzen Analysenzeitenrelativ kurzen Analysenzeiten durchzuführen. D.h. man durchzuführen. D.h. man versucht eine versucht eine minimale Trennstufenhöheminimale Trennstufenhöhe bei möglichst bei möglichst flacher flacher H/u KurveH/u Kurve zu erzielen.zu erzielen.
Dies läßt sich erreichen durch:Dies läßt sich erreichen durch:
Geringe Geringe KorngrößenKorngrößen(Einfluß auf(Einfluß auf AA TermTerm undund CC TermTerm))
hie
I
Vaso
ld (Einfluß auf (Einfluß auf AA--TermTerm und und CC--TermTerm))
Enge Enge KorngrößenverteilungKorngrößenverteilung bzw. dichte Packung bzw. dichte Packung (Ei fl ß f(Ei fl ß f BB TT ))
atog
raph
11/1
2 R
. (Einfluß auf (Einfluß auf BB--TermTerm))
Geringer Geringer SäulendurchmesserSäulendurchmesser
Chr
oma
WS
201
(Einfluß auf (Einfluß auf AA--TermTerm und und BB--TermTerm))
5555
III 13 Bedeutung in derIII 13 Bedeutung in der PraxisPraxisIII Der chromatographische ProzeßIII Der chromatographische ProzeßIII.13 Bedeutung in der III.13 Bedeutung in der PraxisPraxis
B i t ktB i t kt HPLCHPLC Sä lSä l li tli t HH b ib i D ltD ltBei gut gepackten Bei gut gepackten HPLCHPLC--SäulenSäulen liegt liegt HH beim beim Doppelten Doppelten bis bis FünffachenFünffachen des des mittleren Teilchendurchmessers mittleren Teilchendurchmessers ddpp ..
Trennstufenhöhe HPLCTrennstufenhöhe HPLC: 10: 10 25 µm25 µmTrennstufenhöhe HPLCTrennstufenhöhe HPLC: 10: 10--25 µm25 µm
Trennstufenzahl HPLCTrennstufenzahl HPLC: 4.000: 4.000--10.00010.000
hie
I
Vaso
ld
atog
raph
11/1
2 R
.
Trennstufenzahl GCTrennstufenzahl GC: 3.000: 3.000--150.000150.000
Trennstufenhöhe GCTrennstufenhöhe GC: 0.3: 0.3--0.8 mm0.8 mm
Chr
oma
WS
201
5656
hie
I
Vaso
ld
atog
raph
11/1
2 R
.
Kapitel IV: Kapitel IV:
Chr
oma
WS
201 Das Chromatogramm Das Chromatogramm
5757IV Das ChromatogrammIV Das ChromatogrammIV 1IV 1 QualitativeQualitative AussagenAussagenIV.1 IV.1 QualitativeQualitative AussagenAussagen
z B Zuordnung von Substanzen überz B Zuordnung von Substanzen überz.B. Zuordnung von Substanzen überz.B. Zuordnung von Substanzen überidentische Retentionszeitidentische Retentionszeit ttRR(x)(x)..
Ggf. Injektion von Ggf. Injektion von ReferenzsubstanzenReferenzsubstanzen..
z.B. Identifizierung von Substanzen überz.B. Identifizierung von Substanzen überUVUV APEXAPEX SpektrenSpektren (Diodenarray)(Diodenarray)
hie
I
Vaso
ld UVUV--APEXAPEX--SpektrenSpektren (Diodenarray),(Diodenarray),siehe Seminar und Praktikumsiehe Seminar und Praktikum..
atog
raph
11/1
2 R
.
z.B. Identifizierung von Substanzen überz.B. Identifizierung von Substanzen überIsoplot undIsoplot und 33--DD--PlotPlot
Chr
oma
WS
201 Isoplot und Isoplot und 33 DD PlotPlot ..
5858IV Das ChromatogrammIV Das ChromatogrammIV 1 1 DerIV 1 1 Der IsoplotIsoplotIV.1.1 Der IV.1.1 Der IsoplotIsoplot
AbsorptionAbsorption0 mAU0 mAU 100 mAU100 mAUe
[nm
]e
[nm
]en
läng
een
läng
eW
ell
Wel
l
hie
I
Vaso
ld
atog
raph
11/1
2 R
.
Chr
oma
WS
201
Abb. 9:Abb. 9: IsoplotIsoplot einer einer chromatographischenchromatographischen TrennungTrennung Zeit [min]Zeit [min]
5959IV Das ChromatogrammIV Das ChromatogrammIV 1 2 DerIV 1 2 Der 3D3D PlotPlotIV.1.2 Der IV.1.2 Der 3D3D--PlotPlot
n [m
AU
]n
[mA
U]
hie
I
Vaso
ld
bsor
ptio
nbs
orpt
ion
atog
raph
11/1
2 R
.
Ab
Ab
Chr
oma
WS
201
Abb. 10:Abb. 10: 3D3D--Plot einer Plot einer chromatographischenchromatographischen TrennungTrennung
6060IV Das ChromatogrammIV Das ChromatogrammIV 2IV 2 QuantitativeQuantitative AussagenAussagenIV.2 IV.2 QuantitativeQuantitative AussagenAussagen
DiDi Flä hFlä h ii P kP k i t di t dDie Die FlächeFläche eines eines PeaksPeaks ist der ist der eingespritzten Stoffmengeeingespritzten Stoffmenge proportionalproportional
Dadurch hat Dadurch hat jedejede Substanz für Substanz für jedejedeChromatographiebedingung ihren eigenen Chromatographiebedingung ihren eigenen ProportionalitätsfaktorProportionalitätsfaktor..
Diese Proportionalitätsfaktoren können
hie
I
Vaso
ld
Diese Proportionalitätsfaktoren können durch Injektion von Kalibriergemischen, die die zu bestimmenden Substanzen in
atog
raph
11/1
2 R
.
bekannter Konzentration enthalten, ermittelt werden (Methode des Internen Standards -i h S i d P ktik )
Chr
oma
WS
201 siehe Seminar und Praktikum)
6161IV Das ChromatogrammIV 3 Kenngrößen des ChromatogrammsIV.3 Kenngrößen des Chromatogramms
tt tt ttRR (X)(X) SS(X)(X)
ttRR(X(X11))
ttRR(X(X22))tt tt ttRR (X)(X) SS(X)(X) mm
ttRR(X(X11))
ttmm
hie
I
Vaso
ld
atog
raph
11/1
2 R
. Zeit [s]ttSS(X(X11))ttSS(X(X22))
Chr
oma
WS
201
Abb. 11:Abb. 11: MusterchromatogrammMusterchromatogramm mit mit ttSS(X)(X) als Aufenthaltszeit als Aufenthaltszeit der Komponente X in der stationären Phaseder Komponente X in der stationären Phase
6262IV Das ChromatogrammIV Das ChromatogrammIV 4 BerechnungsbeispieleIV 4 BerechnungsbeispieleIV.4 BerechnungsbeispieleIV.4 Berechnungsbeispiele
Beispiel:ttmm = 2 min= 2 min 120 s120 sttRR(X1)(X1) = 5 min= 5 min 300 s300 sRR( )( ) 300 s300 sttRR(X2)(X2) = 10 min= 10 min 600 s600 s
tt tt 300300 120120(X(X ))kk
tt tttt11
300300 120120
RR mm
mm
(X(X11)) ss ss120120 ss
11 55,,
hie
I
Vaso
ld
kktt tt
tt22600600 120120
RR mm(X(X22)) ss ss120120
44 00,,
atog
raph
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2 R
. tt22mm 120120 ss
,,
Chr
oma
WS
201 Angabe der Flächenwerte in Angabe der Flächenwerte in [mAU s[mAU s--11]]
6363IV Das ChromatogrammIV Das ChromatogrammIV 5IV 5 BewertungBewertung derder RetentionsfaktorenRetentionsfaktorenIV.5 IV.5 BewertungBewertung der der RetentionsfaktorenRetentionsfaktoren
Optimale Trennung bei 1,5 < Optimale Trennung bei 1,5 < kk < 5 < 5
Zu wenig Wechselwirkung Zu wenig Wechselwirkung zwischen Substanz und zwischen Substanz und
stationärer Phasestationärer Phasekk < 1,5< 1,5
hie
I
Vaso
ld
Z l A l itZ l A l it
atog
raph
11/1
2 R
. Zu lange AnalysenzeitenZu lange AnalysenzeitenZu breite PeaksZu breite Peakskk > 5> 5
Chr
oma
WS
201
6464IV Das ChromatogrammIV Das ChromatogrammIV 6 Das ProblemIV 6 Das Problem schlecht getrennterschlecht getrennter PeaksPeaksIV.6 Das Problem IV.6 Das Problem schlecht getrennterschlecht getrennter PeaksPeaks
hie
I
Vaso
ld
atog
raph
11/1
2 R
.
ttRR(X1)(X1) ttRR(X2)(X2)Zeit [min]Zeit [min]
Chr
oma
WS
201
Abb. 12:Abb. 12: ChromatogrammChromatogramm mit mit schlecht aufgelöstem schlecht aufgelöstem PeakpaarPeakpaar
6565IV Das ChromatogrammIV Das ChromatogrammIV 7 DieIV 7 Die Selektivität (Trennfaktor)Selektivität (Trennfaktor) ααIV.7 Die IV.7 Die Selektivität (Trennfaktor)Selektivität (Trennfaktor) αα
beschreibt die beschreibt die GüteGüte der Trennung zweier der Trennung zweier ggbenachbarterbenachbarter PeaksPeaks
Wird gebildet aus demWird gebildet aus dem QuotientenQuotienten der beidender beidenWird gebildet aus dem Wird gebildet aus dem QuotientenQuotienten der beiden der beiden RetentionsfaktorenRetentionsfaktoren kk22 und und kk11
kkkk
tttt
mitmit kk kk2222 11
ss(X(X22 ))
(X(X ))
hie
I
Vaso
ld kk tt1122 11
ss(X(X11))
atog
raph
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.
Keine TrennungKeine Trennung= 1= 1
Chr
oma
WS
201 1<1< < 5< 5 optimale Trennungoptimale Trennung
6666IV Das ChromatogrammIV Das ChromatogrammIV 8 DieIV 8 Die AuflösungAuflösung RRIV.8 Die IV.8 Die AuflösungAuflösung RRSS
Die Die geometrischegeometrische Definition lautet:Definition lautet:
tt tt(( ))RR (X(X 22 )) RR (X(X 11))RR
tt tt
tt ttSS
(( ))
,, (( ))RR (X(X 22 )) RR (X(X 11))
ww (X(X 11)) ww (X(X 22 ))00 55
hie
I
Vaso
ld
ww 11 ww 22
atog
raph
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.
BasisbreiteBasisbreite vom Peakvom Peakder Komponente der Komponente X1X1
BasisbreiteBasisbreite vom Peakvom Peakder Komponente der Komponente X2X2
Chr
oma
WS
201 pp
6767IV Das ChromatogrammIV Das ChromatogrammIV 9 DasIV 9 Das GaußprofilGaußprofil
ttRR(X(X22))tt (X(X ))
IV.9 Das IV.9 Das GaußprofilGaußprofil
ttRR(X(X11))
hh11
22 (X(X ))
hh11pp
22ττ(X(X11))
22ττ(X(X22))
hh22pp
hie
I
Vaso
ld ttmm0.61 h0.61 h11
pp0.61 h0.61 h22
pp
atog
raph
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.
Zeit [s]Zeit [s](( ))
ttSS(X(X11))
ttww(x(x11) = ) = 44ττ(X(X11) ) tw(x2) = 4τ(X2)
Chr
oma
WS
201 ttSS(X(X22))ww(( 11)) ττ(( 11))
Abb. 13:Abb. 13: MusterchromatogrammMusterchromatogramm mit mit ttww als als Basisbreite Basisbreite undundττ(X) (X) alsals Diffuse BandenverbreiterungDiffuse Bandenverbreiterung
w( 2) τ( )
6868IV Das ChromatogrammIV Das ChromatogrammIV 10 Bewertung derIV 10 Bewertung der AuflösungAuflösung RRIV.10 Bewertung der IV.10 Bewertung der AuflösungAuflösung RRSS
P k li ihP k li ih
RRSS = 1= 1Peaks liegen um ihrePeaks liegen um ihremittlere Basisbreitemittlere Basisbreiteauseinander d.h.auseinander d.h.ÜÜÜberlappung 3%Überlappung 3%
1<1< RR < 1 5< 1 5 fast vollständige fast vollständige 1< 1< RRS S < 1.5< 1.5 gg(meist ausreichende) (meist ausreichende) TrennungTrennung
hie
I
Vaso
ld
1.25 < 1.25 < RRS S < 1.5< 1.5vollständige, gute vollständige, gute TrennungTrennung
atog
raph
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.
RRS S > 1.5> 1.5meist unnötig gute meist unnötig gute Trennung d.h. zu Trennung d.h. zu l R t ti itl R t ti it
Chr
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201 lange Retentionszeitlange Retentionszeit
6969
hie
I
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ld
atog
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.
Kapitel V: LiteraturKapitel V: Literatur
Chr
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201 Kapitel V: Literatur Kapitel V: Literatur
7070V Literatur V Literatur HPLCHPLC
S d L R Ki kl d J JS d L R Ki kl d J JSnyder L.R., Kirkland J.J.,Snyder L.R., Kirkland J.J.,Introduction to Modern Liquid ChromatographyIntroduction to Modern Liquid Chromatography, John Wiley., John Wiley.
M V RM V RMeyer V.R.,Meyer V.R.,Praxis der HochleistungsflüssigchromatographiePraxis der Hochleistungsflüssigchromatographie,,Salle+SauerländerSalle+Sauerländer.
Unger K.K.,Unger K.K.,Handbuch der HPLCHandbuch der HPLC, GIT Verlag., GIT Verlag.
hie
I
Vaso
ld Scott R.P.W.,Scott R.P.W.,Chromatographic DetectorsChromatographic Detectors, Jack Cazes, Cherry Hill,, Jack Cazes, Cherry Hill,New JerseyNew Jersey
atog
raph
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2 R
. New JerseyNew Jersey
Huber L., George,S.A.,Huber L., George,S.A.,Diode Array Detection in HPLCDiode Array Detection in HPLC, Jack Cazes, Cherry Hill,, Jack Cazes, Cherry Hill,
Chr
oma
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201 yy , , y ,, , y ,
NewJerseyNewJersey