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DR. JESÚS BENITO RUIZ
Células madrederivadas del tejido
adiposo
Clinica Tres Torres, Barcelona
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Las células madres pueden ser células embrionarias y células madre adultas.
Las células madre adultas derivan de celulas madre fetales y de células del cordón umbilical
Los trabajos con céulas madre se iniciaron en 1963, cuando se describieron unas células autoregenerantes en la médula ósea del ratón que se postularon como células madre regenerativas (luego denominadas Células Madre Hematopoyéticas). A finales de los 70 estas células se identificaron en el cordón umbilical y se descubieron también las Células Madre Mesenquimales en la médula ósea.
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Zuk y cols en el 2001 aislan lo que denominaron Processed Lipoaspirate Cells o PLA.
Puesto que en la práctica clínica se observan situaciones en la que hay osificación de tejido adiposo, asumieron que las células residentes , preadipocitos unipotenciales no podrían ser las causantes. Asi que investigaron si las PLA podrían ser las células multipotenciales que podrían diferenciarse en lineas celulares mesodérmicas (adipógenas, condrógenas, osteógenas y miógenas)
(Zuk PA, Zhu M, Mizuno H et al. Multilineage cells from huma adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Eng., 2001, 7:211-228)
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el tejido adiposo humano contiene una población de células capaz de proliferar y diferenciarse en múltiples líneas celulares, características de las células troncales o células madre
(Zuk PA, Zhu M, Ashjian P, De Ugarte DA, Huang JI, Mizuno H, Alfonso ZC, Fraser JK, Benhaim P, Hedrick MH (2002) Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Mol Biol Cell 13:4279–4295)
Se caracterizan por potencial de diferenciación y de clonicidad (diferenciación en múltiples líneas de clones de ASC individuales)
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Dadas las dificultades éticas y políticas para trabajar con células embrionarias, los investigadores vieron la luz al poder trabajar con unas células multipotenciales que se pueden obtener de una forma tan fácil y tan ubicua.
Se han convertido en la principal herramienta de trabajo en investigación de ingenieria tisular. Hay más de 1000 resultados en medline cuando se busca “adipose derived stem cell”.
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Los trabajos con ASC se están realizando en multitud de campos.
En el laboratorio se sabe que pueden diferenciarse (en medio apropiado) en células adiposas, óseas, neurales, cartílago, músculo, tejido cuerdas vocales, uretra, cardiovascular,hematopoyética, pancreático,hepáticas, celulas epiteliales tubulo renal.
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Se está estudiando el papel de ASC para tratamiento de procesos como reparación de disco interventebral, fracturas, lesiones nerviosas (médula espinal, nervio periférico), Huntington, esclerosis múltiple,incontinencia urinaria,disfunción erectil, reparación hepática, diabetes, colitis, Crohn, isquemia miocárdica y tejidos en general, lesiones por radiodermitis, ulceras, antienvejecimiento, tendones.
Hay ensayos clínicos en marcha en reparación osea, enf. De Crohn, incontinencia urinaria y en enfermedad injerto vs huésped (parece que las ASC pueden suprimir aspectos específicos del sistema inmune). También parecen estimular la activación y proliferación de células T durmientes y generan céulas T reguladoras
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Las células, denominadas Celulas Troncales derivadas del tejido adiposo (Adipose-Derived Stem Cells) son capaces de elaborar factores de crecimiento
(Yi, CG et al., VEGF gene therapy fort he survival of transplanted fat tissue in nude mice. J. Plast. Reconstr.Aesth.Surg., 2007, 60:272-278)
(Patrick CW et al., Long term implantation of preadypocite-seeded PLGA scaffolds. Tissue Eng., 2002, 109:1292-1298).
La hipoxia aumenta la secreción de proteina liganda de factor de crecimiento insulina-like (IGFBP 1 y 2), de factor estimulante de crecimiento de colonias de macrófagos (M-CSF), receptor de M-CSF, de PGFbeta y de factor de crecimiento vascular endotelial
(Park BS, Kim Ws, Choi JS et al. Hair growth stimulated by conditioned medium of adipose-derived stem cells is enhanced by hypoxia: evidence of increased growth factor secretion. Biomed Res., 2010, 31(1): 27-34
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El tejido adiposo también contiene células endoteliales progenitoras que participan en la formación de vasos sanguíneos Miranville A, Heeschen C, Sengenes C, Curat CA, Busse R, Bouloumie A (2004) Improvement of postnatal neovascularization by human adipose tissue-derived stem cells. Circulation 110:349–355
Planat-Benard V, et al. Plasticity of human adipose lineage cells toward endothelial cells: physiological en therapeutic perspectives. Circulation 2004, 109: 656-663.
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El conjunto de estas células se conoce como Células regenerativas derivadas del tejido adiposo o fracción vascular estromal, caracterizadas por su capacidad para generar nuevo tejido adiposo y vasos sanguíneos asi como producir factores de crecimiento que ayuden a sobrevivir a los adipocitos y a la formación de la red vascular
Rehman J, Traktuev D, Li J, Merfeld-Clauss S, Temm-Grove CJ, Bovenkerk JE, Pell CL, Johnstone BH, Considine RV, March KL (2004) Secretion of angiogenic and antiapoptotic factors by human adipose stromal cells. Circulation 109:1292–1298
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1 gramo de tejido adiposo aspirado tiene 6.9 x 105 adipocitos y 2.1 x 106 de celulas no-adipocitos.
Considerando factores como la distinta concentración en las distintas fases del centrifugado y el tamaño de adipocitos (entre 90 y 100 µ, calculan que hay 1.000.000 de adipocitos en 1 ml.
El 37% de las células no adipocitos están en la fracción estromal vascular y que ocupan la parte baja del centrifugado son células madre derivadas del adipocito
Suga H, Matsumoto D, Inoue K, Shigeura T, Eto H, Aoi N, Kato H, Abe H, Yoshimura K. Numerical measurement of viable
and nonviable adipocytes and other cellular components in aspirated fat tissue. Plast Reconstr Surg. 2008 Jul;122(1):103-14.
Se calculan unas 400000 células de la fracción estromal por ml y de ellas
un 1-5 % son ASCs
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Se han aislado células tanto en la fraccion de tejido adiposo como en el líquido de la centrifugación.
Estas células se caracterizan por tener marcadores CD34+ y CD45-
El marcador tipico de la ASC es CD31- CD34+ CD45- CD90+
CD105- CD146-
CD34+ significa que son progenitores de pericitos En cultivo las ASC expresan CD31+ que es típico de las
células endoteliales. En cultivo también expresan CD105+ que es el marcador
relacionado con con las células mesenquimales
Yoshimura K, Shigeura T, Matsumoto D, Sato T, Takaki Y, Aiba-Kojima E, Sato K, Inoue K, Nagase T, Koshima I, Gonda K. Characterization of freshly isolated and cultured cells derived from the fatty and fluid portions of liposuction aspirates. J Cell Physiol. 2006 Jul;208(1):64-76
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Esto explica que las ASC son capaces de diferenciarse a células adiposas, condrales, óseas, musculares, neurales, endoteliales y hepáticas (con el estímulo adecuado)
En condiciones adipogénicas las células CD105-
exhiben más genes de tejido adiposo, mientras que las CD105+ son más osteogénicas y condrogénicas ( Jiang T, Liu W, Lu X et al. Potent in vitro chondrogenesis of CD105+ enriched huma adipose derived stem cells. Biomaterials, 2010 (Epub)
Existen evidencias que hay diferentes subpoblaciones de ASC que expresan diferentes marcadores y con diferente capacidad de diferenciación
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El tejido adiposo aspirado tiene también factores de crecimiento y se han aislado bFGF, IGF-1, PDGF-BB y VEGF.
Pallua y cols han estudiado el centrifugado a temperatura ambiente y a los 3 y 5 dias y estos factores permanecen.
Pallua N, Pulsfort AK, Suschek C, Wolter TP. Content of the growth factors
bFGF, IGF-1, VEGF, and PDGF-BB in freshly harvested lipoaspirate after
centrifugation and incubation. Plast Reconstr Surg. 2009 Mar;123(3):826-33.
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Estudio en muestra nativa sinCentrifugar y en centrifugada
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bFGF (basic fibroblastic growth factor) induce neovascularización y s eha visto que añadido a una muestra de tejido adiposo aumenta la supervivencia
VEGF: aumenta la viabilidad del tejido transplantado y la angiogénesis y su expresión aumenta en hipoxia
PDGF-BB: platelet derived groth factor. Inducido en el proceso inflamatorio, estimula la proliferación de preadipocitos, aumenta la supervivencia del transplante y es quimiotáctico.
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Parece pues que tanto los factores presentes como la hipoxia del transplante favorecen la conversión de las ASC en celulas endoteliales, aumentando la vascularización y favoreciendo la angiogénesis. No sólo contribuyen a la supervivencia del implante sino que también a la vascularización de la dermis donde se implantan (validado en la experiencia clínica)
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Influencia de diversos factores en la supervivencia de adipocitos y ASC durante el proceso de obtención y
transferencia
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La temperatura
Matsumoto D, Shigeura T, Sato K, Inoue K, Suga H, Kato H, Aoi N, Murase S, Gonda K, Yoshimura K. Influences of preservation at various temperatures on liposuction aspirates. Plast Reconstr Surg. 2007 Nov;120(6):1510-7
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Estudian la degeneración de la grasa y persistencia de adipocitos y ASC en muestras centrifugadas a 2330g por cinco minutos a 1-2-4-24 horas a temperatura ambiente, 4ºC a 1-2-3 dias y a -80ºC por 1 mes.
Estudian el “oil ratio” y la presencia de glicerol-3-fosfato dehidrogenasa (una enzima intracelular) asi como porcentaje de ASCs
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2330 g = 3600 rpm
Los adipocitos aguantan bien laCentrifugacion incluso a 4300 g
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Hasta las 4 horas de preservacion a Temperatura ambiente hay aumento progresivo de oil ratio y GPDH, muy significativa a 24 hLas ASC parecen mantenerse hasta 4 h. Pero a las 24 horas casi han desaparecido. Si se preserva a -4ºC el número de ASC se mantiene 24 h. PeroLuego se reducen.
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Recomiendan hacer la transferencia en menos de 4 horas
Si se ha de enviar tejido adiposo para procesar y obtener ASC puede enfriarse a 4ºC, teniendo 24 horas.
Parece ser que se puede alargar la supervivencia de las ASC con la adición de PVP (polivinilpirrolidona) al 10% en medio PBS (1) o DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium)(2).
1. (Guha A, Devireddy R. Polyvinylpirrolidone PVP mitigates the damaging effects of intracellular ice formation in adult stem cells. Ann Biomed. Eng., 2010 (Epub))
2. Thirumala S., Gimble JM., Devireddy RV. Cryopreservation of stromal vascular fraction of adipose tissue ina serum-free freezing medium. J. Tissue Eng. Regen. Med., 2009 (Epub)
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La centrifugación
Kurita M, Matsumoto D, Shigeura T, Sato K, Gonda K, Harii K, Yoshimura K. Influencesof centrifugation on cells and tissues in liposuction aspirates: optimized centrifugation for lipotransfer and cell isolation. Plast Reconstr Surg. 2008 Mar;121(3):1033-41
![Page 32: Cirugia plastica: celulas madre del tejido adiposo](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062405/557e2099d8b42abc648b54f2/html5/thumbnails/32.jpg)
Estudio de viabilidad de adipocitos y ASC a 400 – 800 – 1200 – 3000 y 4200 g.
Injerto en ratones y medida del peso del injerto al mes
( Coleman es a 1286 g)
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![Page 34: Cirugia plastica: celulas madre del tejido adiposo](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062405/557e2099d8b42abc648b54f2/html5/thumbnails/34.jpg)
Hay cierta reduccion de tejidoAdiposo y aumento de fracción oleica alAumentar la centrifugación pero no esSignificativaEl número de ASC es consistente hasta1200g pero luego cae a partir de 4000gLa supervivencia de los injertos al mesEn ratones es ligeramente superior enLos centrifugados a 3000 gNo hay incremento de paso de células rojas Y de ASC al liquido a mayor fuerza decentrifugacion
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El tejido adiposo nativo es más rico en ASC que el aspirado, pero la centrifugación hace que el tejido se compacte y aumenta de forma relativa la concentración de ASC.
Calculan que de 140 ml aspirados, se obtienen 100 ml una vez centrifugados y de éstos se consiguen unos 80 ml de aumento
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Recomiendan 1200 g (1892 rpm) que viene a ser lo que expuso Coleman (1286 g)
g = (1.119 x 10^-5) * rpm^2 * r r es el radio del rotor
Ojo que hay que saber el radio del rotor de la centrifuga para poder calcular correctamente las g.
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Lavado vs centrifugado
Condé-Green A, Gontijo de Amorim NF, Pitanguy I.Influence of decantation, washing and centrifugationon adipocyte and mesenchymal stem cell content ofaspirated adipose tissue: a comparative study. J Plast Reconstr Aesthet Surg. 2009
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Estudian la diferencia en número de adipocitos y células no adipocitos
El lavado y el centrifugado eliminan la mayor parte de células de serie roja, pero el lavado parece conservar más adipocitos y ASC que el centrifugado.
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CD 45+ son celulas rojas, CD 45- son celulas endoteliales (CD 34+), Células mesenquimales (CD 105+) y ASC (CD 31+)
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El vacío
No hay datos concluyentes que aseguren que la obtención a jeringa sea mejor que con lipoaspirador.
Se recomienda usar lipoaspirador a 0.5 atmLa jeringa obtiene una presión de 660 mmHG
(0.86 at)
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Kahveci R et al., A useful technique to obtain adequate negative pressure for liposuction, J Plast Reconstr Aesthet Surg (2009),
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El vacío
Parece que el porcentaje de células de la fracción estromal es mayor cuando se usa aspiración a 350 mmHg que 700 mmHG y superior en ambos casos que jeringa.
Mojallal A, A uxenfans C, L equeux C, B raye F, Damour O. Infl uence of negative pressure when harvesting adipose tissue on cell yield of the stromal–vascular fraction. Biomed Mater Eng 2008; 18: 193 – 7 .
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Parece ser que las concentraciones de ASC (CD31-/CD34+) son mayores en el tejido adiposo de zona torácica y abdomen bajos)
Kishi K, Imanishi N, Ohara H et al. Distribution of adipose-derived stem cells in adipose tissues from
human cadavers. J. Plast. Reconstr. Surg., 2009 (Epub)
¿Cuál es la mejor zona donante?
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Se ha comparado la celularidad y viabilidad de ASC entre lipoaspirado y tejido adiposo integro (biopsia). Eto y cols concluyen que la composición original del tejido adiposo intacto es de: Adipocitos, 16%; células estromales, 30 %; céulas endoteliales, 15%; otros (fibroblastos, células musculares lisas, 30 %; y células sanguíneas , 9 %. Los resultados indican un mayor daño tisular y deficiencia de células progenitoras en tejido aspirado.
¿Cómo obtener más ASCs?
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La deficiencia relativa de ASC en lipoaspirado puede deberse a: la mayor parte de ASC esta alrededor del los grandes vasos,
que se dejan en la zona donante Algunas ASC pasan a la fracción liquida del lipoaspirado Algunas ASC son dañadas en el proceso de lipoaspiración.
Hay que tener en cuenta que estos autores no centrifugan el aspirado. La centrifugación puede aumentar la concentración de células madre y adipocitos viables.
Estos hallazgos pueden justificar el enriquecimiento con ASC (Cellution)
¿Cómo obtener más ASCs?
![Page 47: Cirugia plastica: celulas madre del tejido adiposo](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062405/557e2099d8b42abc648b54f2/html5/thumbnails/47.jpg)
Eto H, Suga H, Matsumoto D et al. Characterization of structure and cellular components of aspirated and excised adipose tissue. Plast. Reconstr. Sur., 2009, 124(4): 1087-1097
NOTA: 30% rotura de adipocitos con cánula de 2.5 mm a vacio de 500 – 700 mmHg
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Sin embargo, Schreml y cols concluyen en su trabajo que no encuentran diferencia estadísticamente significativa en cuanto a número de células entre lipoaspirado y pieza de resección quirúrgica, pero había más células viables en lipoaspirado y no hay diferencia en cuanto a potencial adipogénico entre ambas formas de obtención
Schreml S, babilas P, Fruth S et al. Harvesting human adipose tissue-derived adult stem cells: resection vs liposuction. Cytotherapy 2009, 11(7): 947-957
¿Cómo obtener más ASCs?
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Un estudio reciente en ratones ha demostrado que el número de ASC por gramo de tejido adiposo disminuye con la edad, pero no su capacidad de diferenciación y multipotencialidad.
(Yamada T., Akamatsu H, Hasegawa S et al. Age-related changes of p75 neurotrophin receptor-positive adipose derived stem cells. Dermatol. Sci., 2010. (Epub)
ASCs y edad
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ASCs y antiaging
Las ASC tienen varios aceleran la reparación de las heridas, ya que activan los fibroblastos, incitan su proliferación mediante su actividad paracrina y liberación de diversos factores como basic Wbroblast growth factor (bFGF), keratinocyte growth factor (KGF), TGF-1, HGF y VEGF. Promueven también la producción de colágeno tipo I y la migración de fibroblastos. En animale s aceleran la cicatrización.
La hipoxia incrementa estos fenómenos
Kim WS, Park BS, Sung JH, Yang JM, Park SB, Kwak SJ, Park JS (2007) Wound healing eVect of adipose-derived stem cells: a critical role of secretory factors on human dermal Wbroblasts. J Dermatol Sci 48:15–24
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ASCs podrían tener un efecto antioxidante, reductor de arrugas cutáneas y blanqueador.
Algunos estudios en animales han mostrado una reducción de arrugas creadas con radiación UVB
Park BS, Jang KA, Sung JH, Park JS, Kwon YH, Kim KJ, Kim WS (2008) Adipose-derived stem cells and their secretory factors as a promising therapy for skin aging. Dermatol Surg 34:1323–1326.
El problema actualmente es cómo obtener y utilizar las ASCs y medio adecuado para llevarlo a cabo. Se están investigando diversos biomateriales que sirvan como andamio y vehiculo de las ASCs en regeneración tisular
ASCs y antiaging
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