Download - Clase 4 2015 Transformacion Fondo Blanco
-
Transformación Genética de Especies Vegetales
Dra. Marisa LOPEZ BILBAO
Instituto de Biotecnología, INTA
Departamento de Fisiología, Biología Molecular y Celular Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Universidad de Buenos Aires
AGROBIOTECNOLOGIA CURSO 2015
- Para transformar una especie vegetal
Analizar las plantas obtenidas (presencia,
estabilidad y nivel de expresión del transgén)
Ensayos de transformación
Sistema de cultivo de tejidos
Eficiente y reproducible,
Descendencia fértil
Método de selección
(Sin escapes)
Vector de Transformación (gen de
interés, gen de selección, promotor,
otras secuencias regulatorias)
Entrega: Cepa de Agrobacterium
o Gen Gun (otros métodos
menos usados)
Mercedes R
- • Sistemas de transferencia de ADN basados
en vectores biológicos
- Sistemas basados en Agrobacterium tumefaciens
y Agrobacterium rhizogenes
- Sistemas basados en virus vegetales
• Sistemas de transferencia directa de ADN
- Transferencia por biobalística
- Transferencia mediada por cationes divalentes
y/o electroporación
- Transferencia por microinyección
Sistemas de transferencia genética en plantas
Entrega: Cepa de
Agrobacterium o
Gen Gun (otros
métodos menos
usados)
-
Tumor de tallo provocado
por Agrobacterium tumefaciens
Agrobacterium tumefaciens
Tomado de: Tzfira and Citovsky, Trends in Cell Biology, 2002.
Procesos celulares Etapas de infección
Agrobacterium se une a
la célula húesped Reconocimiento célula - célula
Procesamiento del ADN
Empaquetamiento del ADN
Transporte intercelular
Importación al núcleo
Integración del ADN y expresión de los genes
BI
Hebra T
Formación del complejo T
inmaduro, compuesto por
VirD2 y la hebra T
Formación del pilus para el
transporte del complejo T dentro de la célula húesped
Importación de la hebra T al
núcleo de la célula húesped
Integración de la hebra T y la
formación del tumor
Formación del complejo T
maduro, compuesto por
VirD2 y la hebra T cubierta
por VirE2
BD
Procesos celulares involucrados
en las etapas de interacción entre
la bacteria y la planta
Biología de Agrobacterium tumefaciens
-
Mapa genético del plásmido
Ti de octopina
Biología de Agrobacterium tumefaciens
-
Mapa genético del
plásmido Ti de
octopina
Estructura de la
región T de un
plásmido Ti de
octopina
-
Tomado de: Tzfira and Citovsky, Trends in Cell Biology, 2002.
2
Mecanismos moleculares implicados en la transformación por Agrobacterium tumefaciens
-
Agrobacterium
tumefaciens posee
un sistema
regulatorio de dos
componentes para
reconocer las
células vegetales
susceptibles
-
Una única molécula
de proteína VirD2 se
halla unida
covalentemente al
extremo 5’ del DNA.
Se requieren
600 moléculas
de VirE2 para
recubrir los 20
Kbp del ADN-T
VirB2
Ensamblaje de las proteínas de Agrobacterium
involucradas en el transporte del complejo T
Procesamiento de la hebra T y formación
del complejo T maduro
-
La integración
del ADN-T al genoma
de la célula vegetal
involucra
el apareamiento
no homólogo entre
éste y el ADN
cromosómico
(1) y (3): digestión de las cadenas desplazadas de ADN
de la planta por endonucleasas. (2): digestión del
extremo no apareado
del ADN-T por exo- o endonucleasas. (4) y (5): cortes
en la cadena desapareada del ADN de la planta
-
Protocolos de transformación mediante Agrobacterium tumefaciens
Transformación estable
Transformación transiente No se hereda y se usa para estudios en
el laboratorio de función, especificidad,
nivel de expresión, etc
Se obtienen plantas y su descendencia
portadoras del transgén
-
Kan
50 mg/L
Enraizamiento
Invernáculo
Regeneración
Re1
Re2
Re3
Re4
RA
Desinfección
Germinación
Agroinfección
&
Co-cultivo
Transformación estable
Transformación
girasol
Transformación
tabaco Explanto inicial plantas maduras
en macetas
Explanto inicial semillas
en germinación
-
Transformación lechuga Explanto inicial cotiledones expandidos y verdes
-
Transformación
estable por floral dip
en Arabidopsis
Transformación estable
-
Agroinfiltración en Nicotiana benthamiana
Bombardeo en hojas de cebolla
Evaluación
sobre el
explanto
inicial a los ¾
días de la
agroinfección
«estable» de
girasol
Tumor de raíces producido por
Agrobacterium
rhizogenes en discos de remolacha
Cultivo de raíces de tabaco transformadas
por Agrobacterium rhizogenes
Fenotipo Ri en plantas de Brassica napus
No se necesita marcador de selección porque se ve
directamente la raíz
-
Protocolos de transformación mediante Agrobacterium rhizogenes
Genetic transformation of
Calibrachoa excellens via
Agrobacterium rhizogenes:
Changing morphological
traits
-
Transformación estable
El uso de Agrobacterias implica el agregado de antibióticos para eliminar la
bacteria del medio de cultivo de plantas
Los más utilizados son cefotaxina, carbenicilina, timentina, augmentina.
La evaluación de estos antibióticos se realiza casi al mismo tiempo que la
puesta a punto del protocolo de cultivo de tejidos
-
Sistemas de transferencia directa de ADN
• Ventajas
- Son considerados sistemas universales porque, al no depender de organismos
vectores, pueden aplicarse a cualquier especie vegetal
- No requieren eliminar las células del organismo vector de los tejidos o plantas
transgénicas
- Requieren construcciones más simples y pequeñas
- Son apropiados para estudios de expresión transitoria
• Desventajas
- Pueden resultar en un alto número de copias y/o copias truncas del transgén y del
vector en varios sitios del genoma de las células transformadas
- Se caracterizan por la alta frecuencia de aparición de re-arreglos en los transgenes
- Bombardeo de
micropartículas
1984. Sandford et al.,
describen la técnica de
bombardeo de
micropartículas para la
transferencia directa de
ADN (Universidad de
Cornell, EEUU).
Modelo comercial actual
Medidor de presión de helio
Tubo de aceleración de gas
Interruptores de control
Medidor de vacío
Portador del discode ruptura
Portador del macroproyectil
Ensamblaje del propulsorde microproyectiles
Cámara de bombardeo
Controles del flujode aire y de vacío
Células blanco
Soporte del blanco
Válvula de medición de helio
Modelo comercial actual
Medidor de presión de helio
Tubo de aceleración de gas
Interruptores de control
Medidor de vacío
Portador del discode ruptura
Portador del macroproyectil
Ensamblaje del propulsorde microproyectiles
Cámara de bombardeo
Controles del flujode aire y de vacío
Células blanco
Soporte del blanco
Válvula de medición de helio
Medidor de presión de helio
Tubo de aceleración de gas
Interruptores de control
Medidor de vacío
Portador del discode ruptura
Portador del macroproyectil
Ensamblaje del propulsorde microproyectiles
Cámara de bombardeo
Controles del flujode aire y de vacío
Células blanco
Soporte del blanco
Válvula de medición de helio
Acelerador de micropartículas PDS 1000/He
por descarga de helio a alta presión
Soporte del tejido blanco
- • Parámetros físicos y químicos que influyen en la transferencia del
ADN
- Método de aceleración de las micropartículas
- Naturaleza química y física, densidad y volumen de micropartículas
- Naturaleza, preparación, adherencia y concentración del ADN - Vacío y distancias de bombardeo - Diámetro de apertura de la placa de retención - Número de bombardeos
• Parámetros relacionados con la construcción genética utilizada
- Vector, promotores, intrones, genes reporteros y genes marcadores
de selección
• Parámetros relacionados con el tejido o células blanco
La transformación
por biobalística
depende de
factores físicos,
químicos
y biológicos
- - Transferencia de genes a células,
tejidos y órganos vegetales
- Transferencia de genes a
microorganismos y organelas
(cloroplastos)
- Estudio de expresión transitoria
- Análisis de promotores y de
delección de genes
- Estudio de mecanismos de
expresión. y regulación de genes
- Transferencia de ARN viral
-
Transformación
genética de plantas in
vivo usando una
pistola génica Helios
-
A B C
D E F
P
M
A y B: callos de maíz. C: brotes
primordiales de maíz. D y E: callos y
brotes de soja. F: ápice de una plántula
de algodón de 4 días (M: meristema
apical y P: primordio foliar).
Plantas transgénicas obtenidas por bombardeo de micropartículas
Tipos de explantos
DC
A B
Transformación de Festuca arundinacea
a partir de suspensiones celulares
A: suspensión de células de Festuca arundinacea sobre papel de filtro
antes del bombardeo. B: selección de células transformadas en medio
de selección conteniendo higromicina. C y D: plántulas transgénicas
de Festuca arundinacea regeneradas a partir de callos resistentes.
-
Transferencia de ADN mediada por electroporación y/o
métodos químicos
Electroporación de protoplastos
Pulsador de
electroporación
Cubetas de
electroporación
- A B
C D
E F
Cultivo y regeneración de
protoplastos de tabaco
-
Línea celular embriogénica
usada como fuente
de protoplastos
Protoplasto fluorescente
a las 24 h de la electroporación
Protoplastos luego de
la electroporación
Callos embriogénicos de 4
semanas derivados de protoplastos
Callos embriogénicos GFP positivos a los 6
meses de la transformaciónPlanta regenerada a partir de
callos en selección positiva
Línea celular embriogénica
usada como fuente
de protoplastos
Protoplasto fluorescente
a las 24 h de la electroporación
Protoplastos luego de
la electroporación
Callos embriogénicos de 4
semanas derivados de protoplastos
Callos embriogénicos GFP positivos a los 6
meses de la transformaciónPlanta regenerada a partir de
callos en selección positiva
Callos embriogénicos GFP positivos a los 6
meses de la transformaciónPlanta regenerada a partir de
callos en selección positiva
Aislamiento y electroporación de protoplastos de Citrus sinensis
(naranjo dulce) con el gen gfp
-
Expresión estable de genes transferidos a protoplastos de plantas por métodos
químicos y/o electroporación
npt II / kanamicinaPlantasMétodos químicosPetunia hybrida
npt II / kanamicinaCallosMétodos químicosBrassica campestris
npt II / kanamicinaCallosMétodos químicosTriticum monococcum
hpt / higromicinaPlantas fértilesElectroporaciónOryza sativa (Japonica)
dhfr / metotrexatoCallosElectroporaciónPanicum maximum
npt II / kanamicinaCallosElectroporación Brassica napus
hpt / higromicinaPlantas fértilesMétodos químicosArabidopsis thaliana
npt II / kanamicina
hpt / higromicina
als / clorosulfuron
Plantas fértilesElectroporaciónSolanum tuberosum
hpt / higromicinaPlantasMétodos químicos / ElectroporaciónDactylis glomerata
Zea mays
Festuca arundinacea
Oryza sativa (Indica)
Lolium multiflorum
Nicotiana tabacum
Especie
npt II / kanamicina
pat / fosfinotricina
Plantas fértilesMétodos químicos
hpt / higromicina
pat / fosfinotricina
hpt / higromicina
npt II / kanamicina
npt II / kanamicina
Gen marcador de
selección / agente de
selección
Plantas fértiles
Plantas fértiles
Callos
Plantas fértiles
Tipo de
transgénico
Métodos químicos
Métodos químicos
Métodos químicos
Métodos químicos
Técnica de transformación
npt II / kanamicinaPlantasMétodos químicosPetunia hybrida
npt II / kanamicinaCallosMétodos químicosBrassica campestris
npt II / kanamicinaCallosMétodos químicosTriticum monococcum
hpt / higromicinaPlantas fértilesElectroporaciónOryza sativa (Japonica)
dhfr / metotrexatoCallosElectroporaciónPanicum maximum
npt II / kanamicinaCallosElectroporación Brassica napus
hpt / higromicinaPlantas fértilesMétodos químicosArabidopsis thaliana
npt II / kanamicina
hpt / higromicina
als / clorosulfuron
Plantas fértilesElectroporaciónSolanum tuberosum
hpt / higromicinaPlantasMétodos químicos / ElectroporaciónDactylis glomerata
Zea mays
Festuca arundinacea
Oryza sativa (Indica)
Lolium multiflorum
Nicotiana tabacum
Especie
npt II / kanamicina
pat / fosfinotricina
Plantas fértilesMétodos químicos
hpt / higromicina
pat / fosfinotricina
hpt / higromicina
npt II / kanamicina
npt II / kanamicina
Gen marcador de
selección / agente de
selección
Plantas fértiles
Plantas fértiles
Callos
Plantas fértiles
Tipo de
transgénico
Métodos químicos
Métodos químicos
Métodos químicos
Métodos químicos
Técnica de transformación
- Para transformar una especie vegetal
Analizar las plantas obtenidas (presencia,
estabilidad y nivel de expresión del transgén)
Ensayos de transformación
Sistema de cultivo de tejidos
Eficiente y reproducible,
Descendencia fértil
Método de selección
(Sin escapes)
Vector de Transformación (gen de
interés, gen de selección, promotor,
otras secuencias regulatorias)
Entrega: Cepa de Agrobacterium
o Gen Gun (otros métodos
menos usados)
-
La capacidad de Agrobacterium
tumefaciens de introducir ADN
en el genoma de la planta permitió
desarrollar vectores plasmídicos
basados en el plásmido Ti
-
Mapa de restricción
de los plásmidos
pBIN19; pPZP111;
pMON10098;
pGreen0029.
Abreviaturas:
BI: borde izquierdo; ori:
origen de replicación;
BD: borde derecho
Vectores basados en el plásmidos T
-
Tomado de: Hellens and Mullineaux, Trends in Plant Science, 2000.
Si ColE1 pVS1 BI Cloranfenicol Si 9 8909 pPZP111
Si
No
Si
No
No
No
Si
LacZ
Kanamicina
Tetraciclina
Gentamicina
Ampicilina
Tetraciclina
Ampicilina ,
estreptomicina y
espectinomicina
Kanamicina
Selección
bacteriana
BI
BI
BI
BD
BD
BD
BD
Marcador
de
selección
en:
pSa
pRK2
pRi
pRK2
pRK2
pRi
pRK2
Agrobacterium
Origen de replicación
pUC
pRK2
ColE1
ColE1
ColE1
ColE1
pRK2
E. coli
Si 6 9200 pPCV001
Si 7 13200 pGA482
Si 2 17500 pC22
Si 9 11777 pBIN19
Si 4 25700 pJJ1881
Si 5 14440 pCGN1547
No 18 4632 pGreen0029
Mobilización
Sitios
únicos de
restricción
en ADN - T
Tamaño
(kb) Vector
Si ColE1 pVS1 BI Cloranfenicol Si 9 8909 pPZP111
Si
No
Si
No
No
No
Si
LacZ
Kanamicina
Tetraciclina
Gentamicina
Ampicilina
Tetraciclina
Ampicilina ,
estreptomicina y
espectinomicina
Kanamicina
Selección
bacteriana
BI
BI
BI
BD
BD
BD
BD
Marcador
de
selección
en:
pSa
pRK2
pRi
pRK2
pRK2
pRi
pRK2
Agrobacterium
Origen de replicación
pUC
pRK2
ColE1
ColE1
ColE1
ColE1
pRK2
E. coli
Si 6 9200 pPCV001
Si 7 13200 pGA482
Si 2 17500 pC22
Si 9 11777 pBIN19
Si 4 25700 pJJ1881
Si 5 14440 pCGN1547
No 18 4632 pGreen0029
Movilización
Sitios
únicos de
restricción
en ADN - T
Tamaño
(kb) Vector
diseño de vectores binarios
GATEWAY vectors for
Agrobacterium-mediated plant
transformation Mansour Karimi, Dirk Inzé and Ann
Depicker
TRENDS in Plant Science Vol.7 No.5 May
2002
-
Genes Reporteros
Permiten ver la expresión del transgen (reportero)
GUS Gen de la β glucuronidasa
GFP (green fluorescent protein) No es destructiva
Otras proteínas fluorescentes
-
Genes reporteros
-glucuronidasa
Proteína de fluorescencia
verde
Cloranfenicol
acetiltransferasa
Luciferasa
Luciferasa
Abreviatura
gus/uidA
GFP
Cat
Luc
luxA, luxB
Origen
E. coli
Aequorea victoria
E. Coli
Photinus pyralis
Vibrio harveyi
Detección
Fluorométrico (cuantitativo)
o histoquímico (in situ),
no radiactivo
Fluorescencia,
no destructiva
Ensayo radiactivo
sensitivo, semi cuantitativo
Luminiscencia
Luminiscencia
Genes reporteros
-glucuronidasa
Proteína de fluorescencia
verde
Cloranfenicol
acetiltransferasa
Luciferasa
Luciferasa
Abreviatura
gus/uidA
GFP
Cat
Luc
luxA, luxB
Origen
E. coli
Aequorea victoria
E. Coli
Photinus pyralis
Vibrio harveyi
Detección
Fluorométrico (cuantitativo)
o histoquímico (in situ),
no radiactivo
Fluorescencia,
no destructiva
Ensayo radiactivo
sensitivo, semi cuantitativo
Luminiscencia
Luminiscencia
Genes reporteros utilizados en transformación de plantas
-
Promotores constitutivos vs tejido específico
Ejemplo de utilización del gen reportero uid A
-
Promotores
• Promotores constitutivos
• todos los tejidos
• independiente de factores ambientales
• activos entre especies y reinos
• Promotores inducibles
– expresión dependiente de factores externos
– factores abióticos (luz, temperatura, heridas)
– factores bióticos (ataque patógenos)
• Promotores tejido o desarrollo específico
– expresión restringida en tiempo y/o espacio
– desde órganos completos durante todo el desarrollo hasta pocas células en
corto tiempo
– órgano especifico (semillas)
-
Esqueleto del vector
Bordes Izquierdo y Derecho
Gene de selección en bacterias (en E coli y en Agrobacterium)
Genes Reporteros o Genes de Interés
Promotores
Terminadores
Secuencias Enhancer
- Para transformar una especie vegetal
Analizar las plantas obtenidas (presencia,
estabilidad y nivel de expresión del transgén)
Ensayos de transformación
Sistema de cultivo de tejidos
Eficiente y reproducible,
Descendencia fértil
Método de selección
(Sin escapes)
Vector de Transformación (gen de
interés, gen de selección, promotor,
otras secuencias regulatorias)
Entrega: Cepa de Agrobacterium
o Gen Gun (otros métodos
menos usados)
- Genes Marcadores ó
de Selección Diferenciar células
transformadas de las
no transformadas
Selección negativa vs Selección Positiva
Kanamicina,
Higromicina,
Gentamicina,
Antibióticos
Glufosinato de
amonio
Glifosato
Herbicidas
Manosa y
otros
azúcares
Genes de selección
manosa-6P
fructosa-6P
manosa–6P
isomerasa
-
MetotrexatoPlásmido R67Dihidrofolato reductasadhfr
Bleomicina, fleomicinaTn5 y Streptoalloteichus
hindustanus
Resistencia a bleomicinaBle
Kanamicina, G418,
paromomicina, neomicina
Tn5Neomicina fosfotransferasanptII
EstreptomicinaTn5Estreptomicina
fosfotransferasa
SPT
Higromicina BE. coliHigromicina fosfotransferasaaphIV
CloranfenicolFago p1CmCloranfenicol acetil
transferasa
cat
GlifosatoPetunia hybrida5-enolpiruvilshikimato-3-
fosfato sintasa
EPSP
Fosfinotricina, bialofosStreptomices
hygroscopicus
Fosfinotricin acetil
transferasa
bar
GentamicinaSerratia marcescens;
Klebsiella pneumoniae
Gentamicin-3-N-
acetiltransferasa
aacC3, aacC4
SelecciónFuenteProducto genéticoGen de selección
MetotrexatoPlásmido R67Dihidrofolato reductasadhfr
Bleomicina, fleomicinaTn5 y Streptoalloteichus
hindustanus
Resistencia a bleomicinaBle
Kanamicina, G418,
paromomicina, neomicina
Tn5Neomicina fosfotransferasanptII
EstreptomicinaTn5Estreptomicina
fosfotransferasa
SPT
Higromicina BE. coliHigromicina fosfotransferasaaphIV
CloranfenicolFago p1CmCloranfenicol acetil
transferasa
cat
GlifosatoPetunia hybrida5-enolpiruvilshikimato-3-
fosfato sintasa
EPSP
Fosfinotricina, bialofosStreptomices
hygroscopicus
Fosfinotricin acetil
transferasa
bar
GentamicinaSerratia marcescens;
Klebsiella pneumoniae
Gentamicin-3-N-
acetiltransferasa
aacC3, aacC4
SelecciónFuenteProducto genéticoGen de selección
Ejemplos de genes de selección
-
Ya tenemos todos los elementos necesarios, por lo
que podemos armar un vector de transformación
- Para transformar una especie vegetal
Analizar las plantas obtenidas (presencia,
estabilidad y nivel de expresión del transgén)
Ensayos de transformación
Sistema de cultivo de tejidos
Eficiente y reproducible,
Descendencia fértil
Método de selección
(Sin escapes)
Vector de Transformación (gen de
interés, gen de selección, promotor,
otras secuencias regulatorias)
Entrega: Cepa de Agrobacterium
o Gen Gun (otros métodos
menos usados)
- Diseño experimental para los ensayos en semillas de lechuga
Después de los ensayos de transformación, sigue Análisis T1, T2……
-
14 líneas T1 PrHaAP10
Ensayos fluorométricos
Ensayos histoquímicos
-
Líneas T2
Tesis
Diego
Zavallo
-
¿Y este es el final del trabajo en un laboratorio
con plantas transgénicas??
Luego comienza el camino de los desafíos a
los estreses, analizar la equivalencia
sustantiva, observar si aparece el
silenciamiento génico, la estabilidad de los
transgenes, los niveles de expresión, etc.
Esto en invernáculos de bioseguridad
Y así comienza el camino de la desregulación
(Fase I).
- Por último comenzar el camino de la desregulación en Fase II,
que son las pruebas a campo.
Hasta el momento no existen desarrollos argentinos liberados en el mercado