Comment avoir accès aux phénotypes mutants sans faire de mutagénèse ?
utiliser l’interférence ARN
Histoire de l’interférence ARN
• 1990: PTGS (Post Transcriptional Gene Silencing) estdécouvert chez le Pétunia à partir d’observations sur la coloration des feuilles. Ce phénomène est appelé par Rich Jorgensen “co-suppression” Plant Cell 2: 279-289
• 1998: Andrew Fire démontre que l’ARN double brin estresponsable du PTGS chez le C. elegans Nature 391: 806-811
• Depuis 1998: l’ARN interférence devient un outil pour déterminer des phénotypes mutants chez différentsorganismes.
• Depuis 2000 :augmentation exponentielle du nombre de publications sur l’interférence ARN (1000 publications en 2004)
Définitions• Génétique inverse : aller du génotype au phénotype par ingéniérie génétique. Par exemple obtention de mutants KO par recombinaison homologue.
•PTGS = Post-transcriptional Gene Silencing : inhibition de l’expression d’un gène par introduction d’un ARN double brin.
• ARN interference: PTGS induit par l’introduction d’un ARN double brin (siRNA) dans un organisme ou des cellules en culture.
• RISC: RNA-induced silencing complexe, correspond à un ensemble de protéines et du siRNA.
DICER = endonucléase dimérique (famille des RNaseIII) qui coupe l’ARNiRISC = RNA Induced Silencing ComplexRdRP = ARN polymérase ARN dépendante (trouvée chez les végétaux)
L’interférence ARN
L’interférence ARN se déroule en deux étapes
étape 1
Initiation
étape 2
Destruction de la cible
Etape d’initiation
ATP
ATP
ADP + ppi
ADP + ppi
DICER coupe DICER coupe ll’’ARNARN en en fragment de 21 fragment de 21 ntnt = = siRNAsiRNA
RdRPRdRP : : uneune ARN polymARN polyméérase ARN rase ARN ddéépendantpendant peutpeut amplifier le amplifier le siRNAsiRNA
ARN double brin
Une kinase putative phosphoryle le siRNA
Le siRNA se fixe au complexe RISC; le siRNApasse en simple brin, le complexe siRNA/RISC est activé et fixe la cible ARNm. L’activitéendonucléase de RISC coupe la cible, l’activitéexonucléase coupe le reste de l’ARNm.
RISC = RNA induced silencingcomplex=hélicase;RecA;endonucléase;exonucléase
Coupure de la cible
siRNA = short interfering RNA• C’est la molécule essentielle pour l’interférence ARN
• 21-23 nucléotides ARN double brins
• Inhibition de l’expression de l’ARN m par induction de sa dégradation
Méthodes pour produire le siRNA
• Synthèse chimique
• Transcription In vitro• Digestion d’un grand ARN double brin par la RNaseIII (Dicer, Rnase III)
•Expression de l’ARN dans les cellules à partir d’un vecteur
Plasmide exprimant un ARNi
T7 promoter T7 promoter
Bam HI Sal Iluc insert
Not IBgl IIApa I
Kpn I
L4440luc
Amp resistance
Méthodes permettant de donner de l’ARNi àun organisme
Variables selon l’organisme:
•C.elegans – injection nourriture
• D. melanogaster – exposition des cellules dansle milieu de culture
• Cellule de mammifères - électroporation outransfection
Différentes méthodes pour faire des essais in vivo des siRNA
L’inhibition par les siRNA ça marche !
Northern Blot
Western Blot (anti-p53)
Suppression de l’expression de p53 par le vecteurpSUPER-p53
Stabilité de l’effet
Elimination de la protéine naturelle du prion par la méthode des siRNA
Western Blot
in situ
Chaque puits contient des siRNA (synthétique, plasmide …) qui visent à annuler différents gènes. Les siRNA servent à transfecter des cellules. Les cellules sont ensuite observées pour leur phénotype (rythme de division, létalité …)
Utilisation à haut débit des siRNA
Expérience actuelle d’utilisation des siRNA en masse pour étudier le développement précoce du C. elegans
Nonv = létaux+stérilesGrow = Croissance altéréeVpep = mouvements ou morphologie altérés
Analyse de l’inactivation par siRNA de 16757 ORFs de C.elegans