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Contaje de placa aeróbica, Tinción Gram y Aislamiento
Laboratorio de Microbiología de Alimentos
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Contaje de placa aeróbica
• Provee un estimado general de bacterias aeróbicas vivas
• Evalúa calidad• Predictor de “shelf-life”• Monitoreo ambiental• Excluye
– Anaerobos obligados– Microaerofílicos
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Contaje en placas
• Asume– Cada colonia proviene de una sola célula
bacterial– Algunas colonias puede ser originadas de una
“agrupamiento”de bacterias• Se reporta como
- Unidad formadora de colonias (CFU)/gramo ó ml.- NO como bacterias totales
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Resultados del Contaje de placa aeróbica
• Evalúa la sanitación de una producto
• Predice la durabilidad (Shelf-life)
• Indicador de seguridad (Safety)
• Monitorea el ambiente
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Limitaciones del contaje de placa aeróbica
• Sólo se consideran organismos aeróbicos• No se sabe el tipo de bacteria• El medio de cultivo permite el crecimiento de
ciertas bacterias• Limitaciones visuales/Errores humanos• Difícil de distinguir entre partículas de alimentos
y bacterias• No se debe utilizar en alimentos fermentados• Las colonias podrían ser muy pequenas para verse
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Tipos de muestra
• Líquidas– Líquidos no viscosos se miden con pipetas– Líquidos viscosos se pesan
• Sólidas– Pesar asépticamente
• Hisopo– Tomar muestra pasando un hisopo por un área definida
• Ambientales y de envases– Enjuage el interior del envase– Abra una placa para tomar una muestra del aire– Placas RODAC
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Protocolo para Contaje en Placas
• Prepare un homogenado de la muestra– Dilución 1:10– 1 parte de la muestra a 10 partes del volumen
total
• Mezcle en licuadora o “stomacher”por 2 minutos
10 g/ml muestra 90 ml of diluyente
1:10 Dilución – 10-1
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Protocolo para contaje en placas
• Prepare diluciones seriadas– Diluya hasta que obtenga colonias separadas entre 20-
200 en una placa
– Utilice una pipeta estéril entre cada dilución
– Ponga la pipeta usada en el área designada
• Mezcle cada botella de dilución 25 veces en un arco de 90 grados por 7 segundos
• Use amortiguador de fosfato o peptona para diluir
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Diluciones
Dilution Blanks Containing 90 ml Diluent
10 ml 10 ml 10 ml 10 ml
10-1 10-2 10-3 10-4 10-5
(1:10) (1:100) (1:1000)(1:10000)
(1:100000)
Sample Homogenate
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Placas
10-1 10-2 10-3 10-4 10-5
1 ml1 ml1 ml1 ml1 ml1 ml 1 ml1 ml1 ml1 ml
Put 1 ml of Each Dilution into Empty Petri-Dish
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Protocolo Contaje de placas
• Anada 18-20 ml de agar (45-50F), a la placa petri– El agar no puede estar muy caliente porque mata las
bacterias
• Método estándar ó agar de placa (Plate Count Agar)
• Mueve 10x en cada dirección• Deje que solidifique• Incube las placas invertidas a 35-37 por 48
horas.
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Esterilización
• El equipo y el medio de cultivo debe estar estéril• Esterilización en aire caliente
– 170 C por una hora• Ponga en horno por 2 horas luego que éste alcance la
temperatura• Envuelva en papel o papel de aluminio
• Esterilización por vapor– 121C por 15 min. Debe alcanzar el autoclave 15 psi
de presión• Equipo y medio líquido• No ponga las tapas apretadas
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Tinción Gram
• Gram positivo ó negativo
• Basado en la estructura de la pared
• Gram positivo– Pared gruesa por la capa de peptidoglicano
• Gram negativo– Capa fina con presencia del lipopolisacárido
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Obtención de colonias aisladas
• La meta es obtener colonias aisladas del alimentos y/o cultivo
• Las colonias pueden ser identificadas y evaluadas
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•Collect loopful of culture•Streak in each area starting with area 1•Flame Loop in between areas
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Contaje de placas
• Sólo cuente las placas que tengan entre 20 y 200 colonias
• Más de 200– TNTC
• Menos de 20– TFTC
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Contaje de placas
-175---Average
10150TNTCTNTCTNTC2
192200TNTCTNTCTNTC11
1:1000001:100001:10001:1001:10Plate
1 Too Numerous to Count2 Too Few to Count
•Average two countable plates and Multiply by Dilution Factor•Count is 175 x 104
•Must Convert to TWO Significant Digits•1.8 x 106 cfu/ml or g
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Contaje-Ejemplos
TFTC125250-Average
20100200TNTC2
10150300TNTC1
10-410-310-210-1Plate
Use ALL FOUR even though 300 is outside range. If ONE PLATE is in RANGE, use BOTH for Average.
250 x 102 – 2.5 x 104
125 x 103 – 1.3 x 105
AVERAGE – 7.8 x 104 cfu/g or ml
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Contaje - Ejemplos
350---Average
400TNTC TNTCTNTC2
300TNTCTNTCTNTC1
10-410-310-210-1Plate
All Dilutions are outside Range so we MUST use counts Outside range
350 x 104 – 3.5 x 106 cfu/ml or g*Use an “*” when using dilutions outside countable rangesThis means it is an ESTIMATED count
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Contaje- Ejemplos
125250-Average
5400TNTC2
10300TNTC1
10-310-210-1Plate
If Both Dilutions are outside Range, use the Higher Dilution(LOWER COUNTS)
7.5 x 103 cfu/ml or g*
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Placas con muchas colonias
• Cuente la dilución mayor y utilice las rejillas en el contador de colonias– 1 rejilla = 1 cm2
– Una placa plástica estándar tiene 56 cm2 de área de superficie• Si <10 colonias/cm2 cuente 12 cuadrados (6 consecutivos
verticales y 6 consecutivo horizontales)– Totalice y divida por 12 (promedio). Multiplique por 56
para obtener – el número total de colonias en la placa. Reporte como
estimado• Si >10 colonias/ cm2
– Cuente 4 cuadrados, promedie y multiplique por 56
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Variaciones al contaje aérobico
• Psicotróficos– Incube a 5-7 C por 10 días
– Use esparcido
• Termodúricos– Ponga 5 ml de la muestra o la dilución 1:10 de la
muestra sólida en bano de agua entre 60-80n C por 30 minutos
– Enfríe en hielo por 10 minutos
– Ponga en placa e incube
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Primer Período
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Esquema
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Segundo Período
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Petrifilms
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Ventajas y desventajas de utilizar los petrifilms
• VentajasRápidoMenos espacioFácilesNo hay que preparar medioDistinción entre CFU vs. Partículas de alimentos
• DesventajasMorfología de la coloniaCostosoDifícil de leer