Download - Course VHIR-UCTS-UEB - Session 2 - RTqPCR
TECNOLOGÍAS DE ALTO RENDIMIENTO EN GENÓMICA
DIA 1. 5 de Octubre
Microarrays (Ricardo Gonzalo y Alex Sánchez) RTqPCR (Paqui Gallego y Alex Sánchez)
Programa del Seminario RTqPCR-2011
Definición de la técnica
Terminología asociada a qPCR
Diseñando un experimento de qPCR
Etapas en la realización de un experimento de qPCR
Evaluación de un ensayo de qPCR
Bibliografía muy recomendada
Definición de la Técnica
Termociclador
con sistema de detección
R Q
Sonda Agentes intercalantes
A G CNucleótidos
Taqpolimerasa
Tampón dereacción
Cebadores Ácido nucléico
PCR en tiempo real o qPCR o RT-qPCR
http://www.appliedbiosystems.com/support/apptech/#rt_pcr
UNG(opcional) ROX
TTU
ROX como referente pasivo
+ ROX - ROX
Δ R
n
Ciclos Ciclos
Desv St= ± 0.059
Desv St= ± 0.306
Fluoróforo referente pasivo más comúnmente utilizado para normalizar la fluorescencia específica en instrumentos de ABI y Stratagene.
ROX=6-carboxy-X-rhodamine
Programa del Seminario RTqPCR-2011
Definición de la técnica
Terminología asociada a qPCR
Diseñando un experimento de qPCR
Etapas en la realización de un experimento de qPCR
Evaluación de un ensayo de qPCR
Bibliografía muy recomendada
Escala semi-logarítmica
Cycle Number
Terminología asociada a qPCR
PlatóLineal
BaselineCt value= 15.5
ThresholdExpo
nenc
ial
Log
Fluo
resc
ence
Rn
RT-qPCR
Cualitativa y cuantitativa.
Elevado rango dinámico de detección Capaz de detectar cambios 2-fold. No requiere procesado post-PCR
PCR Convencional
Semi-cuantitativa:
Rango dinámico pequeño ›2 logs Baja Precisión; baja resolución y poco
Sensible. Manipulación post-PCR . Baja Resolución No-automatización Discriminación basada sólo en tamaño Los resultados no están expresados en
números. El BrET no es muy cuantitativo
RT-qPCR vs PCR Convencional
A tiempo real(fase exponencial)
Cuantificación Absoluta
Cuantificación Relativa
A tiempo final(fase plató)
Plus/MinusDiscriminación Alélica
Programa del Seminario RTqPCR-2011
Definición de la técnica
Terminología asociada a qPCR
Diseñando un experimento de qPCR
Etapas en la realización de un experimento de qPCR
Evaluación de un ensayo de qPCR
Bibliografía muy recomendada
Diseñando un experimento de qPCR
Aplicación
Método de Normalización
Química de detección: Sondas específicas marcadas con fluorocromos Agentes Intercalantes Fluorocromos unidos a primers
Reactivos: Core kit vs Master Mix dNTPs/dUTPs y UNG enzyme ROX como referente pasivo
Termociclador: Formato Número de canales de detección Software de análisis Duración del programa Precio y flexibilidad de la oferta
mRNAmiRNAncRNAsiRNAsaRNACNA
SNPCNVMutacionesAnálisis Metilación
Análisis en Células StemAnálisis en célula Única
MicoplasmaPatógenos en la comida
Aplicaciones RTqPCR
ProteínaTejido
Célula Eucariota
RNA
DNA
VirusBacteria
Target
5´oligo3´oligo
Validación Microarrays
Normalización respecto a la masa total de RNA exraído(chequeo calidad –RIN, moleculas/ng RNA)
Normalización respecto al volumen/masa de la muestra( moléculas/mg tejido; moléculas/ml sangre)
Normalización respecto al número de células( moléculas/célula)
Normalización respecto a un gen endógeno no regulable(GAPDH, tubulina, actina, albúmina, ciclofilina, micro-globulina, histonas, rRNA, ……)
Normalización respecto a más de un gen endógeno (›3) geNorm (Vandesompele et al. 2002. Genome Biology) BestKeeper (Pfaffl et. Al. 2004; Biotechnology Letters 2004) Normfinder Statistical modeling for selecting houskeeper genes (Szabo et al.2004, Genome Biology)
Estrategias de Normalización qPCR
BMC Bioinformatics 2009, 10:110Genes and Immunity (2005) 6, 279-284. Review
Placas-384
Plataforma de RTqPCR en la UCTS
Microfluidicas(Arrays de baja densidad)Placas-96
FAM, TAMRA, VIC, JOE, NED, SYBR, ROX
Formato 384-p: FAM, TAMRA, VIC, JOE, NED, SYBR, ROX, TET.Formato LDA: FAM, VIC, ROX.
7000 SDS 7900HT Fast SDS
Química
Softwares V1.2.3f2 con RQ studyPrimer Express 2.0
SDS 2.4.1RQ Manager 1.2
Tiras de 8 Tubos
LightCycler 480
White Plates-384
mode 9600 Emulation /Standard 9600 Emulation/StandardFast
Formato
Filtros/canales detección:500, 533, 568, 610, 640, 670 nm
Ref. Pasivo ROX ROX Ninguno
Fast
SW 1.5
9600 Emulation/Standard Fast
UNG:
Química: SYBRGreen SondasTaqMann SondasTaqMann
La UCTS dispone de los siguientes reactivos:
Mode:
Sí Sí
Programa del Seminario RTqPCR-2011
Definición de la técnica
Terminología asociada a qPCR
Diseñando un experimento de qPCR
Etapas en la realización de un experimento de qPCR
Evaluación de un ensayo de qPCR
Bibliografía muy recomendada
Etapas Implicadas en la Realización de un ensayo de qPCR
PreparaciónMuestra
Transcripción Reversa (RT)
PCR a tiempo Real (qPCR )
Extracción Ác. Nucléicos
RNA cDNA
Producto AmplificadoMuestra
DNA
Preparación Material de partida
PreparaciónMuestra
Extracción Ácidos Nucléicos
Transcripción Reversa (RT)
PCR a tiempo Real (qPCR )
Tipo de muestra Método Extracción
NATURE PROTOCOLS. Vol1, Num3, 2006
RNA cDNA
Producto AmplificadoMuestra
DNA
Preparación Material de partida
PreparaciónMuestra
Extracción Ácidos Nucléicos
Transcripción Reversa (RT)
PCR a tiempo Real (qPCR )
RNA total/mRNA/DNA Calidad & Cantidad Almacenamiento (-80ºC)
NATURE PROTOCOLS. Vol1, Num3, 2006
RNA cDNA
Producto AmplificadoMuestra
DNA
Pureza (ausencia de contaminación por DNA y Proteínas y ausencia de inhibidores)
Integridad Cantidad• Existen dif. métodos de cuantificación.• Generan difs. resultados.•Hay que cuantificar muestras comparables entre sí con el mismo método de cuantificación.
• ODA260/A280=1.8-2.0• OD A260/A230=2• SPUD assay (Nolan, 2006)
• rRNA ( 28S:18S=2:1)• Número RIN (› 5)• Ensayo 3´:5´(alrededor de 1 indica elevada integridad; ›5 degradado)
RNA Q &Q
Gel Desnt.Agarosa
Expert Rev. Mol. Diagn. 5, 493-498 (2005)
Evaluación del RNA
10.0 9.2 8.1 7.2 6.0 5.0 4.4 4.0
BUENO MALOPERFECTO
Molecular Aspects of Medicine 27 (2006) 126–139
2:1
Agilent Bioanalyzer
Reacción de Transcripción Reversa (RT)
One-Step vs Two Step CDNA Priming Pérfil Térmico Consideraciones Experimentales
PreparaciónMuestra
Extracción Ácidos Nucléicos
Transcripción Reversa (RT)
PCR a tiempo Real (qPCR )
RNA cDNAProducto AmplifcadoMuestra
NATURE PROTOCOLS. Vol1, Num3, 2006
One-Step RT-PCR Requiere una única mezcla de reacción ya que RT y PCR ocurren en el mismo tubo.
AmpErase UNG no se puede usar. Única enzima (ej. PolimerasaTth) RNA-y-DNA dependiente. Minimiza tiempo de preparación y el riesgo de contaminación. No es posible la optimización por separado de ambas reacciones. Requiere primer RT específico de secuencia. Menos sensible debido a la menor eficiencia de la actividad RT de la polimerasa. Acumulación de dímeros de primers.
Requiere dos mezclas de reacción (reacción RT y reacción PCR).
Más flexible (El cDNA se puede guardar y ser usado más tarde).
Permite la optimización por separado de ambas reacciones.
Permite el uso de primer RT específico de secuencia, random primers o oligo(dT).
Two-Step RT-PCR
One Step RT-PCR vs Two Step RT-PCR
RNA cDNA Producto Amplif.RT qPCR
RNA cDNART
cDNA Producto Amplif.qPCR
NATURE PROTOCOLS. Vol1, Num3, 2006
Transcripción Reversa: cDNA Priming
Consideraciones Experimentales de la RT
En general, usar el RNA total como molde para la RT.
Dado que la eficiencia de RT depende del gen diana y de la enzima de RT, es muy importante usar siempre el mismo enzima RT, los mismos primers para la síntesis de cDNA y las mismas condiciones experimentales si se quieren comparar resultados entre sí.
Hacer réplicas
Incluir siempre control no-RT
Añadir la misma cantidad de RNA total en cada reacción.
Siempre que sea posible, montar las reacciones de RT de todas las muestras al mismo tiempo para evitar la variación entre tandas.
Cuando se procesan múltiples muestras en diferentes tandas, incluir una muestra control positiva de referencia en todas las tandas.
NATURE PROTOCOLS. Vol1, Num3, 2006
qPCR
Elección en el software del ensayo a realizar Perfil Térmico Consideraciones Experimentales
PreparaciónMuestra
Extracción Ácidos Nucléicos
Transcripción Reversa (RT)
PCR a tiempo Real (qPCR )
RNA cDNAProducto AmplifcadoMuestra
NATURE PROTOCOLS. Vol1, Num3, 2006
Elección en el software del ensayo a realizar
7000 SDS de ABI 7900 SDS de ABI
Absolute Quantification (Standard Curve)
7000 SDS de ABI 7900 SDS de ABI
Con Curva Stándard
Standard Curve (AQ)
Elección en el software del ensayo a realizar
7000 SDS de ABI 7900 SDS de ABI
Relative Quantification (ddCt) Plate
ddCt
7000 SDS 7900 SDS∆∆Ct (RQ)
Relative Quantification (ddCt) Study
LightCycler 480 II
Perfil térmico que incluye paso de Activación UNG
Perfil térmico clásico qPCR
1.- Activación UNG2.- Activación Taq y desnaturalización UNG3.- Desnaturalización del dsDNA4.- Anillamiento y extensión primers
Consideraciones qPCR
Cuando se procesan múltiples muestras en diferentes placas, la inclusión de una muestra calibradora o curva estándar en cada placa es un control importante para medir la variabilidad inter-ensayo.
Duplicados técnicos son generalmente suficientes (Triplicados si Cts›35). Si las réplicas difieren ›0.5 Ct, las reacciones deberían repetirse. Son más importantes los duplicados biológicos.
Incluir Controles negativo (NTC) y positivos. Cargar el NTC en el pocillo que esté más distanciado de aquel que contenga mayor concentración de cDNA para evitar contaminación cruzada.
Preparar mezcla de reacción de pcr en laboratorio diferente de donde se manipule el cDNA.
Es siempre mejor no esperar demasiado en correr un run de qPCR después de la preparación de la placa. Si necesitas comparar dos placas idénticas con diferente ciclo de temperaturas, es mejor prepararlas al mismo tiempo, y guardar una de ellas a 4ºC protegido de la luz hasta 10 horas.
Especial atención en el sellado de la placa para evitar evaporaciones y evitar marcas y huellas en la parte superior del cobertor/tapa.
NATURE PROTOCOLS. Vol1, Num3, 2006Real-Time PCR Aplications Guide from Bio-Rad
Programa del Seminario RTqPCR-2011
Definición de la técnica
Terminología asociada a qPCR
Diseñando un experimento de qPCR
Etapas en la realización de un experimento de qPCR
Evaluación de un ensayo de qPCR
Bibliografía muy recomendada
PreparaciónMuestra
Transcripción Reversa (RT)
PCR a tiempo Real (qPCR )
Extracción Ác. Nucléicos
RNA cDNA
Producto Amplificado
Muestra
DNA
Análisis de datos
Calidad del Ensayo
Estadística
Métodos de Cuantificación
Etapas Implicadas en la Realización de un ensayo de qPCR
Calidad del Ensayo
Reproducibilidad (viene indicada por las réplicas)
Controles qPCR
NEGATIVOS NTC (Non Template Control) Detección de dímeros de primers y contaminación NAC (Non Amplif. Control) Detección de degradación de sondas No RT (No RT control) Detección de contaminación por DNA genómico
POSITIVOS Control Endógeno Testado de la calidad de los reactivos. Usado también para normalizar. Control Exógeno Testado de la calidad de los reactivos Spiking Control Detecta presencia de inhibidores
Curva de Disociación (SYBR Green)
Curva Estándar Linealidad de los datos Distancia entre las curvas de amplificación Eficiencia de amplificación
PendienteEficiencia
Amplificación
(E= 10-1/slope)
Convertir E enPorcentaje
%E= (E-1)100%-3,0 2,2 115
-3,1 2,1 110
-3,2 2,1 105
-3,3 2,0 101
-3,32 2,0 100
-3,4 2,0 97
-3,6 1,9 90
-3,7 1,9 86
-4 1,8 78
Curva Estándard:
Slope= -3.73
2n=Factor de dilución
FactorDilución
n=LG(Factor Dil.)/LG(2)
2 1,00
5 2,32
10 3,32
OK
R2 ›0.98 o r › 0.99
Calidad del Ensayo
Cuantificación Absoluta Cuantificación Relativa
Cantidad de ácido nucléico (número de copias, µg) por cantidad de muestra dada (por célula, por µg de RNA total)
Cantidad relativa de ácido nucléico de una muestra A respecto a una muestra B
Ejemplo: medida carga viral Ejemplo: Niveles de expresión génicaen Tumor vs Tejido normal.
104105 102103 10106
Ct
Log (Num de copias)
A.- Cuantificación Relativa con Curva Stándard:
Qty gen problemaQty gen EC
Muestra Problema =
Qty gen problemaQty gen EC
Calibradora =
B.- Método Pfaffl:
RQ = (Egen diana) dCT, gen diana (calibradora – muestra problema)
(Egen EC) dCT, gen EC (calibradora – muestra problema)
C.- Método (Livak) Doble Delta CT:dCT = CT(gen diana) – CT(gen EC)ddCT = dCT(muestra problema) – dCT (calibradora)
RQ= 2–ddCT
Métodos de Cuantificación
SlopeR2
ΔCt
= (C
t ge
n Ta
rget
– C
t ge
n En
dóge
no)
Log Diluciones
Y = 0.0471x + 3.0178R2 = 0.2315
Eficiencias del Gen Target vs Eficiencia gen EC
Routine lab method’s accuracy called into questionNATURE MEDICINE VOL 16,page 349 APRIL 2010Catherine Shaffer
1) Potential viral pathogenic mechanism for new variant inflammatory bowel diseaseV Uhlmann et al. Mol Pathol 2002;55:84–90
Estudio que causó una polémica en 1998 al sugerir un vínculo entre la vacuna triple vírica y el autismo.
RT-qPCR and molecular diagnostics: no evidence for measles virus in the GI tract of autistic children.S.A. Bustin. Eur Pharm Rev Dig 1 (2008) 11-16.
2) The mRNA of the Arabidopsis Gene FT Moves from Leaf to Shoot Apex and Induces flowering.Huang et al. Science 309 September 2005: 1694-1696“Breakthrough of the Year 2005”, the runners-up. Science 310:1880-1885
Retraction of Hung et al., Science 309 (5741) 1694-1696.H. Bohlenius et al. Sience 316 April 2007:367.
Ejemplos:
RTqPCR en tela de juicio
Diseño y Optimización de un experimento de RTqPCR
MIQE Guidelines
Programa del Seminario RTqPCR-2011
Definición de la técnica
Terminología asociada a qPCR
Diseñando un experimento de qPCR
Etapas en la realización de un experimento de qPCR
Evaluación de un ensayo de qPCR
Bibliografía muy recomendada
Direcciones de interés relacionadas con qPCR
http://qpcr.gene-quantification.info/
http://www.horizonpress.com/pcr/qPCR-machines.html
qPCR-Technical-Guide.pdf (Sigma Life Science)
http://www.eurogentec.com
http://www.dorak.info/genetics/glosrt.html
http://genex.gene-quantification.info/
Seminario RTqPCR18 de Octubre en VHIR
Prof. Michael KubistaEstá entre los pioneros que desarrollaron la RTqPCR
Gracias