CULTURA DE TECIDOS: HISTÓRICO, CONCEITOS, APLICAÇÕES, ORGANIZAÇÃO DO LABORATÓRIO E MEIOS DE CULTURA
Prof. Dr. Luiz Antonio Biasi
AF060 – BIOTECNOLOGIA VEGETAL
CULTURA DE TECIDOS DE PLANTAS
1.HISTÓRICO
2.CONCEITOS
3.APLICAÇÕES
4.ORGANIZAÇÃO DO LABORATÓRIO
5.MEIOS DE CULTURA
1.HISTÓRICO
-Haberlandt (1902) - 1º cultivo de células em soluçãonutritiva.
Haberlandt, G. Kulturversuche mit isolierten Pflanzenzellen.Sitzungsber. Akad. Wiss. Wien., Math. – Naturwiss. K., Abt. (1):111, 69-92. 1902.
“Experiments on the culture of isolated plant cells”. The BotanicalReview, Berlin, 35(1):68-88, 1969. (Tradução para inglês).
-Hannig (1904) - 1º cultivo de embriões imaturos-Knudson (1922) - 1º cultivo de embriões de orquídeas-White (1934) - Cultivo de ápices radiculares de tomate em meio líquido-Kogh et al. (1934) - Descoberta do AIA
Gottlieb Haberlandt
-Miller et al. (1955) - Descoberta da cinetina
-Skoog e Miller (1957) - Experimento clássico com calo de fumo – Balanço auxina/citocinina
-Skoog e Tsui (1948) - Formação de partes aéreas e raízes em calos de fumo
Folke Skoog
-Morel e Martin (1952) - Obtenção de dália livre de vírus.
Carlos Miller
Skoog, F. and Miller, C.O. Chemical regulation of growth and organ formation in plant tissue cultured in vitro. Symposia of the Society for Experimental
Biology, 11, 118-131. 1957.
Morel, G. and Martin, C. Guerison de dahlias atteints d’ une maladie a virus. Comptes Rendus de l’ Académie des Sciences, 235:1324-1325, 1952.
-Steward et al. (1958) e Reinert (1959) - Obtenção de embriões somáticos em calos de cenoura-Morel (1960) - Obtenção de orquídeas livre de vírus-Cocking (1960) - Obtenção de protoplastos
-Murashige e Skoog (1962) - Meio de cultura MS-Takebe et al. (1971) - Obtenção de plantas a partir de protoplastos-Murashige et al. (1972) - Microenxertia em Citrus
Toshio Murashige
-Carlson et al. (1973) - Primeira hibridação somática em fumo.-Larkin e Scowcroft (1981) – Variação somaclonal
Biologia molecularTransformação genética de plantas
DESENVOLVIMENTO
Alterações que ocorrem no organismo ao longo do seu ciclo de vida nos níveis morfológico, fisiológico e bioquímico.
Ex: evolução da fase embrionária para planta.Ex: mudança da fase vegetativa para reprodutiva.
CRESCIMENTO
Mudanças quantitativas irreversíveis.Ex: aumento de biomassa.Ex: aumento de comprimento.
DIFERENCIAÇÃO
Mudanças qualitativas. Processo pelo qual as células adquirempropriedades metabólicas, estruturais e funcionais distintas daquelas iniciais.
DIFERENCIAÇÃO OCORRE PELA REGULAÇÃO NA ESPRESSÃO GÊNICA
2.CONCEITOS
MORFOGÊNESE
Origem da forma da planta e sua organização que pode ser estudada nos níveis:
*Estrutural (organização funcional da célula)*Tecidos*Órgãos*Planta inteira
ENVOLVE CRESCIMENTO E DIFERENCIAÇÃO
A morfogênese é o resultado de um complexo controle hormonal múltiplo, espacial e temporal, por meio da regulação e expressão gênica.
Mudanças quantitativas
Mudanças qualitativas
INTEGRAÇÃO ENTRE OS PROCESSOS DE DIVISÃOE ESPECIALIZAÇÃO CELULAR
TOTIPOTÊNCIA
HABERLANDT (1902)
●“As plantas são agregados de seresindividuais e independentes, denominadosde células”●“Células dão origem aos tecidos”
●“As células são as unidades funcionais detodos os seres viventes”
●“Toda a célula nasce de outra célula”
Rudolf Virchow (1858)
Schleiden (1838) & Schwann (1839)
“Toda célula vegetal íntegra possuicapacidade para reproduzir um organismointeiro”.
“TEORIA CELULAR”
(Ideias ainda incompletas)
DETERMINAÇÃO
Processo pelo qual o potencial de desenvolvimento de uma célulatorna-se limitado a uma rota específica de morfogênese.
COMPETÊNCIA
Capacidade das células reagiram a sinais específicos dedesenvolvimento.
EPIGÊNESE
Ativação seletiva e diferencial de genes, envolvendo célulasreceptivas ou tecidos responsivos.
MORFOGÊNESE IN VITRO:
*Organogênese DiretaIndireta
*Embriogênese somática DiretaIndireta
Explante
Novos órgãos(organogênese)
Novos embriões(embriões)
Calo
Indireta
Direta
ORGANOGÊNESE INDIRETA A PARTIR DE SEGMENTOS FOLIARES DE ABACATEIRO
ORGANOGÊNESE INDIRETA A PARTIR DE SEGMENTOS CAULINARES DE MARACUJAZEIRO
ORGANOGÊNESE DIRETA A PARTIR DE SEGMENTOS RADICULARES DE CAQUIZEIRO
Segmento radicular
Segmentos foliares
ORGANOGÊNESE DIRETA A PARTIR DE SEGMENTOS FOLIARES DE CAQUIZEIRO
EMBRIOGÊNESE SOMÁTICA EM TANGERINEIRA ‘PONKAN’
•Produção de mudas em larga escalaMicropropagação (organogênese e embriogênese)
•Produção de material de propagação sadio (livre de virus)Cultura de meristemas + TermoterapiaMicroenxertiaCrioterapia (técnica nova)
•Resgate de embriões de cruzamentos difíceisCultivo de embriões zigóticos
•Conservação de germoplasmaConservação in vitro
Criopreservação
•Obtenção de duplo haploides Cultura de anteras + duplicação cromossômica
•Obtenção de híbridos somáticosFusão de protoplastos
3.APLICAÇÕES
•Produção de material de propagação sadio (livre de virus)
Cultura de meristemaMicroenxertia
•Produção de mudas em larga escala
CARTES R, P. et al. Encapsulated Somatic Embryos and Zygotic Embryos for Obtaining Artificial Seeds of Rauli-Beech (Nothofagus alpina (Poepp. & Endl.) Oerst.). Chilean J. Agric. Res., v.69, n.1, p. 112-118, 2009.
Embriogênese e produção de sementes sintéticas
•Resgate de embriões de cruzamentos difíceis
Resgate de embriões de videira
Ohnishi et al. (Plant and Cell Physiology 52(7):1249-57. 2011).
Resgate de embriões de arroz
Buttibwa et al. African Journal of Biotechnology. 14(27):2191-2201. 2015
Resgate de embriões de mandioca
•Conservação de germoplasma
Embrapa Clima Temperado
Rayssa Natasha Barros Mafra & Victor Spieshttp://www.ebah.com.br/content/ABAAAfW-EAF/criopreservacao
Conservação in vitro
Fayos et al. Frontiers in Plant Science. 6:384. 2015.
Produção de duplo-haplóide de alho
•Obtenção de duplo haploides
Fig. 1 Plant regeneration from protoplast fusion experiment of a grass cultivar with a wild species. http://en.phytowelt.com/phytodiversity.html
• Obtenção de híbridos somáticos
Cultura e fusão de protoplastos
Fig. 2 Tubers of different somatic hybrids in comparison to the fusion partners (cultivar: upper lines, wild species: lower lines, hybrids: in-between).
ESTRUTURA BÁSICA DE UM LABORATÓRIO DE CULTURA DE TECIDOS
1.Sala de preparo de meio de cultura2.Sala para manipulações assépticas3.Sala de crescimento climatizada4.Sala de lavagem de vidraria5.Escritório6.Banheiro
AMBIENTES ADICIONAIS
1.Antecâmara2.Almoxarifado3.Sala de microscopia4.Sala de biologia molecular
ESTRUTURAS EXTERNAS
1.Ambiente para transferência ex vitro2.Casa-de-vegetação3.Telados4.Depósitos
4.ORGANIZAÇÃO DO LABORATÓRIO
EQUIPAMENTOS BÁSICOS
1.Sala de preparo de meio de cultura*Balança*pHmetro*Agitador magnético*Microondas*Destilador ou Deionizador*Refrigerador*Freezer
2.Sala para manipulações assépticas*Câmara de Fluxo Laminar*Microscópio Estereoscópico
3.Sala de crescimento climatizada*Ar condicionado*Timer para controle de fotoperíodo
4.Sala de lavagem de vidraria*Autoclave
1. SALA DE PREPARO DE MEIO DE CULTURA
2. SALA DE MANIPULAÇÃO ASSÉPTICA
3. SALA DE CRESCIMENTO CLIMATIZADA
*CONTROLE DE LUZ:- Fotoperíodo: 16 horas- Intensidade luminosa: 20 a 50 µmol.m-2.s-1
- Tipos de lâmpadas: -Fluorescentes-LED
*CONTROLE DE TEMPERATURA:- Geralmente 25° C- Ar condicionado
*EQUIPAMENTOS:-BOD-Agitadores
NOVAS ALTERNATIVAS: Uso da luz naturalSistemas autotróficos
-Aumento do CO2-Aumento da Intensidade luminosa-Redução da sacarose
4. SALA DE LAVAGEM DE VIDRARIA
AMBIENTE PARA TRANSFERÊNCIA EX VITRO
CASA-DE-VEGETAÇÃO PARA ACLIMATIZAÇÃO
COMPOSIÇÃO DO MEIO DE CULTURA:
1. SAIS MINERAIS:-Macronutrientes:
-Nitrogênio:-Amônio-Nitrato*Concentração de amônio deve ser no máximo até 1/3 do N total.
-Fósforo: H2PO4-
-Potássio: íon livre-Cálcio: deficiência causa necrose apical-Magnésio:-Enxofre:
-Micronutrientes:-Ferro: absorvido na forma de quelato com EDTA-Manganês:-Zinco:-Boro:-Cobre:-Molibdênio-Cobalto e Iodo: ????
5.MEIOS DE CULTURA
2. SUBSTÂNCIAS ORGÂNICAS:-Vitaminas: tiamina (B1), ácido nicotínico (niacina), piridoxina (B6)-Aminoácidos: glicina-Mio-inositol-Adenina
3. CARBOIDRATOS:-Sacarose (mais utilizado)-Outros carboidratros: sorbitol; dextrose (glicose); maltose; galactose.
4. AGENTES SOLIDIFICANTES-Agar: polissacarídeo de algas marinhas (6 a 7%)-Gomas: polímeros produzidos por bactérias (2 a 3%)
*Gelrite® - Kelco Division of Merck & Co*Phyta-gel® - Sigma Chemical Co
5. ÁGUA-Destilada; deionizada-Sistema ‘Milli-Q’: filtros de carvão ativado, colunas de troca iônica e filtros de
acetato de celulose.
6. REGULADORES VEGETAIS
-Auxinas
*Ácido indolacético (AIA)*Ácido indolbutírico (AIB)*Ácido naftalenoacético (ANA)*2,4-D*Picloran
-Citocininas
*Cinetina*Benziladenina (BAP)*Zeatina*2iP
-Giberelinas
*Ácido giberélico (GA3)
AUXINAS: Divisão celularAlongamento celularDiferenciação celular
REGULADORES VEGETAIS
Auxinas naturais Auxinas artificiais
CITOCININAS: Divisão celularDiferenciação celular
Citocininas naturais
Citocininas artificiais
GIBERELINAS: Alongamento celular Divisão celular
OUTROS REGULADORES:
Brassinosteróides:-Mais de 60 conhecidos-Alongamento de caules; crescimento do tubo polínico; desenrolamento defolhas de gramíneas
Poliaminas:-Encontradas em plantas e animais-Tipos: putrescinas;espermidinas; esperminas-Divisão e alongamento celular; enraizamento; formação de tubérculos
Ácido jasmônico:-Formação de tubérculos; amadurecimento de frutos; formação depigmentos; sinalizador de estresse
Ácido salicílico:-Estimula a floração; floração em plantas termogênicas; mecanismo dedefesa.
959,25
4,63
306
0,010,103
Água Sacarose
Ágar Sais
Substâncias orgânicas Reguladores de crescimento
Composição de 1 litro do meio de cultura MS em gramas.
Proporção entre os componentes do meio de cultura em g / litro.
Componentes MS NN WPM QL
Macronutrientes mg L-1 μM mg L-1 μM mg L-1 μM mg L-1 μM
NH4NO3 1650 20612,12 720 8994,39 400 5000,00 400 5000,00
KNO3 1900 18791,41 950 9396,64 - - 1800 17802,36
K2SO4 - - - - 990 5680,40 - -
KH2PO4 170 1249,17 68 499,67 170 1249,70 270 1983,96
Ca(NO3)2.4H2O - - - - 556 2354,40 1200 5080,80
CaCl2.2H2O 440 2992,59 - - 96 652,93 - -
CaCl2 - - 166 1495,30 - - - -
MgSO4.7H2O 370 1501,01 185 750,51 370 1501,10 360 1460,45
Micronutrientes
Fe2SO4.7H2O 27,80 100,00 27,80 100,00 27,80 100,00 27,80 100,00
Na2EDTA 37,30 100,20 37,30 100,20 37,30 100,20 37,30 100,20
H3BO3 6,20 100,26 10,00 161,71 6,20 100,26 6,20 100,26
MnSO4.H2O - - 18,90 111,83 - - - -
MnSO4.4H2O 22,30 99,97 - - 22,30 99,97 1,00 4,48
ZnSO4.7H2O 8,60 29,91 10,00 34,77 8,60 29,91 8,60 29,91
KI 0,83 5,00 - - - - 0,08 0,4 8
Na2MoO4.2H2O 0,25 1,03 0,25 1,03 0,25 1,03 0,25 1,03
CoCl2.6H2O 0,025 0,10 - - - - 0,025 0,10
CuSO4.5H2O 0,025 0,10 0,025 0,10 0,25 1,00 0,025 0,10
Composição de alguns meios de cultura.
MS – Murashige & Skoog (1962)NN – Nitsch & Nitsch (1969)WPM – Lloyd & McCown (1986)QL – Quoirin & Lepoivre (1977)