-
Conf. Univ. Dr. Marian PETRE
METODE I TEHNICI MODERNE DE INVESTIGARE
MICROBIOLOGIC A APEI
CURS DE FORMARE PROFESIONAL
2012
-
2
CUPRINS PREFA SCURT INTRODUCERE Capitolul I
REGULI DE BAZ PENTRU FUNCIONAREA UNUI LABORATOR DE
ANALIZE MICROBIOLOGICE
1.1. Organizarea laboratorului de analize microbiologice
1.2. Procedurile de lucru
1.3. Instalatiile, echipamentul, instrumentarul, consumabilele, reactivii,
materialele de referinta
1.4. Executarea analizelor microbiologice de laborator
1.5. Raportarea rezultatelor
Capitolul II
REGLEMENTAREA ACTIVITILOR PRACTICE,
SPECIFICE LABORATORULUI DE ANALIZE MICROBIOLOGICE
2.1. Reguli generale privind desfurarea corespunztoare a
activitilor practice n Laboratorul de Analize Microbiologice
2.2. Msuri destinate asigurrii proteciei personalului de lucru
Capitolul III
PROGRAMA ANALITIC A SUPORTULUI DE CURS - TEMA 4:
METODE I TEHNICI MODERNE DE INVESTIGARE MICROBIOLOGIC A
APEI
3.1. Corelare competene coninuturi
3.2. Sugestii metodologice
3.3. Fia de observare
-
3
Capitolul IV
TEHNICI DE STERILIZARE A USTENSILELOR I A MATERIALELOR
CONSUMABILE N LABORATORUL DE MICROBIOLOGIE
4.1. Procedee de sterilizare a ustensilelor i mediilor nutritive de cultivare a
microorganismelor
4.2. Pregtirea i sterilizarea sticlriei n laboratorul de analize microbiologice
Capitolul V
PREPARAREA I STERILIZAREA MEDIILOR NUTRITIVE DE CULTIVARE A
MICROORGANISMELOR
5.1. Prepararea i sterilizarea mediilor nutritive de cultivare
5.2. Prepararea mediilor nutritive pentru cultivarea bacteriilor, drojdiilor i
mucegaiurilor
Capitolul VI
INOCULAREA I INCUBAREA PROBELOR MICROBIOLOGICE
6.1. Estimarea densitii populaiilor microbene
6.1.1. Tehnica obinerii diluiilor decimale
6.2. Inocularea culturilor microbiene
6.2.1. Inocularea n eprubete (tuburi)
6.2.1.1. Inocularea cu ansa
6.2.1.2. Inocularea cu pipeta Pasteur sau cu pipeta gradat
6.2.2. Inocularea n plci Petri
6.3. Incubarea probelor microbiologice
Capitolul VII
STUDIUL CARACTERELOR MORFOLOGICE I FIZIOLOGICE ALE
COLONIILOR MICROBIENE
7.1. Caractere morfologice ale bacteriilor
-
4
7.2. Caractere morfologice ale drojdiilor
7.3. Caractere morfologice ale mucegaiurilor
7.4. Determinarea vitezei de cretere a coloniilor de mucegai
7.5. Estimarea densitii populaiilor microbiene cu ajutorul camerei Thoma
7.6. Estimarea numrului de celule microbiene prin metoda culturilor
7.7. Determinarea calitii microbiene a apei
7.7.1. Determinarea numrului total de microorganisme
7.7.2. Determinarea bacteriilor coliforme
Capitolul VIII
EXAMENUL MICROSCOPIC AL MICROORGANISMELOR
8.1. Examenul preparatelor n stare proaspt
8.1.1. Studiul microscopic al culturilor de drojdii
8.1.2. Studiul microscopic al culturilor de mucegaiuri
8.1.3. Evidenierea microscopic a bacteriilor
8.2. Examenul preparatelor n stare uscat
8.2.1. Tehnica de efectuare a preparatelor n stare uscat. Coloraia Gram
8.3. Determinarea dimensiunilor celulare cu scala micrometric
Capitolul IX
MICROORGANISME PATOGENE TRANSMISIBILE PRIN AP
9.1. Microorganismele definiie i caracteristici principale
9.2. Specii bacteriene patogene, transmisibile prin ap
9.3. Specii fungice patogene, transmisibile prin ap
9.4. Specii de protozoare patogene, transmisibile prin ap
9.5. Bioindicatori pentru determinarea gradului de contaminare bacterian a
apelor
-
5
Capitolul X
TEHNICI DE ANALIZ MOLECULAR UTILIZATE PENTRU INVESTIGAREA
MICROBIOLOGIC A CALITII APEI
10.1. Metode moderne de identificare chemotaxonomic a speciilor bacteriene
i fungice
10.1.1. Analiza compoziiei acizilor grai - metod de identificare
chemotaxonomic a bacteriilor i fungilor
10.1.2. Metode de analiz a metaboliilor secundari
10.2. Caracterizarea chemotaxonomic a bacteriilor i fungilor filamentoi, prin
extracie de ADN celular i evideniere electroforetic n gel de agaroz
10.2.1. Metoda extraciei de ADN bacterian
10.2.1.1. Fragmentarea peretelui celular i eliberarea coninutului celular
10.2.1.2. Prepararea extractului brut de ADN
10.2.1.3. Purificarea extractului de ADN
10.2.2. Metoda extraciei de ADN fungic
10.2.3. Metoda reaciei n lan a polimerazei (Polymerase Chain Reaction)
BIBLIOGRAFIE SELECTIV
-
6
SCURT INTRODUCERE
Apa reprezint una dintre componentele chimice indispensabile pentru
existena vieii pe Terra. Proporia de ap din organismul uman variaz dup
vrst: de la peste 97 % la embrionul de 7 zile, scznd treptat la 80 % la nou-
nscut, 60-65 % la adult i 50-55 % la vrstnic.
Totodat, procentul de ap variaz dup intensitatea proceselor
metabolice. Acest fapt se reflect i n proporia diferit a apei n esuturi: smal
dentar 0,2 %, dentin 10 %, esut osos 22 %, esut adipos 20 %, esut
cartilaginos 55 %, muchi striat 75 %, ficat 75 %, rinichi 80 %, creier (substan
cenuie) 85 %, plasm sangvin 90%.
Femeile avnd o proporie mai ridicat de esut adipos (relativ srac n
ap), procentul de ap din organism depinde de sex: n medie 52 % la femei i
63 % la brbai. La obezi, procentul de ap poate scdea astfel pn la 40 %.
n organismul uman, apa total (60% din greutatea corporal) se
repartizeaz n mai multe compartimente: Apa intracelular (40 %) i apa
extracelular (20 %), aceasta la rndul ei reprezentat de apa circulant =
intravascular (4- 4,5 %), apa interstiial (15 % - majoritatea legat n geluri) i
apa transcelular (1%).
Rolurile apei n organism sunt multiple, cele mai importante fiind:
- rolul structural, ca i principal component al organismului;
- rolul de mediu de reacie pentru i intervenia n toate procesele
metabolice; - contribuia la meninerea homeostaziei (fiind esenial pentru
variate procese, ca absorbia, transportul, difuzia, osmoza, excreia etc.);
- rol n metabolismul macronutrienilor (din a cror degradare rezult ap);
-
7
- surs de Ca, Mg, Na, K i alte substane utile pentru organism, dar
uneori i de elemente nedorite (toxice, ageni patogeni etc.).
Dinamica apei n corpul uman i bilanul hidric al organismului au fost
ndelung studiate n fiziologie i sunt astzi binecunoscute, avnd largi aplicaii
medicale. Deshidratarea respectiv hiperhidratarea, cu numeroasele variante
fiziopatologice, sunt ntlnite n cadrul multor afeciuni i pun serioase probleme
de diagnostic i tratament.
Un om are nevoie n medie de circa 100 de litri de ap pe zi: 4 litri pentru
nevoia fundamental, alimentar (2,5 litri pentru but i 1,5 litri prepararea
hranei), 13 litri pentru splat vesela, 13 litri pentru splat rufe, 70 de litri pentru
nevoi sanitare (splat pe mini i fa, du, apa pentru cltirea toaletei etc.).
Variabilitatea este desigur foarte mare, n funcie de disponibilitatea i
preul apei, de obiceiuri etc. Unde nu exist ap curent i consumul casnic e
mai mic, iar unde trebuie crat de la mari distane sau e foarte scump se face
economie.
Sunt i situaii, chiar ri ntregi, unde consumul este sub minimul
acceptabil i duce la consecine negative asupra igienei i sntii publice. A
face baie n van n loc de du duce automat la un consum mult mai mare de
ap, la fel i utilizarea frecvent de maini se splat haine, vesel etc. sau dac
aceste au eficien redus din punct de vedere al consumului de ap.
Pe primul plan al aciunii apei asupra sntii omului st patologia hidric
infecioas. Ea este astzi un concept firesc, dar a fost acceptat public trziu i
nu uor. Prima demonstraie oficial i practic a relaiei ap - epidemii a fcut-o
dr. John Snow la Londra n 1854, probnd corelaia dintre epidemia de holer
consumul apei din fntna de pe Broad Street i o latrin din vecintate, folosit
de bolnavi de holer, determinnd oficialitile s realizeze primele canalizri.
Patologia hidric infecioas a sczut semnificativ n prima parte a
secolului XX, dar n ultimele decenii este statistic n cretere, acest fapt
datorndu-se includerii n categoria celor transmise hidric a unor boli virale i
-
8
parazitare, care stau tot mai mult n atenia specialitilor. Bolile cu transmitere
hidric continu s fac n lume zilnic peste 25.000 de victime.
O statistic american pe 60 de ani (1920-1980) indic 1405 epidemii
hidrice, din care 5 cu peste 10.000 cazuri, 5 ntre 5-10.000 cazuri, 9 ntre 3.5000
cazuri, 31 ntre 1-3000 cazuri, 39 ntre 500-1000 cazuri, 44 cu 300-500 cazuri,
restul cu sub 300 de cazuri / epidemie. Din aceste 1405 epidemii, 603 au
survenit n sisteme comunitare, 500 n sisteme non-comunitare i 302 n sisteme
individuale. Spectrul de boli a cuprins zeci de afeciuni diferite. Germania a
nregistrat multe epidemii hidrice, unele de mare amploare cum este cea din
1882 de la Hamburg care a provocat decesul a 8500 de persoane.
n Romnia au fost nregistrate oficial n perioada 1985 - 1995 un numr
de 75 de episoade de epidemii hidrice, cu un total de 10238 persoane afectate.
Maximul s-a nregistrat n 1993. Se estimeaz ns c aceste date sunt mult
subevaluate fa de situaia real, din cauza raportrii deficitare.
Principala cale de transmitere a agenilor patogeni este cea prin ingestie
(direct, sau a alimentelor contaminate prin ap), dar este posibil infectarea i
prin splare i mbiere (leptospiroz, schistostomiaz, tularemie) i prin inhalare
(aerosoli cu Legionella). Principalele afeciuni determinate de transmiterea
(predominant sau posibil) hidric a agenilor patogeni sunt cele microbiene, virale
i parazitare.
Dac anumite afeciuni sunt specifice zonelor tropicale, iar altele au fost
cvasieradicate n Romnia, multe dintre aceste maladii au nc o frecven
ridicat n ara noastr. La nivel mondial, boala diareic este a doua cauz de
deces dup bolile cardiovasculare, iar studii n ri dezvoltate arat c incidena
bolilor diareice este puternic subestimat, ele fiind, contrar prerii generale, mai
frecvente la vrstnici dect la copii, iar efectele socio-economice foarte
importante. Un studiu pe 10 ani n Cleveland (SUA) indic boala diareic de
etiologie viral ca a doua cauz de boal dup rinofaringit.
Mari diferene n patologia hidric vid din diverse cauze, din care unele
legate de agentul patogen. Unii ageni patogeni triesc doar n anumit climat (de
-
9
regul tropical), alii au nevoie pentru ciclul lor biologic de anumite insecte sau
alte organisme vii ca s se nmuleasc. Acelai tip de surs de infecie face s
ajung n ap cantiti diferite de infectant.
Astfel, n cazul impurificrii fecaloide, ntr-un gram de fecale exist specii
bacteriene, cum sunt: Escherichia coli i Salmonella typhi (de ordinul miliardelor
de celule), Entamoeba histolitica, Vibrio cholerae, Giardia intestinalis (de ordinul
milioanelor de celule), Enterovirusuri (de ordinul sutelor de milioane de entiti
virale), precum i ou de Tenia solium i Ascaris lumbricolides (de ordinul zecilor
de mii) etc.
Timpul de supravieuire n ap a agentului patogen difer mult, n funcie
de particularitile intrinseci ale acestuia, precum i de factorii de mediu extern.
De aceea, unele ape contaminate masiv nu produc epidemii, deoarece
prin diluie scade doza care ajunge n organismul uman sau animal, iar agenii
patogeni liberi n ap, de regul, mor repede.
Astfel, supravieuirea n ap este n medie de 3 luni la enterovirusuri i
Escherichia coli, 2 luni la Salmonella typhi, 1 lun la Shigella sp. i Vibrio
cholerae, 25 de zile la Entamoeba histolitica, precum i Giardia intestinalis.
Doza infectant difer enorm de la un anumit tip de agent patogen la altul.
Astfel, pentru a se mbolnvi, statistic un om trebuie s ingere n medie (doza
infectant 50%) miliarde de Escherichia coli, sute de milioane de vibrioni holerici,
zeci de milioane de bacteriii din specia Salmonella typhi, zeci de mii de bacterii
ale speciei Shigella sp., dar numai cteva sute de enterovirusuri, cteva zeci de
celule de Entamoeba hstolitica sau Giardia intestinalis, civa ascarizi sau
leptospire.
n mod evident, doza depinde preponderent de organismul tip gazd, de
vrsta acestuia, precum i de starea sa de sntate etc.
Evoluiile recente sunt foarte ngrijortoare. Succesele obinute n prima
parte a secolului n combaterea bolilor infecioase cu transmitere hidric a dus la
o reducere a ateniei i fondurilor alocate n acest sector, iar autoritile sunt
-
10
adesea ignorante. 2 milioane de copii mor anual prin boli diareice transmise
hidric, iar numrul anual de astfel de mbolnviri se estimeaz la 900.000.000.
Astfel, n rile n curs de dezvoltare, se nregistreaz anual amibiaze (400
milioane infectai, 30.000 mori), poliomielit (80 milioane infectai, 10.000 mori),
febr tifoid (1 milion infectai, 25.000 mori), ascaridoz (1 miliard infectai,
20.000 mori), schistostomiaz (200 milioane infectai, 500.000 - 1.000.000
mori), trepanosomiaz (1 milion infectai, 5.000 mori), malarie (800 milioane
infectai, 1.200.000 mori) etc.
Calitatea microbiologic a apei este n scdere n majoritatea rilor, iar
germenii sunt tot mai rezisteni la dezinfectante. Scderea imunitii populaiei, n
principal prin mbuntirea general a igienei, a produs o cretere a
susceptibilitii la boli hidrice. Se preconizeaz c securitatea microbiologic a
apei va fi o mare problem a secolului viitor.
Analiza microbiologic const n aplicarea metodelor i tehnicilor
corespunztoare de analiz pentru observarea, izolarea, identificarea i
cuantificarea specific a microorganismelor existente n probele examinate, n
scopul stabilirii prezenei sau absenei microorganismelor nocive pentru
sntatea consumatorului sau pentru conservarea calitii alimentare a
produselor examinate.
n acest context, analiza microbiologic a probelor de ap reprezint un
capitol distinct din punct de vedere al impactului calitii surselor de ap asupra
consumatorilor. Astfel, metodele i tehnicile actuale de investigare microbiologic
se bazeaz pe principiile examinrii rapide i ct mai eficiente a probelor de
analiz, n vederea decelrii, identificrii i cunatificrii prezenei
microorganismelor patogene sau potenial patogene n produsele analizate.
-
11
Capitolul I
REGULI DE BAZ PENTRU FUNCIONAREA UNUI
LABORATOR DE ANALIZE MICROBIOLOGICE
1.1. Organizarea laboratorului de analize microbiologice
Orice laborator care realizeaza analize microbiologice trebuie sa aiba un
sistem de asigurare a calitatii bazat pe documente scrise (proceduri de operare
standard pentru fiecare etapa a analizei microbiologice efactuate ca si conditiile
de executie (instructiuni de lucru). Calitatea unei analize microbiologice depinde
nu numai de calitatea analizei n sine ci si de organizarea generala a
laboratorului, calificarea si motivarea personalului.
Organizarea i managementul laboratorului
Laboratorul trebuie sa aiba o identitate bine stabilita n cadrul organizatiei din
care face parte sau sa aiba personalitate juridica. Organizarea si functionarea
laboratorului trebuie sa ndeplineasca criteriile prevatute n prezentul document,
att pentru sediul permanent, ct si pentru punctele de lucru sau facilitatile de
analiza pe teren.
Laboratorul va avea:
a) personal de conducere cu autoritatea si competenta necesare ndeplinirii
sarcinilor de serviciu;
b) dovezi ca personalul de laborator nu este supus nici unei presiuni de ordin
financiar sau comercial care ar putea influenta negativ calitatea muncii sale;
-
12
c) acolo unde este cazul sunt nominalizati manageri adjuncti pentru a suplini
personalul de conducere cnd acesta lipseste din laborator;
d) participa la exercitii de inter-comparare ntre laboratoarele de profil.
Sistemul calitii
Documentatia sistemului calitatii dintr-un laborator trebuie sa contina
procedurile operationale stabilite pentru ndeplinirea criteriilor prezentei proceduri
si urmatoarele documente aditionale:
a) lista personalului de laborator cu semnatura autorizata;
b) procedura laboratorului pentru realizarea trasabilitatii masurarii;
c) unde este cazul o procedura care stabileste cum se documenteaza si se
urmaresc toate modificarile introduse n activitatea de analiza curenta;
d) descrierea metodelor de analiza utilizate;
e) procedurile de prelevare si manipulare a probelor;
f) procedurile pentru echipamentele majore si materialele de referinta utilizate;
g) procedura pentru actiuni corective
h) procedura pentru reclamatii
i) procedura pentru pastrarea confidentialitatii si proprietatii intelectuale, daca
este cazul.
Atunci cnd este nevoie de implementarea unor actiuni corective, acestea
trebuie documentate. Responsabilul cu asigurarea calitatii va supraveghea
punerea n aplicare a acestor masuri, cu respectarea calendarului stabilit.
Laboratorul va asigura calitatea rezultatelor furnizate clientilor prin
implementarea unor controale periodice. Procedura de control face obiectul
reviziilor periodice si va include cel putin urmatoarele aspecte:
a) participarea la exercitii de inter-comparare si teste de capabilitate;
b) utilizarea cu regularitate a materialelor de referinta si/sau materialelor cu
caracteristici cunoscute preparate n laborator, ca parte a controlului de calitate
al laboratorului;
c) repetarea analizelor pe probele conservate (contra probe), unde este cazul.
-
13
Organizarea unui sistem de calitate n laborator este responsabilitatea
unui responsabil cu asigurarea calitatii numit de director sau de seful de
laborator si priveste mai multe aspecte:
Personalul - stabilirea unei organigrame a laboratorului.
- stabilirea fiselor de post (se asigura ca personalul sa corespunde din punct de
vedere al numarului, educatiei, instruirilor periodice, cunostintelor tehnice si
experientei, pentru functiile pe care le ocupa si domeniul de activitate declarat) -
asigura formatia personalului pentru o anumita sarcina si instruirea permanenta a
personalului.
- Pune la dispozitia personalului procedurile de operare si instructiunile de lucru
cuprinse n ghidurile de specialitate.
- Informeaza personalul cu privire la orice decizie sau introducere de noi POS-
uri sau IL-uri
- Laboratorul trebuie sa mentina nregistrari relevante despre calificarea,
instruirea, aptitudinile, experienta si competenta personalului
- - normele de protectia muncii sunt cunoscute, respectate si aplicate.
Obligatiile biologului din laborator
- validarea analizelor (tehnica si biologica)
- semnarea buletinelor
- transmiterea lor fara ntrziere
Obligatiile personalului
- trebuie sa se conformeze la toate procedurile si instructiunile de lucru n vigoare
din laborator
-
14
Spatiul si conditiile de lucru
Cladirea laboratorului, spatiile de testare, sursele de energie, iluminatul,
sistemul de ncalzire si ventilatia, trebuie sa asigure coditiile optime de realizare
a analizelor.
Conditiile de mediu n spatiile n care se desfasoara analizele trebuie sa nu
conduca la invalidarea rezultatelor sau sa influenteze negativ acuratetea si
precizia masurarii. Trebuie acordata o atentie deosebita acestor aspecte atunci
cnd analizele se desfasoara n alte locuri dect spatiile permanente ale
laboratorului. Se va asigura o separare efectiva a spatiilor nvecinate n care se
desfasoara activitati incompatibile.
Accesul si utilizarea spatiilor destinate analizelor vor fi definite si controlate.
Se vor asigura curatenia si buna gospodarire a laboratorului
1.2. Procedurile de lucru
- se asigura ca procedurile n vigoare, scrise, verificate, aprobate, datate
sunt respectate de catre personal;
- se asigura revizuirile procedurilor sunt notate, aprobate, nregistrate,
datate si communicate ntregului personal al laboratorului;
- ntocmirea unei fise cronologice a tuturor operatiunilor (flux de lucru)
care sa permita supravegherea respectarii instructiunilor de lucru;
- n cazul n care se semnalizeaza o eroare de functionare sau de
executare are initiativa de nlocuirii acesteia si nregistreaza modurile de
corectare ntrepinse;
- asigura gestionarea adecvata a arhivelor.
1.3. Instalatiile, echipamentul, instrumentarul, consumabilele, reactivii,
materialele de referinta
Laboratorul va fi dotat cu toate echipamentele si materialele de
referinta necesare pentru desfasurarea corecta a analizelor.
-
15
Echipamentele vo fi mentinute n mod corespunzator, activitatea
fiind documentata de proceduri. Orice echipament defect sau care produce
rezultate suspecte va fi scos din uz, clar marcat si depozitat pe ct posibil ntr-un
spatiu exterior zonei de desfasurare a analizelor, pna cnd va fi reparat si se va
demonstra prin teste de calibrare si verificare ca a atins o performanta
satisfacatoare.
Laboratorul este obligat sa examineze influenta utilizarii acestui
echipament asupra rezultatelor analizelor anterioare.n cazul n care laboratorul
utilizeaza echipamente care nu sunt n proprietatea si/sau controlul sau, va lua
toate masurile necesare pentru a se asigura ca se respecta cerintele prezentului
document.
Consumabilele, rectivii sunt n termen, disponibili, conservati n
conditii bine definite, conform reglemetarilor n vigoare, n concordan cu
evolutia cunoaterii tiinifice i tehnice
Resursele informatice utilizate pentru controlul, verificarea
aparatelor sau pentru interpretarea rezultatelor sunt autorizate si cu versiuni
actualizate.
Trasabilitatea masurarii si calibrarea echipamentelor de lucru
Programul de calibrare/verificare si de validare a echipamentelor va fi
elaborat si pus n aplicare astfel nct sa asigure trasabilitatea la sistemul
national, a masurarilor efectuate de laborator.
Materialele de referinta sau substantele etalon vor fi utilizate de laborator
numai n scopul calibrarii, daca nu se pot prezenta dovezi obiective ca
performanta lor ca materiale de referinta nu se invalideaza prin utilizare n
activitatea curenta.
Materialele de referinta vor fi calibrate de catre un organism care poate
asigura trasabilitatea la sistemul national de masura. Laboratorul va avea un
program de calibrare si verificare a materialelor de referinta.
-
16
Materialele de referinta vor fi trasabile ori de cte ori este posibil la sistemul
national si international de masuri si greutati, sau la materialele de referinta
certificate, existente la nivel national sau international.
Echipamentele de laborator
Amenajare si ntretinere:
- constructia, localizarea - conform reglementarilor. Amenajarea trebuie sa
permita izolarea activitatilor cu risc de contaminare pentru operator si/sau proba
(evitnd asadar contaminarea la interior sau la exterior).
- Trebuie sa fie prevazute zone de stocare la diferite temperaturi a materiilor
prime, a reactivilor, separate fata de zonele de stocare a probelor. Depozitarea
reactivilor si a materiilor prime toxice sau periculoase se realizeaza separate si
pe ambalajul lor trebuie sa fie vizibile mentiunile: "coroziv", "iritant" sau "toxic",
pastrate si depozitate n conditii de securitate pentru personal si calitatea analizei
probei. Trebuie sa existe proceduri scrise privind modalitatea de ntretinere a
laboratorului.
Securitate:
- respectarea normelor regulamentare pentru evitarea riscului de incendiu si
explozie.
- Instalatiile de distribuire a gazului trebuie sa se conformeze regulamentului si
verificate de personal autorizat
- Substantele inflamabile, periculoase, radioactive trebuie conservate
regulamentar.
Instrumentar:
- carti tehnice
- adecvat pentru toate analizele microbiologice care pot fi efectuate
- actualizat, aprobat
- ntretinut, curatat, verificat periodic (metrologic)
-
17
Minim necesar de echipamente pentru laboratorul de analize microbiologice:
- centrifuga
- 2 termostate
- dispozitiv de anaerobioza
- hota cu flux laminar
- congelator -800C, tanc azot lichid dupa caz
- microscop optic
- microscop inversat (pentru virologie)
- micrometru optic (pentru parazitologie)
- dispozitiv de colorare a lamelor
Materiale si reactivi
- achizitionate din surse conforme cu normele specifice folosite i conservate
corespunzator, conform modului de utilizare prevazut de furnizor
- reactivii preparati si/sau reconstituiti n laborator trebuie sa poarte data
prepararii si cea a valabilitatii solutiei obtinute.
Toti reactivii expirati trebuie eliminati.
Mijloace informatice
Accesul total sau partial la date trebuie limitat la personalul autorizat. Materialul
informatic trebuie protejat fata de accesul extern al persoanelor neautorizate.
Modificarea programelor sau a informatiilor continute trebuie realizata numai de
persoane autorizate, iar modificarile trebuiesc nregistrate.
Responsabilul laboratorului trebuie sa semneze o conventie cu responsabilul de
mentinere a sistemului informatic care sa prevada ca:
- personalul implicat respecta regulile secretului professional
- sistemul este configurat si protejat pentru asigurarea confidentialitatii
-
18
- orice modificare se realizeaza de personal calificat, doar la cererea biologului
si face obiectul unui proces verbal detaliat, semnat si nregistrat si postat n
arhiva laboratorului.
Eliminarea deseurilor
-conform legislatiei si reglementarilor n vigoare
-se separa n 2 categorii: - deseuri cu risc
- deseuri asimilabile celor menajere.
Deseurile cu risc sunt separate n 3 grupe:
a) potential contaminate
b) produsi toxici sau chimici
c) produsi radioactivi
Pentru fiecare din cele 3 grupe, trebuie sa existe reguli stricte privind modalitatile
specifice de conditionare, de stocare, de transport, de tratare si pretratare;
eventual contractarea unei societati de profil pentru realizarea acestor procedee.
Deseurile asimilabile celor menajere sunt depozitate n containere care intra n
circuitul de eliminare prin circuitul deseurilor menajere (cu acordul colectivitatii
locale).
1.4. Executarea analizelor microbiologice de laborator
Laboratorul va avea proceduri de utilizare a tuturor echipamentelor
relevante, instructiuni de manipulare si pregatire pre-analitica a probelor si
proceduri de lucru pentru acele metode unde lipsa unor asemenea precizari ar
pune n pericol corectitudinea rezultatelor analizelor; pot fi substituite de
manuale, carti, articole (ex. POS-uri) privind: modul de recoltare al probelor;
identificarea probei, transportul probei, eventualele tratamente prealabile ale
probei, receptia probelor, conservarea probelor nainte si dupa analize, utilizarea
aparaturii, instrumentarului de laborator, IL privind utilizarea reactivilor, POS cu
descrierera metodei de lucru utilizata pentru o anumita analiza, POS privind
-
19
transmiterea rezultatului, POS privind igiena si securitatea laboratorului, POS
asigurarea calitatii, gestionarea sistemelor informationale eventual existente
Toate instructiunile, standardele de metoda, manualele si literatura de
referinta relevanta pentru domeniul de activitate al laboratorului, vor fi mentinute
la zi si vor fi accesibile personalului de laborator.
Laboratorul va avea un sistem documentat pentru identificarea unica a
probelor de analizat, pentru a preveni orice confuzie legata de identitatea
acestora.
Laboratorul va avea proceduri si facilitati adecvate pentru a preveni
deterioararea probelor n timpul depozitarii, manipularii, pregatirii si analizei. n
situatiile n care probele trebuie depozitate si/sau pregatite n conditii de mediu
speciale, aceste conditii vor fi asigurate, monitorizate si nregistrate. n cazul n
care o proba sau o parte dint-o proba trebuie pastrate pentru repetarea analizelor
(contra-proba), laboratorul va asigura toate conditiile pentru pastrarea integritatii
si securitatii acesteia.
Unde este cazul, laboratorul va avea proceduri pentru receptia si pastrarea n
siguranta a contra-probelor
Laboratorul va utiliza metode de analiza si proceduri de testare adecvate
scopului, inclusiv pentru prelevarea probelor, manipularea, transportul,
depozitarea si pregatirea lor. Performantele metodelor de analiza vor respecta
limita de detectie, precizia si acuratetea recomandate de legislatia n vigoare, n
domeniul apei.
Ori de cte ori este necasara utilizarea unei metode nestandardizate, se va
obtine acordul clientului, iar metoda de analiza va fi documentata, validata si
accesibila clientului sau altor persoane responsabile.
Atunci cnd prelevarea probelor este parte integranta a metodei de analiza,
laboratorul va documenta aceasta situatie printr-o procedura speciala. Unde este
aplicabil, se vor utiliza tehnici statistice pentru esantionare.
-
20
Atunci cnd se utilizeaza echipamente automate asistate de calculator pentru
prelevarea, pregatirea, manipularea, nregistrarea, raportarea si arhivarea
rezultatelor analizelor, laboratorul se va asigura ca:
a) sunt ndeplinite criteriile prezentului document;
b) soft-ul utilizat este adecvat si documentat;
c) sunt stabilite si implementate proceduri referitoare la protejarea integritatii
datelor; aceste proceduri vor include cel putin securizarea datelor introduse,
procesate, transmise, arhivate;
d) calculatoarele si echipamentele automate vor fi mentinute n stare de
functionarea adecvata prin asigurarea conditiilor de mediu si de operare;
e) se vor stabili si implementa proceduri pentru mentinerea securitatii datelor,
inclusiv prin prevenirea accesului neautorizat.
Unde este cazul vor exista proceduri pentru achizitionarea, receptia si
depozitarea materialelor consumabile utilizate n activitatea de laborator.
nregistrarea rezultatelor
Laboratorul va mentine un sistem de nregistare a rezultatelor adecvat
activitatii sale, n concordanta cu prevederile prezentului document. Laboratorul
va nregistra toate observatiile si calculele originale si o copie dupa buletinele de
analiza pe o perioada considerata adecvata. nregistrarile referitoare la fiecare
analiza vor contine suficiente informatii pentru a permite repetarea lor. Acolo
unde este cazul, nregistrarile conexe ca de exemplu calibrarile, vor fi arhivate pe
o perioada considerata adecvata.
Stocarea si conservarea arhivelor
- rezultatele analizelor realizate trebuie pastrate 5 ani (puse la dispozitia
controalelor externe de calitate)
- procesele verbale privind masurile luate pentru corectarea erorilor evidentiate
n urma CEC - 5 ani
- rezultatele CIC - 3 ani
-
21
- 1 exemplar de POS-uri, IL-uri si istoria receptiilor - 3 ani
- contractele cu societatile de profil si documentele legate de eliminarea
deseurilor - 3 ani
- documentatia privind reactivii si consumabilele - pe durata utilizarii lor
- documentele referitoare la modificarile programelor informatice.
Arhiva trebuie depozitata ntr-un loc adecvat si care sa asigure confidentialitatea
datelor.
Laboratorul va avea proceduri pentru nregistrarea electronica a datelor. Daca
arhiva este informatica se iau masuri de evitare a pierderii de informatie (copii
multiple pe CD-ROM - cel putin doua una pentru consultari, una pentru pastrare).
Raportarea rezultatelor
Rezultatele fiecarei analize sau serii de analize efectuate de laborator vor
fi raportate cu acuratete, clar, neambiguu si obiectiv, n conformitate cu
instructiunile din metoda de analiza. Rezultatele vor fi raportate sub forma unui
buletin de analiza care va include toate informatiile necesare pentru interpretarea
rezultatelor si toate informatiile cerute de utilizarea metodei de analiza.
Buletinul de analiza se transmite imediat ce rezultatul analizei este gata catre
"client".
Buletinul de analiza va include cel putin urmatoarele informatii:
Titlul, de exemplu "Buletin de analiza";
Denumirea si adresa laboratorului si locul n care a fost efectuata analiza;
Identificarea unica a buletinului de analiza, ca de exemplu un numar si
numerotarea fiecarei pagini, ca parte din numarul total de pagini;
Unde este cazul, numele si adresa clientului;
Descrierea si identificarea neambigua a probelor analizate;
Unde este cazul, caracterizarea probei si conditiile n care aceasta a fost
analizata;
Unde este cazul, data si ora la care proba a fost receptionata si data si ora la
care aceasta a fost analizata;
-
22
Unde este cazul, specificarea metodei de analiza utilizate si descrierea
neambigua a oricarei alte metode de analiza nestandardizate utilizate;
Unde este cazul, detalii despre procedura de prelevare a probei;
Unde este cazul, se va mentiona orice abatere de la metoda de analiza
standardizata si orice alta informatie relevanta, ca de exemplu conditiile de
mediu;
Masurarile, examinarile si rezultatele derivate, nsotite de tabele, grafice,
schite sau fotografii dupa caz si orice abateri constatate;
Unde este cazul, estimarea incertitudinii n masurare;
Semnatura si functia persoanei responsabile pentru continutul buletinului de
analiza si data eliberarii buletinului;
Unde este relevant, declaratia "rezultatele se refera exclusiv la proba
analizata";
Declaratia "acest buletin de analiza nu va fi reprodus partial, fara acordul scris
al laboratorului".
Cnd buletinul de analiza contine rezultate ale unor analize sub-contractate,
aceste rezultate vor fi clar marcate.
Acolo unde este cazul, se va acorda atentie formei grafice a buletinului de
analiza, astfel nct acesta sa fie usor de citit. Formatul poate fi adaptat fiecarui
tip de analiza, dar antetul se recomanda a fi standardizat.
Unde este cazul, materialele aditionale buletinului de analiza vor fi organizate
ntr-un document separat, intitulat de exemplu "Raport suplimentar la buletinul de
analiza nr..", care va primi un numar de ordine si va respecta prevederile
prezentului capitol.
Atunci cnd este cazul, laboratorul va notifica n scris, cu promptitudine,
clientul, asupra oricarui eveniment care produce dubii asupra validitatii
rezultatelor nscrise n buletinul de analiza.
Unde este cazul, laboratorul va asigura transmiterea rezultatelor catre client,
prin telefon, fax, alte mijloace electronice sau pe suport magnetic, pe baza unei
-
23
proceduri care respecta prevederile prezentului document si confidentialitatea
datelor.
Raportarea rezultatelor va respecta toate cerintele legislatiei n vigoare
referitoare la calitatea apei potabile.
Laboratorul trebuie sa cuprinda:
- un local de receptie
- un birou de secretariat si arhiva
- sala de prelevare a probelor
- spalatorie
- camera pentru efectuarea analizelor microbiologice
-
24
Capitolul II
REGLEMENTAREA ACTIVITILOR PRACTICE,
SPECIFICE LABORATORULUI DE ANALIZE MICROBIOLOGICE
2.1. Reguli generale privind desfurarea corespunztoare a activitilor
practice n Laboratorul de Microbiologie
Pentru respectarea tuturor normelor i reglementrilor actuale, referitoare
la efectuarea corespunztoare a activitilor practice cu profil microbiologic, este
absolut necesar ntocmirea unei documentaii tehnico-tiinifice privind
constituirea, amplasarea, precum i organizarea structural i funcional a
Laboratorului de Microbiologie.
Astfel, un asemenea laborator trebuie s cuprind trei compartimente
principale, proiectate i realizate cu scopul de a asigura spaiile de lucru n mediu
aseptic, precum i fluxul tehnologic de efectuare a tuturor activitilor practice
specifice, i anume:
1 - un compartiment de pregtire a instrumentarului de lucru i de
prepararea a mediilor de cultivare;
2 un compartiment de sterilizare a instrumentelor i a mediilor de
cultivare, repartizate anterior n vase de sticl;
-
25
3 un compartiment de manipulare aseptic a culturilor microbiene
- o sal de pregtire a mediilor i obiectelor de lucru i de decontaminare,
coninnd mese, un autoclav, o etuv, un congelator i un frigider (care va fi
utilizat i pentru pstrarea tulpinilor microbiene). Tot aici se poate stoca sticlria,
mediile de cultur precum i reactivii.
- o sal de lucrri propriu-zise, de manipulare a culturilor microbiene, la
adpost de curenii de aer, dotat cu mese cu suprafa neted, rezistent,
impermeabil, cu conducte de gaz i prize electrice, un sistem de vid i de aer
comprimat i o hot sterilizabil, cu radiaii ultraviolete (eventual o hot cu flux
laminar). n msura n care este posibil, n legtur cu aceast sal, ar trebui s
existe anexe prevzute cu termostate la diferite temperaturi ( 250C, 300C, 370C,
440C, 550C).
Manipulrile de culturi microbiene sau de produse susceptibile s conin
microorganisme se efectueaz innd cont de unele tehnici particulare prin care
s se evite cele dou tipuri de contaminare:
1. contaminarea culturii sau a produsului ce trebuie analizat datorit
personalului sau mediului inconjurtor;
2. contaminarea personalului sau a mediului nconjurtor de ctre
microorganismele studiate.
In laboratorul de microbiologie, operaia de baz este transferul de
microorganisme dintr-un recipient n altul, lucrare ce se execut n zona steril
de protecie din jurul flcrii becului de gaz.
Sticlria cel mai des utilizat n laboratorul de microbiologie const n
eprubete de diferite dimensiuni, flacoane Erlenmeyer, plci Petri, pipete Pasteur
i pipete gradate. n ultima perioad sunt din ce n ce mai mult utilizate
recipientele i pipetele din plastic, de unic folosin. Pentru prelevarea i
inocularea culturilor se utilizeaz ansa sau firul metalic, fabricate din nicrom.
Ustensilele de etalare permit repartizarea uniform a inoculului pe suprafaa
mediilor solidificate i pot fi fabricate prin ndoirea unui tub sau a unei baghete
-
26
din sticl. n afara acestor ustensile curente de lucru, mai pot fi ntrebuinate o
serie de alte instrumente, n funcie de operaia efectuat.
Laboratorul de microbiologie trebuie s fie dotat cu urmtoarele aparate i
echipamente:
robinet cu ap cald i rece, de preferin acionat cu piciorul;
hot cu flux laminar sau ni sterilizabil, indispensabil lucrrilor de
microbiologie;
bec de gaz tip Bunsen pentru lucrul n zona steril din jurul flcrii cu con
albastru i pentru sterilizarea ansei;
etuv pentru sterilizarea sticlriei;
incubator cu termostat pentru incubarea culturilor microbiene de tip
staionar;
incubator cu termostat i agitator orbital pentru incubarea culturilor
microbiene de tip submersibil;
autoclav pentru sterilizarea mediilor de cultur i pentru decontaminarea
obiectelor;
baie de ap termostatat;
frigidere pentru conservarea mediilor i a culturilor microbiene;
balane;
pH-metru;
microscoape optice i stereo-microscoape;
Pentru evitarea riscurilor de contaminare cu ageni patogeni din culturile
efectuate n laborator, precum i de introducere n incinta laboratorului a unor
microorganisme existente n spaiul exterior acestuia, pe tot parcursul
desfurrii activitilor practice n laborator, fiecare membru al personalului
de lucru este obligat s respecte ntocmai urmtoarele reguli specifice:
1 - Utilizarea echipamentului complet de protecie, compus din:
-
27
a) combinezon sau halat de protecie asociat cu pantaloni lungi, fiecare
dintre aceste obiecte fiind confecionate dintr-un material textil natural sau
sintetic, care s protezeje corpul uman de interaciunea cu diveri colorani sau
cu diferite substane reactive corozive sau decolorante i care s fie rezistente la
termosterilizarea cu abur sub presiune;
b) masc de protecie a feei, confecionat din tifon sau din materiale
sintetice uor sterilizabile prin metode fizice sau chimice;
c) mnui de cauciuc pentru ntrebuinare unic, sterilizate n prealabil cu
radiaii gamma;
d) bonet pentru protecia capului, confecionat din pnz, din tifon sau
din materiale sintetice uor sterilizabile prin metode fizice sau chimice;
e) ochelari de protecie, fabricai din sticl sau plastic incolor,
termosterilizabili prin iradiere cu ultraviolete;
f) papuci confecionai din cauciuc, termosterilizabili prin autoclavare,
special destinai lucrului n laborator sau, n lipsa acestora, huse de unic
folosin, confecionate din pnz sau hrtie rezistent la termosterilizare,
destinate acoperirii n ntregime a nclmintei de strad.
2 Echipamentul de protecie trebuie s fie pstrat ntr-un dulap special
destinat acestui scop, separat de hainele utilizate n spaiul exterior.
3 - Toate hainele sau alte obiecte personale vor fi pstrate n dulapuri
ermetice, amplasate la distan de incinta propriu-zis de lucru.
4 Introducerea n laborator a oricror obiecte de uz personal (exemple:
cri, caiete, mape, serviete, geni, sacoe, pungi etc.) este strict interzis,
acestea fiind, n mod obligatoriu, depozitate n anticamera special amenajat n
acest scop.
5 Lecturarea complet a coninutului lucrrii practice din manual,
preferabil n ziua premergtoare sosirii n laborator sau, n anumite situaii
extreme, cu minimum o or nainte de nceperea lucrrilor propriu-zise.
6 Elucidarea complet a oricror nelmuriri sau neclariti referitoare la
protocolul de lucru ce urmeaz a fi pus n aplicare, prin urmrirea cu atenie a
-
28
explicaiilor oferite de asistenta / asistentul cu rol coordonator al lucrrilor de
laborator i solicitarea de lmuriri suplimentare sau precizri absolut necesare
nelegerii corecte a modului de lucru i a rezultatelor preconizate a se obine la
finalul lucrrii efectuate.
7 ntocmirea planului de lucru pe etape cu stabilirea judicioas a
aparatelor, instrumentelor i materialelor ce urmeaz a fi utilizate pentru
efectuarea corespunztoare a lucrrii practice.
8 Identificarea tuturor ustensilelor i a obiectelor de lucru (anse
bacteriologice sau micologice, tuburi de cultur, pipete, plci Petri, baloane
Erlenmeyer, pahare Berzelius, cilindri gradai etc.), precum i a materialelor
consumabile absolut necesare pentru a fi utilizate n timpul desfurrii lucrrii
(colorani, reactivi, ingrediente pentru prepararea mediilor de cultur etc.).
9 Deplasarea prin laborator nu trebuie s se efectueze n vitez, prin
fug sau prin mers rapid, iar micrile trebuie s fie atent controlate, fr gesturi
brute, care s determine formarea de cureni de aer n zona de lucru.
10 - Toate culturile microbiene ce se utilizeaz n laboratorul de
microbiologie, precum i produsele biologice destinate analizelor microbiologice
specifice sunt considerate ca fiind potenial infectante.
11 Evitarea expunerii direct pe masa de lucru a tuburilor (eprubetelor)
sau a placilor Petri ce conin culturi bacteriene sau fungice, ci numai n interiorul
incintei cu aer steril, prevzut n acest scop.
12 Dezinfectarea cu alcool sau alte substane antiseptice a meselor de
lucru i a obiectelor auxiliare utilizate n timpului lucrului n laborator (creioane cu
grafit, creioane din plastic, tip markerdestinate inscripionrii obiectelor
confecionate din sticl, metal sau plastic etc.).
13 - Flambarea ansei la flacara emanat prin intermediul becului de gaz,
pn la nroirea complet a firului metalic n form de bucl i a unei poriuni din
lungimea acestuia pn la zona de conexiune a acestuia cu mnerul acoperit de
un material izolator ignifug.
-
29
14 Interzicerea transvazrii sub presiune a lichidelor din pipete n
interiorul eprubetelor, precum i a deschiderii brute a unor recipiente astupate
cu dopuri fixate ermetic pentru a se evita producerea de aerosoli cu grad ridicat
de contaminare.
15 Respectarea cu strictee a tuturor operaiunilor de manipulare a
culturilor de microorganisme, a ustensilelor, precum i a materialelor de
laborator, conform instruciunilor corespunztoare de lucru, n condiii de asepsie
total, fr efectuarea de micri brute sau violente care s pericliteze
desfurarea n siguran a activitilor specifice.
16 Interzicerea cu desvrire a fumatului sau a ingerrii alimentelor
sau buturilor n incinta laboratorului de microbiologie.
17 Semnalarea de urgen a asistentului coordonator de lucrri asupra
oricrui accident survenit n timpul lucrului n laborator (spargerea unui tub sau a
unei plci Petri de cultur microbian, spargerea unei pipete cu un anumit lichid,
rsturnarea unor flacoane coninnd acizi sau baze etc.) i acoperirea rapid i
complet, cu o lavet mbibat n soluie dezinfectant, a zonei n care s-a
produc accidentul respectiv i apoi curarea integral a particulelor reziduale
remanente.
18 Introducerea materialelor contaminate n recipientele special
destinate colectrii acestora pentru decontaminare prin sterilizare termic umed
(autoclavare).
19 Informarea temeinic asupra proprietilor fizice i chimice ale
substanelor manipulate n cursul efecturii experimentelor de laborator (gradul
de volatilitate, de inflamabilitate, de explozivitate, temperatura de aprindere, de
lichefiere, de sublimare etc.), n vederea evitrii unor posibile accidente datorate
lipsei de cunotine referitoare la reaciile poteniale pe care acestea le induc n
contact cu ali reageni chimici.
20 Activitatea practic n laboratorul de microbiologie implic n mod
direct sau indirect contactul cu un produs biologic infecios sau potenial
contaminant!
-
30
21 Utilizarea aparatelor i dispozitivelor de lucru trebuie efectuat n
conformitate cu instruciunile de folosire specifice.
22 La ncheierea oricrei lucrri practice n laboratorul de microbiologie,
este obligatorie dezinfectarea minilor prin imersarea acestora ntr-o soluie
antiseptic (bromocet, cloramin etc.) timp de 2 3 minute, iar apoi splarea
acestora cu ap cald i spun.
23 Pentru asigurarea unui control ct mai riguros al modului de
efectuare a lucrrilor de laborator, fiecare participant la activitatea practic, ce
urmeaz a se desfura pe parcursul unui semestru de an universitar, are
urmtoarele obligaii:
a) de a ntreine n mod corespunztor spaiul de lucru care i este
destinat, nc de la nceputul primei lucrri practice i pn la ncheierea stagiului
de activitate n cursul semestrului respectiv;
b) de a pstra ordinea i curenia n spaiul de lucru alocat;
c) de a asigura meninerea nealterat a suprafeei de lucru, precum i a
diferitelor dispozitive i obiecte adiacente spaiului de activitate.
24 Accesul persoanelor strine n laborator este strict interzis.
25 - Intrarea n laborator i participarea la efectuarea lucrrilor
practice se va realiza numai dup audierea i nsuirea temeinic a
regulilor de protecie a muncii.
2.2. Msuri destinate asigurrii proteciei personalului de lucru
Pentru a preveni accidentele de lucru, este absolut necesar respectarea
cu strictee a metodologiei specifice de lucru, precum i a regulilor de
dezinfectare i aseptizare, care se aplic laboratorului de microbiologie,
dup cum urmeaz:
a) toate operaiunile de inoculare se efectueaz la flacra unui bec de
gaz, prin flambarea orificiului vaselor de cultivare, att n momentul deschiderii
-
31
lor, prin detaarea lent (fr micri brute) a capacelor sau a buoanelor, ct i
al nchiderii acestora;
b) att ansa, ct i acul de platin se sterilizeaz prin nclzire la rou,
nainte i dup folosire, iar portansa se va flamba prin cteva treceri scurte pe
deasupra flcrii becului de gaz;
c) toate recipientele de cultivare (cutiile Petri, eprubetele, vasele
Erlenmeyer etc.) i materialele contaminate se introduc dup terminarea lucrului
n recipientul special destinat colectrii acestor materiale care vor fi ulterior
sterilizate prin autoclavare;
d) pipetele i lamele din sticl, ce au fost deja utilizate, nu se
decontamineaz la flacr, ci se imerseaz, dup ntrebuinare, n recipiente
coninnd soluie dezinfectant, amplasate n centrul fiecrei mese de lucru;
e) pentru efectuarea operaiunii de pipetare se vor utiliza instrumente sau
dispozitive special destinate acestui scop, respectiv, pipete automate cu vrfuri
sterilizate prin iradiere gamma sau pipete din sticl, sterilizate n prealabil prin
cldur uscat la 180oC; este total interzis efectuarea pipetrii prin aspiraie i
pompare cu gura;
f) manipularea substanelor inflamabile i a celor caustice este realizabil
numai prin respectarea cu strictee a regulilor de protecie mpotriva accidentelor.
-
32
Capitolul III
PROGRAMA ANALITIC A SUPORTULUI DE CURS - TEMA 4:
METODE I TEHNICI MODERNE DE INVESTIGARE
MICROBIOLOGIC A APEI
3.1. Corelare competene coninuturi
TABEL DE CORELARE COMPETENE CONINUTURI
Nr. crt.
Unitatea de competen
Competene individuale
Coninuturi
CONTROLUL CALITII MICROBIOLOGICE A APEI
Preleveaz probele de ap n vederea analizei microbiologice
Dispozitive de prelevare : - recipiente de sticl, polietilen, pompe, aparat de prelevare automat, recipient pentru prelevarea la adncime. Pregtirea : - Sterilizarea Probe de ap : -probe simple, probe medii, probe de suprafa, probe de adncime, probe pentru determinarea oxigenului Conservarea, marcarea, transportul - reactivi de conservare, unde este cazul, pstrarea la temperaturi sczute, etichete - transport; lzi frigorifice, auto, Buletin de prelevare: - denumire ap, zon de prelevare, punct de prelevare, data si ora, modul de prelevare, aspectul probei in
-
33
momentul prelevrii, condiii meteorologice, modul de conservare, numele persoanei care a fcut prelevarea
Determin indicatorii microbiologici ai apelor naturale
Indicatori microbiologici: - bacterii mezofile, coliformi totali, fecali Determinarea microbiologic: - bacterii mezofile, coliformi totali, fecali conform metodelor de analiz Interpretarea rezultatelor - normele de calitate in vigoare
3.2. SUGESTII METODOLOGICE
Ordinea cronologic recomandat pentru parcurgerea coninuturilor este
cea din tabelul de corelare competene coninuturi, dar poate fi oricare alta, la
alegerea profesorului.
Se impune doar tratarea succesiv a coninuturilor corespunztoare
aceleiai competene.
Numrul de ore recomandat, orientativ, pentru aceste coninuturi este prezentat
n tabelul de mai jos
Nr. crt. Coninuturi Total ore
Ore instruire teoretic
Ore laborator tehnologic
1. Preleveaz probe de ap n vederea analizei microbiologice a) Alegerea dispozitivelor de prelevare a probelor de ap b) Pregtirea dispozitivelor de prelevare pentru analiza microbiologic
8
2
6
-
34
c) Recoltarea probelor de ap pentru analiza microbiologic d) Conservarea, marcarea i transportul probelor de ap e) ntocmirea buletinului de prelevare
2. Determin indicatorii microbiologici ai apelor naturale a) Caracterizarea indicatorilor microbiologici b) Determinarea indicatorilor microbiologici b)Interpretarea rezultatelor analizelor
8 2 6
TOTAL 16 4 12
Se precizeaz faptul c numrul de ore alocat fiecrei teme este
orientativ.
Se recomand ca procesul de predare nvare s se desfoare, fie n
laboratoarele de microbiologie ale unor instituii specializate, fie la diferii ageni
economici sub ndrumarea profesorului de specialitate.
Colaborarea cu ageni economici de profil este deosebit de important
pentru parcurgerea acestui modul. Ageniile teritoriale de Protecia Mediului ar
putea fi, n acest caz, partenerii cei mai potrivii. Ideal ar fi ca aceste colaborri
s se materializeze n edine de practic la locul de munc n cadrul crora
cursanii s execute aceste tipuri de determinri, familiarizndu-se cu modul
specific de recoltare a probelor i cu echipamentele moderne utilizate pentru
efectuarea determinrilor specifice.
Dac, ns, acest lucru nu este posibil orele se pot desfura sub forma
vizitelor n cadrul crora cursanii pot doar s asiste la efectuarea acestor
determinri.
-
35
n demersul didactic se vor utiliza fie de lucru sau fie de observaie,
aplicnd metodele didactice precizate anterior.
La sfritul fiecrei determinri practice fiecare cursant i va ntocmi
propriul referat al lucrrii, referat care poate fi utilizat de ctre profesor ca
instrument de evaluare curent.
De asemenea, referatele pot fi utilizate pentru ntocmirea de ctre cursani
a unor portofolii sau proiecte utilizate, de asemenea, pentru evaluarea acestora.
Rolul profesorului este de a supraveghea atent activitatea cursanilor, de
a-i ndruma pe acetia i de a corecta, atunci cnd este cazul greelile acestora.
n scopul formrii competenelor prevzute de program, se recomand
utilizarea unor metode de predarenvare interactive cum ar fi: nvarea prin
descoperire, problematizarea, joc de rol, studiul de caz, proiecte de lucru,
portofolii etc.
Strategiile de predare presupun alegerea metodei n funcie de obiectivele
propuse. Alegerea tehnicilor de instruire revine profesorului, care are sarcina de
a individualiza i de a adapta procesul didactic la particularitile specifice
fiecrui cursant.
Profesorul are libertatea de a alege metodele i tehnicile didactice i de a
propune noi activiti de nvare n msur s asigure formarea competenelor
specifice prevzute de program.
Exersarea abilitilor-cheie se va realiza ori de cte ori este posibil pe
parcursul instruirii, cnd coninuturile i activitile de nvare o permit.
Evaluarea trebuie s fie corelat cu criteriile de performan i cu tipul
probelor de evaluare care sunt precizate n Standardul de Pregtire Profesional.
Cursanii trebuie evaluai numai n ceea ce privete dobndirea competenelor
specificate n cadrul suportului de curs.
Chiar dac se exerseaz i alte competene-cheie n procesul de predare-
nvare, trebuie precizat faptul c se va evalua numai competena-cheie
prevzut n suportul de curs. O competen se evalueaz numai o singur
dat.
-
36
Principala metod de evaluare a competenelor specifice menionate n
acest suport de curs este proba practic.
Pe lng aceasta se mai pot utiliza: observarea sistematic, proiectul,
portofoliul, tema n clas, autoevaluarea.
Probele de evaluare i autoevaluare se pot concepe sub form de fie de
observare, fie de autoevaluare, fie de evaluare.
Exemplu de fi de observare :
3.3. FI DE OBSERVARE Numele i prenumele cursantului : Data verificrii : Numr de nregistrare : Timp de lucru : Numele i prenumele evaluatorului : Semntura evaluatorului :
Rezultat Feed-back
Modulul : Controlul calitii apelor naturale Competena 1 : Preleveaz probe de ap n vederea analizei microbiologice Criterii de performan :
a) Alegerea dispozitivelor de prelevare a probelor de ap
b) Pregtirea dispozitivelor de prelevare pentru analiza microbiologic
c) Prelevarea probelor de ap pentru analiza microbiologic
d) Conservarea, marcarea i transportul probelor de ap
e) ntocmirea buletinului de prelevare
Instruciuni pentru cursant :
Citii cu atenie sarcinile de lucru ;
-
37
Solicitai lmuriri evaluatorului n cazul unor neclariti la cerinele din sarcinile de
lucru
Asigurai-v de existena instrumentelor materialelor i echipamentelor necesare
rezolvrii sarcinilor de lucru
Asigurai-v de ndeplinirea condiiilor de protecia i securitatea muncii precum
i de existena echipamentului specific de protecia muncii
Deplasai-v pe teren pentru ndeplinirea sarcinilor de lucru
Sarcini de lucru :
Preleveaz probe de apa din rul Arge respectnd etapele prelevrii
Evaluatorul pune la dispoziia cursantului materiale i reactivi, din care cursantul
i alege cele necesare
Not:
Pentru fiecare criteriu de performan se elaboreaz sarcini de lucru. Realizarea
acestora de ctre cursani se marcheaz prin bifarea csuelor respective
Nr.
probei
Etapele prelevrii Evaluator Data
1. Alegerea dispozitivelor de prelevare a probelor de
ap
2. Pregtirea dispozitivelor de prelevare pentru analiza
microbiologic
3 Prelevarea probelor de ap pentru analiza
microbiologic
4 Conservarea, marcarea i transportul probelor de ap
5 ntocmirea buletinului de prelevare
-
38
Capitolul IV
TEHNICI DE STERILIZARE A USTENSILELOR I A
MATERIALELOR CONSUMABILE N LABORATORUL DE
MICROBIOLOGIE
Distrugerea microorganismelor sau sterilizarea este indispensabil pentru
pregtirea materialului de lucru i a mediilor de cultivare.
Un produs este considerat steril cnd nu mai conine microorganisme ce
se pot revitaliza.
Exist mai multe procedee de sterilizare care corespund diferitelor tipuri
de materiale ce trebuie tratate. n laboratorul de microbiologie pentru analize de
rutin, cldura reprezint modalitatea de sterilizare cea mai frecvent
ntrebuinat.
4.1. Procedee de sterilizare a ustensilelor i mediilor nutritive de cultivare a
microorganismelor
Sterilizarea prin cldur
Cldura umed
Sterilizarea prin cldur umed se efectueaz n autoclavul cu aburi prin
procedeul de autoclavare.
-
39
Principiu: n atmosfera de vapori de ap sub presiune, toate bacteriile
(inclusiv formele sporulate) sunt omorte dup 20 minute la 1210C. Aceasta este
metoda cea mai eficient de sterilizare.
Autoclava permite:
- pregtirea materialului (medii de cultur, diferite obiecte) n vederea
utilizrii n laborator, prin distrugerea microorganismelor;
- decontaminarea materialelor dup folosirea n laborator (cel puin 30
minute la 1210C).
Microorganismele din produsele patologice, eantioanele de ap i
produse alimentare analizate, din culturile microbiene de laborator etc, trebuie
neaprat distruse.
Aceste dou operaii ar trebui efectuate de preferin n dou autoclave
diferite sau, cel puin,n mod separat.
Timpul de sterilizare
In tabelul 1, sunt prezentai parametrii de sterilizare doar pentru obiecte,
medii de cultur sau alte substane ce trebuie sterilizate n autoclav pentru
analizele de rutin.
Tabelul 1
Parametrii de sterilizare pentru obiecte, medii nutritive i substane auxiliare
Materialul sterilizat Temperatura
(0C)
Presiunea
(barr)
Timp (minute)
Sticlrie curat 121 1 20
Ap , ser fiziologic 121 1 20
Parafin 121 1 20
Sruri minerale 121 1 20
Medii curente (bulion nutritiv,
geloz nutritiv)
121 1 15 - 20
Lapte degresat 115 0,7 15
-
40
Medii cu substane termolabile
(ex. glucide)
110 0,5 20
Glucoz n soluie 110 0,5 20
Controlul eficienei sterilizrii prin autoclavare este realizat adesea cu
ajutorul unor indicatori de sterilizare cum sunt hrtiile indicatoare: sunt
comercializate benzi de hrtie special imprimate pentru a vira culoarea dac au
fost ndeplinite condiiile de sterilizare.
Pasteurizarea
Sterilizarea trebuie s fie deosebit de pasteurizare, care reprezint doar
un procedeu de conservare utilizat n industria alimentar.
Pasteurizarea const n tratarea produsului la o temperatur n domeniul
560C - 850C, o durat variabil de la cteva minute pn la o or, n mediu
umed, n funcie de produs.
n aceste condiii, majoritatea celulelor vegetative bacteriene sunt distruse,
dar nu i formele sporulate.
Tyndalizarea
Tyndalizarea const n 2 - 3 pasteurizari repetate, alternate cu perioade n
care proba este meninut n condiii favorabile pentru germinarea endosporilor
bacterieni, care devin vulnerabili trecnd n stare vegetativ i sunt distrui prin
pasteurizare.
Acest procedeu de sterilizare se poate realiza n baie de ap, de exemplu,
n urmtoarele condiii: nclzire la 560C (pn la 800C) timp de 1 or, 3 - 7 zile
consecutiv, cu un interval de 24 de ore.
Tyndalizarea se poate folosi pentru distrugerea microorganismelor n
mediile ce conin substane termolabile.
-
41
Cldura uscat
Sterilizarea prin cldur uscat se efectueaz n sterilizatoarele cu aer
cald (etuve).
Cldura uscat nu poate distruge bacteriile i n special sporii bacterieni,
dect la o temperatur mai ridicat ca n cazul cldurii umede. Tratamentul
pentru sterilizare cu cldur uscat este de 4 ore la 1400C sau 1 or la 1800C.
Un alt procedeu de sterilizare prin cldur uscat este flambarea, care
se efectueaz n flacra becului de gaz pentru: extremitatea firului ansei,
exteriorul pipetelor, gtul eprubetelor i al flacoanelor.
Sterilizarea prin filtrare
Filtrarea const n trecerea unui produs lichid printr-un perete poros sau o
membran care reine bacteriile. Se pot utiliza filtre de portelan (Chamberland),
de sticl poroas sau membrane tip Millipore, cu pori de diferite dimensiuni.
Sterilizarea prin gaze toxice
Oxidul de etilen, de exemplu, este foarte utilizat pentru sterilizarea
materialului medico-chirurgical, a materialelor din plastic numite sterile, de unic
folosin din industrie.
Sterilizarea cu ajutorul radiaiilor
Radiaiile ultraviolete - sunt radiaii cu utilizare curent n laboratorul de
microbiologie; ele sunt bactericide, dar nu distrug sporii bacterieni. Acest tip de
radiaii acioneaz n mod direct i au putere de penetraie sczut (civa
milimetri). Lmpile germicide al cror efect se bazeaz pe aciunea radiaiilor
UV cu lungimea de und de 254 nm sunt utilizate :
- pentru sterilizarea apei
- pentru sterilizarea incintelor i a aerului ambiant
-
42
Radiaiile gamma
Radiaiile gamma fac parte din categoria radiaiilor ionizante i au un efect
puternic microbicid. Sunt dificil de produs i de utilizat i foarte periculoase
datorit efectelor pe care le au asupra materiei vii.
Acest tip de radiaii poate fi utilizat n sterilizarea materialului medical i
microbiologic de folosin unic sau pentru sterilizarea unor deeuri.
4.2. Pregtirea i sterilizarea sticlriei n laboratorul de analize
microbiologice
Pregtirea i sterilizarea materialului n vederea utilizrii n laboratorul de
microbiologie este o operaie deosebit de important deoarece exactitatea
rezultatelor precum i reuita desfurrii proceselor microbiologice depind n
mare msur de rigurozitatea cu care se efectueaz.
Principalele operaii de pregtire a sticlriei de laborator sunt:
- splarea
- uscarea
- executarea dopurilor i ambalarea - recipientele pot fi pregtite cu dop
din vat hidrofob pentru a nu pstra umezeala dup autoclavare. Din ce n ce
mai folosite sunt dopurile din celuloz comprimat (comercializate), sterilizabile
pan la 2000C. Pentru nlocuirea eprubetelor cu dop de vat, n scopul pstrrii
optime a culturilor, se pot utiliza tuburi prevzute cu capsule care se monteaz
prin nurubare.
Pentru evitarea contaminrii mediilor de cultur utilizate n analiza
microbiologic sau n obinerea culturilor microbiologice, sticlria de laborator
trebuie ambalat i sterilizat corespunztor.
Sterilizarea se efectueaz la etuv (sau pupinel), iar materialele supuse
acestei operaii trebuie s fie curate i mpachetate n hrtie sau aezate n
conteinere metalice nchise.
Sterilizarea uscat se poate aplica pentru articole din sticl (plci Petri,
baloane, pipete, eprubete), obiecte din porelan, instrumentar metalic fr suduri
-
43
n cositor, pulberi uscate etc. Aerul fiind slab conductor de cldur, sterilizatorul
trebuie s uniformizeze temperatura i s asigure ptrunderea aerului fierbinte n
obiectele de sterilizat.
n calcularea timpului de sterilizare uscat trebuie avute n vedere
urmtoarele etape:
perioada de nclzire la temperatura de sterilizare, socotit n general o or;
perioada de meninere a temperaturii de sterilizare;
perioada de rcire n care scderea temperaturii trebuie realizat treptat pentru
evitarea spargerii obiectelor de sticl prin oc termic, aprox. 2 ore.
n practic se procedeaz la alegerea unei temperaturi de sterilizare de
180o C i a unei durate de o or. Din exces de pruden se practic sterilizri la
temperaturi mai ridicate sau de durate mai mari. n unele cazuri aceast practic
este duntoare deoarece, de exemplu, vata ordinar - la durate i temperaturi
mari de sterilizare uscat - elibereaz gudroane ce pot inhiba creterea
microbian.
Materiale utilizate:
- pipete;
- plci Petri;
- eprubete;
- flacoane Erlenmayer;
- vat hidrofob;
- tifon;
- hrtie ambalaj;
- etuv.
Mod de lucru:
Se confecioneaz dopuri de vat hidrofob pentru eprubete, astfel nct
s poat fi extrase uor n timpul inoculrii, iar densitatea materialului s asigure
sterilitatea. Eprubetele se introduc in coul de srm i se acoper cu hrtie.
-
44
Pipetele se astup la partea opus vrfului, cu un dop subire de vat care
s rein microorganismele ce ar putea ptrunde n pipet pe la partea
superioar. Pipetele se ambaleaz ntr-o fie de hrtie care se rsucete n
jurul tubului de sticl, ncepnd de la vrf.
Plcile Petri se ambaleaz n hrtie de ambalaj, n funcie de numrul
necesar. Flacoanele Erlenmayer pentru medii de cultur se astup cu dop de
vat nfurat n tifon.
Toat sticlria se sterilizeaz timp de 1 or la 180oC n etuv, perioad
calculat din momentul atingerii temperaturii. Dup aceast perioad etuva se
oprete i se ateapt rcirea materialului.
-
45
Capitolul V
PREPARAREA I STERILIZAREA MEDIILOR NUTRITIVE DE
CULTIVARE A MICROORGANISMELOR
5.1. Prepararea i sterilizarea mediilor nutritive de cultivare
Un mediu de cultur reprezint un substrat nutritiv complex, steril, care
trebuie s asigure microorganismelor cantitatea necesar de ap, sursa de
carbon, de azot, sruri minerale, factori de cretere, deci care s le furnizeze
substanele i energia necesare n procesele de cretere, reproducere i
ntreinerea funciilor vitale.
Mediul de cultur trebuie s ndeplineasc urmtoarele condiii:
s corespund din punct de vedere nutritiv,
s aib o concentraie a substantelor dizolvate care s nu influeneze negativ
schimburile osmotice ale celulei
s nu conin substane toxice,
s aib un anumit pH
s fie steril (lipsit de microorganisme vii), astfel nct s se dezvolte numai
celulele introduse prin inocul.
Mediile de cultur se folosesc n practica de laborator sau n practica
industrial i sunt foarte difereniate n funcie de scopul urmrit.
-
46
n tehnicile de laborator, mediile se folosesc pentru izolarea din mediul
natural a diferitelor microorganisme, pentru obinerea de culturi pure, pentru
ntreinerea culturilor selecionate.
n scopuri industriale, mediile de cultur sunt utilizate pentru obinere de
biomas sau a unor compui de natur microbian.
Dup scopul utilizrii lor, mediile de cultur se mpart n:
* medii de cultur generale care asigur dezvoltarea unui mare numr de
specii
* medii de cultur selective care permit dezvoltarea unui numr restrns de
microorganisme
* medii de cultur de difereniere care permit separarea speciilor n funcie
de anumite caractere biochimice
* medii de mbogire destinate separrii i cultivrii unor microorganisme
pretenioase din punct de vedere nutritiv sau care se afl n numr redus
* medii de conservare
* medii de cultur industriale
Din punct de vedere al compoziiei chimice, mediile de cultur se mpart n
3 categorii:
* medii naturale (empirice) de origine animal sau vegetal, cu o
compoziie chimic nedefinit n mod exact;
* medii sintetice: acestea sunt soluii de substane chimice pure n ap
distilat, cu o compoziie perfect determinat;
* medii semi-sintetice: sunt constituite din produse chimice bine definite,
dar i din produse de origine natural (cu compoziie cunoscut).
Constituenii principali ai mediilor de cultur sunt:
1. Extracte de carne i macerate
Aceste produse, comercializate n form concentrat sub denumirea de
extracte de carne, conin n principal proteine puin hidrolizate, glucide, sruri
-
47
minerale, vitamine hidrosolubile. Compoziia lor variaz n funcie de carnea
utilizat pentru preparare.
2. Extracte de drojdie
Aceste extracte, comercializate sub form deshidratat, sunt preparate din
drojdia de bere, fiind utilizate ca surs de aminoacizi i de vitamine hidrosolubile
(vitamine din complexul B).
3. Peptone i hidrolizate
Peptonele reprezint un amestec de compui solubili n ap care provin n
urma aciunii enzimelor asupra materialului proteic.
Acestea pot fi: pepton pepsic din carne, pepton tripsic din cazein (cu
coninut crescut n triptofan), pepton pancreatic de cazein, pepton tripsic
de carne, pepton papainic de soia, peptone compuse.
Hidrolizatele sunt peptone obinute n urma aciunii compuilor anorganici
asupra proteinelor (acid clorhidric de ex.). Cel mai des ntrebuinat este
hidrolizatul acid de cazein, coninnd aminoacizii constitutivi ai cazeinei din
lapte.
4. Agar-agarul sau geloza
Agar-agarul denumit i geloz este un extract de alge roii
(Rhodophyceae) din genul Gelidium i Gracillaria, recoltate n mrile Japoniei
sau ale Noii Zeelande. Se dizolv n ap la o temperatur n jur de 900C i se
solidific sub 450C, fiind utilizat pentru solidificarea mediilor de cultur.
Agar-agarul nu este degradat de microorganismele obinuite i este
comercializat n forma sa iniial deshidratat, numit agar fibre (foarte impur),
sub form de paiete (mai puin impur), sau sub form de pulbere.
Numeroase firme sunt specializate n producerea i comercializarea
mediilor de cultur de laborator (firma Difco, Merck, Biokar, Oxoid).
-
48
Mediile fermentative sunt medii de cultur industriale destinate producerii
unor cantiti mari de celule sau produi de metabolism. n compozitia acestor
medii intr ca surse de carbon: melasa, produs secundar rezultat la fabricarea
zahrului i care conine 45 - 55% zaharoz, diferite tipuri de finuri, cereale
boabe, zer bogat n lactoz, tre etc.
Dintre sursele de azot cel mai des folosite sunt: finurile proteice de soia,
sulfatul de amoniu, ureea, ngrmntul complex. Ca sruri minerale se adaug
fosfai, sulfai, cloruri etc.
Pentru cultivarea microorganismelor care necesit factori de cretere, se
adaug extract de porumb (obinut prin concentrarea apelor rezultate la
nmuierea porumbului, bogat in aminoacizi, vitamine, acid lactic, microelemente),
extract de drojdie, extract din radicele de mal i germeni de gru i porumb.
5.2. Prepararea mediilor nutritive pentru cultivarea bacteriilor, drojdiilor i
mucegaiurilor
Materiale utilizate:
- balan cu precizie de 0,1 g;
- pahare Berzelius;
- sit azbest;
- agar nutritiv pulbere;
- mediu de cultur extract de mal - agar pulbere;
- mediu extract de cartof-dextroz-agar pulbere;
- eprubete cu dop, sterile;
- pipete de 10 ml;
- flacoane Erlenmayer;
- bec de gaz;
- autoclav electric automat
-
49
Mod de lucru:
Conform indicaiilor de pe flacoanele coninnd mediile de cultur
pulverulente, se vor cntri cantitile necesare pentru a obine cte 1 litru din
fiecare tip de mediu de cultur pentru eprubete i cte 300 ml mediu pentru
baloanele Erlenmayer.
n cazul n care nu exist medii deshidratate, procurate de la firme
specializate, mediile se vor prepara prin cntrirea componentelor pentru
volumul final dorit.
Mediul de cultur se aduce la fierbere n paharele Berzelius de 1 l, pn la
completa dizolvare a agarului, apoi se repartizeaz cte 10 ml n eprubete
sterile, prevzute cu dop de vat, care se aeaz n couri de srm i se
acoper cu hrtie. n mediu se determin pH-ul i, dac este necesar, se
ajusteaz la valoarea dorit.
Mediile cu agar nu trebuie s fie aduse la un pH mai mic de 6, deoarece
agarul este parial hidrolizat n timpul sterilizrii la pH acid i nu se mai solidific
la rcire. Cnd sunt necesare astfel de medii, pH-ul trebuie ajustat dup
sterilizare.
Baloanele Erlenmayer se astup cu dop de vat nvelit n tifon, se leag la
gur cu hrtie i srm subire oelit. Courile i baloanele Erlenmayer se
introduc n autoclava cu alimentare electric, iar sterilizarea se efectueaz
conform instruciunilor menionate n cartea tehnic a instalaiei de sterilizare.
Se verific nivelul apei n incinta de sterilizare, se nchide capacul, se
conecteaz la reeaua electric, se procedeaz la selectarea programului
automat de sterilizare i se ateapt nclzirea prin formarea de abur
supranclzit care, dup atingerea temperaturii de 100o C este eliminat prin
purjare, acesta antrennd spre exterior aerul rezidual, remanent n incinta de
sterilizare nc de la nceputul operaiunii de sterilizare.
Dup 1-2 minute de purjare se nchide robinetul, iar presiunea indicat de
manometru va urca pn la valoarea 1,1 unde va fi meninut timp de 15-20
minute de ctre sistemul automat de sterilizare al autoclavei .
-
50
ntre presiune i temperatura din autoclav exist o corelaie, aa cum se
prezint n tabelul urmtor:
Tabelul 2
Corelaia dintre temperatur i presiune n procesul de sterilizare
Temperatura n grade
Celsius
Presiunea
n kg/m3
Presiunea
n atmosfere
100 0,00 0,00
105 0,20 0,20
110 0,43 0,42
112 0,55 0,50
115 0,69 0,67
120 0,99 0,96
121 1,10 1,07
122 1,33 1,29
128 1,55 1,50
130 1,72 1,65
135 2,16 2,09
140 2,65 2,56
Dup acest interval de meninere a temeperaturii la valoarea de 121o C,
se ateapt scderea presiunii pe manometru, se deschide robinetul de purjare,
iar dup aproximativ 5-10 minute se poate deschide capacul autoclavei.
n general, mediile de cultur trebuie s ofere o suprafa de dezvoltare
suficient de mare pentru toate microorganisme. De aceea, dup sterilizare,
tuburile cu mediu de cultur se nclin pentru a se extinde la maximum suprafaa
de cretere.
-
51
nclinarea se face prin sprijinirea eprubetelor pe o baghet suficient de
groas, innd seama ca mediul negelificat s nu ating dopurile tuburilor de
sticl, ci s se opreasc la o distan de 2 - 3 cm fa de acestea.
Prin rcire, vaporii ce ies din mediul cald, se condenseaz pe pereii mai
reci ai eprubetelor i cad sub form de picturi pe mediu, colectndu-se la partea
inferioar a acestora. Din aceast cauz, eprubetele cu mediul rcit nu se
aeaz n poziie orizontal, ci doar vertical, n couri de srm, care se
acoper cu folie metalizat sterilizat n prealabil.
Pentru a nu se prepara n fiecare zi medii de cultur, sau, dac este
nevoie de mai multe tipuri de medii n acelai timp, acestea se pregtesc o
singur dat i apoi se depoziteaz pentru pstrare.
Sticlele cu medii de cultur se eticheteaz, notndu-se tipul mediului i
data preparrii. Pentru evitarea uscrii se recomand pstrarea mediilor nutritive
n frigider.
-
52
Capitolul VI
INOCULAREA I INCUBAREA PROBELOR MICROBIOLOGICE
6.1. Estimarea densitii populaiilor microbene
Numrarea microorganismelor se execut n mod frecvent n laboratorul de
microbiologie, n vederea aprecierii stadiului de multiplicare a celulelor din diferite
culturi folosite n industrie sau pentru determinarea gradului de contaminare a
unor produse, n special alimentare. Pentru a asigura o numrare rapid i n
acelai timp precis, innd cont c ncrctura microbian a diferitelor produse
i culturi poate s fie foarte ridicat, se recomand n prima etap s se
efectueze diluri ale produsului supus analizei microbiologice.
6.1.1. Tehnica obinerii diluiilor decimale
Dup recoltare, la omogenizarea probelor destinate analizei
microbiologice, se recomand ca raportul ntre produs i diluant s fie de 1:10,
obinndu-se astfel prima diluie (diluie 10-1). Pentru efectuarea urmtoarelor
diluii decimale, cu o pipet steril, se barboteaz lichidul pentru omogenizare ,
se recolteaz 1 ml din diluia I i se scurge lichidul n alt eprubet cu 9 ml ser
fiziologic steril, obinndu-se diluia a II-a (diluie 10-2) i se continu procedeul
pn la obinerea diluiei necesare. Gradul de diluare este condiionat de
-
53
numrul presupus de microorganisme din proba de analizat; cu ct numrul este
mai mare, cu att se fac mai multe diluii. Pentru majoritatea produselor sunt
suficiente 4 - 8 diluii succesive.
Cnd se face numrarea celulelor dintr-o anumit diluie considerat
corespunztoare, numrul obinut se multiplic cu coeficientul de diluie k,
pentru a obine numrul de celule existent n produsul iniial (pentru d I, k = 10,
pentru d II, k = 100 etc).
Pentru evitarea erorilor se recomand omogenizarea coninutului
eprubetelor n care s-a fcut diluarea fie prin rotirea eprubetei ntre palme, fie,
cu ajutorul pipetei sterile, prin barbotare, nainte de recoltarea volumului de 1 ml
destinat urmtoarei diluii. Se iau toate msurile de precauie pentru a evita
contaminarea cu microorganisme din mediul ambiant, lucrnd n zona de
protecie din jurul flcrii becului de gaz i respectnd regulile de manipulare.
1 ml 1 ml 1 ml 1 ml
Suspensie iniial 1: 10 1 : 100 1 : 1000 1 : 10000
Fig.1. Schem reprezentativ pentru tehnica de obinere a diluiilor
decimale
Dup efectuarea diluiilor decimale, numrarea microorganismelor se poate
realiza prin metode directe, cu ajutorul camerelor de numrare sau prin metode indirecte.
-
54
6.2. Inocularea culturilor microbiene
Principiul metodei:
Microorganismele pot fi cultivate pe medii de cultur n plci Petri sau n
tuburi, att pentru studiul lor, pentru conservarea lor prin refrigerare, ct i pentru
obinerea culturilor stoc i de lucru, n diversele procese biotehnologice. Operaia
de trecere a unei culturi dintr-un vas de cultur n altul se numete repicare sau
trecere, iar fragmentul de cultur ce se trece pe alt mediu se numete
inoculum.
n jurul flcrii becului de gaz exist o zon steril cu diametrul de
aproximativ 20 cm, n lipsa curenilor de aer.
Toate manipulrile care necesit deschiderea recipientelor sterile
sau coninnd culturi trebuie efectuate n aceast zon de protecie.
6.2.1. Inocularea n eprubete (tuburi)
Materiale utilizate:
- culturi de Bacillus subtilis pe agar nutritiv;
- culturi de Saccharomyces cerevisiae pe mediul extract de mal - agar;
- culturi de Monascus purpureus, Aspergillus niger i Penicillium notatum pe
mediul extract de cartof - dextroz - agar;
- ans de inoculare;
- bec de gaz;
- eprubete cu mediu sterilizat i nclinat (nutrient-agar, extract de mal-agar,
extract de cartof-dextroz-agar);
- termostat la 30 oC;
- lamp bactericid.
-
55
Mod de lucru:
6.2.1.1. Inocularea cu ansa
Se terge suprafaa din interiorul niei de lucru cu un tampon mbibat cu
alcool 95%. Se aprinde lampa bactericid i se las 15 minute pentru
sterilizarea incintei de lucru. Se spal minile cu spun, apoi se cltesc cu alcool.
Se aprinde becul de gaz i se regleaz flacra, care trebuie s aib conul de
culoare albastr.
Se ine eprubeta n care exist cultura ce trebuie repicat cu mna
stng, n poziie oblic sau chiar orizontal. n mna dreapt se ine acul de
repicat. Acesta se arde n flacra becului de gaz, inndu-l n poziie vertical
pentru ca flacra s cuprind o poriune ct mai mare din el. Se ine n flacr
pn ce mai mult de jumtate din ac se nroete, apoi se plimb de 2 -3 ori i
restul acului pn la mner, n flacr.
Dup aceea se apropie gura eprubetei de flacr i, cu degetul mic de la
mna dreapt ndoit, se trage afar dopul de vat din gura eprubetei, apucndu-l
de captul rmas afar. Nu i se d drumul dopului pe mas sub nici un motiv, ci
se ine tot timpul n mn. Se trece gura eprubetei de 2 -3 ori prin flacr. Se
introduce acul fierbinte n eprubet i se rcete, nu n cultur, ci alturi, pe o
poriune de agar fr cultur. Se ia apoi o foarte mic poriune (de 1 - 2 mm) din
cultur pe vrful acului (se alege poriunea cea mai tipic i mai curat a culturii
respective).
Se scoate acul din eprubet, se arde din nou gura eprubetei i se astup
cu dopul de vat din mna dreapt. Se las jos eprubeta i se ia, tot cu mna
stng, o alt eprubet cu mediu steril.
Acul de repicat cu fragmentul de cultur, se ine mai departe n mna
dreapt ferindu-l acum de flacr.
Se procedeaz cu eprubeta a doua la fel cum s-a procedat cu prima,
adic: se ine n poziie orizontal sau putin oblic n mna stng, se scoate
-
56
dopul cu degetul cel mic de la mna dreapt ndoit, inndu-se tot timpul
operaiei de repicare n mn. Se trece gura eprubetei prin flacr, se introduce
acul de repicare cu fragmentul de cultur, atingnd uor mediul (n centrul
eprubetei), pn ce bucica de cultur rmne pe mediu. Uneori este bine ca
fragmentul de cultur s fie puin afundat n mediu, pentru a face un contact mai
strns cu el.
Se scoate acul de repicat din eprubet, se arde din nou gura eprubetei i
se astup cu dopul din mna dreapt. Se trece i captul dopului care a fost
inut cu mna prin flacr, dar foarte rapid.
Se arde din nou acul n flacr pan la rou. Aceast operaie este
absolut necesar i trebuie fcut cu rbdare, pentru a se evita infectarea
mediilor urmtoare. Dup arderea acului se ia din nou eprubeta cu cultura ce
trebuie repicat i se repet operaia de repicare cu o alt eprubet steril.
Toate micrile descrise mai sus, din care const operaia de repicare,
trebuie executate destul de repede pentru a nu permite infectarea mediilor sterile
din eprubete. Ele trebuie fcute cu o oarecare ritmicitate i nu prelungite prea
mult. De asemenea trebuie respectate o serie de indicaii, care la prima vedere
par minore, dar de care depinde foarte mult reuita unei repicri.
Astfel, trebuie avute n vedere:
-inerea eprubetei n poziie orizontal n timpul repicrii pentru a evita cderea
sporilor de ciuperci i bacterii din atmosfer pe mediu;
-inerea acului de repicat n poziie vertical n flacr i nu orizontal, pentru ca
arderea s se fac pe o poriune ct mai mare;
-scoaterea dopului de vat cu degetul mic al minii drepte i inerea lui tot timpul
n mn, pentru a-l feri de contaminri secundare;
-arderea gurii eprubetei la scoaterea i introducerea dopului de vat, deoarece
pe marginile exterioare ale eprubetei pot exista germeni de infecie secundar.
Dup dezvoltarea culturii se observ aspectul , culoarea, tipul coloniilor,
precum i eventuala prezen a contaminrii cu alte microorganisme.
-
57
6.2.1.2. Inocularea cu pipeta Pasteur sau cu pipeta gradat
Pentru pregtirea pipetei Pasteur, se ia un tub de sticl obinuit, cu
diametrul exterior de 6 mm i cel interior de 4 mm, care se taie la o lungime de
25 cm, se rotunjesc marg