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CursodeBiologíaMolecularyGenómicaparaprofesoresdeEnseñanzaMedia2018
Dr.MarceloAntonelliProgramadeBiologíaCelularyMolecularICBMFacultaddeMedicinaUniversidaddeChile
ENERO2018
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TemariodelaClaseParte1-Elcódigogenético-SíntesisdeproteínasParte2-Ingenieríagenética-Genotecas-Vectoresdeexpresión-Animalestransgénicos
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Parte1:Elcódigogenéticoylabiosíntesisdeproteínas
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Flujodelainformación
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Síntesisdeproteínas
• mRNA
• Ribosomas
• aatRNA
• energía
• enzimasyfactores
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HipótesisdelAdaptador
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EstructuradelRNAdetransferencia(tRNA)
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EstructuradeltRNA
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ElCódigoGenético
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CÓDIGOGENÉTICO20aa64codones
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• Nosesuperpone
• Notienepuntuación
• Seleedecorrido
• Noesambiguo
• Esdegeneradooredundante
• Esuniversal
Característicasdelcódigogenético
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Elcódigogenéticonoesambiguoyesdegenerado
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• Nosesuperpone
• Notienepuntuación
• Seleedecorrido
• Noesambiguo
• Esdegeneradooredundante
• Esuniversal
Característicasdelcódigogenético
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EnrealidadelCódigoGenéticonoesUniversal
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Cisteina
Selenocisteina
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¿CuántostRNAssenecesitanparalasintesisdelasproteínas?
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LateoríadelbalanceodeterminaelnúmerodecodonesquepuedereconoceruntRNA
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Serequiereunminimode32tRNAsparatraducirlos61codones(31codonesparalosaminoácidosyunoparalainiciación).
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Aminoacil-tRNAsintetasas
• EnzimasquecatalizanlaunióndeunaminoácidoauntRNA(activacióndelosaminoácidos)
• Sonespecíficasparacadaaminoácido
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Gln-tRNAsintetasa
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Formacióndelenlacepeptídico
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Reaccióndeactivacióndelaminoácido
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ReaccióndeaminoacilaciónocargadeltRNA
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ReaccióndeaminoacilaciónocargadeltRNA
• Fidelidaddelatraducción
• Conservacióndelaenergía
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Aminoacil-tRNA
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Latraducciónrequierelaparticipacióndeestructurascomplejasvisiblesaniveldelmicroscopioelectrónico……..
RibosomasESTRUCTURASDE
RNAyPROTEÍNA
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Ribosomasbacterianos
versus
Ribosomaseucarióticos
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Síntesisdeproteínasenprocarióntes
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VisualizaciónsubunidadesribosomalesporMET
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Acoplamientotranscripción-traducciónenbacterias
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LecturadelmRNA5’3’
SíntesisNH3
+COO-
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Reconocimientodelsitiodeiniciodelatraducciónenbacterias
SecuenciadeShineDalgarno
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OtrosCodonesdeinicio:-Bacterias(E.coli)GUGyUUG-Eucariotes muyraroquenoseaATG
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Arquitecturadelribosomabacteriano:
rRNA16S
ShineDalgarno
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Iniciodelasíntesisdeproteínas
§ Subunidadribosomalmenor
§ factoresdeiniciación
§ mRNA
§ formilmetionil-tRNA
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Subunidad30SdelRibosomadeE.coli
zonadecontactoconelmRNArRNA
Proteínasribosomales
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SUBUNIDAD50SDELRIBOSOMA
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Elongación
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Formacióndelenlacepeptídicoenelribosoma
PeptidiltransferasarRNA23S
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rRNA23S:estructurasecundaria
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Traslocación
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Términodelasíntesisdeproteínas
actividadpeptidilhidrolasa
RF=releasingfactor
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Elongación
Bacterias Eucariontes
EF-Tu eEF1α
EF-Ts eEF1βγ
EF-G eEF-2
Término
Bacterias Eucariontes
RF1 RF
RF2
RF3
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LastresfuncionesdelRNAenlasíntesisdeproteínas
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GENPROCARIONTE
Transcripción
mRNA
Términodelatranscripción+1
Iniciodelatranscripción
regiónreguladora
Traducción
proteína
regióncodificante
AUG Codóndetérmino
3’5’
ShineDalgarno
+1
promotor
5’UTR3’UTR
ATG
DNA
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EstructuradelosGenesydelmRNAenEucariontes
+1
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EUCARIONTE
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Ensamblajedelosribosomasencélulaseucariontes
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eIF4FisoftenusedtorefertothecomplexofeIF4A,eIF4E,andeIF4G.
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Regulatingcap-dependenttranslationinitiation.Therecruitmentofthe40Sribosomalsubunittothe5ʹendofmRNAisacrucialandrate-limitingstepduringcap-dependenttranslation.
IniciodelatraducciónenEucariontes
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Síntesisdeproteínaseneucariontes
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Síntesisdeproteínaseneucariontes
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Síntesisdeproteínaseneucariontes
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Síntesisdeproteínaseneucariontes
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Síntesisdeproteínaseneucariontes
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Síntesisdeproteínaseneucariontes
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Síntesisdeproteínaseneucariontes
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Síntesis de proteínas en eucariontes
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Síntesis de proteínas en eucariontes
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Síntesis de proteínas en eucariontes
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Parte2:DNARECOMBINANTEEINGENIERÍAGENÉTICA
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EstructuradelosGenesydelmRNAenEucariontes
+1
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INGENIERÍAGENÉTICA
MANIPULACIÓNDELDNADELOSORGANISMOSVIVOS
1) INVESTIGACIÓNBÁSICA(ESTUDIODELAORGANIZACIÓN,EXPRESIÓNYFUNCIÓNDEGENESENLOSORGANISMOSVIVOS).2) APLICACIÓN DE ESTE CONOCIMIENTO EN LA MANIPULACIÓNCONSCIENTEDELOSGENESENSALUD,ENLAINDUSTRIADEALIMENTOS,ENLAAGRICULTURA,ETC.
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PIEDRASANGULARESDELAINGIENIERÍAGENÉTICA
1. ENDONUCLEASASDERESTRICCIÓN(ENZIMASDERESTRICCIÓN)
2. REACCIÓNDEPOLIMERIZACIÓNDECADENAOPCR(POLYMERASECHAINREACCTION)
3. GENOTECASGENÓMICASYDEcDNA
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TécnicasdeDNARecombinante
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ELOBJETIVODELATECNOLOGIADELDNARECOMBINANTEes…………………
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AislarsecuenciasdeDNAquecontengangenesyobtenermúltiplescopiasdeellos
para…………..
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1. Conocersuestructuramolecular
2. Estudiarsufunciónbiológica
3. Manipularlos
4. Transferirlosdeunorganismoaotro⇒IngienieríaGenética
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TÉCNICAS§ CLONAMIENTOMOLECULAR
§ PCR(reacciónencadenadelapolimerasa)
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CLONAMIENTODEUNGEN
ETAPAS1) ObtencióndelfragmentodeDNAdeinterésmediantePCR(Gen).
2) Uniónaunvector(DNAvehículo):ObtencióndeDNArecombinante.
3) Introducciónenunacélulahospedera(Objetivo:perpetuarloyamplificarlo).
4)Rastreo(screening):Identificacióndecoloniasquecontienenel
DNArecombinantedeinterés.
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ClonamientodeunGen
DNAVector FragmentodeDNA
AmplificacióndelDNAencélulahospedera
IdentificaciónyaislamientodelfragmentodeDNA
DNArecombinante
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ClonamientoporPCR
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ReaccióndePolimerasaenCadena(PCR)
u Técnica utilizada en la detección yclonamientodegenesdeinterés.
u DiagnósticoClínico.
u MedicinaForense.
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![Page 90: Curso de Biología Molecular y Genómica para profesores de ... · 5’ 3’ Shine Dalgarno +1 promotor 5’ UTR 3’ UTR ATG DNA Estructura de los Genes y del mRNA en Eucariontes](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022050718/5e17603895358446205a8490/html5/thumbnails/90.jpg)
![Page 91: Curso de Biología Molecular y Genómica para profesores de ... · 5’ 3’ Shine Dalgarno +1 promotor 5’ UTR 3’ UTR ATG DNA Estructura de los Genes y del mRNA en Eucariontes](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022050718/5e17603895358446205a8490/html5/thumbnails/91.jpg)
![Page 92: Curso de Biología Molecular y Genómica para profesores de ... · 5’ 3’ Shine Dalgarno +1 promotor 5’ UTR 3’ UTR ATG DNA Estructura de los Genes y del mRNA en Eucariontes](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022050718/5e17603895358446205a8490/html5/thumbnails/92.jpg)
CLONAMIENTODEUNPRODUCTODEPCR
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HERRAMIENTASBÁSICAS• Enzimasderestricción
CLONAMIENTOMOLECULAR
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Enzimasde
Restricción
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DIGESTIONDELDNAPORENZIMASDERESTRICCION
![Page 96: Curso de Biología Molecular y Genómica para profesores de ... · 5’ 3’ Shine Dalgarno +1 promotor 5’ UTR 3’ UTR ATG DNA Estructura de los Genes y del mRNA en Eucariontes](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022050718/5e17603895358446205a8490/html5/thumbnails/96.jpg)
Sitiodecorteenzimasderestricción
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HERRAMIENTASBÁSICAS
• Vectores
CLONAMIENTOMOLECULAR
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PLASMIDIODECLONAMIENTO
*Origendereplicaciónautónomo*Marcadordeselección*Sitiosúnicosderestricción
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HERRAMIENTASBÁSICAS
• DNAligasa
CLONAMIENTOMOLECULAR
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Ligacióndefragmentosderestricciónconextremoscohesivos
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![Page 103: Curso de Biología Molecular y Genómica para profesores de ... · 5’ 3’ Shine Dalgarno +1 promotor 5’ UTR 3’ UTR ATG DNA Estructura de los Genes y del mRNA en Eucariontes](https://reader033.vdocuments.pub/reader033/viewer/2022050718/5e17603895358446205a8490/html5/thumbnails/103.jpg)
ClonamientoDirigido
Ligacióndeextremoromo
Ligacióndeextremocohesivo
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HERRAMIENTASBÁSICAS
• Célulashospederas
CLONAMIENTOMOLECULAR
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PROPAGACIONENCELULAHUESPED
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¡Sepuedencomprar¡
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Recordarsiemprecolocarlesitiosderestricciónalospartidoresparapoderclonarelfragmentoenunplasmidio
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fragmentodePCR
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EstudiodelaFuncióndeunGen
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HerramientasdeEstudio:
u Análisiscomputacionalenbancodedatos:homologíadesecuenciaconungendeotroorganismocuyafunciónseconoce.
u Animalestransgénicos.
u Expresiónenbacteriasycélulaseucariontes.
u Mutagenesis
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Vectordeexpresiónenbacterias
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u AmplificacióndelgendeinterésporPCR.
u Clonamientoenvectordeexpresión.
u Induccióndelaexpresióndelgendeinterésenbacterias.
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Intervenciónenlabiologíaanimal:
Transgénesis
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¿Quéesunanimaltransgénico?
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Unanimal transgénicoesunoqueportaun genquehasidodeliberadamenteinsertadoensugenoma.
El gen extraño es construído e insertado utilizandometodologíadeDNArecombinante.
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Además el DNA del gen a ser incorporado debe incluirotrassecuenciasquelocapacitenpara:
-Serincorpordoenelgenomadelhospedante-Ser expresado correctamente por las células delhospedante.
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¿CómogenerarunanimaltransgénicoenelLaboratorio?
Método1:Inyecciónalpronúcleomasculino
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Laconstrucciónlinearizadaesinyectadaenelpronúcleomasculino
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TransgénicosdelgenSry(TDFenhumanos)
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RATONES TRANSGENICOS El gen de la hormona de crecimiento se ha modificado geneticamente para que
se exprese en gran cantidad .
El promotor de metallothionein es regulado
por metales Ratones alimentados con metales
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Conclusiones:
-Integraciónmuytempranaeneldesarrollo.
-Antesdeladivisióndelaprimeracéluladelcigoto.
-Antes de que la población de células germinalessegregadelascélulassomáticasprimordiales.
-Integración estable en las celulas somáticas ygerminales.-TransmiciónMendelianadelgentransgénico.
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Método2:Transferencianuclear
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Dolly
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Animalestransgénicosproducidosportransferencianuclear
GeneX
X
transfección
transducción
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GeneXX
x
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Transgénicosdelactoferrinaenbovino
u Utilizarlalechedelganadobovinocomo“reactor”paragenerargrandescantidadesdeunaproteínahumanadeinterésbiológico
Promotordecaseina
u Interésglobaldelaindustriaalimenticia
Ej:Transgénicosdelactoferrinahumana
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Fin