Dr n.przyr. Ewa Chmara
CZYNNIKI GENETYCZNE WPŁYWAJĄCE NA DZIAŁANIE LEKÓW
Farmakogenetyka - kerunek badań koncentrujący się na:
- dziedzicznie uwarunkowanych różnicach w działaniu leku, a także ich przyczynach na
poziomie molekularnym;
- znaczeniu klinicznym zmienionego działania leku;
- testach umożliwiających identyfikację zagrożonych pacjentów przed rozpoczęciem leczenia
(terapia celowana);
- poszukiwaniu genów oporności;
- mutagennym działaniu leków i ksenobiotyków
„ Głównym celem farmakogenetyki jest zapewnienie pomocy w podawaniu i dawkowaniu
chorym takich leków, których stosowanie stwarza największe prawdopodobieństwo
odniesienia korzyści terapeutycznych i najmniejsze prawdopodobieństwo wystąpienia
reakcji niepożądanych”.
Farmakogenetyka wychodziła od nietypowej reakcji na lek, aby
przez badanie fenotypu dotrzeć do odpowiedzialnej za tę reakcję
mutacji genu.
Farmakogenomika jest próbą odwrócenia podejścia do problemu
odmienności osobniczych:
Wychodzi od odkrytych wielu różnic genetycznych, takich jak liczne SNP, aby
poprzez analizę DNA, RNA (transkryptomika) i powstającego białka (proteomika)
dotrzeć do osobniczych reakcji będących sumą tych wszystkich czynników.
Efekt farmakologiczny zależy od:
genetycznie uwarunkowanej aktywności enzymów metabolizujących leki (procesy I i II
fazy biotransformacji)
ekspresji genów kodujących białka biorące udział w mechanizmie działania leków
(receptory, kanały jonowe, transportery neuroprzekaźników)
ekspresji genów kodujących białka transporterów dla leków (gen ABCB1 kodujący
glikoproteinę P)
Procesy farmakokinetyczne determinowane genetycznie:
1. Wchłanianie
2. Dystrybucja
3. Metabolizm
4. Wydalanie
Molekularne mechanizmy polimorfizmu genetycznego mogą polegać na:
Mutacji pojedynczego nukleotydu SNP (Single Nucleotide Polymorphism)
Mutacjach dotyczących całego genu, jego fragmentu, zwielokrotnienia,
powtórzenia nukleotydu (haplotypy)
Bazy danych NCBI
NCBI (National Center for Biotechnology Information)
bazy danych są ze sobą powiązane poprzez unikalny system wyszukiwania i pobierania, zwany
Entrez: www.ncbi.nlm.nih.gov
BADANIE GENOTYPU Precyzyjna ocena, czy zaburzenie szybkości metabolizmu leków jest związane z defektem
genetycznym , czy też wynikiem oddziaływania dodatkowych czynników niegenetycznych takich
jak np.:
Związana z wiekiem niedojrzałość enzymatyczna wątroby, Wiek, płeć, masa ciała, Ciąża Infekcja, choroba, stres Leki towarzyszące (interakcje) Zmienność dobowa i sezonowa Dieta, suplementy diety Czynność układu sercowo naczyniowego Czynność układu immunologicznego Czynność wątroby, nerek, płuc Spożycie alkoholu, palenie tytoniu Zanieczyszczenia środowiska GENETYCZNIE UWARUNKOWANE ZABURZENIA WCHŁANIANIA LEKÓW Przyczyna - zwiększona ekspresja genu ABCB1 dawniej nazywanego MDR1 (ang.:Multi Drug Resistance 1, gen oporności wielolekowej) odpowiedzialnego za wytwarzanie białka P glikoproteiny (20 odmian polimorficznych) Leki będące substratami podlegającymi transportowi przez P-gp:
- leki sercowo-naczyniowe (digoksyna, chinidyna, celiprolol, talinolol, werapamil) - leki przeciwnowotworowe (aktynomycyna D, doksorubicyna, daunorubicyna, etopozyd, irynotekan, paklitaksel, winblastyna) - leki immunosupresyjne (cyklosporyna A, takrolimus) - steroidy (aldosteron, hydrokortyzon, deksametazon) - opioidy (morfina, metadon) - leki przeciwgruźlicze (ryfampicyna) - leki różne (cefazolina, kolchicyna, atorwastatyna, erytromycyna, flufenazyna, lowastyna, perfenazyna, ondansetron, fenytoina, tamoksyfen, tiorydazyna, loperamid).
GENETYCZNIE UWARUNKOWANE ZABURZENIA METABOLIZMU LEKÓW
Polimorfizm utleniania (cytochromu P-450) Polimorfizm acetylacji
Genotyp utleniania – Cytochrom P-450 (CYP-450)
Jest hemoproteiną obecną w mikrosomach komórek wątrobowych (także: nabłonek jelitowy i płuca)
Funkcja: CYP jest końcową oksydazą, która prowadzi do utleniania wielu leków (ok.
80%)
Liczba izoenzymów CYP-450 jest olbrzymia, a do klasycznych należą: CYP2D6, CYP2C19, CYP2C9, CYP1A2, CYP3A4
The percentage of individual isoenzymes
Quantitative differences
Antidepresants
Antihypertensives
Anti-arrhytmics
Analgetics, opiates
Antidiabetics,
Beta-blocers…..
NSAIDs
Anti-epileptics,
Anticoagulants
EtOH, Antirheumatics….
Lovastatin, Simvastatin, Atovarstatin
Cyclosporine
HIV protease inhibitors,
Calcium channel blockers
Erythromycin, clarithromycin
SSRI, TCAs…..
TCAs, Theophylline, Estrogens
www.pharmacologyweekly.com
Farmakogenetyka leków przeciwbólowych
Statyny metabolizowane w układzie P-450: fluwastatyna, ceriwastatyna, atorwastatyna, lowastatyna, simwastatyna Statyny praktycznie niemetabolizowane w układzie P-450: pitawastatyna, prawastatyna, rosuwastatyna Polimorfizm utleniania / fenotypowe grupy:
EM (Extensive Metabolizers) - szybcy metabolizerzy (osoby dobrze, w znacznym stopniu utleniający)
PM (Poor Metabolizers) – osoby wolno, słabo utleniający
IM (Intermediate Metabolizers) – osoby o pośrednim metabolizmie
UM (Ultrarapid Metabolizers) – osoby ze zwielokrotnioną liczbą aktywnych
genów Ważniejsze induktory i inhibitory metabolizmu leków: Induktory: fenobarbital, fenytoina, karbamazepina, ryfampicyna, aminoglutetimid Inhibitory: amiodaron, allopurynol, cymetydyna, diltiazem, erytromycyna, disulfiram, enoksacyna, flukonazol, izoniazyd,ketokonazol, klarytromycyna, metronidazol, omeprazol, rytonawir, werapamil,
CYP2C9: Diklofenak Ibuprofen Ketoprofen Naproksen Meloksykam Piroksykam Indometacyna Celekoksyb Częstość w populacji: CYP2C9*2: 10,7 – 12.5% CYP2C9*3: 7,4 – 8,5%
CYP2D6 : kodeina Hydrokodon Oksykodon Metadon Tramadol
Częstość w populacji: PM: 5-10% UM: 2-3% EM: 80-90%
Polimorfizm reakcji II fazy biotransformacji N-acetylotransferaza (NAT1/2) S-transferaza glutationowa UDP-glukuronylotransferaza S-metylotransferaza tiopuryny NAT2 – enzym odpowiedzialny za acetylację leków i ksenobiotyków bedacych aryloaminami lub hydrazynami. Znanych jest ponad 100 odmiennych alleli: Allel NAT2*4 koduje szybką acetylację; Allele NAT2*5A, *5B, *5D, *6A, *7A, *7B, *14B są przyczyną wolnej acetylacji. W populacji kaukaskiej fenotyp „wolno acetylujący”: 40 - 60% ludzi Przykłady leków metabolizowanych przez N-acetylotransferazę NAT1 i NAT2 NAT1: kwas p-aminosalicylowy, kwas p-aminobenzoesowy, sulfametoksazol, sulfanilamid
NAT2: izoniazyd, sulfametazyna, hydralazyna, dapson, prokainamid, nitrazepam, kofeina, 2- aminofluoren
WYBRANE POLIMORFIZMY
1. Paracetamol / S- transferaza glutationowa Prawidłowy metabolizm paracetamolu: - utlenianie do bardzo toksycznej N-acetylo-p-benzochinoiminy (NAPQI) - koniugacja z glutationem.
Mutacja deaktywująca sprzęganie z glutationem ( GSTM1 i GSTT1)
Efekt mutacji : już małe dawki paracetamolu mogą prowadzić do objawów zatrucia !
dawka > 10-15 g: hipoglikemia, martwica wątroby, śpiączka, zgon dawka 6 g (dawka toksyczna): osoby z chorobami wątroby, alkoholicy
Odtrutka N-acetylocysteina (ACC) lub węgiel aktywny zalecenia Polskiego Towarzystwa Toksykologicznego !!!!
2. Leki przeciwkrzepliwe
Klopidogrel
Polimorfizm genów:
1. ABCB1 związany z absorpcją (Glikoproteina P)
2. CYP3A5, CYP2C19 – związane z aktywacją proleku w aktywny metabolit w wątrobie
3. P2RY12, ITGB3 – związane z aktywnością receptorów płytkowych
Warfaryna i acenokumarol
Optymalizacja leczenia antagonistami witaminy K - rola polimorfizmów genowych (CYP2C9 i
VKORC1) )
Polimorfizm : CYP2C9
Polimorfizm genetyczny związany z różnym tempem metabolizmu Acenokumarolu i Warfaryny
a wysokością dawki terapeutycznej oraz występowaniem powikłań krwotocznych.
Allele: CYP2C9*2 ( 8-12% chorych) i CYP2C9*3 (3-8% chorych)
– warunkują wolniejszy metabolizm (większe ryzyko krwawień)
Mniejsza dawka jest skuteczna!
Polimorfizm: VKORC1
Polimorfizm podjednostki 1 reduktazy epoksydu witaminy K (VKORC1) istotnie wpływa na
skuteczność działania antykoagulantów doustnych, antagonistów witaminy K.
Allele:
VKORC1*2 mniejsza o ok. 50% ilość enzym
VKORC1*3 i *4 oporność na VKA
Polimorfizm genów CYP2C9 i VKORC1 łącznie odpowiadają za 50% zmienności
odpowiedzi farmakologicznej na warfarynę – stabilnej dawki antagonistów witaminy K
4. Genetycznie uwarunkowany polimorfizm dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej-
G6PD
Istnieje ponad 80 typów G6PD-najbardziej znane:
Afrykański (A) : niedobór – hemoliza powoduje zniszczenie tylko starszych krwinek 63-67
dniowych
Śródziemnomorski (B): niszczone wszystkie krwinki czerwone konieczność przetoczenia krwi
Konsekwencje: nie wolno przyjmować: leków o właściwościach utleniających, bobu (fawizm),
agrestu, czerwonej porzeczki !!!
5. Wrażliwość na sukcynylocholinę
Sukcynylocholina jest lekiem stosowanym pomocniczo w narkozach w celu zmniejszenia
napięcia mięśni szkieletowych. Działanie leku jest zazwyczaj krótkotrwałe (3-5 minut), ponieważ
sukcynyclocholina jest metabolizowana przez cholinoesterazę (ChE).
Nadwrażliwość na sukcynylocholinę jest uwarunkowana genetycznie. U ludzi z tą enzymopatią
prawidłowa dawka sukcynylocholiny może spowodować długotrwały bezdech, prowadzący
niekiedy nawet do śmierci. Reakcja taka spowodowana jest nieprawidłowym genem
cholinesterazy rzekomej. W populacji kaukaskiej u ok. 1 na 3000-3500 osób blokada nerwowo-
mięśniowa po tym leku przedłuża się nawet do 3 - 4 godzin, co z powodu całkowitego porażenia
mięśni oddechowych i bezdechu, stwarza niebezpieczeństwo dla życia ( wystarcza 1/60 zwykłej
dawki leku)!
6. Genetycznie uwarunkowana predyspozycja do hipertermii a stosowanie środków
znieczulenia ogólnego i zwiotczającego
U osób z dziedziczną predyspozycją do złośliwej hipertermii (Malignant Hyperthermia – MH)
gwałtownie wzrasta ciepłota ciała (do 43-44°C), wzrasta napięcie mięśni, pojawia się
przyspieszenie akcji serca, duszność, sinica, rozwija się kwasica metaboliczna i oddechowa,
wzrasta stężenie potasu, zmniejsza się stężenie wapnia we krwi, rozwija rabdomioliza.
U osób będących nosicielami zmutowanego genu RYDR – kodującego wytwarzanie receptora
rianodynowego (Rianodine Receptor - RYDR), kontrolującego kanał wapniowy, zachodzi
niekontrolowany napływ jonów Ca do komórki.
Aktywne usuwanie z komórki jonów Ca przez dążący do homeostazy organizm powoduje
wytwarzanie dużej ilości ciepła.
Częstość występowania hipertermii: 1 / 5000 znieczuleń
Do najsilniejszych aktywatorów należą:
Anestetyki dożylne: ketamina
Anestetyki wziewne: halotan, izofluran, eter dwuetylowy, metoksyfluran
Środki zwiotczajace: suksametonium, deksametonium, galamina
Leki sympatykomimetyczne
Leki nasercowe: glikozydy naparstnicy, wapń
7. Genetycznie uwarunkowany polimorfizm glukuronylotransferazy (UGT1A1)
Substratem UGT1A1 jest Irynotekan.
U słabych metabolizerów (PM) - nosicieli allela UGT1*28 po podaniu leku
przeciwnowotworowego - irynotekanu aktywny metabolit (SN-38) ulega kumulacji, czego
następstwem może być ciężka toksyczność ( biegunka, neutropenia, małopłytkowość).
8. Herceptin (Trastuzumab) - stosowany w leczeniu raka piersi i beta-komórkowego
chłoniaka nieziarniczego.
Jest monoklonalnym przeciwciałem skierowanym swoiście przeciwko receptorowi HER2,
którego białko jest kodowane przez gen ERBB2. Nadekspresja tego receptora obserwowana jest
w 25-30 % przypadków raka piersi i jest skorelowana ze złośliwością nowotworu i zwiększonym
prawdopodobieństwem nawrotu choroby i śmierci.
Trastuzumab wiąże się specyficznie z receptorem, który uległ nadekspresji, wskazując tym
samym komórki rakowe do zniszczenia przez system immunologiczny – specyficznie działający
lek dla nowotworów z nadekspresją HER2/ERBB2
Możliwość skutecznej, celowanej terapii, powstanie nowej grupy leków, takich jak: cetuksymab,
lapatynib i pertuzumab
9. Analiza genu KRAS - analiza 12 i 13 kodonu sekwencji genu (miejsca najczęstszych
mutacji). jakościowo, sekwencjonowanie automatyczne.
Gen KRAS koduje białko, które jest jednym z najczęściej aktywowanych onkoprotein w rakach
trzustki, tarczycy, jelita grubego, płuc oraz białaczkach szpikowych u ludzi.
Forma genu decyduje o powodzeniu terapii celowanej w leczeniu raka jelita
grubego (Panitumumabem, Cetuximabem itd.), opartej na hamowaniu namnażania komórek
poprzez inhibitory receptora naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR), epidermal growth
factor receptor)
Określenie statusu genu KRAS jest konieczne przed przystąpieniem do tej terapii,
ponieważ w przypadku występowania mutacji dowiedziono jej nieskuteczność.
Występowanie zmutowanego genu KRAS stwierdza się u ok.45-50% chorych na raka
jelita grubego !!!!
10. Efektywności Albuterolu w leczeniu astmy
Albuterol (salbutamol): agonista receptora -2 adrenergicznego (ADRB2); łagodzi objawy astmy
Badania wykazały związek pomiędzy polimorfizmem w rejonie kodującym genu ADRB2
(warianty alleliczne Arg-16 lub Gly-16) a odpowiedzią na lek.
Pacjenci homozygotyczni (dwa allele Arg-16) wykazywali pięciokrotnie silniejszą odpowiedź na
leczenie niż homozygoty Gly-16.
U pacjentów heterozygotycznych (Arg-16/Gly-16) odpowiedź na lek była 2.3 razy wyższa w
porównaniu do homozygot Gly-16.
11. Nadwrażliwość na Abacavir
Abacavir – inhibitor transkryptazy, stosowany w terapii AIDS
4.3 % pacjentów leczonych abacavirem – nadwrażliwość: gorączka, wysypka, biegunka, w
ostateczności śmierć. Objawy nadwrażliwości cofały się po zaprzestaniu terapii
Badania genetyczne: rejon HLA: allel HLA-B*5701 jest znacząco skorelowany z
nadwrażliwością. Testy genetyczne mogą okazać się skuteczną metodą uniknięcia przypadków
nadwrażliwości na abacavir .
12. Farmakogenetyka nowotworów
Imatinib (Gleevec): lek stosowany w terapii przewlekłej białczki szpikowej(CML)
Działanie: Wiąże i inaktywuje białko BCR-ABL – kinazę tyrozynową aktywującą proliferację
leukocytów (przyczyna CML).
Problem: mutacje BCR-ABL mogą prowadzić do oporności na imatinib (inhibicja wiązania leku)
Badania farmakogenetyczne: zidentyfikowano kilka somatycznych mutacji w BCR-ABL, z czego
6 stanowi 60-70 % wszystkich obserwowanych mutacji
Wskazania do określenia genotypu metabolizmu leku
1. Leki stosowane w formie proleku lub których metabolit ma istotne znaczenie
farmakologiczne/terapeutyczne: enkainid, proguanil, kodeina;
2. Leki o małej wartości indeksu terapeutycznego lub o dużej farmakokinetycznej zmienności
(czyli takie, dla których jedyna lub główna droga metabolizmu jest katalizowana
przez polimorficzny enzym), wykazujące znaczne/ niebezpieczne efekty uboczne
3. Leki mające możliwość alternatywnego metabolizmu, prowadzącego do powstania związku
toksycznego, np.fenacetyna.
Korzyści wynikające z wykonania testu genotypowania
1. Możliwość szybkiego podjecie decyzji dotyczącej dawki leku, a zatem zwiększenie jego
skuteczności i tolerancji;
2. Osoby „słabo metabolizujące": uniknięcie odstawienia leku z powodu braku jego tolerancji
3. Osoby „ultraszybko metabolizujące": uniknięcie odstawienia prawidłowo wybranego leku
wskutek braku efektu terapeutycznego spowodowanego zbyt małym jego stężeniem w krwi, a
w przypadku monitorowania stężenia leku w osoczu uniknięcie niesłusznego
posądzenia pacjenta o niestosowanie się do zaleceń lekarza (noncompliance);
4. Genotypowanie może w dużym stopniu zastąpić monitorowanie stężenia leku w klinice, co
ma szczególne znaczenie w przypadku pacjentów nie reagujących na lek, nie tolerujących
leku oraz osób starszych ze współistniejącymi schorzeniami układu krążenia, wątroby, nerek;
5. Wykonanie jednego z powyższych testów umożliwia (ułatwia) prawidłowe wprowadzenie
nowego leku do terapii przez zastosowanie bezpiecznej dawki;
6. Ponieważ test taki wystarczy wykonać raz w życiu, czas i koszty są usprawiedliwione,
zwłaszcza w przypadku leczenia długotrwałego lekami nasercowymi lub psychotropowymi.
Zalecenia FDA
Markery farmakogenetyczne – przeprowadzane przed podaniem leków (ponad 150 markerów
farmakogenetycznych na liście FDA)
Farmakogenetyka w grupach etnicznych - zróżnicowanie międzypopulacyjne wpływa również
na działanie niektórych leków
Genotypowanie - etapy
1. Izolacja DNA z materiału biologicznego i kontrola jakości :
Metoda chloroformowo-fenolowa
Metoda wysalania
Adsorpcja na kolumnach z krzemionką i solami chaotropowymi
Z zastosowaniem cząstek magnetycznych (Fe3 O4 z krzemionką)
2. Amplifikacja fragmentu DNA (PCR) – specyficzność procesu.
3. Rozdział elektroforetyczny (na żelach agarozowych i poliakryloamidowych)
4. Wizualizacja (bromek etydyny z dwuniciowym DNA wykazuje zdolność do
fluorescencji w świetle UV )
6. Obliczenia częstości występowania alleli.
Metody analityczne - podstawowe techniki biologii molekularnej
PCR / RFLP (ang. Polymerase Chain Reaction - Łańcuchowa Reakcja
Polimerazy / ang. Restriction Fragment Length Polymorphism-
analiza fragmentów DNA po cięciu enzymami restrykcyjnymi);
RT/PCR (ang.ReverseTranscription Polymerase Chain Reaction),
Czyli kombinowana metoda z udziałem enzymu odwrotnej transkryptazy w
połączeniu z techniką PCR;
Real Time PCR daje możliwość detekcji przyrostu ilości produktu PCR w
czasie rzeczywistym;
Mikromacierze (ang.DNA microarrays), chipy DNA - badanie profilu
molekularnego komórek i tkanek przez równoczesną hybrydyzację izolowanego z
nich RNA do wielu tysięcy sond oligonukleotydowych – możliwość badania
całego genomu podczas jednej analizy!
Sekwencjonowanie; Pirosekwencjonowanie; Sekwencjonowanie nowej generacji
TORRENT.
Epigenetyka
Pojęcie: „ekspozom” - idea, że środowisko, w którym żyją geny ma większe znaczenie od
samych genów.
Opinie – ponad 70% chorób ma związek z ekspozycją na czynniki środowiskowe.
Zestaw czynników , które decydują o zdrowiu i chorobach:
toksyny, jedzenie, mikroby, wewnętrzne substancje chemiczne, w tym
wszystkie aktywne biologicznie cząsteczki kontrolujące stany zapalne, stres
oksydacyjny, mikroflora jelitowa i inne naturalne procesy.
Epigenomika, nutrigenomika, mikrobiomika, toksygenomika…..i inne omiki !!!!