De moleculaire diagnostiek van
B-NHL: detectie van breuken met
behulp van FISH
Philip Kluin, UMCG,
Daphne de Jong, VUMC
Yvonne van Norden, HOVON
en
Alle deelnemers HOVON kwaliteitsronde
Ontwikkeling
rijpe B-cellen
in lymfeklier,
MALT etc
De oorsprong en de verspreiding van normale
B-lymfocyten
Ontwikkeling
voorloper
B-cellen
Plasmacellen in
lymfeklier, MALT,
beenmerg etc
antigen onafhankelijk antigen afhankelijk
Aanmaak Ig Ig affiniteits verhoging
en Ig klasseswitch
MALT MALT
Ontwikkeling
rijpe B-cellen
in lymfeklier,
MALT etc
B cel maligniteiten in alle stadia
Ontwikkeling
voorloper
B-cellen
Plasmacellen in
lymfeklier, MALT,
beenmerg etc
MALT MALT
acute lymfatische leukemie maligne lymfomen plasmacel tumoren
& CLL
RAG1/2 gemedieerde VDJ recombinatie in
voorloper B-cellen
VH DH C JH C C3 C1 C1 C2 C4 C2 C E E E
V D J
E
IgM transcript Chromosoom 14
In voorloper B-cel van folliculair lymfoom
gaat iets mis….
VH DH C JH C C3 C1 C1 C2 C4 C2 C E E E
BCL2
+
E
BCL2
Chromosoom 18
Chromosoom 14
Kiemcentrumreactie in rijpe B cellen
Somatic
hyper
mutations:
affinity
maturation
of BCR
Class
switching:
from IgM to
IgG / IgA etc
Activation induced deaminase – AID / AICDA /
HIGM2
VDJ recombinaties, somatische
hypermutaties en klasseswitch
De enzymen (RAG1/2 en AID) en DNA
repair mechanismen treffen ook andere
targets: inmiddels groot aantal targets
van AID bekend waaronder MYC
Het ontstaan van DNA breuken in zowel
de IG genen als deze targets kan zorgen
voor chromosomale translocaties met
activatie van oncogenen zoals MYC.
Meest bekende translocaties in B-
NHL
t(14;18)(q21;q32): BCL2 en IGH*
t(3;?)(q27;?): BCL6 en IGH, IGK, IGL of
andere genen
t(8;14)(q24;q32): MYC en IGH*
t(11;14)(q13;q32): CCND1 en IGH*
t(11;18)(q21;q21): BIRC3 en MALT1
* of IGK of IGL op #2, resp. #22
Welke NHL hebben een t(14;18)?
90% folliculair lymfoom graad 1&2,
30-50% folliculair lymfoom 3A & B
15-20% DLBCL 30-35% GCB type (CD10+, MUM1-), deel is
progressie uit folliculair lymfoom?
0-5% ABC type (CD10-, MUM1+)
Meeste dubbelhit lymfomen (MYC breuk met andere breuk (BCL2 > BCL6 > 9p13 > CCND1 > IRF4)
Welke NHL hebben een t(11;14)?
99% MCL // CCND1 +
<5% atypische CLL & 15% SLVL = indolente variant MCL, SOX11 negatief
33% B-PLL & paraimmunoblastair lymfoom = blastair MCL
15% myeloma (breakpoints in Ig switch sites), all strongly CCND1 +
Welke NHL hebben een MYC / 8q24
breuk?
90-100% Burkitt lymfomen // goede prognose en genezing mits adekwaat behandeld
10-15% DLBCL Slechte prognose en nieuwe therapie nodig
>50% “dubbelhit” met ook BCL2/BCL6 breuk of beide
30-50% “intermediate” lymfomen Erg slechte prognose
>50% “dubbelhit” met ook BCL2/BCL6 breuk of beide
10% van getransformeerde folliculaire lymfomen (dus ook dubbelhit), sporadisch ook MCL (idem)
fors deel van progressief multipel myeloom
Hoe belangrijk is het detecteren van een
MYC breuk? MMML data, S Aukema et al,
Haematologica 2014
MYCR+ lymfomen
mBL
non mBL (GEP)
Zeer belangrijk, alles in de juiste context
Waarom niet alleen MYC IHC?
Y69 rabbit monoclonal
Afkappunten verschillen (mediaan, 40, 50, 70% etc)
Eenzijdige relatie: de meeste MYC-breuk+ lymfomen hebben hoge MYC
expressie
In DLBCL vaker MYC expressie (30-40%) dan breuk (10-15%)
Verschillen in GCB en ABC groepen: MYC breuken vaker in GCB, BCL2 breuken uitsluitend in GCB
MYC en BCL2 expressie juist vaker in ABC
Vooral MYC+ BCL2+ dubbelexpressie is belangrijk
MYC en overleving (563 R-CHOP
behandelde DLBCL; Mod Pathol 2013)
MYC breuk in alle DLBCL
MYC breuk in DLBCL met hoge MYC expressie (>75%)
MYC breuk in GCB DLBCL
Nieuwe HOVON studie(s)
Alle DLBCL, BL & “intermediate” lymfomen:
screening voor MYC breuken
niet BL:
Dus voorbereiden op wat komen
gaat …..
FISH rondzending voor MYC, BCL2 en
BCL6
TMA gemaakt van 11 cases uit Würzburg
(gouden standaard)
7 augustus 2013 verstuurd aan 17 labs,
sommige labs kregen op verzoek een
nieuwe coupe
Gegevens verwerkt en 13 december
feedback
Probes in 17 labs
Abbot / Vysis Dako Kreatech geen
BCL2 ba 8 9 0
BCL6 ba 8 6 1 2
MYC ba 9 7 1
MYC-IGH 6 0 0 13
Probes
02
04
06
08
01
00
Num
ber
of re
su
lts
BCL2 BCL6 MYC_BA
Probe 1
goed vals+ vals-
goed-dubieus fout-dubieus No concl
No core
02
04
06
08
01
00
Num
ber
of re
su
lts
BCL2 BCL6 MYC_BA
Probe 2
goed vals+ vals-
goed-dubieus fout-dubieus No concl
No core
02
46
81
0
Num
ber
of re
su
lts
BCL2 BCL6 MYC_BA
Probe 3
goed vals+ vals-
goed-dubieus fout-dubieus No concl
No core
Abbott/Vysis (6-9 labs)
Dako (6-9 labs)
Kreatech (1 lab)
02
04
06
08
01
00
Num
ber
of re
su
lts
BCL2 BCL6 MYC_BA
Probe 1
goed vals+ vals-
goed-dubieus fout-dubieus No concl
No core
Scores
Goed: zowel lab als ref zijn beide pos of beide
neg
Vals+: ref is negatief en lab oordeelt positief
Vals-: ref is positief en lab oordeelt negatief
No core: core er af
No concl: geen (interpreteerbare) data
Goed-dubieus: afgegeven als dubieuze conclusie, maar wel juist beoordeeld
Fout-dubieus: afgegeven als dubieuze conclusie, maar wel fout beoordeeld
02
04
06
08
01
00
Num
ber
of re
su
lts
BCL2 BCL6 MYC_BA
Probe 1
goed vals+ vals-
goed-dubieus fout-dubieus No concl
No core
05
10
15
20
Num
ber
of la
bs
BCL2 BCL6 MYC_BA
Case 7
goed vals+ vals-
goed-dubieus fout-dubieus No concl
No core
05
10
15
20
Num
ber
of la
bs
BCL2 BCL6 MYC_BA
Case 10
goed vals+ vals-
goed-dubieus fout-dubieus No concl
No core
Forse verschillen tussen cases
Lab 11:
BCL2: <10%, geen breuk, polysomie
BCL6: <5%, geen breuk, polysomie
MYC: breuk in 63%
MYC –IGH: fusie in 76%
Lab 11:
BCL2: breuk in 73%
BCL6: <5%, geen breuk
MYC: breuk in 65%
MYC –IGH: <5% geen fusie
Nog een casus 0
51
01
52
0
Num
ber
of la
bs
BCL2 BCL6 MYC_BA
Case 9
goed vals+ vals-
goed-dubieus fout-dubieus No concl
No core
Lab 11:
BCL2: breuk, 81%
BCL6: <5%, geen breuk
MYC: breuk in 25% (andere labs hoger %) tgv extra losse signalen 5’ zijde (centromeer)
MYC –IGH: <5%, geen fusie
Dus breuk met deletie
Individuele labs, voorbeeld lab 1
0
24
68
10
Num
ber
of ca
se
s
BCL2 BCL6 MYC_BA
Lab 1
goed vals+ vals-
goed-dubieus fout-dubieus No concl
No core
02
04
06
08
01
00
Num
ber
of re
su
lts
BCL2 BCL6 MYC_BA
Probe 1
goed vals+ vals-
goed-dubieus fout-dubieus No concl
No core
02
46
81
0
Num
ber
of ca
se
s
BCL2 BCL6 MYC_BA
Lab 2
goed vals+ vals-
goed-dubieus fout-dubieus No concl
No core
02
46
81
0
Num
ber
of ca
se
s
BCL2 BCL6 MYC_BA
Lab 3
goed vals+ vals-
goed-dubieus fout-dubieus No concl
No core
02
46
81
0
Num
ber
of ca
se
s
BCL2 BCL6 MYC_BA
Lab 4
goed vals+ vals-
goed-dubieus fout-dubieus No concl
No core
02
46
81
0
Num
ber
of ca
se
s
BCL2 BCL6 MYC_BA
Lab 5
goed vals+ vals-
goed-dubieus fout-dubieus No concl
No core
02
46
81
0
Num
ber
of ca
se
s
BCL2 BCL6 MYC_BA
Lab 6
goed vals+ vals-
goed-dubieus fout-dubieus No concl
No core
02
46
81
0
Num
ber
of ca
se
s
BCL2 BCL6 MYC_BA
Lab 8
goed vals+ vals-
goed-dubieus fout-dubieus No concl
No core
02
46
81
0
Num
ber
of ca
se
s
BCL2 BCL6 MYC_BA
Lab 9
goed vals+ vals-
goed-dubieus fout-dubieus No concl
No core
02
46
81
0
Num
ber
of ca
se
s
BCL2 BCL6 MYC_BA
Lab 10
goed vals+ vals-
goed-dubieus fout-dubieus No concl
No core
02
46
81
0
Num
ber
of ca
se
s
BCL2 BCL6 MYC_BA
Lab 11
goed vals+ vals-
goed-dubieus fout-dubieus No concl
No core
02
46
81
0
Num
ber
of ca
se
s
BCL2 BCL6 MYC_BA
Lab 12
goed vals+ vals-
goed-dubieus fout-dubieus No concl
No core
02
46
81
0
Num
ber
of ca
se
s
BCL2 BCL6 MYC_BA
Lab 13
goed vals+ vals-
goed-dubieus fout-dubieus No concl
No core
02
46
81
0
Num
ber
of ca
se
s
BCL2 BCL6 MYC_BA
Lab 14
goed vals+ vals-
goed-dubieus fout-dubieus No concl
No core
02
46
81
0
Num
ber
of ca
se
s
BCL2 BCL6 MYC_BA
Lab 15
goed vals+ vals-
goed-dubieus fout-dubieus No concl
No core
02
46
81
0
Num
ber
of ca
se
s
BCL2 BCL6 MYC_BA
Lab 16
goed vals+ vals-
goed-dubieus fout-dubieus No concl
No core
02
46
81
0
Num
ber
of ca
se
sBCL2 BCL6 MYC_BA
Lab 17
goed vals+ vals-
goed-dubieus fout-dubieus No concl
No core
0
2
4
6
8
10
Nu
mb
er
of ca
se
s
BCL2 BCL6 MYC_BA
Lab 7
goed vals+ vals-
goed-dubieus fout-dubieus No concl
No core
maar 1 vals+!
Welke labs tellen en heeft dat
invloed? 0
24
68
10
Num
ber
of ca
se
s
BCL2 BCL6 MYC_BA
Lab 1
goed vals+ vals-
goed-dubieus fout-dubieus No concl
No core
semiquantitatief
quantitatief
02
04
06
08
01
00
Num
ber
of re
su
lts
BCL2 BCL6 MYC_BA
Probe 1
goed vals+ vals-
goed-dubieus fout-dubieus No concl
No core
0
2
4
6
8
10
Nu
mb
er
of ca
se
s
BCL2 BCL6 MYC_BA
Lab 7
goed vals+ vals-
goed-dubieus fout-dubieus No concl
No core
02
46
81
0
Num
ber
of ca
se
s
BCL2 BCL6 MYC_BA
Lab 3
goed vals+ vals-
goed-dubieus fout-dubieus No concl
No core
02
46
81
0
Num
ber
of ca
se
s
BCL2 BCL6 MYC_BA
Lab 8
goed vals+ vals-
goed-dubieus fout-dubieus No concl
No core
02
46
81
0
Num
ber
of ca
se
s
BCL2 BCL6 MYC_BA
Lab 11
goed vals+ vals-
goed-dubieus fout-dubieus No concl
No core
02
46
81
0
Num
ber
of ca
se
s
BCL2 BCL6 MYC_BA
Lab 4
goed vals+ vals-
goed-dubieus fout-dubieus No concl
No core
02
46
81
0
Num
ber
of ca
se
s
BCL2 BCL6 MYC_BA
Lab 5
goed vals+ vals-
goed-dubieus fout-dubieus No concl
No core
02
46
81
0
Num
ber
of ca
se
s
BCL2 BCL6 MYC_BA
Lab 6
goed vals+ vals-
goed-dubieus fout-dubieus No concl
No core
02
46
81
0
Num
ber
of ca
se
s
BCL2 BCL6 MYC_BA
Lab 9
goed vals+ vals-
goed-dubieus fout-dubieus No concl
No core
02
46
81
0
Num
ber
of ca
se
s
BCL2 BCL6 MYC_BA
Lab 10
goed vals+ vals-
goed-dubieus fout-dubieus No concl
No core
02
46
81
0
Num
ber
of ca
se
s
BCL2 BCL6 MYC_BA
Lab 12
goed vals+ vals-
goed-dubieus fout-dubieus No concl
No core
02
46
81
0
Num
ber
of ca
se
s
BCL2 BCL6 MYC_BA
Lab 13
goed vals+ vals-
goed-dubieus fout-dubieus No concl
No core
02
46
81
0
Num
ber
of ca
se
s
BCL2 BCL6 MYC_BA
Lab 14
goed vals+ vals-
goed-dubieus fout-dubieus No concl
No core
02
46
81
0
Num
ber
of ca
se
s
BCL2 BCL6 MYC_BA
Lab 15
goed vals+ vals-
goed-dubieus fout-dubieus No concl
No core
02
46
81
0
Num
ber
of ca
se
s
BCL2 BCL6 MYC_BA
Lab 16
goed vals+ vals-
goed-dubieus fout-dubieus No concl
No core
02
46
81
0
Num
ber
of ca
se
sBCL2 BCL6 MYC_BA
Lab 17
goed vals+ vals-
goed-dubieus fout-dubieus No concl
No core
02
46
81
0
Num
ber
of ca
se
s
BCL2 BCL6 MYC_BA
Lab 2
goed vals+ vals-
goed-dubieus fout-dubieus No concl
No core
Percentages breuk per lab (alleen
als geteld)
BCL2 MYC
Grote & consistente verschillen tussen labs!
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
1 2 3 4 5 6 2 4 5 7 8 11 0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 4 5 6 7 8 11
Vals + casus
Tellen is meer
dan tellen, lab 11
2 of 3 analisten kijken
1 telt, 2 kijken globaal
evt kijkt patholoog mee
vast score formulier
Geen goede verklaring voor
verschillen tussen labs: vergelijking exacte
werkwijze noodzakelijk
CONCLUSIES
Goede participatie en waardevolle resultaten
Geen grote verschillen tussen probe sets
Maar 2/17 labs (12%) hadden alles goed 5 labs (incl 1 met missing core; 30%) hadden alle MYC break
apart tests goed
Grote verschillen in kwantificering tussen labs
Relatie tussen tellen en scores niet keihard, maar de twee labs zonder fouten tellen
Vaker vals negatief dan vals positief worden losse signalen van één kleur (= breuk) over het hoofd
gezien?
Sommige labs hebben vaak een onzekere uitslag; deze is voor de kliniek niet erg behulpzaam
Tot slot: dank aan de
organisatoren en