Aus dem Zentrum für Kinderheilkunde und Jugendmedizin
der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i. Br.
Deletions- und Bruchpunktanalyse mittels Southern-Blot-Verfahren bei Familien mit Nephronophthise Typ 1 (NPH1)
INAUGURAL-DISSERTATION
zur
Erlangung des Medizinischen Doktorgrades
der Medizinischen Fakultät
der Albert-Ludwigs-Universität
Freiburg im Breisgau
Vorgelegt 2003
von Thalia Vetsi
geboren in Esslingen a.N.
Dekan: Prof. Dr. rer. nat. M. Schumacher
1. Gutachter: Prof. Dr. F. Hildebrandt
2. Gutachter : PD Dr. W. Offensperger
Jahr der Promotion: 2003
Abkürzungen(Begriffe aus dem Englischen sowie Gennamen sind kursiv gedruckt)
ADPKD adult dominant polycystic kidney disease
ARPKD adult recessive polycystic kidney disease
bp Basenpaare
DNA desoxyribo nucleic acid
cDNA copy DNA
cM Centimorgan
cpm counts per minute
EST expressed sequence tag
FISH Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung
JN/MCD juvenile nephronophthisis/medullary cystic disease
kb Kilobase(n)
kD Kilodalton
LINE long interspersed nuclear element
MAL maturation associated protein of lymphocytes
MALL MAL-like
Mb Megabase(n)
MCD medullary cystic disease
mRNA messenger ribonucleic acid
NPHP1 Gen für nephronophthise Typ 1
NPH1(2) alte Bezeichnung für das Gen für
Nephronopthise Typ1(2)
NPH Nephronophthise
ORF open reading frame
PAC P1-related artificial chromosome
PCR polymerase chain reaction
PFGE Pulsfeld-Gelelektrophorese
RACE rapid amplification of cDNA ends
RNA ribonucleic acid
SINE small interspersed nuclear element
SSCP single stranded conformation polymorphism
STS sequence- tagged site
TBM Tubuläre Basalmembran
Tris Trihydroxymethylaminomethan
Upm Umdrehungen pro Minute
YAC yeast artficial chromosome
I
1.EINLEITUNG ............................................................................................................... 1
1.1 Die familiäre juvenile Nephronophthise................................................................ 11.1.1 Klassifikation ...................................................................................................... 11.1.2 Epidemiologie..................................................................................................... 21.1.3 Klinik................................................................................................................... 21.1.4 Pathologie und renale Histologie........................................................................ 31.1.5 Ätiologie und Pathogenese ................................................................................ 41.1.6 Diagnostik .......................................................................................................... 51.1.7 Therapie ............................................................................................................. 6
1.2 Genetik..................................................................................................................... 71.2.1 Allgemeine Aspekte............................................................................................ 71.2.2 Tiermodelle ........................................................................................................ 71.2.3 Molekulare Genetik ............................................................................................ 8
2. ZIELSETZUNG......................................................................................................... 19
3. MATERIAL UND METHODEN ................................................................................. 20
3.1 Patienten................................................................................................................ 20
3.2 Genomische DNA.................................................................................................. 203.2.1 EBV-Transformation von Lymphozyten............................................................ 203.2.2 DNA-Extraktion mittels Ionenaustauschersäulen ............................................. 21
3.3 Plasmidpräparation .............................................................................................. 233.3.1 Plasmidpräparation nach Chowdhury............................................................... 233.3.2 Plasmidpräparation nach Birnboim und Doly.................................................... 24
3.4 Präzipitation von DNA .......................................................................................... 263.4.1 Ethanolfällung................................................................................................... 263.4.2 Isopropanolfällung ............................................................................................ 26
3.5 Verdau von DNA mit Restriktionsendonukleasen.............................................. 263.5.1 Verdau von PAC-Klonen .................................................................................. 263.5.2 Verdau von genomischer DNA......................................................................... 27
3.6 Agarose-DNA-Gelelektrophorese........................................................................ 28
3.7 Southern Blot ........................................................................................................ 293.7.1 Aufbau des Kapillarblots................................................................................... 303.7.2 Blotten der DNA ............................................................................................... 303.7.3 Polymerasekettenreaktion (PCR) ..................................................................... 323.7.4 Gewinnung der Sonde...................................................................................... 333.7.5 Radioaktive Markierung der Sonden ................................................................ 343.7.6 Prähybridisieren und Hybridisieren des Southern Blots ................................... 343.7.7 Waschen der Blots ........................................................................................... 353.7.8 Auswertung der Blots ....................................................................................... 353.7.9 Wiederverwendung der Blots durch “membrane stripping” .............................. 35
3.8 Nährmedien ........................................................................................................... 36
II
3.9 Andere Lösungen und Chemikalien.................................................................... 36
3.10 Restriktionsnzyme .............................................................................................. 39
3.11 Primer und Sonden............................................................................................. 40
3.12 Materialien ........................................................................................................... 40
4.ERGEBNISSE ........................................................................................................... 43
4.1 Allgemein............................................................................................................... 43
4.2 Deletionsanalyse im Bereich der distalen Bruchpunktregion .......................... 444.2.1 Hybridisierung genomischer Southern Blots mit einer radioaktiv markierten Sonde (Sonde A) im 3‘-Bereich des NPHP1-Gens........................................... 444.2.2 Hybridisierung genomischer Southern Blots mit dem EST yb08f05 (Sonde B) 46
4.3 Deletionsanalyse am proximalen Bruchpunkt bei Familie 12........................... 484.3.1 Hybridisierung genomischer Southern Blots mit einer radioaktiv markierten Sonde (Sonde C) im Bereich des vermuteten proximalen Bruchpunkts........... 484.3.2 Wiederholung des Experiments aus 4.3.1........................................................ 524.3.3 Erstellung einer partiellen Restriktionskarte für den proximalen Bruchpunkt bei Familie 12 nach Hybridisierung genomischer Southern Blots mit der radioaktiv markierten Sonde C ........................................................................................ 53
4.4 Deletionsanalysen stromabwärts des vermuteten proximalen Bruchpunkts beiweiteren NPH-Familien ............................................................................................... 55
4.4.1 Hybridisierung genomischer Southern Blots mit einer radioaktiv markierten Sonde im Sp6-Bereich des PACs 62p20 (Sonde D) ........................................ 55
5. DISKUSSION ........................................................................................................... 57
5.1 Allgemein............................................................................................................... 57
5.2 Bisherige Charakterisierung der Deletionsbruchpunkte für NPHP1 ................ 58
5.3. Die Southern Blot Technik ................................................................................. 585.3.1 Die Southern Blot Technik im Vergleich zu anderen molekularbiologischen Techniken......................................................................................................... 58
5.4 Deletionsanalyse am distalen Deletionsbruchpunkt ......................................... 605.4.1 Hybridisierung genomischer Southern Blots mit einer radioaktiv markierten Sonde im 3‘-Bereich des NPHP1 –Gens (Probe A).......................................... 605.4.2 Hybridisierung genomischer Southern Blots mit dem EST yb08f05 (Probe B). 61
5.5 Deletionsanalyse am proximalen Bruchpunkt bei Familie 12........................... 625.5.1 Hybridisierung genomischer Southern Blots mit einer radioaktiv markierten Sonde im Bereich des vermuteten proximalen Bruchpunkts (Probe C)............ 625.5.2 Erstellung einer partiellen Restriktionskarte für den proximalen Bruchpunkt bei Familie 12......................................................................................................... 64
5.6 Deletionsanalysen stromabwärts des vermuteten proximalen Bruchpunkts beiweiteren NPH-Familien............................................................................................... 64
III
5.6.1 Hybridisierung genomischer Southern Blots mit einer radioaktiv markierten Sonde im Sp6-Bereich des PACs 62p20 ( Probe D) ........................................ 64
5.7 Mögliche Pathomechanismen für die Entstehung der NPHP1-Deletion .......... 65
5.8 Ausblick................................................................................................................. 66
6. ZUSAMMENFASSUNG............................................................................................ 68
7. LITERATURLISTE ................................................................................................... 69
8. ANHANG
8.1 Sequenzierter Bereich Exon 1 und Exon 2
8.2 Danksagung
8.3 Abstracts und Veröffentlichungen
8.4. Lebenslauf
1
1.EINLEITUNG
1.1 Die familiäre juvenile Nephronophthise
1.1.1 Klassifikation
Unter familiärer juveniler Nephronophthise (NPH) versteht man eine autosomal rezessiv
vererbte zystische Nierenerkrankung (Fanconi et al., 1951), welche im Alter von
durchschnittlich 13 Jahren zum terminalen Nierenversagen führt (Waldherr et al., 1982).
Die NPH stellt die häufigste genetische Ursache für terminales Nierenversagen im
Kindesalter dar (Hildebrandt, 1995).
1945 wurde das Krankheitsbild der NPH zum ersten Mal beschrieben (Smith und
Graham, 1945), 1951 erfolgte die heute gültige Namensgebung (Fanconi et al., 1951).
1997 erfolgte die Identifizierung des Gens für Nephronophthise durch Hildebrandt
(Hildebrandt et al., 1997) und Saunier (Saunier et al., 1997). 1998 gelang die
Entdeckung eines zweiten Genlocus für Nephronophthise (Nephronophthise Typ 2)
durch Haider (Haider et al., 1998).
Die NPH kann auch in Kombination mit Erkrankungen anderer Organe auftreten,
sogenannten extrarenalen Manifestationen. Hierzu zählen die Retinitis Pigmentosa
(Senior et al., 1961; L∅ ken et al., 1961), Leberfibrose (Boichis et al., 1973),
Knochenanomalien (Mainzer et al., 1970), zerebelläre Ataxie (Fontaine et al., 1970),
mentale Retardierung (Proesmans et al., 1975; Donaldson et al., 1985) und
Kleinhirnwurmaplasie (Dekaban et al., 1969).
Neben der autosomal rezessiv vererbten NPH wurde auch eine autosomal dominant
vererbte Form der Erkrankung beschrieben, wobei sich diese beiden Formen
histologisch nicht voneinander unterscheiden (Gardner et al., 1976). Das späte
Auftreten der Krankheitssymptomatik (terminales Nierenversagen) im dritten
Lebensjahrzehnt sowie das Fehlen extrarenaler Manifestationen stellen
charakteristische Merkmale der autosomal dominanten Form der Erkrankung dar. Diese
2
Erkrankungsform bezeichnet man heute als medullary cystic disease (MCD),
Markzystenkrankheit. Die Juvenile Nephronophtise und die Markzystenkrankheit
werden unter dem Begriff des “NPH-Komplexes” zusammengefaßt.
1.1.2 Epidemiologie
Die NPH ist bei weiblichen und männlichen Individuen mit der gleichen Häufigkeit
vorzufinden. Die Angaben über die Inzidenz der NPH unterliegen großen
Schwankungen, was zum einen auf die Seltenheit der Erkrankung, zum anderen auf die
schwer zu stellende Diagnose zurückzuführen ist. So gibt es Schätzungen von 9
Erkrankten pro 8,3 Millionen Lebendgeburten in den USA (Potter et al., 1980). In
Kanada liegen die Schätzungen bei 1 auf 50000 Lebendgeburten (Waldherr et al.,
1983).
In der Bundesrepublik Deutschland beträgt bei pädiatrischen Patienten mit chronischer
Niereninsuffizienz der Anteil der NPH 12% (Pistor et al., 1985).
Unter den Patienten, die vom NPH-Komplex betroffen sind, nimmt die isolierte NPH
einen Anteil von 56 % ein, NPH assoziiert mit Retinitis Pigmentosa (SLS:
Senior-L∅ ken-Syndrom) tritt bei 12% der Patienten auf, NPH in Kombination mit
Erkrankungen der Leber, des Skeletts oder des Zerebellums bei 2-5% der Patienten,
die MCD bei 30% (Gardner und Evan, 1979).
1.1.3 Klinik
Die ersten Symptome der NPH sind Polyurie, Polydipsie, verminderte
Harnkonzentrationsfähigkeit und sekundäre Enuresis. Sie treten bereits im Alter von
ungefähr 4 Jahren auf. Durch die progrediente Einschränkung der Nierenfunktion treten
eine schwere Anämie, renale Osteodystrophie sowie Wachstumsretardierung hinzu.
Das chronische Nierenversagen wird durchschnittlich im Alter von 13 Jahren erreicht.
Ein weiteres charakteristisches Merkmal bei Patienten mit NPH ist eine verminderte
Urinkonzentrationsfähigkeit unter 800 mosm/l nach einem 12-14 h langen Durstversuch
(Waldherr et al., 1984).
Im Vergleich zu anderen degenerativen Nierenerkrankungen ist für die NPH das Fehlen
von Ödemen, Hämaturie und Harnwegsinfektionen typisch. Trotz der Schwere der
Niereninsuffizienz ist das Auftreten von Hypertonie selten, da der
3
Salzverlust durch die Nieren stark ist.
Zusammenfassend läßt sich sagen, daß aufgrund der unspezifischen
Anfangssymptome sowie des Fehlens von Ödemen und Bluthochdruck, die Diagnose
einer NPH oft erst dann gestellt wird, wenn die Kinder bereits ein chronisches
Nierenversagen aufweisen. Somit besteht für die erkrankten Kinder das Risiko, ohne
richtige frühzeitige Diagnose aufgrund von Störungen des Wasser- und
Elektrolythaushaltes zu versterben (Hildebrandt et al., 1992).
1.1.4 Pathologie und renale Histologie
Im Rahmen der NPH kommt es zu makro-und mikropathologischen Veränderungen
beider Nieren. Zu Erkrankungsbeginn weisen die Nieren eine normale Größe auf. Im
Endstadium der Erkrankung finden sich geschrumpfte Nieren mit dünnen und
atrophischen Rinden. Daher stammt die Wahl des Begriffs der “Nephronophthise”, des
“Nierenschwundes” (Bernstein und Gardner, 1979).
Renale histologische Veränderungen treten bereits im Frühstadium der Erkrankung auf.
Sie imponieren lichtmikroskopisch als tubulointerstitielle lymphohistiozytäre
Infiltrationen. Im weiteren Verlauf der Erkrankung kommt es zur Ausbildung
atrophischer und gewundener Tubuli im Bereich des kortiko-medullären Übergangs.
Elektronenmikroskopisch sind charakteristische Veränderungen der tubulären
Basalmembran (TBM) nachzuweisen. Zu diesen Veränderungen der TBM zählen deren
extreme Verdickung, Aufsplitterung in mehrere Lagen mit dazwischenliegenden
Fibroblasten sowie eine unregelmäßige Faltung.
Im Bereich der Glomeruli findet sich eine periglomeruläre Sklerose und eine
Verbreiterung der Bowmanschen Kapsel.
Im weiteren Verlauf der Erkrankung kommt es zur Ausbildung einer diffus
sklerosierenden tubulo-interstitiellen Nephropathie.
Bei ungefähr 70% der Patienten lassen sich multiple Zysten beobachten, welche von
den Sammelrohren ausgehen und einen Durchmesser von 1-15 mm zeigen. Diese
Zysten sind an der kortikomedullären Grenze gelegen und mit einer bernsteinfarbenen
Flüssigkeit gefüllt (Gardner et al., 1979). Andere Organe sind nicht von zystischen
Veränderungen betroffen (Gardner et al., 1979; Waldherr et al., 1982).
4
1.1.5 Ätiologie und Pathogenese
Die Ursache für NPH ist das Fehlen beider NPHP1 Gene auf Chromosom 2. Unklar
bleibt jedoch die Pathogenese der NPH. Die Fragen, warum die Nierenveränderungen
erst postpartal auftreten, warum sie bevorzugt an der kortikomedullären Grenze
lokalisiert sind, welches die Rolle interstitieller Infiltrationen und Sklerosen sind, bleiben
offen.
Als pathogenetischer Erklärungsversuch für das Auftreten der Nierenveränderungen im
Rahmen einer NPH galt die Annahme eines metabolisch-toxischen Defekts (Giselson et
al., 1970; Van Collenburg et al., 1978). Als Gegenargument hierfür ist jedoch die
Tatsache anzusehen, daß nierentransplantierte NPH-Patienten kein NPH-Rezidiv
entwickelten (Steele et al., 1980).
Da sich viele funktionelle sowie histologische Veränderungen im Bereich der Tubuli
abspielen, gehen viele pathogenetische Erklärungsversuche von dem Vorliegen einer
defekten tubulären Funktion aus. Für einen solchen Defekt sprechen die mangelnde
Harnkonzentrationsfähigkeit und die renalen Salzverluste, das frühe Auftreten einer
tubulärer Azidose in einigen Fällen, das seltene Auftreten einer Proteinurie, welche-
wenn vorhanden- vom tubulären Typ ist (Giselson et al., 1970) und der gestörte
Paraaminohippursäure-Transport (Weber et al., 1982).
Es bleibt weiterhin ungeklärt, ob die Veränderungen an der TBM als primär oder
sekundär anzusehen sind. Die Vermutung, daß es sich hierbei um einen primären
Defekt der TBM handelt, wird durch einen schwächer ausfallenden indirekten
Immunfluoreszenznachweis der TBM-Matrixkomponten bei Patienten mit NPH
unterstützt (Cohen und Hoyer, 1986). Dieser Mangel an Antigenstrukturen der TBM
könnte zu einer verminderten mechanischen Compliance der TBM führen. Die
verminderte mechanische Compliance wiederum kann als potentielle Ursache für die
Entstehung von Zysten angesehen werden. Denn im Tierversuch konnte nachgewiesen
werden, daß durch mutagene Schädigung der tubulären Basalmembranzellen eine
verminderte mechanischen Compliance induziert werden kann und es im weiteren
Verlauf auch zur Zystenbildung kommt (Carone et al., 1989).
5
Theorien bezüglich der Zystenbildung beinhalten verschiedene Mechanismen. Zu
diesen zählen die verminderte Compliance der TBM (s. vorangegangener Abschnitt),
durch Epithelhyperplasie verursachte tubuläre Obstruktionen mit nachfolgender
Ausbildung von Tubulusdivertikeln (Waldherr et al., 1983) und der Nachweis von
Zytokinen (Gardner et al., 1991).
In einigen anderen Studien ließ sich ein direkter Zusammenhang zwischen einer
Senkung der intra- bzw. extrazellulären Kaliumkonzentration und vermehrter
Zellproliferation nachweisen (Saeki et al., 1986; Walsh-Reitz et al., 1983; Novak-Hofer
et al., 1988).
Des weiteren wurde ein Zusammenhang zwischen einer erhöhten tubulären Natrium-
Konzentration und einer Zystenausbildung gezeigt (Avner et al., 1985).
1.1.6 Diagnostik
Die Diagnosestellung einer NPH beruht auf der Anamnese, bildgebenden Verfahren
sowie der renalen Biopsie. Bei Vorliegen der typisch klinischen Symptome und bei einer
ev. vorhandenen positiven Familienanamnese sollte eine eindeutige Abgrenzung zu
anderen Nierenerkrankungen erfolgen. Nierenuntersuchungen durch Ultraschall und
Biopsie nehmen hierbei eine wichtige Rolle ein. Als histologisches Charakteristikum für
das Vorliegen einer NPH kann das Vorliegen einer sklerosierenden tubulointerstitiellen
Nephropathie gelten.
Es ist sinnvoll, Eltern und Geschwistern der betroffenen Individuen ebenfalls einer
Untersuchung hinsichtlich des Vorliegens einer NPH zu unterziehen. Dabei ist es
wichtig, außer Ultraschalldiagnostik und Biopsie eine Bestimmung der
Harnkonzentrationsfähigkeit durchzuführen. In einigen Studien wurde nachgewiesen,
daß bei Eltern betroffener Kinder verminderte Harnkonzentrationsfähigkeiten vorlagen
(Brouhard et al., 1977; Herdman et al., 1967; Mangos et al., 1964). Desweiteren sind
bei betroffenen Familien Stammbaumanalysen von Nutzen.
Da bei einem Teil der Erkrankten eine homozygote Deletion auf Chromosom 2q12
nachgewiesen werden konnte (s. Kap. 1.2), kann die Diagnosestellung einer NPH Typ 1
6
auch mittels einer Deletionsanalyse auf PCR-Basis erfolgen. Heterezygote
Deletionsträger sind mit dieser Analyse jedoch nicht detektierbar und diagnostizierbar.
Es gibt andere interstitielle Nephropathien, die von der NPH abzugrenzen sind. Zu
diesen zählen die chronische Pyelonephritis, die Gichtnephropathie (Burke et al., 1982),
die autosomal dominant vererbte (ADPKD) und die autosomal rezessiv vererbte
(ARPKD) polyzystische Nierenerkrankung, die Markschwammniere (Cacchi und Ricci,
1948) und die Nierenhypoplasie mit Oligonephronie (Lennert et al., 1975).
1.1.7 Therapie
Die Therapie der NPH ist rein symptomatisch. Ein möglichst früher Therapiebeginn
sollte angestrebt werden. Dies wird jedoch durch die späte Diagnosestellung der NPH
erschwert. Im Durchschnitt beträgt der Zeitraum zwischen Diagnosestellung und
terminalem Nierenversagen 3 Jahre (Pistor et al., 1985).
Das therapeutische Vorgehen beruht auf folgenden Prinzipien:
Einstellung der renalen Hypertonie
Regulation des Säure-Basenhaushaltes
Korrektur des Wasser-und Elektrolythaushaltes
Korrektur der Anämie z.B. durch Erythropoetingabe
Gabe von Vitamin D und Wachstumshormon
Bei Erreichen des terminalen Nierenversagens sind folgende Schritte indiziert:
Peritoneal- oder Hämodialyse
Nierentransplantation
7
1.2 Genetik
1.2.1 Allgemeine Aspekte
Die NPH stellt eine autosomal rezessive Erkrankung dar. Die Untersuchungen, die seit
der ersten Beschreibung des Krankheitsbildes erfolgten, wiesen bereits früh auf den
genetischen Hintergrund der Erkrankung hin. So wurde festgestellt, daß die Eltern
betroffener Kinder auffallend oft Konsanguinität demonstrierten (Balen und Van
Collenburg). Zudem wurde gezeigt, daß Mädchen und Jungen mit der gleichen
Häufigkeit an NPH erkranken (Waldherr et al., 1982). Ein weiterer Hinweis auf ein
erbliches Geschehen ist die Tatsache, daß bei 29 NPH-Patienten die Verschlechterung
der Nierenfunktion homogen verlief (Gretz et al., 1989). Außerdem wurde beschrieben,
daß sich Nierenversagen bei eineiigen Zwillingen übereinstimmend entwickelte
(Mongeau et al., 1967).
1.2.2 Tiermodelle
1971 wurde zum ersten Mal eine Mauslinie mit dem Namen kd (kidney disease) mouse
als Tiermodell für Nephronophthise beschrieben (Lyon and Hulse, 1971). Dieses Modell
weist ein der NPH sehr ähnliches klinisches und pathohistologisches Erscheinungsbild
auf. Neben den Frühsymptomen wie etwa Polyurie, Polydipsie und verminderte
Harnkonzentrationsfähigkeit, zeigen die kd-Mäuse Zystenausbildung sowie eine
mononukleäre Infiltration (Neilson et al., 1983). Studien, in denen ein T-Zell-Transfer
von kd-Mäusen auf HLA-kompatible Kontrollmäuse ohne Nierenerkrankung stattfand,
führten zu der Vermutung, daß die Inaktivierung der T-Suppressorzellen auslösender
Faktor der Erkrankung ist. Die Inaktivierung der T-Suppressorzellen führt zu einem
Toleranzverlust gegen ein 56 kD großes tubuläres Antigen und sukzessiv zur
Schädigung der tubulären Basalmembran in Form einer Autoimmunnephritis (Kelly und
Neilson, 1987). Die Tatsache, daß der Genlocus der Maus für kd auf Chromosom 10
(vergleichbar mit Chromosom 6 beim Menschen) liegt, der NPH1-Genlocus jedoch auf
Chromosom 2 liegt (s. Kap. 1.2.3), spricht gegen ein homologes Gen als Ursache der
Erkrankung.
8
Ein der Nephronophthise ähnliches Krankheitsbild konnte bei Mäusen festgestellt
werden, bei denen die Expression des Gens für Tensin, einem Signalprotein im
Zytoskelettaufbau, unterdrückt worden war. Diese Tensin-knock-out-Mäuse
entwickelten eine progrediente Nierendegeneration mit Zystenbildung (Lo et al., 1997).
1.2.3 Molekulare Genetik
1.2.3.1 Positionsklonierung des Gens für Nephronophtise
Die genetische Kartierung des Genlocus für NPH erfolgte mit Hilfe von
Kopplungsanalysen. Der Genort für NPH konnte hierbei auf Chromosom 2 lokalisiert
werden (Antignac et al., 1993).
Im weiteren Verlauf wurde durch Haplotypenanalyse einer großen NPH-Familie der
Genort für die Erkrankung auf ein Intervall von 15 cM eingegrenzt. Dieser Abschnitt
wird von den Markern D2S135 und D2S110 flankiert. Die zytogenetischen
Untersuchungen ergaben eine Lokalisation auf Chromosom 2p12-2q13 (Hildebrandt et
al., 1993).
Durch weitere Haplotypenanalysen gelang es, den Genlocus für NPH auf ein Intervall
von 5-7 cM einzugrenzen. Dieses Intervall wird durch die Marker D2S293/D2S340 und
D2S121 in der Region 2q13 begrenzt. Außerdem wiesen 4 von 23 untersuchten
Familien keine Kopplung mit Markern des Chromosom 2 auf. Somit wurde gezeigt, daß
bei NPH Genlocusheterogenie besteht. Aufgrunddessen wurde der Begriff
“Nephronophtise Typ 1” für den gefundenen Genort auf Chromosom 2q13 eingeführt
(Medhioub et al., 1994).
1995 wurden an 12 kleineren NPH1-Familien Haplotypenanalysen durchgeführt. Dabei
wurde ein 8 cM großes Intervall für die NPH1-Region bestimmt. Dieses Intervall wird
von den Markern D2S923 und D2S363 begrenzt. Bei der Untersuchung einer großen
Familie ließ sich der Genlocus zytogenetisch auf die Region zwischen 2q11.1 und
2q12.1 kartieren.
9
Da die begrenzenden DNA-Marker der NPH1-Region gefunden waren, bestand der
nächste Schritt aus dem Aufbau einer physikalischen Karte. Hierzu erfolgte ein
Screening von YACs aus der Mega-YAC-Genbank (Albertsen et al., 1990) mit vier in
der NPH1-Region liegenden Mikrosatellitenmarkern. Mit den so gefundenen
YAC-Klonen ließ sich ein partielles Contig zwischen den Markern D2S160 und IL1A
sowie D2S121 und D2S308 erstellen (Hildebrandt et al., 1995).
Durch die Verwendung neuer Mikrosatellitenmarker an 10 NPH1-Familien konnte die
genetische Karte verfeinert werden: die NPH1-Region konnte bei diesen Familien
zwischen dem proximalen Marker D2S1890 und den distalen Marker D2S1888 auf ein
2 cM großes Intervall eingegrenzt werden. Dieses Intervall mit einer maximalen Größe
von 3,5 Mb wurde durch ein YAC-Contig komplett abgedeckt (Konrad et al., 1995).
Parallel dazu wurde ein vollständiges, 7 Mb umfassendes YAC-Contig erstellt. Dieses
Contig erstreckt sich über die von Medhioub et al., 1994 beschriebenen Markergrenzen
für den NPH1-Genort.
Bei fast 80% der Patienten mit NPH ohne extrarenalen Organmanifestationen wurden
1996 große homozygote Deletionen von etwa 250 kb gefunden. Die Deletion liegt
zwischen zwei duplizierten und gleichzeitig invertierten Regionen. Dabei liegt das
telomerische Ende der Deletion innerhalb der distalen Duplikation (Konrad et al., 1996).
1.2.3.2 Identifikation des Gens für Nephronophtise Typ 1 (NPHP1) durch dieForschungsgruppe Hildebrandt et al., 1997
In der NPHP1-Region wurde zwischen den Markern D2S1893 und D2S1888 ein 30
PAC-Klone umfassendes PAC-Contig erstellt. Hierzu wurden am YAC-Klon 804H10
inter-Alu-PCRs durchgeführt. Mit den so amplifizierten Produkten wurde ein ”Screening”
einer ”PAC-library” vollzogen. Die PAC-Enden wurden ansequenziert und entsprechend
kartiert. Insgesamt wurden 36 neue STS-Marker (sequence-tagged-site markers)
generiert. Dies ließ das Erstellen einer hochauflösenden physikalischen Karte zu. Die
Deletionsregion konnte durch 8 aufeinanderfolgende Marker abgedeckt und von den
PAC-Klonen 107o20, 62p20 und 146c2 überspannt werden. Zusätzlich konnten 7 EST
(expressed sequence tag)-Klone in die NPHP1-Region kartiert werden. Zwei dieser
10
sieben EST-Klone (zc07a11 und yy63e10) lagen in der Deletionsregion und stellten
daher sehr gute Kandidaten für das Nephronophthise-Gen dar (Nothwang et al., 1998).
12
Die Abbildung 1.1 zeigt das YAC/PAC-Contig und die transkriptionelle Karte der
kritischen NPHP1-Region auf Chromosom 2q12-q13 (Abb. entnommen aus Nothwang
et al., 1998).
A: hier wird die Anordnung aller STS-Marker gezeigt. Die Marker D2S1893 und
D2S1888, welche die NPHP1-Region flankieren, sind eingerahmt. Zwischen den
flankierenden Markern befinden sich zwei weitere Kästchen. Die darin angeführten
Marker befinden sich in der proximalen bzw. distalen Duplikation.
B: das minimale YAC-Contig, welches die kritische NPHP1-Region überspannt
C: die neuen STS-Marker zu sehen, die von PAC-Endsequenzen abgeleitet sind
(ausgefüllte Kreise: von T7-Primern abgeleitet, leere Kreise: von SP6-Primern
abgeleitet)
D: Das PAC-Contig: die horizontalen Linien sind PACs, die vertikal gestrichelten Linien
zeigen STS-Marker, welche mit den jeweiligen PAC-Klonen ein positives
Hybridisierungssignal ergaben
E: Partielle transkriptionelle Karte: Gene oder ESTs sind durch ausgefüllte Dreiecke
gekennzeichnet. Konnte die Transkriptionsrichtung festgestellt werden, so zeigen die
Dreiecke in die jeweilige Richtung. Die minimale homozygote Deletionsregion wird
durch einen Kasten gekennzeichnet.
Isolierung von NPHP1 cDNAsDurch Vergleich von PAC-Endsequenzen wurden zwei EST-Klone identifiziert, yy63e10
und zc07a11. Diese ESTs waren bei NPH-Patienten deletiert. Daraufhin wurde mit einer
aus zc07a11 generierten Sonde eine cDNA-Bank des menschlichen fetalen Gehirns
untersucht. Der Klon EO1 mit einer Länge von 3961 bp wurde isoliert und sequenziert.
Die Exon-Intron-Strukur wurde aufgeklärt. Es konnten 20 Exone gefunden werden, von
denen 18 eine durchschnittliche Größe von 95 bp hatten. Bei Exon 8 entdeckte man,
daß der offene Leserahmen an einem Stop-Codon endete. Dies führte zu dem
Verdacht, daß das Exon 8 bei der Transkription des Gens fakultativ herausgespleißt
werden konnte. Um den längsten offenen Leserahmen des Gens darstellen zu können,
wurde in einer Skelettmuskel-mRNA Genbank eine PCR zwischen den Exonen 7 und 9
durchgeführt. Dabei fand man einen Klon (EO3), bei dem die Sequenz, welche das
Stop-Codon enthielt, herausgespleißt war und der offene Leserahmen erhalten blieb.
13
Expression von NPHP1Eine Northern-Blot Analyse des cDNA-Klons ergab ein 4,5 kb langes mRNA Signal, das
vor allem im Skelettmuskel, aber auch schwach in Herz-, Nieren und Pankreasgewebe
nachweisbar war.
Sequenzhomologien zu SH3 DomänenMittels des BLAST-Programmes (National Center of Biological Information-NCBI)
wurden Datenbankvergleiche erstellt. Es konnten Sequenzhomologien der Exone 5 und
6 mit der src homologen Domäne 3 (SH3) aufgezeigt werden. SH3-Domänen sind
hochkonservierte Regionen. Sie kommen beispielsweise in GRB2-Proteinen bei
Mäusen und beim Menschen sowie in Proteinen von Caenorhabditis elegans und
Schizosaccharomyces pombe vor. Weitere Homologien die cDNA-Sequenz und die
davon abgeleitete Aminosäuresequenz betreffend konnten nicht gefunden werden.
Somit stand fest, daß ein neues Gen, NPHP1, gefunden war, das keinerlei
Verwandtschaft zu einer bisher bekannten Genfamilie aufweist.
Exon-Intron-Struktur des GensDie Exon-Intron-Struktur des Gens ist in Abb.1.2 dargestellt.
Charakterisierung der DeletionZur Durchführung der Deletionsanalysen wurde die genomische DNA von 22 multiplex
NPH Familien, die Kopplung mit NPHP1 aufwiesen, mit STS-Markern untersucht. Dabei
stellte sich heraus, daß 15 NPH Familien für die folgenden 8 STS-Marker deletiert
waren: cen-804/6-Zcb90-Zcb241-107o20S-146c2T-62p20T-765F2L-9657T7C-tel. Der
gemeinsame proximale Bruchpunkt der Deletion befand sich somit zwischen den
STS-Markern 9681S und 804/6. Für Familie 12 wurde ein alternativer proximaler
Bruchpunkt zwischen den STS-Markern Zcb90 und Zcb241 gefunden. Dieser
alternative Bruchpunkt befindet sich zwischen Exon 2 und Exon 3.
Der distale Bruchpunkt wurde auf das Intervall zwischen den Primern 57T7C5 und
57T7D eingegrenzt. Die distale Deletionsregion enthält den Großteil der NPHP1 3‘
untranslatierten Region, da der Marker HILZCB (5/2), der direkt nach dem Alu-Repeat
der 3‘ untranslatierten Region kartiert, ebenfalls deletiert ist.
Hiermit konnte gezeigt werden, daß fast das gesamte NPHP1-Gen bei den meisten
NPH Familien homozygot deletiert war.
14
Identifikation von MALLDas Intervall zwischen dem 3‘-Ende des Gens und dem telomerischen Ende der
Deletion hatte eine Länge von 11 kb. Diese 11 kb wurden sequenziert und durch
Datenbankvergleich auf kodierende Sequenzen hin untersucht. Dabei wurde das erste
Exon eines bekannten EST, MALL (”MAL-like”) genannt, gefunden. MALL weist 60%
Sequenzhomologie zum MAL-Gen, welches das T-Lymphozyten Reifungsprotein
kodiert, auf. Es stellte sich heraus, daß MALL sowie das MAL-Gen aus vier Exonen
bestehen.
Mutationsanalysen bei NPHP1-PatientenDa bei 16 von 22 multiplex Familien sowohl NPHP1 als auch MALL deletiert waren,
waren beide Gene Kandidaten für das Nephronophthise Typ-1 Gen. Um zu zeigen, ob
der Funktionsverlust beider Gene oder Mutationen in einem der beiden Gene
ausreichend ist für die Expression des NPH1-Phänotyps, wurden Patienten ohne
homozygote Deletion auf Punktmutationen hin untersucht. Mit der single-strand
conformation polymorphism (SSCP) Analyse wurde bei drei Familien eine heterozygote
paternale Deletion kombiniert mit einer heterozygoten maternalen Punktmutation
gefunden. Diese Punktmutationen im maternalen Allel führten in zwei Fällen zum
Verlust einer Spleißstelle und in einem Fall zu einer Nonsense-Mutation. Es fanden sich
keine Mutationen in den vier Exonen des MALL-Gens. Diese Ergebnisse sprachen stark
dafür, daß rezessive Mutationen im NPHP1-Gen für die Ausprägung des
NPHP1-Phänotyps notwendig sind (Hildebrandt et al., 1997).
16
Abb.1.2 zeigt die genomische Struktur und die cDNA der Gene NPHP1 und MALL.
Exons sind als Rechtecke, Introns als Circumflexe, Alu-Sequenzen als vertikal
schraffierte Rechtecke dargestellt.(Abbildung entnommen aus Hildebrandt et al., 1997).
a: Position der potentiellen SH3-Domäne
b: Zusammengesetzte NPHP1-cDNA (aus den Sequenzen der cDNA-Klone c-f), die
den längsten offenen Leserahmen enthält. Die Exongröße in bp ist unterhalb der Exone
angegeben. In Exon 20 befindet sich ein TGA-Stop-Codon, an das sich eine 1380 bp
große 3‘-untranslatierte Region (3‘UTR) anschließt, die vier potentielle
Polyadenylierungssignale enthält.
c: der cDNA-Klon EO1 stellt möglicherweise eine unvollständig gespleißte prä-mRNA
dar, da im zweiten Teil des Exons 8 (genannt Exon 8‘) ein Stop-Codon (TAA) und ein
Polyadenylierungssignal (AATAAA) aus dem Transkript nicht herausgespleißt wurden.
Um Exon 9 zu spleißen, wird eine Splice-Donor-Stelle, die sich an ein Alu-repetitives
Element anschließt, genutzt. Vor dem Poly-A-Schwanz befindet sich kein normales
Polyadenylierungssignal, sondern eine A-reiche Region wie sie für Alu-repetitive
Elemente typisch ist.
d: EST yy63e10 stellt ein kurzes alternatives Transkript dar, das mit Exon 7 beginnt und
das Stop-Codon sowie das Polyadenylierungssignal von Exon 8‘ verwendet.
e: EST zc07a11 benutzt das erste Polyadenylierungssignal von Exon 20 und enthält vor
Exon 9 eine chimärische Sequenz. Diese Sequenz ist nicht Bestandteil des
NPHP1-Gens, da sie in keinem PAC-Klon der NPHP1-Region vorhanden ist.
f: Klon EO3 stellt ein RT-PCR-Produkt zwischen den Primern zcb(3)730 (von Exon 7)
und zcb1365 (von Exon 9) dar. Die Sequenzierung dieses Klons zeigte, daß es sich bei
Klon EO1 um ein unvollständig gespleißtes Transkript handelt.
g: Die Probe A wurde für die Northern Blot Analyse und zur Isolierung des Klons EO1
verwendet. Sie repräsentiert ein 1,114 kb großes PCR-Produkt aus der 3‘-kodierenden
Sequenz zwischen den Primern 146c2T-5 und Zco7A11-3.
h: Position der 4 Exone des MALL-Gens
i: Darstellung der PAC-Klone der NPHP1-Region
k: Position der STS-Marker der NPHP1-Region
l: Ausdehnung der gemeinsamen homozygoten Deletion in 15 NPH Typ1-Familien
17
1.2.3.3 Identifikation des Gens für Nephronophtise Typ 1 (NPHP1) durch dieForschungsgruppe Saunier et al., 1997
Noch im selben Jahr definierten Saunier et al. (1997) ein minimales Deletionsintervall,
das durch die drei BAC-Klone 183K24, 187E16 und 96G18 komplett abgedeckt wurde.
Durch Sequenzieren, cDNA-Selektion und computergesteuerte Analyse gelang es, zwei
transkriptionelle Einheiten zu charakterisieren: eine Einheit, genannt BENE (entspricht
“MAL” bei Hildebrandt et al., 1997). Es kodiert für ein MAL-ähnliches Protein
(T-Lymphozytenreifungsprotein). Das andere ist ein Gen, welches für 730 AS großes
Protein, das eine putative SH3-Domäne besitzt, kodiert. Letzteres wurde als NPH1-Gen
identifiziert, da ebenso wie bei Hildebrandt et al., 1997, die Kombination einer großen
Deletion in einem Allel und einer Punktmutation im anderen Allel zur Ausprägung des
NPH-Phänotyps führt.
Im Gegensatz zu Hildebrandt et al. kam bei der Forschungsgruppe Saunier et al., 1997
die Pulsfeldgelelektrophorese-Technik (PFGE) zum Einsatz (s. Kap. 5.3).
Durch den Einsatz von Markern, die aus BAC-Endsequenzen generiert waren, konnten
mittels PFGE bei 24 Patienten mit NPH homozygote Deletionen im NPH1-Bereich
nachgewiesen werden. Dazu wurde die Patienten- DNA mit dem Restriktionsenzym SfiI
verdaut und die Probe 921H4R, die in der Duplikation liegt, verwendet. Hierbei wurde
das normale 95 kb große zentromerische Fragment detektiert, nicht aber das normale
65 kb große telomerische Fragment.
Mit der Probe 183K24B, die in der Duplikation liegt, zeigten alle 24 Patienten das
normale 50 kb große zentromerische Fragment, aber nur 8 von ihnen das normale
75 kb große telomerische Fragment. Somit wurde demonstriert, daß unterschiedlich
große Deletionen vorliegen. Die minimale Deletionsregion für NPH1 ließ sich auf ein
Intervall von 205 kb zwischen zwei SfiI-Restriktionsschittstellen festlegen.
Für den telomerischen Deletionsbruchpunkt wurde postuliert, daß er in der
telomerischen Duplikation im Intervall zwischen den Markern 96G18B und 183K24B
liegt (hierzu s. Abb.1.3, entnommen aus Saunier et al., 1997).
18
A: Physikalische Karte der NPH1-Region. STS-Positionen und
SfiI-Restriktionsschnittstellen (F) sind durch vertikale Linien gekennzeichnet. Die
invertierte Duplikation ist durch Pfeile gekennzeichnet.
B: Das BAC-Contig, welches die Deletionsregion und das minimale Deletionsintervall
abdeckt. Die BAC-Klone, die sequenziert wurden, sind unterstrichen. Das minimale
Deletionsintervall von ca. 205 kb ist als weißes Rechteck dargestellt, die telomerische
Bruchpunktregion als liniertes Rechteck und die nicht deletierten Bereiche als
schwarze Rechtecke dargestellt.
C: Transkriptionelle Karte NPH1 Deletionsregion. Die genomischen Strukturen der
NPH1-Kandidatengene, BENE, IMAGE-Klone ID 179152 und ID 70593 und das
Pseudogen α-Centraktin sind eingezeichnet. Die telomerische Kopie der Duplikation ist
als schwarzes Rechteck dargestellt.
Abb.1.3
19
2. ZIELSETZUNG
Nach der Identifikation des Gens für Nephronophthise Typ 1 (s. Kap.1) galt der näheren
Charakterisierung der Deletionsregion und die Eingrenzung der Bruchpunktregion
besonderes Interesse. Daraus ergaben sich für diese Arbeit folgende Zielsetzungen:
1. Mit Hilfe genomischer Southern Blot Analysen sollten – alternativ zur PCR-Technik –
bei Familien mit Nephronophthise Deletionen nachgewiesen werden. Die
Deletionsanalyse mittels Southern Blot ist insofern bedeutend, da sie im Gegensatz zur
PCR-Deletionsanalyse durch Dosiseffekt den Nachweis heterozygoter Deletionen
erlaubt.
2. Durch Einsatz verschiedener Sonden, die in der Nähe des vermuteten Bruchpunktes
lagen, sollten die Deletionsbruchpunkte näher eingegrenzt werden.
3. Bei Familie 12, die eine kürzere Deletion aufweist, sollte der Deletionsbruchpunkt
identifiziert werden. Durch Detektion von junction fragments mit Hilfe des genomischen
Southern Blots sollten Aussagen über unterschiedliche Deletionen und die maximale
Entfernung der verwendeten Marker zum Bruchpunkt gemacht werden.
4. Durch nähere Eingrenzung der Deletionsbruchpunkte sollte nach
Pathomechanismen, die für die Deletion verantwortlich sein könnten, gesucht werden.
20
3. MATERIAL UND METHODEN
3.1 Patienten
Blutproben und Stammbäume aus Familien mit isolierter NPH, d.h. NPH ohne
extrarenale Manifestationen, wurden nach der Einwilligung der jeweiligen Patienten
gewonnen. Die Diagnosestellung einer NPH erfolgte durch einen Nephrologen. Dabei
diente als diagnostisches Kriterium die Entwicklung eines terminalen Nierenversagens
nach einer anfänglichen Symptomatik mit Polyurie, Polydipsie, verminderter
Harnkonzentrationsfähigkeit, Anämie und Wachstumsretardierung. Die Diagnose wurde
in allen Familien durch eine renale Biopsie bestätigt.
3.2 Genomische DNA
Genomische DNA wurde aus Lymphozyten nach Standardmethoden isoliert (Sambrook,
Fritsch, Maniatis, 1987). Die Lymphozyten wurden entweder direkt aus Venenblut oder
aus nach EBV-Transformation der Zellen angelegten Lymphozytenkulturen gewonnen.
3.2.1 EBV-Transformation von Lymphozyten
Um mehrfache Blutentnahmen bei den betroffenen Familien zu vermeiden, wurden die
Lymphozyten mit dem Epstein-Barr-Virus immortalisiert. Die mit EBV transformierten
Zellen können auch nach jahrelanger Aufbewahrung unter Tiefkühlbedingungen zur
DNA-Extraktion angezüchtet werden. Somit ist eine langfristige Verfügbarkeit der DNA
gewährleistet. Für die Transformation der Zellen wurde ein Protokoll angewandt,
welches von Ventura und Mitarbeitern (1988) eingeführt, sowie durch Zimmer (1989)
weiterentwickelt und modifiziert wurde.
Dabei wurden zu 2 ml einer heparinisierten, bei Raumtemperatur belassenen
Venenblutprobe 20 ml RMPI-Medium (RMPI-Medium mit 2 g/l NaHCO3, Fa. Seromed)
hinzugegeben und in einem verschlossenen Zentrifugenröhrchen 10 min lang bei
1400 UpM zentrifugiert. Der Überstand wurde mit einer sterilen Pipette abgesaugt und
verworfen. Dann wurde das Pellet in 0,75 ml RMPI und 20 %igem fetalen Kälberserum
21
resuspendiert. Anschließend wurden aus einer im Labor dauerhaft gezüchteten,
EBV-infizierten Affenzellkultur 2 ml zellfreier EBV-haltiger Mediumüberstand
entnommen, steril filtriert und der Probe zugegeben.
Die Anzüchtung der Zellen erfolgte in vier getrennten Ansätzen. In 25cm3-
Triangularflaschen (“Falcon”, Fa. Becton Dickinson, Heidelberg) wurden jeweils 2,5 ml
RMPI, supplementiert mit 20 %igem fetalem Kälberserum, vorgelegt. Danach wurden je
0,3 ml, 0,6 ml und 1,2 ml von der Zell-Virussuspension hinzugefügt. Diese Ansätze
wurden in einer 5 %igen Kohlendioxidatmosphäre bei 37 °C bebrütet. Das Medium
wurde 2 Mal pro Woche gewechselt, so daß nach ca. 2 bis 4 Wochen eine Zelldichte
von 5x105 Zellen/ml erreicht wurde. Der Zellklon konnte dann mit 10 %igem
Dimethylsulfoxid bei -70 °C eingefroren und zur dauerhaften Konservierung in flüssigem
Stickstoff bei -170 °C gelagert werden.
3.2.2 DNA-Extraktion mittels Ionenaustauschersäulen
Für die Extraktion der DNA wurde das Präparationskit der Firma Qiagen GmbH/Hilden
verwendet. Durch diese Methode läßt sich DNA sowohl aus Vollblut als auch aus
isolierten Lymphozyten gewinnen. Dabei ergeben sich Fragmente zwischen ca. 50 und
140 kb. Da die Effizienz der Extraktion großen Schwankungen unterliegt, liegt die DNA-
Ausbeute aus 5 ml Vollblut zwischen 10 und 100 µg.
Lyse
Bei der Lyse der zellulären Bestandteile des Blutes ist eine Stabilisierung der
Kernmembran nötig, um die DNA vor einer chemischen Degradation zu schützen.
Dabei wurden je 5 ml Vollblut mit jeweils 5 ml eiskalter C1-Pufferlösung (1 Teil) sowie
jeweils 15 ml sterilem Aqua bidest. (3 Teile) vermischt. Die Probe wurde in einem
verschlossenen 50 ml-Reagenzröhrchen 10 min lang auf Eis inkubiert. Das lysierte Blut
wurde bei 4° C für 15 min bei 3300 UpM zentrifugiert. Nach Dekantieren des
Überstandes wurde das Pellet mit 1 ml eiskaltem C1-Puffer und mit 3 ml eiskaltem,
sterilem Aqua bidest. (3 Teile) versetzt und anschließend resuspendiert. Unter gleichen
Bedingungen wurde erneut zentrifugiert und der Überstand verworfen. Zum Pellet
wurden 5 ml G2-Extraktionspuffer gegeben. Die Probe wurde mit dem Vortex-Mischer
22
resuspendiert. Nach Zugabe von 100 µl des Enzyms Proteinase K (20 mg/ml,
Fa. Merck, Darmstadt) wurde der Reaktionsansatz über Nacht (ca. 8 h) im 50° C
warmen Wasserbad inkubiert. Dabei dienten die beiden letzten Schritte der Lyse der
Kernmembranen und des Verdaus von Kernproteinen (Histone, kernspezifische
Enzyme).
Extraktion und Aufreinigung
Auf ein steriles 50 ml-Reagenzröhrchen wurde eine Qiagen-Ionenaustauschersäule
gesetzt und mit 4 ml QBT-Puffer äquilibriert. Dabei erfolgte der Durchfluß des Puffers
nur durch Schwerkraft und Kapillarkraft. Die Probe wurde mit dem Vortex-Mischer
gemischt und komplett auf die Säule gegeben. Nachdem die Probe die Säule passiert
hatte, wurde die Säule mit 10 ml QC-Puffer gewaschen. Im Anschluß daran wurde die
Säule auf ein neues, steriles Reagenzröhrchen gesetzt. Die DNA wurde aus dem
Austauscherharz mit 5 ml QF-Elutionspuffer eluiert.
Präzipitation
Zum Eluat wurden 3,5 ml (0,7 Teile) eiskaltes Isopropanol hinzugegeben. Die DNA
wurde durch manuelles Schütteln sichtbar präzipitiert. Dann wurde bei 4° C 15 min mit
5500 UpM zentrifugiert. Nach Verwerfen des Überstandes wurde die DNA mit 1 ml
eiskaltem 70 %igem Ethanol gewaschen, in ein Eppendorf-Röhrchen überführt und ein
letztes Mal bei 14000 UpM pelletiert. Der Überstand wurde abpipettiert und die
erhaltene DNA 5 bis 10 min bei Raumtemperatur luftgetrocknet. Das nun sichtbare
Pellet wurde in 300 µl TE-Puffer aufgenommen. Der Lösungsprozeß wurde durch die
kontinuierliche Durchmischung auf dem Schüttler beschleunigt.
Photometrische Konzentrationsbestimmung von DNA
Um die Konzentration der erhaltenen DNA zu bestimmen, wurde ein Aliquot (5 oder
10 µl) aus der Präparation entnommen, mit Wasser auf 500 µl (1:50 oder 1:100
Verdünnung) aufgefüllt und daraufhin in eine saubere Glasküvette überführt. Nun wurde
23
die DNA Konzentration der wässrigen Lösung durch Extinktionsmessung bestimmt.
Dabei entspricht eine Extinktion E260 nm von 1,0 einer Konzentration von 50 µg/ml an
doppelsträngiger DNA. Mit der Messung bei E280 nm und dem Bilden des Quotienten aus
E260 nm : E280 nm ließ sich die Verunreinigung der Probe mit Protein beurteilen. Eine
Verunreinigung lag bei Werten unter 1,7 vor.
3.3 Plasmidpräparation
PAC-Klone aus der NPHP1-Region wurden in Glycerin-Stocklösungen (0,85 ml LB-
Medium, 0,15 ml steriles Glycerin) bei -80° C aufbewahrt. Zur DNA-Präparation wurden
kleine Mengen Stocklösung steril entnommen, in das Nährmedium gegeben und
inkubiert. Die amplifizierten Plasmide konnten daraufhin der DNA-Präparation
unterzogen werden.
3.3.1 Plasmidpräparation nach Chowdhury
Die Methode von Chowdhury (1991) dient der Präparation von kleineren Plasmid-
Mengen. Hierzu wurden 0,5 ml Kulturen (LB- oder TB-Nährlösungen versetzt mit dem
entsprechenden Antibiotikum) in sterilen 10 ml Glasröhrchen mit 250 UpM bei 37° C
über Nacht (9-15 h) inkubiert. Jeweils 0,5 ml der gewachsenen Kulturen wurden in
Eppendorf-Röhrchen überführt und mit 0,5 ml Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol
(25:24:1) versetzt. Der Ansatz wurde auf dem Vortexer gemischt und anschließend
5 min bei 15000 UpM zentrifugiert. Nun konnten 0,45 ml des oberen wässrigen
Überstandes vorsichtig abgenommen werden und in einem Eppendorf-Röhrchen mit
0,5 ml Isopropanol gefällt werden (Mischen mit dem Vortexer, 5 min Zentrifugation bei
15000 UpM). Danach wurde der Überstand dekantiert und das Pellet mit 0,5 ml
70 %igem Ethanol gewaschen (Mischen mit dem Vortexer, 5 min Zentrifugation bei
15000 UpM ). Im Anschluß daran wurde das Ethanol abpipettiert und das Pellet im
geöffneten Eppendorf-Röhrchen für ca. 3-5 min luftgetrocknet. Schließlich wurde das
Pellet in 30-50 µl TE-Puffer, bzw. Aqua bidest. gelöst. Es ließen sich hierbei bis zu 3 µg
Plasmid- DNA gewinnen.
24
3.3.2 Plasmidpräparation nach Birnboim und Doly
Die Plasmidpräparation nach Birnboim und Doly (1979) dient der Gewinnung größerer
Mengen hochreiner Plasmid-DNA. Diese Methode basiert auf dem Prinzip der
alkalischen Lyse chromosomaler DNA. Bei einem pH-Wert von 12-12,5 kann
chromosomale DNA denaturiert und ausgefällt werden, während die ringförmige
Plasmid-DNA als Doppelstrang erhalten bleibt. Über eine Ionenaustauschersäule läßt
sich diese DNA extrahieren. Zu diesem Zweck wurde das Midi Plasmid-Extraktionskit
(Fa. Qiagen) verwendet. Die im zugehörigen Qiagen Plasmid Handbuch beschriebene
Vorgehensweise wurde wie folgt modifiziert:
Aus Glycerin-Stockkulturen wurden Bakterien entnommen und in 2 ml LB- bzw TB-
Nährmedium inokuliert. Das Antibiotikum Kanamycin wurde der Lösung in einer
Konzentration von 25 µg/ml Nährmedium beigegeben. Der Ansatz wurde für ungefähr
8 h mit 250 UpM bei 37° C inkubiert. Diese Tageskulturen wurden in ein größeres
Medium-Volumen (60 ml) der gleichen Lösung transferiert und über Nacht unter
gleichen Bedingungen erneut inkubiert (12-16 h). Danach wurden die Ansätze in
Zentrifugenbecher (230 ml) gegeben und bei 3800 UpM und 4° C für 15 min
zentrifugiert (“Sorvall”). Der Überstand wurde dekantiert und das gewonnene Pellet mit
eiskaltem STE-Puffer resuspendiert. Unter Verwendung kleinerer Zentrifugenröhrchen
(35 ml) erfolgte eine weitere Zentrifugation unter gleichen Bedingungen. Nach
Dekantieren des Überstandes wurde dem Pellet 7,5 ml P1-Puffer mit RNAse A
zugegeben. Das Pellet wurde sorgfältig resuspendiert, so daß eine homogene Lösung
ohne Zellklumpen entstand. Durch die Zugabe von P2-Puffer und mehrfachem kräftigen
Schütteln wurden die Bakterien vollständig lysiert und die DNA sowie die Proteine
denaturiert. Um eine irreversible Denaturierung der Plasmide zu vermeiden, mußte
dieser Vorgang innerhalb von 5 min erfolgen. Der nächste Schritt bestand aus der
Addition von eiskaltem Neutralisationspuffer P3. Nach sofortigem Schütteln wurde das
Röhrchen 15 min auf Eis gelagert, wobei zusätzlich gelegentlich geschüttelt wurde.
Danach wurde bei 12000 UpM und 4° C für 30 min zentrifugiert (High-Speed-“Sorvall”).
Der DNA-haltige Überstand wurde vorsichtig in ein neues Zentrifugenröhrchen
transferiert und erneut bei 13000 UpM und 4° C für 30 min zentrifugiert. Der Überstand
wurde erneut überführt und die darin enthaltene Plasmid-DNA mit dem 0,7 fachen
Volumen (15 ml) Isopropanol gefällt. Die gefällte DNA wurde nach kurzem Schütteln für
30 min bei 12000 UpM und 4° C abzentrifugiert. Das Pellet wurde in 0,5 ml TE-Puffer
25
gelöst, mit 3,5 ml QBT-Puffer versetzt und bei 12000 UpM für 2 min zentrifugiert.
Parallel hierzu erfolgte die Vorbereitung der „Qiagen tip 100 Säulen“ aus dem Qiagen
Kit. Die Säulen wurden mit 4 ml QBT-Puffer äquilibriert. Anschließend wurde das
QBT/DNA-Gemisch auf die Säule gegeben. Der Fluß erfolgte aufgrund der Schwerkraft
sowie der Kapillarkraft. Die an die Säule gebundene DNA wurde durch zweimaliges
Hinzufügen von je 10 ml QC-Puffer gewaschen. Die Säule wurde an ihrem unteren
Ende dicht mit Parafilm verschlossen. Nun wurden 5 ml, auf 37° C vorgewärmter, QF-
Puffer auf die Säule gegeben. Nach 10 min wurde der Parafilm entfernt und das
QF/DNA-Gemisch in ein frisches Zentrifugenröhrchen (35 ml) eluiert. Die Probe wurde
mit 2,5 fachen Volumen an 100 %igem Ethanol gefällt (Schütteln, 30 min bei 4° C,
zentrifugieren in “Sorvall”, 12000 UpM). Das weiße Pellet (wegen des hohen
Salzgehaltes) wurde mit 300 µl 70 %igem Ethanol gewaschen und bei 12000 UpM für
3 min zentrifugiert. Anschließend wurde das oftmals nicht mehr sichtbare Pellet in
0,5 ml TE-Puffer aufgenommen und in ein 1,5 ml-Röhrchen überführt. Es erfolgte eine
weitere Präzipitation mit dem 0,1fachen Volumen an 3 M Natriumacetat und dem
2,5fachen Volumen an 100 %igem Ethanol. Danach wurde mit 70 %igem Ethanol
gewaschen und bei 12000 UpM für 3 min zentrifugiert (“Haereus”). Schließlich konnte
das Pellet in 30-50 µl TE-Puffer aufgenommen werden. Die Proben wurden über Nacht
bei Raumtemperatur auf dem Schüttler durchmischt, so daß sich die Pellets komplett
lösen konnten. Bis zur Weiterverarbeitung wurde die DNA bei 4° C gelagert. Mit dieser
Methode ließen sich 50-100 µg hochreine Plasmid-DNA gewinnen.
Wenn nur kleine Mengen hochreiner DNA benötigt wurden, wurde das „Qiagen Mini Kit“
verwendet. Dabei wurden strikt die Angaben des Herstellers beachtet (Qiagen Plasmid-
Handbuch). Unter Verwendung von 3 ml Kulturen (LB Nährmedium) konnten bis zu
30 µg hochreine DNA extrahiert werden.
Für die photometrische Bestimmung des DNA Gehaltes der erhaltenen Probe wurde ein
Aliquot (5 µl) entnommen, mit sterilem Wasser auf 500 µl (1:100 Verdünnung) aufgefüllt
und die Extinktion im Photometer, wie schon in Kapitel 3.2.2 (s. unter photometrische
Konzentrationsbestimmung von DNA) beschrieben, gemessen.
26
3.4 Präzipitation von DNA
Mit der Fällung der DNA in wässriger Lösung wurde eine Konzentrierung und eine
Reinigung der DNA erzielt. Angewandt wurden sowohl Ethanol, -als auch Isopropanol-
Fällungen.
3.4.1 Ethanolfällung
Die wässrige DNA-Lösung wurde mit 2,5 Volumina eiskaltem 100 %igem Ethanol und
mit 1/10 Volumen 3 M Natriumacetat (pH 5,3) bzw. mit ½ Volumen 7,5 M
Ammoniumacetat versetzt. Daraufhin wurde der Ansatz kurz geschüttelt und für 20 min
bei –20° C inkubiert. Anschließend wurde für 15 min bei 15000 UpM mit der Eppendorf-
Zentrifuge (“Haereus”) zentrifugiert, der Überstand vorsichtig abpipettiert, und das
erhaltene Pellet mit 500 µl 70 %igem Ethanol gewaschen. Nach erneuter kurzer
Zentrifugation und Verwerfen des Überstandes wurde das Pellet 5-10 min
luftgetrocknet. Schließlich wurde das Pellet in TE-Puffer gelöst und im Kühlschrank bis
zum Gebrauch gelagert.
3.4.2 Isopropanolfällung
Bei dieser Methode wurde der salzhaltigen DNA-Lösung 0,7 Volumina Isopropanol
hinzugefügt. Nach kurzem Schütteln und mindestens 10 minütiger Inkubation bei
Raumtemperatur wurde in der Eppendorf-Zentrifuge für 15 min bei 15000 UpM
zentrifugiert. Das Pellet wurde mit 500 µl 70 %igem Ethanol gewaschen. Es wurde
erneut kurz zentrifugiert, der Überstand verworfen, das Pellet kurz luftgetrocknet und in
TE-Puffer gelöst.
3.5 Verdau von DNA mit Restriktionsendonukleasen
3.5.1 Verdau von PAC-Klonen
PAC-Klone , P1-related artificial chromosomes, sind DNA-Klonierungssysteme in der
Zelle. Durch Verwendung von Teilen des Bakteriophagen P1 sowie des F (Fertiltäts)-
27
Plasmids wird die DNA durch extrakorporation in die Zellen eingeschleust (Strachan
und Read, Molekulare Himangenetik, 1996).
Der für den Southern Blot bestimmte Restriktionsverdau wurde mit 0,1-0,25 µg PAC-
DNA (pro Gelspur) durchgeführt. Um einen kompletten Verdau zu erzielen, wurden pro
µg DNA 3 Einheiten (Units “U”) des jeweiligen Restriktionsenzyms eingesetzt. Waren
die zu pipettierenden Volumina der Restriktionsenzyme zu klein ( z.B. bei einem Enzym
mit 25 U/µl), wurden 0,1 µl des jeweiligen Enzyms eingesetzt. Der Reaktionsansatz sah
folgendermaßen aus:
PAC-DNA X µl (100 ng)
Restriktionsenzym X µl (0,3 U)
Restriktionsenzympuffer (10x) 4 µl
Aqua dest. ad 40 µl
Der Reaktionsansatz wurde vorsichtig gemischt und für mindestens 2 h in ein
Schüttelwasserbad gestellt. Somit konnte der Verdau bei der für das Enzym optimalen
Temperatur erfolgen. Anschließend wurden die Reaktionsansätze mit Ladepuffer
gemischt und auf ein Agarosegel aufgetragen .
3.5.2 Verdau von genomischer DNA
Beim Verdau von genomischer DNA wurden 20 µg DNA pro Reaktionsansatz
verwendet. Es wurden pro µg DNA 3 U des entsprechenden Enzyms dazugegeben. Der
Reaktionsansatz sah folgendermaßen aus:
DNA X µl (20 µg)
Restriktionsenzym 2 x 30 U
Restriktionsenzympuffer (10x) 40 µl
Aqua dest. ad 400 µl
Zur Vermeidung eines inkompletten Verdaus wurde dem Reaktionsansatz (DNA, Aqua
dest., Restriktionsenzympuffer) unter vorsichtigem Umrühren zuerst die Hälfte der
benötigten Menge an Enzym beigemischt. Dieser Reaktionsansatz wurde für eine
28
Stunde bei der für das Enzym optimalen Temperatur im Schüttelwasserbad inkubiert.
Anschließend wurde die zweite Hälfte der benötigten Menge desselben Enzyms
hinzugefügt. Dieser Ansatz wurde über Nacht im Schüttelbad belassen (14-18 h). Dem
Verdau folgte das Auftragen der Proben auf ein Agarosegel. Da die Taschen des Gels
nur ein Volumen von maximal 50 µl faßten, das Volumen des Reaktionsansatzes
jedoch 400 µl betrug, war eine Konzentrierung des Ansatzes durch Präzipitation
erforderlich. Die Präzipitation erfolgte mit 0,1 Volumen 3 M Natriumacetat und
2,5 Volumen 100 %igem Ethanol. Der Ansatz wurde 20 min bei -20° C inkubiert und
anschließend in der Eppendorf-Zentrifuge zentrifugiert (“Haereus”, 20 min bei
15000 UpM). Nach vorsichtigem Abpipettieren des Überstandes wurde das Pellet kurz
luftgetrocknet und in 40 µl TE-Puffer aufgenommen. Anschließend wurde die Probe bei
geöffnetem Deckel für 10 min in ein 70° C warmes Schüttelwasserbad gestellt. Dadurch
konnte die Probe von den verbliebenen Ethanolrückständen befreit werden. Danach
konnten die Proben mit Ladepuffer gemischt und zur elektrophoretischen Auftrennug
auf ein Agarosegel aufgetragen werden.
3.6 Agarose-DNA-Gelelektrophorese
Mittels DNA-Gel-Elektrophorese wurden sowohl präparierte als auch amplifizierte DNA
oder durch Restriktionsverdau entstandene DNA-Fragmente untersucht. Dabei ließen
sich die Größe der DNA-Fragmente ermitteln sowie DNA-Mengen und DNA-Reinheit
abschätzen.
Dafür wurden in Abhängigkeit von der zu erwartenden Fragmentgröße Gele mit
0,7-1,5 % Agarose gegossen. Dabei wurden 50 ml bzw. 200 ml des
1xTBE-Elektrophoresepuffers mit der entsprechenden Menge an Agarose unter
regelmäßigem Schütteln erhitzt. Nachdem die Agarose vollständig in Lösung gegangen
war, folgte das Abkühlen des Gels auf 50° C. Anschließend wurden der Lösung 1%iges
Ethidiumbromid (0,05 µl/ml Gel) zugegeben. Nun konnte die Agarose auf einen
Gelschlitten der Größe 10 cm x 7 cm bzw. 20 cm x 20 cm gegossen werden. Nach
einiger Zeit polymerisierte die Agarose vollständig. Das feste Gel konnte dann auf dem
Schlitten in die Horizontal-Elektrophorese-Anlage gelegt werden. Der darin befindliche
1xTBE-Elektrophorese-Puffer mußte das Gel dabei vollständig bedecken. Daraufhin
wurden die Proben mit 1/5 Volumen Ladepuffer (6x) gemischt und bei 70 bzw.120 Volt
aufgetrennt. Die Laufzeit betrug in Abhängigkeit der Fragmentlänge der DNA 0,5-3 h.
29
Die elektrophoretische Auftrennung der für den Southern Blot bestimmten humanen,
genomischen DNA erfolgte unter abgeänderten Bedingungen. Hierbei wurden 0,7 %ige
Agarosegele mit 0,5xTBE-Laufpuffer gegossen. Die Proben wurden mit 6x Ladepuffer
(0,25 % (w/v) Bromphenolblau, 0,25 % (w/v) Xylen-Zyanol) bei einer Spannung von
30-35 Volt aufgetrennt. Eine ausreichende Auftrennung der DNA Fragmente erfolgte in
einem Zeitraum von 18-24 h.
Das elektrophoretische Auftrennen bei präparativen Gelelektrophoresen wurde
ebenfalls unter abgeänderten Bedingungen durchgeführt. Hierbei wurde “low melting
temperature” Agarose kombiniert mit 1xTAE-Elektrophoresepuffer eingesetzt. Die
angelegte Spannung mußte wegen der “low melting temperature” Agarose
entsprechend auf 50 Volt reduziert werden. Nach der Auftrennung konnten die DNA-
Fragmente durch UV-Licht sichtbar gemacht, ausgeschnitten und beispielsweise als
Sonde eingesetzt werden.
Als Längenmarker wurden je 0,5-1 µg der 100 base-pair-ladder (Life technologies) und
des λ-Hind-DNA-digest (Life technologies) eingesetzt.
Nach der elektrophoretischen Auftrennung wurden die Gele auf den UV-Schirm gelegt
und fotografiert.
3.7 Southern Blot
Mit dieser von Southern (1975) beschriebenen Methode lassen sich DNA-Sequenzen
nachweisen. Die DNA wird durch Restriktionsenzyme verdaut (s. Kap. 3.5) und die
resultierenden Fragmente werden dann ihrer Länge nach mittels Agarose-
Gelelektrophorese (s. Kap. 3.6) aufgetrennt. Die DNA wird anschließend in situ
denaturiert und auf eine solide Membran transferiert (geblottet), meist ein
Nitrozellulosefilter oder eine Nylonmembran. Der Transfer kann durch drei Verfahren
erfolgen: dem Kapillarblot, welcher in dieser Arbeit angewandt wurde, dem
elektrophoretischen Blot oder dem Vakuum-Transfer. Die relative Position der DNA-
Fragmente bleibt während des Transfers erhalten. Die auf der Membran fixierte DNA
wird mit einer radioaktiv markierten DNA-Sonde hybridisiert. Anschließend erfolgt eine
Autoradiographie. Dadurch lassen sich spezifische DNA-Banden (Sequenzen)
detektieren, welche komplementär zur Sonde sind.
30
3.7.1 Aufbau des Kapillarblots
500 g Gewicht
Glasscheibe
Zellstoff
Gel Whatman Papier
Nylon Membran
Sockel
Whatman Papier
20xSSC Puffer
Abb. 3.1Schematische Darstellung des Aufbaus eines Kapllarblots (s. auch Kap. 3.8.2 unter
Aufbau des Kapillarblots)
3.7.2 Blotten der DNA
Nach Abschluß der Gelelektrophorese wurde das zu blottende Gel auf dem UV-Schirm
mit Lineal fotografiert. Das Lineal sollte später als Längenmaß dienen, um die Größe
der mittels Hybridisierung erhaltenen DNA-Fragmente zu bestimmen. Das Gel wurde
danach wieder auf den Gelschlitten geschoben. Anschließend wurde nach Angaben
des Hestellers der “HybondTM-N+Membran- (Fa. Amersham) verfahren (S.5-7 des
„blotting-protocol“).
Depurinieren der DNANach Fotografieren des Gels wurde es in eine Wanne, welche 1000 ml 0,25 M HCl
enthielt, gelegt. Die Salzsäurelösung bewirkte ein Depurinieren der DNA. Dadurch sollte
ein effizienterer Transfer der DNA-Fragmente, welche größer als 10 kb waren, erreicht
werden. Die Wanne wurde auf dem Schüttler plaziert. Das Gel wurde auf niedrigster
Stufe geschüttelt, um ein Einreißen zu vermeiden. Nachdem das Blau des im Gel
sichtbaren Ladepuffers auf Grün umschlug (nach ca. 20 min), wurde das Gel nur noch
weitere 10 min in der Salzsäurelösung belassen.
31
Denaturieren der DNANun wurde die Salzsäurelösung verworfen, das Gel mit Aqua dest. vorsichtig gespült
und 1 l Denaturierungslösung (1,5 M NaCl, 0,5 M NaOH) in die Wanne gegeben. Das
Gel wurde unter kontinuierlichem Schütteln für 30 min in der Denaturierungslösung
belassen. Die Farbe des Ladepuffers schlug in dieser Zeit wieder auf Blau um.
Neutralisieren der DNADie Denaturierungslösung wurde verworfen, das Gel vorsichtig mit Aqua dest. gespült
und 500 ml Neutralisierungslösung (1,5 M NaCl; 0,5 M Tris-HCl pH 7,2; 0,001 M EDTA)
in die Wanne gegeben. Das Gel wurde für 15 min unter kontinuierlichem Schütteln in
der Neutralisierungslösung belassen. Anschließend wurde die Neutralisierungslösung
verworfen, das Gel mit Aqua dest. gespült und mit weiteren 500 ml frischer
Neutralisierungslösung 15 min lang neutralisiert.
Aufbau des KapillarblotsDer Aufbau des Kapillarblots erfolgte gemäß Abbildung 3.1. Eine Wanne wurde mit
20xSSC-Puffer gefüllt und ein Sockel (umgedrehter 20x20 cm-Elektrophorese-Schlitten)
darin plaziert. Danach konnte ein an den seitlichen Enden überhängendes Stück
Whatman-Papier auf den Sockel gelegt werden. Als das Papier vollgesogen war, wurde
das Gel auf das Whatman-Papier gesetzt. Eventuell vorhandene Luftblasen zwischen
Papier und Gel wurden durch Rollen mit einer Glaspipette beseitigt. Die auf 20x20 cm
zurechtgeschnittene Nylonmembran wurde für 2 min in 6xSSC-Puffer getaucht und
anschließend auf das Gel gelegt. Eventuell vorhandene Luftblasen wurden entfernt.
Danach wurden vier auf Gelgröße zurechtgeschnittene Stück Whatman-Papiere auf die
Nylonmembran gelegt, wobei die unteren zwei zuvor mit 20xSSC-Puffer befeuchtet
worden waren und die oberen zwei in trockenem Zustand waren. Schließlich wurden
auf dem Aufbau mehrere Lagen Zellstoff, eine Glasscheibe und ein Gewicht von
ungefähr 500 g plaziert. Der kapilläre Sog war nun gesichert. Um einen möglichst
vollständigen Transfer zu gewährleisten, wurde der Aufbau zwei Tage so belassen.
Nach Beendigung des Transfers wurden die Taschen des Gels mit schwarzem
Kugelschreiber auf der Membran nachgezeichnet. Somit ließen sich die fotografierten
DNA-Banden auf dem Gel mit späteren Hybridisierungssignalen auf der Membran direkt
vergleichen. Danach wurde die Membran 30 min lang luftgetrocknet. Währenddessen
wurde das Gel erneut mit Ethidiumbromid gefärbt und unter UV-Licht auf nicht
transferierte DNA hin untersucht. Anschließend wurde die Membran einer
32
zweiminütigen UV-Bestrahlung unterzogen, um so die transferierten Fragmente an die
Nylonmembran zu binden (UV-Crosslinking). Bevor der Blot zum ersten Mal hybridisiert
wurde, wurde er 5 min lang in 6xSSC-Puffer befeuchtet.
3.7.3 Polymerasekettenreaktion (PCR)
Die Polymerasekettenreaktion (PCR) stellt eines der schnellsten und einfachsten
Verfahren dar, um DNA zu amplifizieren. Dabei lassen sich spezifische DNA-
Sequenzen aus geringen Mengen an DNA-Proben herstellen. Die DNA-Synthese wird
durch Zugabe von gegenläufigen Oligonucleotiden (+ Primer, - Primer)
Desoxynucleosid-Triphosphaten (dNTPs) als DNA-Bausteinen und einer
hitzebeständigen DNA-Polymerase des Bakteriums Thermophilus aquaticus
(Taq-Polymerase) ermöglicht.
Als DNA-Matritze (template) kam die DNA der präparierten PAC-Klone (s. Kapitel 3.3)
zum Einsatz. Dabei stellten die jeweiligen Oligonucleotidprimer die Anfangs-
und Endpunkte der zu amplifizierenden DNA dar.
Der Reaktionsansatz für die PCR sah folgendermaßen aus:
10x Puffer 2,5 µl
template (30 ng) X µl
+ Primer (18 µMol/µl) 1 µl
- Primer (18 µMol/µl) 1 µl
dNTP-Mix für Agarose 1 µl
Taq-Polymerase(5U/µl) 0,1 µl
Steriles Wasser ad 25 µl
Für die PCR wurden Mikrotiterplatten verwendet. In einem Eppendorf-Röhrchen wurden
der 10xPCR-Puffer, der dNTP-Mix, die Primer und das Wasser vermischt und so der
“Mastermix” hergestellt. Die template wurden in die Vertiefungen der Mikrotiterplatte
vorgelegt. Zu jedem Reaktionsansatz wurde 0,1 µl Taq-Polymerase hinzugegeben.
Abschließend wurde jeder Ansatz mit einem Tropfen Mineralöl versehen, um so ein
Austrocknen der Ansätze zu verhindern.
33
Die PCR wurde dann unter den nachfolgenden Bedingungen durchgeführt, wobei einige
Parameter variierten. So richtete sich die “Annealing” Temperatur nach den
Bindungseenergien der Primer, die Zeit für die “Extension” nach der Länge des zu
vervielfältigenden DNA-Abschnitts.
Temperatur Zeit
Initial Denaturation 94° C 4 min 1 Zyklus
Denaturation 94° C 30sec
Annealing z.B. 53° C 30 sec 30 Zyklen
Extension 72° C 30-90 sec
Final Extension 72° C 10 min 1 Zyklus
Die Reaktionsprodukte wurden nach Beendigung des Programms mit 6x Ladepuffer
vermischt und auf einem Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt (s. Kapitel 3.7).
3.7.4 Gewinnung der Sonde
DNA-Sonden wurden mittels PCR unter Verwendung entsprechender PAC-DNA als
template hergestellt. Die erhaltenen Produkte wurden mit Ladepuffer vermischt und
elektrophoretisch aufgetrennt. Hierzu wurde ein 1 %iges Agarosegel bestehend aus
“Low melting Agarose” eingesetzt. Nach Beendigung der Auftrennung wurde das Gel
unter dem UV-Schirm fotografiert. Dabei ließen sich Länge sowie DNA-Menge der
Sonde durch den Vergleich mit den zusätzlich aufgetragenen Längenmarkern
(100 base pair ladder, λ-Hind DNA III digest) ermitteln. Anschließend wurden die
Sonden unter UV-Licht mit einem jeweils frischen Skalpell aus dem Gel geschnitten.
Der nächste Schritt bestand in der Ermittlung des Gewichts der Gelbanden. Dazu wurde
eine Feinwaage benutzt. Nach dem Wiegen wurden die Gelbanden in ein kleines
Eppendorf-Röhrchen überführt. Pro Gramm Gelbande wurden 3 ml steriles Wasser
hinzugegeben. Nach kurzem Erwärmen des Eppendorf-Röhrchens konnte des
Endvolumen des Gel-Wasser-Gemisches abgelesen werden. Nun konnte die
Konzentration der DNA errechnet werden (abgeschätzte DNA-Menge
in µg/Endvolumen in ml).
34
3.7.5 Radioaktive Markierung der Sonden
Bei der radioaktiven Markierung der Sonde wurde nach dem RediprimeTM-Protokoll (Fa.
Amersham) verfahren. Die hier aufgeführten Mengen gelten für die Hybridisierung eines
Blots. Bei Verwendung mehrerer Membranen erfolgte eine entsprechende Modifikation.
Das dem Gel-Wasser-Gemisch, in welchem die Sonde enthalten war (s. Kapitel 2.9 ),
wurde 5-10 min auf 95° C erhitzt, um das Gel zu schmelzen und die DNA zu
denaturieren. Dann wurden 2,5-25 ng DNA entnommen und mit sterilem Wasser auf ein
Volumen von 45 µl aufgefüllt. Die Lösung wurde vorsichtig zum “Rediprime Labelling
Mix” gegeben, vermischt und kurz anzentrifugiert. Der Lösung wurden 5 µl 32P-
markiertes α-dCTP (etwa 10 mCi/ml) zugegeben. Der Reaktionsansatz wurde
wiederum kurz anzentrifugiert und im Anschluß daran bei 37° C für 30 min inkubiert.
Danach wurde ein Aliquot entnommen und in 3 ml Szintillationsflüssigkeit gegeben. Im
Szintillationsmeßgerät wurde die Radioaktivität des Aliquots bestimmt. Der
Reaktionsansatz wurde mit 0,5 Volumen 7,5 M Ammoniumacetat und 2,5 Volumina
100 %igem Ethanol gefällt, um nicht eingebaute Nukleotide zu entfernen (s. Kap. 3.4.1).
Anschließend wurde das Pellet in 200 µl TE-Puffer aufgenommen. Die inkorporierte
Radioaktivität wurde durch die Entnahme eines weiteren Aliquots bestimmt.
3.7.6 Prähybridisieren und Hybridisieren des Southern Blots
Für das Prähybridisieren und das Hybridisieren wurde das ExpressHybTM-Protokoll (Fa.
Clontech) der zugehörigen Hybridisierungslösung verwendet.
PrähybridisierenDie 20 cm x 20 cm großen Southern Blots wurden in Glasröhren gelegt und mit
10 ml ExpressHybTM-Hybridisierungslösung für 30 min bei 60° C im Hybridisierungsofen
prähybridisiert.
HybridisierenDie hergestellte Sonde (s. Kap. 3.7.5) wurde für 3min auf 95° C denaturiert und sofort
zu 10 ml frischer Hybridisierungslösung (60°C) gegeben. Nun enthielt jeder
ml Hybridisierungslösung ungefähr 1-2 Mio cpm Radioaktivität. Danach wurde der Blot
mit der Hybridisierungslösung für mindestens 5 h bei 60° C im Hybridisierungsofen
inkubiert.
35
3.7.7 Waschen der Blots
Nach Beendigung der Hybridisierung und Entsorgen der radioaktiven
Hybridisierungslösung wurde der erste Waschschritt mit Lösung 1 (2xSSC,
0,05 % SDS) durchgeführt. Die Blots wurden bei Raumtemperatur 20 min lang
gewaschen, wobei die Lösung mehrfach gewechselt wurde. Der zweite Waschschritt
wurde mit Lösung 2 (0,1xSSC, 0,1 % SDS) durchgeführt, wobei die Lösung drei Mal
jeweils nach 30 min gewechselt wurde. Nach Beendigung der Waschschritte wurden die
Blots in Plastikfolie eingeschlagen. Anschließend wurden die Blots in Kassetten mit
Verstärkerfolien gelegt. Auf einem Kodak-XRA-Film wurden die Blots bei –80° C für
24 h exponiert. Mit einer automatischen Entwicklermaschine wurden die Filme
entwickelt. Nach einer Exposition über Nacht wurde aufgrund der
Hintergrundschwärzung über eine längere Expositionszeit der Blots entschieden (ggf.
7 Tage).
3.7.8 Auswertung der Blots
Nach ausreichend langer Exposition wurden die Ränder des Blots und die
Markierungen der Geltaschen auf den Film übertragen. Die Längenmarker wurden auf
den Röntgenfilm übertragen (Foto mit Lineal neben Agarosegel). Dazu wurden die
einzelnen Banden des elektrophoretisch aufgetrennten Längenmarkers entsprechend
ihrer Größe und ihrer Entfernung von den Geltaschen auf halblogarithmisches Papier
übertragen. Dabei wurde auf der Abszisse die Entfernung der aufgetrennten
DNA-Banden von den Geltaschen in mm eingetragen. Auf der Ordinate erfolgte die
Größenangabe der DNA in kb. Die einzelnen Punkte wurden miteinander verbunden,
so daß annäherungsweise eine Gerade entstand. Anhand dieser Geraden ließ sich die
Länge jeder auf dem Film sichtbaren Bande ermitteln.
3.7.9 Wiederverwendung der Blots durch “membrane stripping”
Eine weitere Hybridisierung der geblotteten Nylonmebranen mit neuen Proben war
möglich, wenn die alte Probe von der Membran heruntergewaschen wurde.
Grundvoraussetzung hierfür war es, ein Austrocknen der hybridisierten Membran zu
verhindern. Dies wurde durch ein sorgfältiges Einpacken der Membran in Plastikfolie (s.
36
Kap 3.7.7) gewährleistet. Somit konnte das Waschen des Blots jederzeit erfolgen. Dazu
wurde die Nylonmembran bei 45 °C 30 min lang in 0,4 M NaOH inkubiert. Anschließend
wurde weitere 15 min bei ebenfalls 45 °C in 0,1xSSC, 0,1%SDS und 0,2 M Tris-HCl
(pH 7,5) inkubiert. Nach Abschluß des Waschvorgangs wurde für mindestens 24 h
autoradiografiert, um die Vollständigkeit des Waschvorgangs zu dokumentieren.
3.8 Nährmedien
LB (Luria-Bertani)-Medium 10 g Trypton
5 g Hefeextrakt
10 g NaCl
in 1000 ml H2O gelöst und autoklaviert
TB (Terrific Broth)-Medium 12 g Trypton
(nach Tartof und Hobbs 1987) 24 g Hefeextrakt
10 g NaCl
4 ml Glycerin
in 900 ml H2O gelöst und autoklaviert,
anschließend wurden 100 ml steriler
Phosphatpuffer
(0,17 M KH2PO4,0,72 M K2HPO4) hinzugegeben
3.9 Andere Lösungen und Chemikalien
C1-Puffer Fa. Qiagen, Hilden
C2-Puffer Fa. Qiagen, Hilden
dNTPs 10 mM dATP, 10 mM dCTP, 10 mM dGTP,
10 mM dTTP
(Fa. Invitrogen Corporation, San Diego, CA, USA)
Ethanol Fa. Sigma Chemie GmbH, Deisenhofen
37
Isopropanol Fa. Sigma Chemie GmbH, Deisenhofen
Glycerin Stocklösung 0,85 ml LB Nährlösung, 0,15 ml steriles Glycerin
(Fa. Sigma Chemie GmbH Deisenhofen)
Ladepuffer (6x) 0,25 % Bromphenolblau
0,25 % Xylencyanol
30 % (v/v) Glycerin in Wasser
Längenmarker 100 bp ladder
λ-HindIII DNA digest
Mineralöl Fa. Sigma Chemie GmbH, Deisenhofen
P1-Puffer 50 mM Tris-HCl (pH 8,0)
10 mM EDTA
100 µg/ml RNAse A
(Fa. Qiagen, Hilden)
P2-Puffer 200 mM NaOH
1%SDS
(Fa. Qiagen, Hilden)
P3-Puffer 3 M Kaliumacetat (pH 8,3)
(Fa. Qiagen, Hilden)
PCR-Puffer (10x) 500 mM KCl
100 mM Tris-HCl (pH 8,3; bei 42 °C)
15 mM MgCl2(Fa. Perkin Elmers, Überlingen)
Phenol-Chloroform-
Isoamylalkohol (25:24:1) Roti�-Phenol/Chloroform gesättigt mit TE-Puffer
(10 mM Tris-HCl, pH 7,5; 1 mM EDTA-Na)
(Fa. Roth, Karlsruhe)
38
Prähybridisierungs- und
Hybridisierungslösung ExpressHybTM Hybridisation Solution
(Fa. Clontech, Palo Alto, USA)
QBT-Puffer 750 mM NaCl
50 mM MOPS (pH 7,0)
15% Ethanol
0,15% Triton-X24
(Fa. Qiagen, Hilden)
QC-Puffer 1 M NaCl
50 mM MOPS (pH 7,0)
15% Ethanol
(Fa. Qiagen, Hilden)
QF-Puffer 1,25 M NaCl
50 mM Tris-HCl (pH 8,5)
15% Ethanol
(Fa. Qiagen, Hilden)
Radionuklide α32 P-dCTP
(Fa. Amersham Buchler, Braunschweig)
SSC-Puffer (20x) 3 M NaCl
0,3 M Na-Citrat (pH 7,0)
SDS (10%) Natriumlaurylsulfat 10 % (w/v) in Wasser
(Fa. Roth, Karlsruhe)
STE-Puffer 0,1 M NaCl
10 mM Tris-HCl (pH 8,0)
1 mM EDTA (pH 8,0)
Szintillationsflüssigkeit Rotiszint� eco plus
(Fa. Roth, Karlsruhe)
39
TAE-Puffer 0,04 M Tris-Acetat
0,001 M EDTA
TBE-Puffer 0,09 M Tris-Borat
0,02 M EDTA
TE-Puffer (pH 7,4) 10 mM Tris-HCl (pH 7,4)
1 mM EDTA (pH 8,0)
3.10 Restriktionsnzyme
BamHI G↓GATCC
(Fa. Amersham Buchler, Braunschweig)
BglII A↓GATCT
(Fa. MBI)
DraI TTT↓AAA
(Fa. Pharmacia, Freiburg)
EcoRI G↓ AATTC
(Fa. Amersham Buchler, Braunschweig)
EcoRV GAT↓ATC
(Fa. Amersham Buchler, Braunschweig)
HindIII A↓AGCTT
(Fa. Amersham Buchler, Braunschweig)
PstI CTGCA↓G
(Fa. Amersham Buchler, Braunschweig)
PvuI CGAT↓CG
(Fa. Amersham Buchler, Braunschweig)
40
SalI G↓TCGAC
(Fa. Amersham Buchler, Braunschweig)
XbaI T↓CTAGA
(Fa. Amersham Buchler, Braunschweig)
XhoI C↓TCGAG
(Fa. Amersham Buchler, Braunschweig)
3.11 Primer und Sonden
EST yb08f05 Ressourcenzentrum Berlin
62p17A+ TGCTAGGTGCTGATTTCTGG
61p17A- CCAAAATCTTCAGATATCACC
Zcb198-c+ GGACATTAGGAGAAACCAGG
Zcb159+c- ATTCAGCTTGAACTAAATCCC
3.12 Materialien
Agarose Ultra Pure Agarose
(Fa. Life Technologies, Paisley, UK)
Low melting temperature-
Agarose NuSieve�GTG� Agarose
Fa. FMC Bioproducts, Rockland, USA)
DNA-Extraktionskit (Fa, Qiagen, Hilden)
Elektrophoreseeinheit Pharmacia LKB GPS 200/400 und
Gelelektrophoresis Apparatus GNA 200
41
(Fa. Pharmacia, Freiburg)
Feinwaage Sartorius Basic
(Fa. Sartorius, Göttingen)
Filme Kodak-X OMAT, 35x43 cm
(Fa. Sigma Chemie GmbH, Deisenhofen)
Hybridisierungsofen Hybaid
(Fa. MWG Biotech, Hook& Tucker, UK)
Mikrotiterplatten (Fa. Techne LTD, Duxford, Cambridge, UK)
Nylonmembran HybondTM-N+ Nylonmembran
(Fa. Amersham, Arlington Heights, USA)
PCR-Maschine Thermal-Cycler Cyclogene PHC3
(Fa. Techne LTD, Duxford, Cambridge, UK)
Photometer Pharmacia LKB Ultraspect III
(Fa. Pharmacia, Freiburg)
Plasmidextraktionskit Qiagen�Plasmid Mini bzw. Midi Kit
(Fa. Qiagen, Hilden)
Schüttelinkubator Certomat R und Certomat HK
(Fa. B.Braun, Melsungen)
Schüttelwasserbad Schüttelwasserbad 1083
(Fa. GFL�, Burgwedel)
Szintillationsmeßgrät Tri-Carb 1900 liquid szintillation analyser
(Fa. Packard, Meriden, USA)
Tischschüttler Bender & Hobein
(Fa. IKA, Wilmington, USA)
42
UV-Leuchttisch (Fa. International Biotechnology Inc.,
New Haven, USA)
Vortex Janke & Kunkel
(Fa. Ika�-Labortechnik, Staufen i. Br.)
Whatman-Papier 3 MM
(Fa. Whatman Laboratory Products, Clifton, USA)
Zentrifugen Biofuge 15
(Fa. Heraeus Sepatech GmbH)
Sorvall Superspeed RC 2-B
(Fa. Norwalk, USA)
Eppendorf Centrifuge 5414
(Fa. Eppendorf Gerätebau, Netheler & Hinz GmbH,
Hamburg)
43
4.ERGEBNISSE
4.1 Allgemein
Zur Veranschaulichung der Ergebnisse sollen hier nochmals die Deletionsregionen
sowie die entsprechenden Bruchpunkte bei Familien mit Nephronophthise dargestellt
werden.
Abb. 4.1 zeigt schematisch die Ausdehnung der Deletion im Bereich des NPHP1 Gens.
Der Abbildung können die Positionen der im Rahmen dieser Arbeit verwendeten
Sonden sowie die Lage der als Positivkontrollen verwendeten PAC-Klone entnommen
werden.
A
Sond
e D
Sond
e C
Sond
e A
Sond
e B
107o20
62p20 (95 kb)
146c2 (50 kb)9657(=21h9)
B
C
50 kb
Abb.4.1A: Physikalische Karte der NPHP1- Region mit Darstellung der Deletionen sowie der invertierten Duplikationen (Inv. Dupl.)B: Darstellung der PAC-Klone, die die Deletionsregion überspannen.Die Größen der PACs 107o20 und 9657 konnten noch nicht genau ermittelt werden ( als Punkte dargestellt)C: Schematische Karte der relativen Position der Sonden
cen tel
Klassische Deletion (250 kb)Inv. Dupl.(100 kb)
Inv. Dupl.(100 kb)
Deletion F 12
Deletionsbruchpunkte:
Der “klassische” zentromer gelegene Deletionsbruchpunkt, den ca. 80% der
Nephronophthisepatienten aufweisen, wurde auf das Intervall zwischen den STS-
Markern 9681S und 804/6 festgelegt. Für Familie 12 wurde ein alternativer proximaler
Bruchpunkt zwischen den STS-Markern Zcb90 und Zcb241 gefunden. Dieser
alternative Bruchpunkt befindet sich zwischen Exon 2 und Exon 3 des NPHP1 Gens.
44
Der gemeinsame distale Bruchpunkt wurde auf ein Intervall zwischen den Primern
9657T7C5 und 9657T7D kartiert (Hildebrandt et al., 1997; s. Kap. 1).
Deletionsanalysen:
Die nachfolgend beschriebenen Experimente wurden mit DNA der Familien F9, F12,
F33 sowie F40 durchgeführt.
Familie 9 (F9):
Aus früheren PCR-Deletionsanalysen ist bekannt, daß die Eltern der Familie 9
heterozygote Träger und die beiden Kinder homozygote Träger einer Deletion im
Bereich des NPHP1-Gens sind (Hildebrandt et al., 1997).
Familie 12 (F12):
Frühere PCR-Analysen ergaben, daß bei der Mutter von F12 der zentromer gelegene
Bruchpunkt zwischen Exon 2 und Exon 3 liegt, der Vater dagegen die “klassische”
größere Deletion im NPHP1-Gen aufweist. Die ersten drei Kinder der Familie sind von
beiden Deletionen im NPHP1-Gen betroffen, das vierte Kind hingegen ist gesund
(Hildebrandt et al., 1997).
Familie 33 (F33)/ Familie 40 (F40) :
Mit SSCP-Mutationsanalysen und anschließender Sequenzierung stellte man fest, daß
die Mütter von Familie 33 und Familie 40 Trägerinnen einer Punktmutation im
NPHP1-Gen sind, während die Väter beider Familien Träger einer heterozygoten
Deletion sind (Hildebrandt et al., 1997). Punktmutation sowie heterozygote Deletion
wurden an die Kinder vererbt (s. Diskussion, Kap. 5).
4.2 Deletionsanalyse im Bereich der distalen Bruchpunktregion
4.2.1 Hybridisierung genomischer Southern Blots mit einer radioaktiv markiertenSonde (Sonde A) im 3‘-Bereich des NPHP1-Gens
Da der gemeinsame distale Bruchpunkt mittels PCR auf ein Intervall zwischen den
Primern 57T7C5 und 57T7D eingegrenzt wurde (Hildebrandt et al., 1997), sollte die
Deletion mittels Southern Blot- Hybridisierung bestätigt sowie der Bruchpunkt näher
charakterisiert werden. Hierzu wurde eine genomische Hybridisierungssonde (Sonde A)
10 kb stromabwärts des 3‘-Endes des NPHP1-Gens verwendet. Die ca. 500 bp lange
Probe wurde mittels PCR mit den beiden STS-Primern 9657 T(1) sowie 9657 T7F3
45
hergestellt und radioaktiv markiert. Als Restriktionsenzym für den Southern Blot wurde
BamHI verwendet. Die Abb. 4.2 zeigt einen Ausschnitt der Autoradiographie nach
erfolgter Hybridisierung.
Spur: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
1,2 kb
BamHI
F9-1
-1F9
-1-2
F9-2
-1F9
-2-2
F12-
1-1
F12-
1-2
F12-
2-1
F12-
2-2
F12-
2-3
------
-F3
3-1-
1F3
3-1-
2F3
3-2-
1F3
3-2-
2F4
0-1-
1F4
0-1-
2F4
0-2-
1
F40-
2-3
146c
2
F40-
2-2
9657
Abb. 4.2
Ausschnitt aus der Autoradiographie eines Southern Blots mit der BamHI verdauten
DNA der Familien 9, 12, 33, 40 sowie der PACs 146c2 und 9657 nach Hybridisierung
mit der Sonde 9657 T(1)/ 9657 T7F3 (Sonde A). Die PACs (Spur 20-21) lassen ein
starkes Hybridisierungssignal bei 1,2 kb erkennen. Bei den Familien, die nur Deletion
aufweisen (F9 in Spur 1-4, F12 in Spur 5-9), zeigen die betroffenen Kinder (2-1, 2-2, 2-
3) im Vergleich zu ihren Eltern (Väter jeweils 1-1, Mütter jeweils 1-2) keine Bande bei
1,2 kb. Bei den Familien, die eine Punktmutation in Kombination mit einer
heterozygoten Deletion besitzen (F33 in Spur 1-14, F40 in Spur 15-19 ), zeigen die
betroffenen Kinder (2-1, 2-2, bzw. 2-3) dieselbe 1,2 kb große Bande wie ihre Eltern
(Väter jeweils 1-1, Mütter jeweils 1-2).
Die erfolgreiche Hybridisierung demonstriert bei den Vätern und Müttern der Familien 9
und 12 ein 1,2 kb großes Fragment; den homozygot von der Deletion betroffenen
Kindern dagegen fehlt das 1,2 kb große Fragment. Bei den Kindern sind diese im 3‘-
Bereich des NPHP1-Gens verwendeten Marker deletiert. Für die Famlien 33 und 40 gilt,
daß bei allen Individuen ein Fragment von 1,2 kb Länge zu sehen ist. Die betroffenen
46
Kinder zeigen ebenfalls dasselbe Signal, da eine Punktmutation sowie eine
heterozygote Deletion an sie vererbt wurden (s. Diskussion, Kap. 5).
Dieses Experiment zeigt, daß der bisher postulierte distale Bruchpunkt nicht wie
vermutet zwischen den Deletionsmarkern 57T7C5 und 57T7D liegt. Er muß sich distal
der verwendeten Sonde A befinden, da die Kinder der Familien 9 und 12 in diesem
Bereich der Sonde eine Deletion aufweisen (s. Diskussion, Kap. 5).
4.2.2 Hybridisierung genomischer Southern Blots mit dem EST yb08f05 (Sonde B)
Der EST yb08f05 (Probe B) kartiert distal der Probe 9657 T(1)/9657 T7F3 (s. 4.2.1) und
proximal des telomer gelegenen etwa 100 kb großen inverted repeats (s. Abb. 4.1).
Aufgrund der Ergebnisse aus 4.2.1 sollte untersucht werden, ob der Bruchpunkt noch
vor dem telomer gelegenen inverted repeat liegt oder nicht. An seinem 5‘-Ende war der
EST mit einer EcoRI-Restriktionsschnittstelle, an seinem 3‘-Ende mit einer XhoI-
Restriktionsschnittstelle in den Plasmid-Vektor kloniert worden. Um den EST als Sonde
für die Hybridisierung von Southern Blots einzusetzen, wurde ein Restriktionsverdau mit
den Enzymen EcoRI und XhoI durchgeführt. Nach erfolgter Inkubation wurde der
Ansatz auf ein low-melting Agarosegel geladen und elektrophoretisch aufgetrennt.
Hierbei zeigten sich zwei Fragmente: ein 1,3 kb Fragment sowie ein 0,5 kb Fragment,
die auf eine interne EcoRI-Restriktionsschnittstelle zurückzuführen waren. Als Sonde
wurde das 1,3 kb Fragment verwendet.
47
Die Abb. 4.3 zeigt einen Ausschnitt aus der Autoradiographie des mit dem
Restriktionsenzym PstI hergestellten genomischen Southern Blots nach erfolgter
Hybridisierung.
Spur: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
PstI
F9-1
-1F9
-1-2
F9-2
-1F9
-2-2
F33-
1-2
F33-
2-1
F33-
2-2
------
-96
57
F12-
1-1
F12-
1-2
F12-
2-1
F12-
2-3
F33-
1-1
4 kb
2 kb
Abb. 4.3
Ausschnitt aus der Autoradiographie eines Southern Blots mit der DNA von Familie
9,12, 33 sowie des PACs 9657 nach Hybridisierung mit dem radioaktiv markierten
1,3 kb-Fragment des EST yb08f05. Die Eltern (Väter jeweils 1-1, Mütter jeweils 1-2) von
Familie 9 und 12 zeigen ein Fragment bei 4 kb Länge, die homozygot deletierten Kinder
dagegen nicht (2-1, 2-2, bzw. 2-3). Bei Familie 33 (F33) zeigt der Vater (1-1) ein
Fragment bei 2 kb Länge. Die Mutter (1-2) sowie die betroffenen Kinder (2-1, 2-2)
lassen das 4 kb große Fragment erkennen. Der PAC läßt ein deutliches 4 kb großes
Fragment erkennen.
Bei den gesunden Eltern der Familien 9 und 12 sieht man ein Fragment von 4 kb
Länge. Den erkrankten Kindern dagegen fehlt das 4 kb-Fragment, da sie im Bereich der
Sonde deletiert sind.
Beim Vater sieht man ein Fragment von 2 kb Länge, das als ”aberrantes” Fragment
klassifiziert wurde (s. Diskussion, Kap.5). Die Mutter sowie die Kinder zeigen ein
Fragment von 4 kb Länge. Da die Kinder auf dem mütterlichen Allel eine Punktmutation
und auf dem väterlichen eine große Deletion im Bereich des NPHP1-Gens besitzen,
zeigen sie dasselbe Fragment wie nicht deletierte Individuen.
48
Durch Demonstration von homozygoten Deletionen im Bereich des EST yb08f05 wird
gezeigt, daß der distale Deletionsbruchpunkt stromabwärts, in Richtung telomer
gelegener invertierter Duplikation liegen muß.
4.3 Deletionsanalyse am proximalen Bruchpunkt bei Familie 12
4.3.1 Hybridisierung genomischer Southern Blots mit einer radioaktiv markiertenSonde (Sonde C) im Bereich des vermuteten proximalen Bruchpunkts
PCR-Deletionsanalysen ergaben, daß bei Familie 12 die Deletion im NPHP1-Gen
kürzer ist als bei den anderen NPH-Familien. Während der Vater von Familie 12 Träger
der ”großen” Deletion ist, besitzt die Mutter eine kürzere Deletion. Den an
Nephronophthise erkrankten Kindern wurde die größere Deletion des Vaters und die
kürzere Deletion der Mutter vererbt (Hildebrandt et al., 1997).
Zur Charakterisierung des für Familie 12 spezifischen proximalen Bruchpunkts wurde
aus der Sequenz von Intron 2 des NPHP1-Gens mit den beiden STS-Primern
Zcb 198-c+ sowie Zcb159+c- mit Hilfe einer PCR-Reaktion eine Sonde von 1,9 kb
Länge amplifiziert und radioaktiv markiert (Sonde C in Abb. 4.1). Weiterhin wurde ein
Southern Blot hergestellt, indem DNA mit acht verschiedenen Restriktionsenzymen
verdaut wurde. Dieser Southern Blot wurde mit der DNA der Mutter von Familie 12 und
eines erkrankten Kindes sowie DNA des PAC 62p20 hergestellt. Hierzu wurden die
Restriktionsenzyme BglII, DraI, EcoRI, EcoRV, HindIII, PvuII, SalI und XbaI verwendet
und in der Reihenfolge ihrer Aufzählung bei der Herstellung des Blots aufgetragen.
Abbildung 4. 4 und 4.5 zeigen die Autoradiographie der Southern Blots nach erfolgter
Hybridisierung. In Abbildung 4.4 ist die genomische DNA einzelner Individuen aus
Familie 12, in Abbildung 4.5 sind die dazugehörigen Positivkontrollen mit dem PAC
62p20 dargestellt.
Die Ergebnisse beider Experimente sind in Tabelle 4.1 zusammengestellt.
49
Spur: 1 2 3 4 5 6 7 8
DraI
EcoR
I
Hind
IIII
PvuI
ISa
lI
EcoR
V
XbaI
BglII
F12-1-2 F12-2-3
23 kb
9 kb
6 kb
4 kb
Abb. 4.4
Autoradiographie eines Southern Blots mit der DNA von Individuen aus Familie 12 nach
Hybridisierung mit der radioaktiv markierten Sonde Zcb 198-c+/ Zcb 159+c- (Sonde C in
Abb.4.1).
Die Mutter von Familie 12 (1-2) zeigt mit dem Restriktionsenzym BglII ein Fragment von
12,2 kb Länge (Spur 1), mit DraI zwei von 1,1 kb und 0,75 kb Länge (Spur 2) , mit
EcoRI zwei von >33 kb und 16 kb Länge (Spur 3) und mit EcoRV ein Fragment von 15
kb Länge (Spur 4). Beim erkrankten Kind von Familie 12 (2-3) sind nach Verdau mit
dem Restriktionsenzym HindIII zwei Fragmente von 9 kb und 3,1 kb Länge zu
identifizieren (Spur 5), mit PvuI eines von 14 kb Länge (Spur 6), mit SalI eines von >23
kb Länge (Spur 7) und mit XbaI zwei von 10 kb und 4,9 kb Länge (Spur 8).
50
BglII
62p20
Spur: 1 2 3 4 5 6 7 8
DraI EcoRI
EcoRV
HindIII
SalIPvuI
XbaI
23 kb
9kb
6 kb
4 kb
Abb. 4.5
Autoradiographie eines Southern Blots mit der DNA des PAC 62p20 nach
Hybridisierung mit der radioaktiv markierten Sonde Zcb 198-c+/ Zcb 159+c- (Sonde C in
Abb. 4.1). Deutlich Signale sind zu erkennen für BglII bei 12,2 kb (Spur 1), für DraI bei
1,1 kb sowie 0,5 kb und 0,3 kb (Spur 2), mit EcoRI bei 16 kb (Spur 3), mit EcoRV bei 15
kb (Spur 4), mit HindIII bei 9 kb und 3,1 kb (Spur 5), mit PvuII bei 14 kb (Spur 6), mit
SalI bei >23kb (Spur 7), mit XbaI bei 10 kb und 4,9 kb (Spur 8) (s. auch Tab. 4.1).
Mit diesem Experiment sollte der proximale Bruchpunkt bei Familie 12 näher
charakterisiert werden, z.B. durch Erstellen einer partiellen Restriktionskarte in diesem
Bereich. Außerdem war von besonderem Interesse, ein Fusionsfragment (junction
51
fragment) zu detektieren. Daher wurden die Banden, die bei Familie 12 zu sehen waren
(Abb.4.4) mit denen der Positivkontrollen (Abb.4.5) in Tabelle 4.1 verglichen.
BglII DraI EcoRI EcoRV HindIII PvuII SalI XbaI
Genom
DNA
12,2 kb 1,1 kb/
0,75 kb
>33 kb/
16 kb
15 kb 9 kb/
3,1 kb
14 kb >23 kb 10 kb/
4,9 kb
62p20 12,2 kb 1,1 kb/
0,5 kb/
0,3 kb
16 kb 15 kb 9 kb/
3,1 kb
14 kb >23 kb 10 kb/
4,9 kb
Tab. 4.1
Tabellarische Zusammenfassung der genomischen Fragmente sowie der Fragmente
des PAC 62p20 nach Hybridisierung mit der Sonde Zcb 198-c+/ Zcb 159+c- (Sonde C
in Abb. 4.1).
Die Fragmentlängen, die dieses Experiment mit den Restriktionsenzymen BglII, EcoRV,
PvuII und SalI lieferte, waren bei den Individuen der Familie 12 mit denen der den
Positivkontrollen identisch. Für die nähere Charakterisierung des Bruchpunktes waren
diese Ergebnisse daher unbedeutend.
Beim Restriktionsverdau mit DraI (Spur 2 in Abb. 4.4) zeigt die Mutter von F12 zwei
genomische Fragmente von 1,1 und 0,75 kb Länge. Dies führt zu der Annahme, daß die
Sequenz der 1,9 kb-Sonde eine bzw. mehrere DraI-Restriktionsschnittstellen besitzt (s.
Anhang: Sequenzierter Bereich Exon 1 und 2; s. Diskussion Kap. 5). Vergleicht man die
Fragmente mit denen der Positivkontrolle (s. Abb. 4.5), so stellt man fest, daß bei der
PAC-Kontrolle ein zusätzliches kleines Fragment zu sehen ist. Dieses (genomische
DNA) ist beim elektrophoretischen Auftrennen wahrscheinlich aus dem Gel gelaufen.
Darauf soll in der Diskussion näher eingegangen werden (s. Kap. 5).
Der Restriktionsverdau mit EcoRI (Spur 3 in Abb. 4.4) liefert bei der Mutter von F12
zwei Fragmente: ein Fragment mit einer Länge >33 kb, sowie ein 16 kb-Fragment.
Vergleicht man dieses Ergebnis mit dem aus der Positivkontrolle (s.Abb.4.5), so stellt
man fest, daß die PAC-DNA lediglich ein Signal bei 16 kb aufweist. Dies führt zur
Annahme, daß es sich bei dem >33 kb-Fragment der Mutter um ein sog. junction
52
fragment handelt, das nach der Deletion aus Fusion der Chromatidenteile entstanden
ist. Darauf soll in der Diskussion (s. Kap. 5) näher eingegangen werden.
Beim Restriktionsenzym HindIII (Spur 5 in Abb. 4.5) sieht man beim dritten erkrankten
Kind von F12 zwei Fragmente von 9 sowie 3,1 kb Länge. Für die Positivkontrolle (s.
Abb. 4.5) liegt dasselbe Ergebnis vor. Dieses doppelte Signal weist darauf hin, daß in
der Sequenz der 1,9 kb-Sonde eine HindIII-Restriktionsschnittstelle enthalten ist (s.
Anhang: Sequenzierter Bereich Exon 1 und 2).
Mit dem Restriktionsenzym XbaI (Spur 8 in Abb. 4.4) zeigt das dritte erkrankte Kind von
Familie 12 zwei Signale: bei 10 kb sowie bei 4,9 kb Länge. In der Positivkontrolle ist
dasselbe zu sehen (s. Abb. 4.5). Diese beiden Signale weisen auf eine interne
XbaI-Restriktionsschnittstelle hin (s. Anhang: Sequenzierter Bereich Exon 1 und 2).
4.3.2 Wiederholung des Experiments aus 4.3.1
Durch die Wiederholung des Experiments aus 4.3.1 sollte zum einen seine
Reproduzierbarkeit gezeigt werden, zum anderen eine bessere Auftrennung des >33 kb
großen junction fragments erzielt werden. Hierzu wurde ein neuer Southern Blot mit
dem Restriktionsenzym EcoRI und der DNA der Mutter sowie des ersten erkrankten
Kindes von Familie 12 durchgeführt. Dieser wurde erneut mit Sonde C hybridisiert. Das
Ergebnis ist in Abb. 4.6 zu sehen.
EcoRI
F12-
1-2
F12-
2-1
>33kb
16 kb
Abb. 4.6Autoradiographie eines Southern Blots mit der DNA der Mutter von F12 und des ersten
erkrankten Kindes von F12 nach Hybridisierung mit der radioaktiv markierten Sonde
Zcb 198-c+/ Zcb 159+c- (Sonde C in Abb. 4.1). Man erkennt bei der Mutter zwei
53
Banden: eine bei 16 kb und eine weitere bei >33 kb (junction fragment). Das erkrankte
Kind zeigt lediglich die >33 kb Bande (junction fragment).
Dieses Experiment zeigt folgende Ergebnisse: bei der Mutter sind zwei Fragmente zu
sehen, das Wildtyp-Fragment von 16 kb Länge sowie das junction fragment von >33 kb
Länge. Das zweite erkrankte Kind zeigt lediglich das junction fragment. Es ist eine
deutlichere Auftrennung der beiden erwarteten Fragmente gelungen.
4.3.3 Erstellung einer partiellen Restriktionskarte für den proximalen Bruchpunktbei Familie 12 nach Hybridisierung genomischer Southern Blots mit derradioaktiv markierten Sonde C
Mit Hilfe der in 4.3.1 erhaltenen Daten (s. Tab. 4.1) ließ sich eine partielle
Restriktionskarte für den proximalen Bruchpunkt bei Familie 12 erstellen (Abb.4.7).
Dazu wurden zum einen die Fragmentlängen derjenigen Positivkontrollen, die im
Bereich der Probe interne Restriktionsschnittsstellen aufwiesen zum anderen das
junction fragment verwendet. Desweiteren wurde die mittels Sequenzierung im
Forschungslabor gewonnene Sequenz im Bereich der Exone eins bis zwei
hinzugezogen. Dadurch sollten die Restriktionsschnittstellen überprüft und die
jeweiligen Fragmentgrößen genau ermittelt werden. Die Sequenz vor und nach Exon 1
ist im Anhang beigefügt.
Aufgrund folgender Fragmentgrößen und Restriktionsschnittstellen wurde eine
postulierte Restriktionskarte erstellt. Als Nullpunkt wurde der Beginn des Exon 1
festgelegt.
-0,505 bis ca.16 kb: 16kb großes EcoRI-Fragment
2,316 bis 4,259 kb: Sonde C (1,923 kb)
3,524 kb: XbaI-Restriktionsschnittstelle
3,581 kb: HindIII-Restriktionsschnittstelle
XbaI–Fragmente: 10 kb und 4,9 kb wegen interner Restriktionsschnittstelle im
Bereich der Probe
HindIII–Fragmente: 9 kb und 3,1 kb wegen interner Restriktionsschnittstelle im
Bereich der Probe
EcoRI-Fragmente: 16 kb Wildtyp Fragment und >33kb junction fragment
54
Die Restriktionsenzyme XbaI und HindIII lieferten wegen Restriktionsschnittstellen im
Bereich der Sonde C jeweils zwei Fragmente. Dabei stellte sich die Frage, welches der
beiden Fragmente zentromer bzw. telomer der Schnittstelle lag. Die HindIII
Restriktionsschnittstelle lag bei 3,513 kb. Wäre das 3,1 kb Fragment zentromer der
Schnittstelle, so hätte sich eine weitere HindIII Restriktionsschnittstelle bei 3,524-
3,1 kb= 424 kb befinden müssen. Da dies nicht der Fall war, ging man davon aus, daß
das 9 kb Fragment zentromer der Restriktionsschnittstelle lag, das 3,1 kb Fragment
telomer davon. Dieselben Überlegungen wurden für die XbaI Fragmente angestellt.
Dort fand sich ebenfalls keine entsprechende Restriktionsschnittstelle ca. 1,5 kb vor
Exon 1. Daher postulierte man, daß das 10 kb Fragment zentromer und das 4,9 kb
Fragment telomer der XbaI Restriktionsschnittstelle (3,513 kb) lagen. Für die Enden
der telomer gelegenen Fragmente ergaben sich folgende postulierte Positionen:
XbaI -Fragmentende telomer: ca.8,4 kb (da keine Sequenz vorhanden)
HindIII –Fragmentende telomer: ca.6,7 kb (da keine Sequenz vorhanden)
Diese beiden Fragmentenden stellten die letzten postulierten Restriktionsschnittstellen
vor dem proximalen Bruchpunkt der Familie 12 dar. Die nächste telomer gelegene
EcoRI Restriktionsschnittstelle war bei den erkrankten Individuen der Familie 12
deletiert (S.4.3.2). Beide Fragmentlängen (HindIII- Fragment, XbaI- Fragment) wurden
jeweils vom 16 kb großen EcoRI Wildtyp-Fragment subtrahiert. Daraus resultierten
folgende Fragmente (in Abb.4.7 ist nur das EcoRI/ XbaI- Fragment als liniertes
Rechteck dargestellt):
EcoRI/ HindIII- Fragment: ca.9 kb
EcoRI/ XbaI- Fragment: ca.7 kb
Daraus läßt sich folgern, daß der proximale Bruchpunkt von Familie 12 auf einen
Bereich von maximal 7 kb eingegrenzt werden kann. Dieses Ergebnis ist in Abb. 4.7
graphisch dargestellt.
Das junction fragment besitzt einen Anteil, der aus dem Bereich des distalen
Bruchpunktes stammt. Das linierte Rechteck ist durch Subtraktion (s. Berechnung im
Absatz zuvor) entstanden. Es steht für ein postuliertes Fragment und stellt gleichzeitig
den Fusionsbereich des junction fragments dar. Durch das EcoRI/ XbaI- Fragment
wird der Bereich des proximalen Deletionsbruchpunktes bei Familie 12 auf eine Länge
von ca. 7 kb eingegrenzt.
55
Abb.4.7 Partielle Restriktionskarte im Bereich des proximalen Deletionsbruchpunkts von Familie 12 mit Darstellung einesjunction fragments.Die einzelnen Restriktionsfragmente mit ihren Längen sind als Rechtecke dargestellt. Anfang und Ende der Rechtecke bzw.die Trenn-linien dazwischen stehen für Restriktionsschnittstellen. Dabei wurden die Restriktionsschnittstellen aus dem nicht sequenzierten Bereichpostuliert. Das durch Subtraktion des 4.9 kb XbaI-Fragments vom EcoRI Wildtyp Fragment entstandene Fragment wurde postuliert (liniert). Es erlaubt die Eingrenzung des proximalen Deletionsbruchpunktes bei F12 auf maximal 7 kb (8,5 kb- 15,5 kb). (Abkürzungen: Prb.C= Probe C; Seq. 1= Sequenzierter Bereich vor Exon 1; Seq. Bereich Ex.1/ 2= sequenzierter Bereich Exon 1/ 2)
0 kb 5 kb 10 kb 15 kb 20 kb
Xba I 10 kb 4,9 kb
SondeC
Hind III 9 kb 3,1 kb
EcoRI Wildtyp Fragment 16 kb
telcen
EcoRI junction fragment >33 kb
Xba I / EcoRI Fragment 7 kb
Fusionsbereich
25 kb 30 kb
Exon 1 Exon 3Exon 2
Seq.1 Seq.Bereich Ex1/2Fusionsbereich
4.4 Deletionsanalysen stromabwärts des vermuteten proximalen Bruchpunkts beiweiteren NPH-Familien
4.4.1 Hybridisierung genomischer Southern Blots mit einer radioaktiv markiertenSonde im Sp6-Bereich des PACs 62p20 (Sonde D)
In einer PCR wurde mit den STS-Primern 62p17A+ sowie 62p19A- eine ca. 1 kb große
Probe hergestellt (Sonde D, Abb.4.1). Die Probe kartiert am proximalen Ende des PAC
62p20 (Sp6-Ende). Nach Herstellung eines Southern Blots mit der DNA einzelner
Mitglieder der NPH-Familien 9, 12, 33 und 40 sowie der DNA der PACs 107o20 und
62p20 mit dem Restriktionsenzym PstI, efolgte die Hybridisierung mit Probe D.
Abbildung 4.8 zeigt die Autoradiographie dieses PstI-Blots.
56
PstI
5 kb
F9-1-1
F9-1-2
F9-2-1
F12-1-
1
F9-2-2
F12-1-
2
F12-2-
1
F12-2-
3
F33-1-
2
F33-1-
1
F33-2-
1
F40-1-
1
F33-2-
2
F40-1-
2
F40-2-
1
F40-2-
262
p20
107o
20
Spur: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
Abb. 4.8Ausschnitt aus der Autoradiographie des Pst I- Southern Blots nach Hybridisierung mit
der radioaktiv markierten Sonde 62p17A+/62p17A- (Sonde D).
Alle Individuen der Familien 9 (Spur 1-4), 12 (Spur 5-8) und 40 (Spur 13-16) zeigen ein
5 kb langes Fragment. Bei Familie 33 weisen die Mutter sowie die beiden an NPH
erkrankten Kinder ein Fragment gleicher Länge auf, der Vater (Spur 9) dagegen nicht.
Die Positivkontrollen mit den PACs 107o20 sowie 62p20 lassen ein starkes Signal bei
5 kb erkennen.
Mit diesem Experiment wird demonstriert, daß alle Individuen der Familien 9, 12, 33 und
40 -mit Ausnahme des Vaters von Familie 33- ein Fragment von 5 kb Länge aufweisen.
Dies führt zum Schluß, daß sie für den Bereich dieses Markers nicht deletiert sind. Das
Fehlen des Hybridisierungssignals beim Vater von Familie 33, läßt auf eine homozygote
Deletion in diesem Bereich schließen. Da er phänotypisch gesund ist, ergeben sich
mehrere Fragen. In der Diskussion (Kap. 5) wird auf diese Problematik näher
eingegangen.
Die Positivkontrollen mit den PACs 62p20 und 107o20 zeigen ebenfalls ein Signal bei
5 kb.
57
5. DISKUSSION
5.1 Allgemein
Den Hintergrund für diese Arbeit lieferte die Identifikation des Gens für
Nephronophthise Typ 1. Nachdem der Genlocus für NPH anhand von
Kopplungsanalysen und FISH auf die zytogenetische Bande 2q13 festgelegt wurde,
wurden YAC- und PAC-Contigs für diese Region erstellt. Ungefähr 80 % der
NPH-Patienten zeigen in der Region 2q13 homozygote Deletionen. Durch weitere
Forschungsarbeit konnten innerhalb der Deletionsregion zwei Gene, NPHP1 und MALL,
identifiziert werden. Mutationsanalysen führten zum Schluß, daß rezessive Mutationen
im NPHP1-Gen für die Ausprägung des NPH-Phänotyps notwendig sind.
Diese Arbeit beschreibt den Nachweis von Deletionen bei Nephronophthise-Familien
mittels Southern-Blot Technik. Der Southern Bot stellt eine Alternative zur PCR dar, da
er durch Dosiseffekt auch den Nachweis heterozygoter Deletionen erlaubt. Außerdem
sollten durch dieses Verfahren die Deletionsbruchpunkte näher eingegrenzt werden.
Dabei waren bruchpunktnahe, nicht deletierte Marker besonders interessant, weil siebei Deletionsträgern fusionierte Fragmente, junction fragments, ergeben können.
Junction fragments entstehen, wenn ein bruchpunktnaher Marker ein Fragment
detektiert, dessen eine Restriktionschnittstelle ursprünglich in der Deletionsregion lag
und verlorenging. Somit kommt ein neues Fragment zustande, das durch die nächste
Restriktionsschnittstelle außerhalb der Deletionsregion definiert wird.
Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war es, durch neu gewonnene Erkenntnisse bezüglich
der Bruchpunkte nach Pathomechanismen, die für die Deletion verantwortlich sein
könnten, zu suchen. Da das Genom des Menschen keine statische Einheit ist, treten
immer wieder verschiedene vererbbare Mutationen auf. Chromosomen können
verlorengehen oder hinzukommen, es kann zu Brüchen oder Verschmelzungen von
Chromatiden kommen. Zudem enthält das menschliche Genom einen hohen Anteil an
repetitiven DNA-Sequenzen. Auf die Wiederholungssequenzen wirken verschiedene
genetische Mechanismen ein, die zu Austauschvorgängen, Deletionen, Insertionen,
Duplikationen usw. führen können (Strachan, 1996; S.285; S.313).
58
5.2 Bisherige Charakterisierung der Deletionsbruchpunkte für NPHP1
Die bisherige Eingrenzung der Deletionsbruchpunkte durch Hildebrandt et al., 1997, sah
folgendermaßen aus:
Der gemeinsame proximale Bruchpunkt bei Familien mit Nephronophthise wurde auf
das Intervall zwischen den STS- Markern 9681S und 804/6 festgelegt. Bei Familie 12
dagegen- die eine alternative, kürzere Deletion aufweist- lag der proximale Bruchpunkt
zwischen den STS-Markern Zcb90- und Zcb241 somit zwischen Exon 2 und Exon 3des NPHP1-Gens.
Für den gemeinsamen distalen Bruchpunkt wurde postuliert, daß er zwischen den
Markern 57T7C5 und 57T7D liegt.
Die Forschungsgruppe Saunier et al., 1997, postulierte für den telomerischen
Deletionsbruchpunkt, daß er in der telomerischen Duplikation im Intervall zwischen den
Markern 96G18B und 183K24B liegt (hierzu s. Abb. 1.3).
5.3. Die Southern Blot Technik
5.3.1 Die Southern Blot Technik im Vergleich zu anderen molekularbiologischenTechniken
Die Southern Bot Technik stellt ein zur PCR-Technik alternatives Verfahren dar, da sie
im Gegensatz zur PCR-Technik aufgrund eines Dosiseffektes den Nachweis
heterozygoter Deletionen erlaubt.
Dem Southern Blot Verfahren liegt die Agarosegelelektrophorese zugrunde. Die
DNA-Fragmente wandern durch die Gelporen wie durch ein Sieb. Kurze Fragmente
wandern schneller als längere Fragmente. Oberhalb einer bestimmten Größe passen
kompakte DNA-Fragmente nicht mehr durch die Poren. Die Moleküle müssen eine
gestreckte Form annehmen, deren vorderes Ende in das Gel eindringt. Eine
Auftrennung nach der Größe ist dabei nur schlecht möglich (Strachan, 1996, S. 338).
Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Agarosegelelektrophoresen für den
Southern Bot zeigten, daß sich DNA-Restriktionfragmente bis zu einer Größe von
maximal 20 kb bzw. 30 kb auftrennen ließen.
59
Die Pulsfeldgelelektrophorese stellt eine modifizierte Form der
Agarosegelelektrophorese dar. Die PFGE dient dazu, sehr große Restriktionsfragmente
aufzutrennen. Man gibt die Agaroseblöcke mit den DNA-Fragmenten in die Taschen
des Agarosegels, und die DNA wandert im elektrischen Feld. Während eines
PFGE-Laufs wird die Orientierung des elektrischen Feldes relativ zum Gel periodisch
verändert, indem im allgemeinen kurze Spannungsimpulse an das Gel angelegt
werden. Diese erzeugen abwechselnd zwei verschieden ausgerichtete elektrische
Felder, so daß ein diskontinuierliches elektrisches Feld entsteht. Dieses
diskontinuierliche elektrische Feld bewirkt eine fortwährende Konformations- und
Richtungsänderung der DNA bei ihrer Bewegung durch das Gel. Die Zeit, die ein
DNA-Molekül für eine Konformations- und Richtungsänderung benötigt, hängt
ausschließlich von der Größe ab. Dadurch lassen sich DNA-Fragmente bis zu einer
Größe von mehreren Megabasen gut auftrennen.
Mit der PFGE ist aufgrund der enormen Fragmentgrößen lediglich eine gröbere
Eingrenzung einer bestimmten Chromosomenregion möglich. Andererseits ist durch die
gute Auftrennung größerer Restriktionsfragmente die Wahrscheinlichkeit höher, ein
junction fragment zu detektieren und somit den Deletionsbruchpunkt zu finden.
Mit der Agarosegelelktrophorese für den Southern Blot ist die Wahrscheinlichkeit, ein
junction fragment mit einer Probe zu detektieren, geringer. Gelingt jedoch die Detektion
eines junction fragments, so erlaubt dies eine feinere Charakterisierung der
entsprechenden Bruchpunktregion auf dem Chromosom. Hierbei kann es jedochproblematisch sein, eine exakte Längenbestimmung eines großen (>20 kb) junction
fragments durchzuführen.
5.3.2 Schwierigkeiten bei der Southen Blot Technik
Die Southern Bot Technik weist eine Reihe von Schwierigkeiten auf, so beispielsweise
in bezug auf DNA und deren elektrophoretische Auftrennung im Gel sowie in bezug auf
die radioaktiv markierte Probe.
DNA:Schwierigkeiten ergeben sich hinsichtlich der DNA-Verfügbarkeit (Patientenblut,
Lymphozytentransformation, DNA-Extraktion; s. Kap.2), da für einen Blot jeweils relativ
große Mengen DNA (mindestens 10 µg) benötigt werden.
60
Eine weitere Schwierigkeitbesteht darin, identische DNA-Mengen aufzutrennen. Vor
dem Auftragen der DNA in die Geltaschen wird die DNA-Konzentration photometrisch
bestimmt (s. Kap.2). Dabei erweist sich die photometrische DNA Messung als nicht
ausreichend sensitiv.
Elektrophoretische Auftrennung der DNA im Gel:Trotz vorheriger Bestimmung der DNA Mengen mit dem Photometer, ergeben sich aus
der nicht ausreichend genauen Messung sowie aus den hohen DNA-Mengen von bis
zu 20 µg unterschiedliche Laufgeschwindigkeiten der im Gel wandernden DNA-
Fragmente. Daraus resultieren kleinere Abweichungen der Fragmentlängen im
Vergleich zu den Positivkontrollen (klonierte PAC-DNA) sowie unterschiedliche
Signalstärken nach Hybridisierung. Zur Optimierung könnte man versuchen, nur 10 bis
15 µg DNA im Gel aufzutragen. Des weiteren ist es sinnvoll, die DNA im Gel bei
geringerer Spannung aufzutrennen.
Auswählen der radioaktiv zu markierenden Probe:Ein weiterer problematischer Punkt ist die Sondenlänge: um eine ausreichende
Signalstärke zu erhalten, sollte die Sonde mindestens 500 bp groß sein.
Trotz der hier aufgeführten Probleme läßt sich sagen, daß die Southern Bot Technik ein
äußerst sensitives Verfahren ist und –wie in 5.3.1 bereits erwähnt- eine brauchbare
Alternative zur PCR darstellt sowie diese ergänzt.
5.4 Deletionsanalyse am distalen Deletionsbruchpunkt
5.4.1 Hybridisierung genomischer Southern Blots mit einer radioaktiv markiertenSonde im 3‘-Bereich des NPHP1 –Gens (Probe A)
Allgemein:
Bereits im Vorfeld dieser Arbeit wurden Patienten mit Nephronophthise mit Hilfe der
PCR-Technik auf Deletionen hin untersucht. Der distale Bruchpunkt war nach
Forschungsergebnissen von Hildebrandt et al. (1997) zwischen den Primern 9657T7C5
und 9657T7D im T7-Bereich des PACs 9657 postuliert worden. Aus diesem Grund war
es von besonderem Interesse, in diesem Bereich Deletionsanalysen mit der Southern
Bot Technik durchzuführen, um den Deletionsbruchpunkt näher einzugrenzen.
61
Die Probe A (Kap. 4.1, Abb. 4.1), die aus STS-Primern 9657T(1) und 9657T7F3
generiert wurde, kartiert telomer des Primers 9657D3, der als nicht deletiert galt.
Die Hybridisierung eines genomischen Southern Blots (Restriktionsenzym BamHI)
demonstrierte jedoch Deletion bei den an Nephronophthise erkrankten Individuen. Die
homozygot deletierten Kinder der Familien 9 und 12 zeigten im Gegensatz zu ihrenEltern, die ein gesundes Allel des NPHP1-Gens besitzen, kein entsprechendes Signal.
(Kap. 4.2.1, Abb. 4.2).
Mit diesem Experiment konnte gezeigt werden, daß der distale Deletionsbruchpunkt
weiter telomer liegen muß als aufgrund der PCR-Daten (Hildebrandt et al., 1997)
vermutet wurde. Dies wird in Kapitel 5.4.2 mit einer weiteren Probe bestätigt.
Die Diskrepanz zwischen den PCR-Daten und den in dieser Arbeit mit Hilfe der
Southern Blot Technik erzielten Ergebnisse, lassen sich folgendermaßen begründen:
weitere Sequenzanalysen ergaben, daß die durchgeführten PCR-Untersuchungen
aufgrund von repetitiven Sequenzen in diesem Bereich falsch positive Resultate
lieferten.
5.4.2 Hybridisierung genomischer Southern Blots mit dem EST yb08f05 (Probe B)
Der EST yb08f05 (entspricht ID 70593 bei Saunier et al., 1997) kartiert weiter telomer
als der in Kap. 4.2.1 verwendeten Marker und proximal des telomer gelegenen 100 kb
großen inverted repeats, der invertierten Duplikation (s. Kap. 4.1, Abb.1).
Mit diesem EST als Sonde sollte untersucht werden, ob der distale Deletionsbruchpunkt
noch vor der telomer gelegenen Duplikation liegt, da sich die Publikationen in diesem
Punkt widersprachen (Hildebrandt et al. 1997, Saunier et al., 1997).
Der Southern Blot mit der PstI-verdauten DNA einzelner Mitglieder der Familien 9, 12,
und 33 zeigte Deletion bei homozygot deletierten Individuen (s. Kap. 4.2.2, Abb. 3).
Bei Familie 33 lagen folgende Ergebnisse vor:
Die Mutter wies die 4 kb Bande auf, da sie ein gesundes Allel und ein Allel mit einer
Punktmutation besitzt. Die Kinder, die ein deletiertes Allel vom Vater sowie ein Allel mit
Punktmutation von der Mutter geerbt haben, zeigten ebenfalls das 4 kb Fragment. Der
Vater hingegen ließ eine aberrante Bande bei 2 kb erkennen. Diese Bande ist auf dem
Röntgenfilm nur sehr schwach zu sehen und ist phototechnisch nicht darstellbar. Eine
mögliche Erklärung für dieses aberrante Fragment ist, daß der Vater von Familie 33
(Daten unveröffentlicht) mit FISH-Untersuchungen (Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung)
62
eine Translokation auf Chromosom 6 zeigte. Diese chromosomalen Rearrangements
könnten die Ursache für das Zustandekommen dieses Hybridisierungsergenbisses sein.
Dieses interessante Ergebnis sollte Gegenstand weiterer Forschungsarbeit sein.
Aus diesem Experiment läßt sich schlußfolgern, daß der Deletionsbruchpunkt weiter
stromabwärts, in Richtung telomer gelegene invertierte Duplikation liegt oder, wie
Saunier et al. (1997) postulieren, der telomerische Deletionsbruchpunkt innerhalb der
invertierten Duplikation liegt.
5.5 Deletionsanalyse am proximalen Bruchpunkt bei Familie 12
5.5.1 Hybridisierung genomischer Southern Blots mit einer radioaktiv markiertenSonde im Bereich des vermuteten proximalen Bruchpunkts (Probe C)
Mit Hilfe von PCR-Deletionsanalysen wurde festgestellt, daß bei Familie 12 die Deletion
im NPHP1-Gen kürzer ist als bei den anderen NPH-Familien. Der Vater von Familie 12
ist Träger der “großen” “klassischen” Deletion, während die Mutter eine kürzere Deletion
trägt. Den an NPH erkrankten Kindern wurde die große Deletion des Vaters und die
kürzere Deletion der Mutter vererbt (Hildebrandt et al., 1997).
Zur Charakterisierung dieses für Familie 12 spezifischen proximalen Bruchpunkts wurdeaus dem Sequenzbereich nach Exon 2 des NPHP1-Gens die Probe C ( in Abb. 4.1;
Primer: Zcb 198-c+/Zcb159-c-) generiert und als Sonde für einen Southern Blot
eingesetzt.
Abb. 4.4 und 4.5 (s. Kap. 4) zeigen die Ergebnisse der Hybridisierung. Abb. 4.5 ist
wesentlich heller und zeigt schärfere Banden als Abb. 4.4, da die PACs bei der
Hybridisierung stärkere Signale geben als genomische DNA und da der Film
aufgrunddessen nur wenige Stunden exponiert werden mußte. Der Blot mit der
genomischen DNA mußte wegen der schwächeren Hybridisierungssignale mehrere
Tage exponiert werden und zeigt daher auch entsprechend mehr Hintergrundstrahlung.
In Tabelle 4.1 (Kap. 4) sind die Fragmentlängen aus diesem Experiment aufgeführt.
Vergleicht man die Fragmentlängen der PACs mit denen der genomischen DNA, so
erkennt man, daß die Fragmentlängen der Positivkontrollen mit denen der genomischen
63
DNA bis auf zwei Fälle übereinstimmen: bei den Enzymen DraI und EcoRI weichen die
Ergebnisse ab.
Bei dem Enzym DraI zeigte die Mutter von Familie 12 zwei Fragmente: 1,1 kb und 0,7
kb; der Pac 62p20 zeigte 3 Fragmente: 1,1 kb, 0,5 kb und 0,3 kb. Das Auftreten
mehrerer Fragmente beim Verwenden einer Probe ist ein Hinweis auf interne
Restriktionsschnittstellen des jeweiligen Enzyms innerhalb der Sequenz der Probe. Da
die Sequenz von Exon1 und Exon 2, aus der die Probe stammte, bekannt war, wurde
sie herangezogen, um die Fragmentlängen zu überprüfen. Die Sequenz ist im Anhang
beigefügt. Es fanden sich fünf DraI Restriktionsschnittstellen im Bereich der Probe
(2310bp- 4343bp): bei 2305 bp, bei 3370 bp, bei 3389 bp, bei 3471 bp, und bei
4310 bp. Daraus ergaben sich folgende Fragmentlängen: 1055 bp, 19 bp, 82 bp und
839 bp.
Das 1055 bp gr0ße Fragment entspricht dem genomischen und dem PAC Fragment
von 1,1 kb.
Für das 839 bp große Fragment kann folgende Erkärung herangezogen werden: es
entspricht etwa dem genomischen 0,7 kb Fragment und dem 0,5 kb Fragment des
PACs, da die Längenberechnung der Fragmente mit Hilfe eines Längestandards (Kap.
3.7.8) auf halblogarithmischen Papier nicht exakte Werte liefert. Somit können gewisse
Abweichungen und Ungenauigkeiten auftreten.
Im Falle der DNA des PACs, die etwas langsamer gelaufen ist als die genomische
DNA, kann man davon ausgehen, daß das detektierte Fragment von 0,3 kb dem
berechneten ~0,1 kb Fragment entspricht. Denn die halblogarithmische
Fragmentlängenbestimmung ist nicht hundertprozentig und liefert nur Näherungswerte.Der Southern Blot demonstrierte mit dem Restriktionsenzym EcoRI das interessante
Ergebnis eines erstmaligen junction fragments. Während der PAC 62p20 ein Signal bei
16 kb zeigte, sah man bei der EcoRI-verdauten DNA der Mutter von Familie 12 zwei
Banden, eine von 16 kb und eine weitere von >33 kb Länge. Durch Wiederholung
dieses Experiments konnte das Ergebnis bestätigt werden (s. Kap. 4.3.1, Abb. 4.6). Wie
in Kap. 5.1 beschrieben, entsteht ein junction fragment durch Deletion einer
Restriktionschnittstelle und die Verbindung mit einem anderen Fragment nach der
Deletion. Es wird somit von den jeweils ersten Schnittstellen vor und nach der Deletion
begrenzt. Heterozygote Deletionsträger zeigen im Southern Blot ein normales Fragment
sowie ein junction fragment. Homozygot deletierte Individuen besitzen ausschließlich
das junction fragment. So auch in Abb. 4.6.: die Mutter von Familie 12 weist neben dem
64
16 kb Wildtyp-Fragment auch das >33kb junction fragment auf, das erkrankte Kind
dieser Familie jedoch nur das junction fragment.
Die Identifizierung des junction fragments stellt die Grundlage für die weitere
Eingrenzung des proximalen Deletionsbruchpunktes bei Familie 12 dar.
5.5.2 Erstellung einer partiellen Restriktionskarte für den proximalen Bruchpunktbei Familie 12
Die Ergebnisse, die Probe C lieferte, erlaubten die Konstruktion einer partiellen
Restriktionskarte für den proximalen Bruchpunkt bei Familie 12 (s. Abb.4.7, Kap.4.3.3).Die stromabwärts gelegene Restriktionsschnittstelle des EcoRI Wildtyp Fragments (bei
ca. 15,6kb) lag bereits in der Deletionsregion Die letzen beidenRestriktionsschnittstellen vor dem proximalen Bruchpunkt waren bei ca. 7 kb für HindIII
und bei ca. 8,5 kb für XbaI postuliert worden. Der proximale Bruchpunkt bei Familie 12
war auf etwa 7 kb eingegrenzt worden.
Indem man weitere in der Nähe des proximalen Bruchpunktes gelegeneRestriktionsschnittstellen ermitteln würde, würde sich ein kleineres junction fragment
finden. Dadurch würde man die Möglichkeit haben, den zentromerischen und den
telomerischen Bruchpunkt bei Familie 12 zu identifizieren. Mit Hilfe des gemeinsamen
telomerischen Bruchpunktes ließe sich dann auch der „klassische“ proximale
Deletionsbruchpunkt ermitteln.
5.6 Deletionsanalysen stromabwärts des vermuteten proximalen Bruchpunkts beiweiteren NPH-Familien
5.6.1 Hybridisierung genomischer Southern Blots mit einer radioaktiv markiertenSonde im Sp6-Bereich des PACs 62p20 ( Probe D)
Mit einer Probe aus dem Sp6 –Bereich des PACs 62p20 (62p17A+/ 62p2019A-; Probe
D, Abb. 4.1)wurden die NPH-Familien 9, 12, 33 und 40 auf Deletion hin untersucht. Es
zeigte sich, wie erwartet, keine Deletion in diesem Bereich. Alle Individuen– mit
Ausnahme des Vaters von Familie 33- lieferten das 5 kb Fragment (Abb. 4.8). Da beim
Vater von Familie 33 keine Bande zu sehen war, sprach dies für homozygot Deletion.
65
Hier lag ein Widerspruch vor, denn er war gesund und zeigte keine Symptome einer
Nephronophthise. Wie in 5.4.2 bereits erwähnt war bei ihm in einer FISH-Untersuchung
eine Translokation auf dem Chromosom 6 gezeigt worden. Ob diese mit dem hier
erwarteten Ergebnis in Verbindung steht, bleibt Gegenstand weiterer Forschungsarbeit.
5.7 Mögliche Pathomechanismen für die Entstehung der NPHP1-Deletion
Neben den einfachen Mutationen gibt es auch Deletionen, die in vielen Organismen
Krankheiten verursachen können. Den häufigsten Mechanismus bei Deletionen von
Genen stellt die homologe Rekombination dar. Dabei unterscheidet man homologe
ungleiche Rekombination zwischen zwei homologen Chromosomen oder
Schwesterchromatiden (Cooper und Schmidtke, 1991) von nicht homologer
Rekombination zwischen zwei kurzen DNA-Sequenzen mit minimaler Homologie
(Krawzak und Cooper, 1991).
Im menschlichen Genom gibt es viele spezifische Sequenzen, die an der Formation von
Deletionen beteiligt sind. Zu diesen zählen die long interspersed nuclear elements
(LINE oder L1), die short interspersed nuclear elements (SINE), wie beispielsweise
Vertreter der Alu-Familie, Transposons (Mariner Elements), Topoisomerase I und II
Sequenzen, direkte und indirekte repetitive Sequenzen sowie verschiedene kleinere
Familien von Transposons.
Die drei häufigsten Arten mobiler Elementen im menschlichen Genom sind
Transposons (Mariner elements), autonome Retrotransposons (IAPs und LINEs) und
nicht autonome Retrotransposons (Alu-Wiederholungsequenzen, prozessierte
Pseudogene). Sie können für krankheitsverursachende Deletionen des menschlichen
Genoms verantwortlich sein (Kazazian, 1998).
Im Bereich des eingegrenzten Deletionsbruchpunktes bei Familie 12 wurde ein LINE-1-Element entdeckt. Es befand sich zwischen Exon 2 und 3 des NPHP1-Gens. Daher soll
die potentielle Rolle dieses Elements bei der Entstehung der Deletion diskutiert werden.
Mehr als 50.000 Wiederholungen der LINE-1-Elemente kommen im menschlichen
Genom vor. Sie machen ungefähr 5% der menschlichen DNA aus. Mindestens ein
Viertel des menschlichen Genoms besteht aus Sequenzen, die direkt mit L1-Elementen
verwandt sind oder durch die Wirkung der von den LINE-1-Elementen kodierten
Reversen Transkriptase entstanden sind (Smit, 1996).
66
Ein vollständiges LINE-1-Element ist ungefähr 6-7 kb groß. Es besitzt zwei offene
Leserahmen (ORF). ORF1 ist ca. 1 kb groß und kodiert für ein unbekanntes Protein,
ORF2 ist 4 kb groß und kodiert für eine Endonuklease sowie für ein Reverse
Transkriptase. Bei mehr als 90% der LINE-1-Elemente handelt es sich jedoch um am
5’-Ende verkürzte Varianten. Die interne Struktur ist bei ungefähr 10% verändert.
LINE-1- Elemente können sich autonom replizieren. Ihr RNA-Transkript kann mit Hilfe
der eigenen Reversen Transkriptase in der Zelle in eine komplementäre DNA
umgeschrieben werden. Der Einbau dieser DNA erfolgt an verschieden Stellen im
Chromosom (Weiner et al., 1986).
Mittlerweile gibt es ca. 10 Berichte in der Literatur über krankheitsverursachende
Deletionen im Bereich von LINE-1- Elementen. Homologe Rekombination zwischen
zwei LINE-1-Elementen fand sich bei einem Fall mit Alport-Syndrom und
Leiomyomatose (Segal et al., 1999) sowie bei einem Patienten mit Hämophilie A (Van
de Water et al., 1998). Meistens jedoch liegen nicht homologe Rekombinationen
zwischen LINE-1-Elementen und nicht repetitiver Sequenz vor.
Da in der Nähe des vermuteten proximalen Deletionsbruchpunktes bei Familie 12 ein
LINE-1-Element vorzufinden war, könnte das Entstehen dieser Deletion in direktem
Zusammenhang mit diesem mobilen Element stehen. Das Vorkommen dieses LINE-1-
Elements muß daher als möglicher Pathomechanismus für die Entstehung der Deletion
in Betracht gezogen werden.
5.8 Ausblick
Die im Rahmen dieser Arbeit gewonnenen Daten stellen die Grundlage für die
Identifizierung der Deletionsbruchpunkte bei Patienten mit Nephronophthise dar. Mit der
erstmaligen Darstellung eines junction fragments bei NPH gelang es, den proximalen
Deletionsbruchpunkt bei Familie 12 auf einen Bereich von 7 kb einzugrenzen. Durch
weiteres Sequenzieren, Verwenden zusätzlicher Restriktionsenzyme und Einsetzen von
Sonden, die sich näher am Bruchpunkt befinden, besteht die Möglichkeit, kürzere
junction fragments zu detektieren. Diese erlauben eine engere Eingrenzung der
Bruchpunktregion. Desweiteren läßt sich mittels einer „across-breakpoint-PCR“ durch
Sequenzieren des amplifizierten Produkts die genaue Identifizierung der
Deletionsbruchpunkte vornehmen. Weiteres Sequenzieren in diesem Bereich kann
Aufschlüsse über Pathomechanismen, die für die Deletion verantwortlich sein können,
67
geben. Dazu müßte man gezielt nach Hinweisen auf Rekombination und nach
spezifischen Sequenzen, beispielsweise LINE-1-Elementen, repetitiven Alu-Elementen,
Topoisomerase I und II Sequenzen sowie anderen repetitiven Elementen suchen.
68
6. ZUSAMMENFASSUNG
Die Juvenile Nephronophthise (NPH) ist eine autosomal-rezessive zystische
Nierenerkrankung, die im Alter von ca. 13 Jahren zu terminalem Nierenversagen führt.Das Gen für Nephronophthise Typ 1 (NPHP1) wurde auf dem Chromosom 2q13
identifiziert. Es besteht aus 20 Exonen. Mehr als 80% der Patienten tragen eine 250 kbgroße homozygote Deletion des NPHP1- Gens, die von beiden Seiten von einer
invertierten Duplikation (100 kb) flankiert wird. Alternativ dazu gibt es bei einer weiteren
NPH-Familie (F12) eine kürzere mütterliche Deletion im proximalen Bereich. Die
Deletionsbruchpunkte waren durch PCR-Analyse postuliert worden. Dabei waren der
klassische proximale sowie der gemeinsame distale Deletionsbruchpunkt auf Intervalle
zwischen STS- Markern festgelegt worden. Der alternative proximale Bruchpunkt vonF12 war zwischen Exon 2 und Exon 3 des NPHP1 Gens eingegrenzt worden.
Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Southern Blot Analysen sollten die PCR-
Daten bestätigen und zur weiteren Charakterisierung der Bruchpunktregion führen.
Mit zwei Experimenten konnte gezeigt werden, daß der gemeinsame distale Bruchpunkt
weiter telomer liegen muß (in Richtung telomer gelegene invertierte Duplikation,
möglicherweise innerhalb dieser) als aufgrund von PCR-Daten bisher vermutet.
Der alternative proximale Deletionsbruchpunkt bei Familie 12 konnte durch die
erstmalige Detektion eines >33 kb junction fragments und durch die Erstellung einer
partiellen Restriktionskarte für diese Region auf einen Bereich von ca. 7 kb eingegrenzt
werden.
In der Nähe des vermuteten proximalen Bruchpunktes bei F12, zwischen Exon 2 und 3,
fand sich ein LINE-1-Element. Dieses autonome Retrotransposon könnte eine
potentielle Rolle bei der Entstehung der Deletion bei F12 spielen.
69
7. LITERATURLISTE
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8. ANHANG8.1 Sequenzierter Bereich Exon 1 und Exon 2
ATAGTACAAAAAAAGGCAACACAAGTTTGTGCTCTTATAAGTTAGGATATTGTTCACCTTTGGT
GTGTGGTAGAGAAGTGAGAGGGTTGAGAGGTTGGGGGTAGGCAAGGACTAGAAAGACAGGAAGA
GTGTGAGTGGGCAGATAATGTTCTGTTTCATAATCTGGGTGCTGTTATGGGGTGGAGGGTTTTC
AGAGCTGCACACAAAGTCTGTAGACTTTTCTCTGTATGTATTATACTTGAAGAAAAAAGTACAT
AAATAATGGTTCATCCTGGCCTGTGGCTGTTCTGAAGAACATTCATTTGTATTAATGGGGTCCA
TCATTTGGAAGGTGAGCCCCAAGCATCATCATTCTTATTCAAGTTCAATTTTGGTGTAGTGGAG
TTTTGGAATTGGATTCATGGGATGCAGTCCCATATGGGGGAAACATGACAACCTTCCTGAGAGT
TGATGTAAACTGGGAATCATAATGAGAACTAATAATTTGCTCATAGATTTGCTGTAGAACAATT
ACCATCCTTACAGAATTCAGAATTGACAACGTGCAATATTAGAATGAAATGAAACTTCAGTAGC
EcoRI
CTAAATGGCAAAGAATTAAAAACTGCCTTTTGAAGTGACAGTATGGAACAGAACCATATATTCC
ATAGGAAAGCTATCCTTGGAGTTAATGAAAGAGTTTAAGATACTAAAATTGTATCTTAACATTA
GCTTACAAAATTGGTATCAGAAAGCAAATGCCATAAAACAGGTATCCCAGCAAGAAGGTGGTGT
TATTATTGATGTATTGTGGGGAATGTAGTTTCAGACGCCGGGGGACGTTCCCCTATCCTTAGGA
ATTGCCGAGGAAAAGTGACTCCCCCGGCTGTGACCTGCCTGGTGGCGTGGGATGACCACCGCAA
GAGAACATTTGACCCTTCCCGGGACCGGCCCGGGCGGGGCGGGGCTGGGAGGCGGGCGCACATC
GATGGCGTCACCTTCTGGCGCCGCCGGTTGGTTTCCCTGGCAACTGGAGCAATCAGAGCACCGC
AGCCAGGGAG
1 ATGCTGGCGA GACGACAGCG AGATCCTCTC CAGGCCCTGC GGCGCCGCAA
exon 1
51 TCAGGAGCTG AAGCAACAGG TATGGTCAGG CTGTGCAGAG GGCCCTGGGG
101 CGGGCGACAG GCGGACGCAG CTGCGCGCAC TGCGCCTTCC CACCGTGACC
151 CCACCTAATC CTGGGAGCTT GCCCCCAACC TACTTACCTT CCCAGGTTGT
201 AACGCCCCCT TACCCCATAA CATTCCAGCA CCCAACCCCG ATTCAAACCC
251 CTCCTGATCC CAACTCAACC CCCAGCCAAA GGCGAAACCT CCCAAAATTC
301 GTGACCATCA ACTAAGCGCC CCCTCCTCCG ACCCTCACTC CCACCTAACG
351 TCTCAACCTC CTACCCTAAC AACTCACTAA CCCACCTTAT CTCCCAATCT
401 AAACTTAGTG GTGTAACCAT TTCCAACCCA ACTCTGAGCC TAGCTCCTCT
451 CCTCCACTTT CCAAGCCCAT TTCCTTTCAG CCTTCCTCAA GTGGAGATTA
501 TTATTGCCTC CGTGAACTCA AGCGAAATAG GTGTCAAGAA ATAGTCTTAA
551 TATGCAAGAA CATTAAGATC TGATAAATGA GCAAAGGAGG TGAACGAGAG
601 AGGAAATACA AGTAACTCAT AAACATACGA GGAATGTTAA CTTCAAAGAT
651 ACTCAAGTAA TTGCAAAGCA CATAAGGTAT CACAAAAATG TTAAAAATCA
701 CAACACTCTG TCTTGAGGAA GGTGTGATGA AGCAGGCACA TTCACTGCTC
751 CCGTGTATAA GGTGCTTGTA CAGCATTTCA GGAAAGCAGC TTGACAAGGT
801 GTAACATATG TGTATGCACC TAGGCTCAAA AATTACATTT CCAGGGATCT
851 GCTATGTGTA ATAATTAGAA AGTAGGACAG AGATTGATGT ATAAAAGTAT
901 TCATCACATT GTTACTTATA TAATATACAC AGAACAGCAT AGAAGGGAAC
951 AGGCTAATAT GGTATTTCTG TGTGACAGGA TGCTGATGAT TATTATGATT
1001 TTCTTTATTC TTTTTCATAT TTATAAAAAT TTTTAGGCCA GGTGTGGTGG
1051 CTCATGCTAG TAGTACCAGC TACTTGGGAG GCTGAGACAG GAGGATCACC
1101 TGAGCCCAGG AGTTCGAGAC TAGCCTGGGC AACATAACAA GACTTGGTCT
1151 CAAAAAAAAA AAAACTTTTT AAAAATACAC TGAGTTCTTA TTAAAAATAA
1201 GAAAAAAGTA AATAGCAACC AGTGGGTTTA TTTTCTGACA TTTTAATTTC
1251 ACTTTAATTT TTTTCATGTG ATCTATTACC AAGTATTTTT CCACTGAGTA
1301 AAATTATTTT ATAATCTGAG GCCGGTAAGA GATTCACTGA TGCTCATATT
1351 TTATCCATTT TTGTTCTCTT GTTTAAAGTA AAAAGGATTT GGAAGGTAAA
1401 TATTTAGGTG ACTGTGTATT GGAATCACAG TGGTGCAACA AAAGCTAAAT
1451 ACTCTTCTGG TAGAAATAAA AAATAAAACT TGATGGGGCA TTGACTTATG
1501 CTGAACTTCG GTGGATCTTA ATATGGTTCT GTGTCTTATT TTAAAATTTC
1551 AACTTTTATT TTAGATTCAG GGGGTACATG TGCAGGTCTG TCACATGGGA
1601 ACACTGTGTT ATGCTGAGGT TTGGGGTACA GATGAGCCTA TCACACAAGC
1651 AGTGAGCACA GTACCCAATA GGCAGTCTTT CAGTCTTCAT TCCTCTTCCC
1701 TCCCCCACCC CACTCCAGCA GTCACCAGTG TCCATTGCTC CCATCTTTAT
1751 GTCCATGTGT ACTCAACGAG TGAGAACATA TGGTATTTGG TTTTCTGTTC
1801 CTATGCTAAT TCACTTAGGA CAATGGCCTC CAGCTCCATC CATGTTGCTG
1851 CAAAGGACAT GATTTCATTC TTTTTTATGG TTGCATATTT TTTCATGGTG
1901 TATATGTACC ACATTTTCTT TATCCAGTCC ACCATTGGTG GGCATCTATG
1951 TTGATTCCAT GTCTTTGCTA TTGTGAATAG TGCTGTAGGG AACATACACA
2001 TGCATGTGAC ATTTTGGTAG AATCATTTCT TTTTTGGGGG TATATACACG
2051 GAAATGGGAT TTCTGGGTCA AATGATAGTT CTGTTTTACG TTGTTTGGGA
2101 AATCTCCAAA CTGCTTTCCA CAGTGGCTGA ACTAATTTTC ATGCCCACCN
2151 AACAGTGTaT ATGTGTACTC TTTTCTTGTC AGCCTCACCA GAATCTGTCA
2201 TTTCTTGATT TTTTAATAAT AGCCATTTTG ACCAGTGTGA GATGGTACCT
2251 CATTGTAGTT TTAATTTGCA TTTCTCTGAT GATTAGTCAT GATGAGTTAA
TTTTAAATTT AGTGGGACAT TAGGAGAACC AGGAAAAGTT TTAGAAGGAA
DraI Zcb198-c+
2351 ACTATAAAAA TGATTNATTA AAACAAACTA TTAGAAAGNT NNTTCTcCCC
2401 TGGNgNAANA taNNNNGCTT NNGGAGCCCT TTNGATACCT TGANAATNNG
2451 GGAAAAGTTT NTTTNGATAG TATTAAGCTA ATTCTTCCCT GTCTTCACAG
2501 AGGACACCTG GAGCTGAATA TGGAACAGAT TTTCTATTCG GTGTCTGTNG
2551 GACAAGTAAT CAACANCCCC TCTGAGTCAG GCCTGTGATG ACTGGCTCTA
2601 TCACTAGGNG NGTGGATTTN GNAAATAACA CTCAGATGGA TGCCAAATTG
2651 CAAGAGTACA GAAGAAACTN ATGGAATTTT CTCTTTTTTC ATCCACTTTA
2701 TCTTCTCTAC GTAATCTATA GAAAACAGAC CAAAGAAGTA TGTGCCTTTT
2751 TGGAGAGTAT ATTGACAAAG TTACATATAG TGTTAGTAAA CAAACTACTA
2801 AGTCAAGAGA AACAAAGTCA TGATACATTC AATACAATGG ATACCACTCA
2851 GTAATGAGAA GGAATGAACT AATGGTACAC ACAACAATAT GGAAGTATCT
2901 CAAAAACATG CTTTGTGGAA AGGTTACACA AGAGTGCTTA CTGTATGAGT
2951 CCATTTATAT AAAATTTCAA GAACAGGCAA AACTAATTTA TGTTGGAAAA
3001 ATATCAAAAC AGGTTTGTCT GTGGAGGAAT AAGGAGGGGA TTTACTGGCA
3051 AGGGCATGAG GGAACTTACT AGGGTGATGG TAGTTTTCTA CATCTTGATA
3101 AGAATTTTGG TTACACAGAT GTATGCATTT GTCGAAACTC AGCAAATGTA
3151 TGCCTCGTAT TTGTGCATTT CACTATATAC ATATTTTACA TCAACTATTG
3201 AACTTTAGTT AGTGACATCC ATAGTCCATT ATTTAGGGAG AAATGTATTG
3251 ATAACTGCAA CTTACTTTGA AAGGCATAAG GTGGGTTGAC GGATAGATCA
3301 AATAAGTATA GTATAATGTT AATGTTTTTT CTAGGTAGCG GGTATATGGG
TTTTCACTGT AAAATTTTTA AAACTTTGTT GTATGTTTAA AAGTGTTCAT
DraI DraI
3401 TATAAAATAT TGGATAAAAA AAGAAGTTTT CTTTCCTAAG GCGATATGGT
ATTTAATAAT GTGATATTTT AAATGGTCTC CATAGGTTGA TAGTTTGCTT
DraI
3501 TCTGAGAGCC AACTGAAAGA AGCTCTAGAA CCCAATAAAA GACAACATAT
exon 2 XbaI exon 2
TTATCAAAGG TAAAGTATGC TAAATTATAT AAGCTTTACA GGAACCGCAC
HindIII
3601 TTACATTTCA ATGCATAGTA TTTAAGGCAT AGAGATTGGT CCTTTGGAAT
3651 CAAATGGAAG AATCACATAG TGTTGTAAGT TGAATGTAGA AGAAACCAAC
3701 CTAAACCTGA TGGTTGCGGA CTTGCTGTTG TGACAGCAAC TATAAAAACT
3751 GCTTAATGTA AACATAGGTG ACATGGGCAG GATTACCCTA AATCCTTAGC
3801 CTATGTAGCC CAGATCCTGT GACCTGGTCA GAAACCTCTG TCTATAAGCA
3851 ATTAGTACTT CATTGGGATG TCAACTTTAA CTCCCATGAG AAGACAACAC
3901 TGTTTTCTAG GTGGGTGTTT TTTGTTTTGT ATTTGTTTTT ACTTAAAAAA
3951 AAATCCTTGG GAGAGTTTAA ATAGACGTGA TGAACTACAT CAAATTTAGA
4001 CTATTAATTC ATAACATTTG TATTAAGTTT AGGACATCAT TAAGATAATC
4051 TTTGTTTTTG AGATATTTAA GGATTTTATT ACATTCCAAA GAACATGAGA
4101 TTCATTCTAT TAATTTAAGT GAATTGTAAT TGTTTGGAGA AGTTTTACTT
4151 AAGTCAGGCA TTCAGAGTGC TTAAAGGCAA AACAAATGAA TTTTGAAATG
TCAAATGAAT TTAATTTATA ATAGTAGGAT TGATTAAGGG ATTTAGTTCA
Zcb 159-c-
AGCTGAATTA ACAGTAATGA AAGAAAAGCA AAGGTTATTG TTCTTGCTTT
ACTAGATTTA AAAACAGAGT AAGATTTATA GACTGAATTT GAAGGCCAAG
DraI
4351 GGAAAACTAC GTTTTTAAAT TTTATGTTAG TAAACTAAAA ATCATAATTA
4401 TTATTATTTT ATTTTTTGAG ACTAAATCTC ACTCTGTCAC CCAGGCTGGA
4451 GTGCAGTGGC GCAATCTCGG CTCATTGCAA CCTGCACCTC CCAGGTTCAA
4501 GCGATTCTTC TGCCTCAGGC TCTTGAGTAG TTGGGATTAC AGTCGTGCCC
4551 CACCACACCT GGCTGGATTT TGTATTTTGA GTAGAGATGG GTTTCATCAC
4601 GTTGGCCAGG CTGGTTTCGA ACTCCTGACC TCAAGGGATC CCCCAGCCTT
4651 GGCCTCCCAA AGTGCTGGGA TTATAGGTGT GAGCCACTGT GCCCAGCCTA
4701 ATAATTGTTA TGTTTTATTT TTTTTGAGAT AGAGTCTCTC TCTGTCGCCC
4751 AGGCTGGAGT GCAGTGGCAT GATCTCGGCT CACTGCAAGC TCCACCTCCC
4801 AGGTTCAAGC GATTCTCCTG CCTCAGCCTC CCGAGTAGCT GGGATTACAG
4851 GTGCCCGCCA CCATGCCTGG CTAATTTTTT GTATTTTTAG TAGAGATGGG
4901 GTTTCACCGT GCTAGCCAGG ATGGTCTCAA TCTCCTGACC TCATGCCCCC
4951 TGCTTTGGCC TCCCAAAGTG CTGGGATTAT AGGCGTGAGC CACCGCGCCC
5001 GGCC
Legende:Exone: doppelt unterstichen
Restriktionsschnittstellen: einfach unterstrichen
Primer: fett unterstrichen
8.2 Danksagung
Mein erster Dank gilt Herrn PD Dr. Friedhelm Hildebrandt für die freundliche
Überlassung des Themas und die vielen konstruktiven Anregungen. Bei meinem
Betreuer Dr. Edgar Otto möchte ich mich für seine Geduld, seine hilfreiche
Unterstützung und seine kompetente Betreuung bedanken.
Recht herzlich danke ich auch Herrn PD Dr. Offensperger für die Übernahme der
Zweitkorrektur.
Anita Imm und den anderen Mitarbeitern im Labor danke ich für ihre gute
Zusammenarbeit und die schöne Zeit.
Bei meinen Freunden und vor allem meiner Familie möchte ich mich für ihre
Unterstützung während der gesamten Zeit bis zum Vollenden dieser Arbeit bedanken.
Thalia Vetsi
8.3 Abstracts und Veröffentlichungen
AbstractsC. Rensing, E. Otto, M. Vollmer, U. Sommer, T. Vetsi, J. Adolphs, H. Omran, M.
Brandis, F. Hildebrandt und Arbeitsgemeinschaft Pädiatrische Nephrologie,
(Universitäts-Kinderklinik Freiburg), Monatszeitschrift Kinderheilkunde Band 146,
Heft 2-1998
C. Rensing, E. Otto, M. Vollmer, U. Sommer, T. Vetsi, A. Imm, M. Brandis, F.
Hildebrandt, (Universitäts-Kinderklinik Freiburg), Mutationsanalyse bei Patienten mit
Nephronophthise Typ 1 und assoziierten Symptomen, Monatszeitschrift
Kinderheilkunde Heft 4-1998
E. Otto, R. Betz, S. Schätzle, T. Kuntzen, T. Vetsi, A. Imm, M. Brandis, F. Hildebrandt
(Universitäts-Kinderklinik Freiburg), Charakterisierung der chromosomalen
Bruchpunktregion bei Patienten mit Nephronophthise Typ 1, Monatszeitschrift
Kinderheilkunde, Heft 2-1999
VeröffentlichungEdgar Otto, Regina Betz, Cornelia Rensing, Silvia Schätzle, Thomas Kuntzen, Thalia
Vetsi, Anita Imm and Friedhelm Hildebrandt (2000) A Deletion Distinct from the
Classical Homologous Recombination of Juvenile Nephronophthisis Type1 (NPH1)
Allows Exact Molecular Definition of Deletion Breakpoints, Human Mutation 16: 211-223