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Diagnostic bactériologique Diagnostic bactériologique de de Mycoplasma pneumoniaeMycoplasma pneumoniae
par PCR en temps réelpar PCR en temps réel
Au laboratoire de PellegrinAu laboratoire de Pellegrin
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M. pneumoniae with respiratory epithelial cells
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● Non commensal : pas de portage sain (sauf période d’épidémie)
● Infections respiratoires aigues, souvent bénignes
● Transmission aérienne
● Enfant > 5ans, adulte jeune-Trachéobronchites +++- Pharyngites- Pneumopathies atypiques- Asymptomatique (20%)
● Mode endémique avec poussées épidémiques Tous les 4-7 ans
Probable : exacerbation de l’asthme chez enfant et adulte
Infections respiratoires à M. pneumoniae
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Manifestations extra-respiratoires
● Lésions cutanées +++éruption, exanthème, érythème noueux, Stevens Johnson
● Atteintes neurologiques encéphalites, neuropathies périphériques, Guillain Barré
● Arhrites, arthralgies
● Cardiaques (rares)myocardites, péricardites
● Anémie hémolytiques (rares)
Non spécifiques
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Diagnostic biologique
● Recherche directe de la bactérie
- Culture
- PCR
● Recherche indirecte : recherche d'anticorps
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Prélèvements pour détection directe
● Mêmes pour culture et PCR
● Respiratoires pvt gorge (infection diffuse)asp. naso-pharyngée (jeune enfant)LBA (formes sévères)expectorations peu adaptées
Autres (rares)
● Milieu de transport- Milieu 2SP (saccharose-phosphate)- conservation +4°C 24 h, puis -70°C
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Culture de M. pneumoniae
• Fastidieuse, longue • Exigence nutritionnelles milieux spéciaux enrichis
Hayflick modifié, SP4(20% sérum, extrait levure, -lactamines)Solide ou liquideGlucose 37°C +/- CO2 pendant 2-3 semaines
• Prop. métaboliques en milieu liquideFermentation glucose Changement de couleur du rouge de phénol
• Dilutions indispensables (inhibiteurs)
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Détection de la croissance en milieu solide
● Aspect des colonies sur agar (37°C, CO2) Loupe binoculaire, 50-300µm
2-3 sem
● Identification : aspect colonies, hémadsorption, PCR
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Détection de la croissance en milieu liquide
● Virage indicateur coloré
- Fermentation du glucose acidification : virage du rouge de phénol : rouge jaune
- 2-3 semaines en primo-isolement
M. pneumoniae
● Sensibilité vs PCR: 60%, spécificité : 100% rare (labo spécialisés)
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Détection par biologie moléculaire
● Hybridation par sonde : peu sensible
● 1ère publication de PCR en 1989 (Bernet, JCM, 89)
1989-2003 : 34 articles (Loens, JCM, 03)
● Cibles variées ATPase, gène tuf
ARNr 16S adhésine P1 +++ (meilleure sensibilité)
● Techniques variées- ADN : PCR, PCR multiplex, PCR en temps réel
- ARN : NASBA, RT-PCR
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● Extraction d’ADN- phénol-chloroforme et précipitation de l’ADN
+/- SDS, protéinase K- sonication- ébullition- kits commercialisés- Automate (ex: MagNAPure Roche diagnostic)
Sensibilité: 78-92%, spécificité: 92-100%
Détection par biologie moléculaire (2)
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Avantages Rapidité Grande spécificité Bonne sensibilité si infection Quantification possible Typage des souches, (groupe 1 et 2) Autres pathogènes respiratoires (PCR multiplex)
Limites Méthodes "maison" Contrôles indispensables
- Négatifs- Internes- Extraction
Présence possible comme commensal? Détection d’organismes non viables
Détection par biologie moléculaire (3)
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Diagnostic biologique
● Recherche directe de la bactérie
- Culture
- PCR
● Recherche indirecte : recherche d'anticorps
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Diagnostic indirect sérologique
• Très utilisé mais résultat tardif
• Cinétique des ACIgM : 1 sem après début infection, enfants +++IgG : pic à 3 semaines, décroissance plusieurs moisIgA ?
• Différentes techniques- agglutination de particules- immunofluorescence- Fixation du complément- ELISA (différents antigènes)
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IgG
IgM
Infection
Temps (semaines)
Qua
ntité
d'A
ntic
orps
Cinétique des anticorps
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En résumé
Diagnostic par PCR + sérologie
• Enfants, PCR + IgM (sérum en phase aigue)
degré maximal de certitude diagnostic en 1 ou 2 jours
• Une PCR positive isolée chez enfant avec pneumopathie atypique : très suggestif
• Adultes, PCR + FC ( 1/64) ou IgG X4 entre 2 sérums
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Aujourd'hui, recherche de M.pneumoniae
Prélèvement de gorge
Extraction d'ADN automatisée
PCR en temps réel Taqman
Interprétation des résultats
MagNAPure
Prism 7000
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Extraction d'ADN automatisée
MagNA Pure LC, Roche diagnostics
Principe
- Lyse cellulaire et dénaturation des protéines
- Digestion des protéines (Protéinase K)
- Liaison de l'ADN à la surface de particules de verre magnétiques
- Lavages (élimination des protéines, membranes, etc…)
- Elution de l'ADN purifié à haute température
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Amplification par PCR temps réel
ABI Prism 7000
PCR en temps réel
- Protocole Taqman
- Cible : Adhésine P12 amorces :
P1-204P1-328
1 sonde de 125 bp P1-284R (FAM-TAMRA)
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Sondes Taqman - Principe
Hybridation d'une sonde spécifique
Composition de la sonde ● Fluorochrome émetteur (reporter) en 5'Ex : FAM 6-carboxy-fluorescein
● Fluorochrome suppresseur (quencher) en 3' ex : TAMRA 6-carboxy-tetramethyl-rhodamine
pas d'émission de fluorescence
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Cette méthode repose sur deux principes :- la technologie FRET (fluorescence resonance energy transfer)- l’activité 5’-exonucléase de la Taq Pol
Spécificité l’amorce pour la PCR Spécificité de l’hybridation de la sonde TaqMan
5’
5’
3’
3’
FP
RP
Reporter Quencher
FAM, VIC TAMRA
Sondes Taqman - Principe
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5’
5’
3’
3’
FP
RP
R Q
Lumière
- FRET (fluorescence resonance energy transfer) depuis le reporteur (haute énergie) vers le quencher (faible énergie),
pas de signal fluorescent émis par le reporteur quand la sonde est intacte
Sondes Taqman - Principe
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- au cours de l’élongation catalysée par la Taq Pol l’activité 5’ nucléase coupe la sonde libération du reporter
5’
5’
3’
3’
FP
RP
R
Q
5’
5’
3’
3’
FP
RP
R
Q
- lorsque la polymérisation est complétée, pour chaque molécule d’ADN synthétisée un reporteur émet de la fluorescence.
![Page 24: Diagnostic bactériologique de Mycoplasma pneumoniae par PCR en temps réel](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062314/568146a2550346895db3bdf5/html5/thumbnails/24.jpg)
Sondes Taqman
Avantage : - Spécificité accrue
Spécificité des primers pour la PCRSpécificité de l’hybridation de la sonde TaqMan
- Possibilité de multiplexage avec des sondes portant des fluorochromes différents
Inconvénient :- Impossibilité de réaliser des courbes de fusion
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Protocole opératoire
- Extraits dilués au 1/10ème
- Préparation du MixAmorcesSondesMix (dNTP, Taq Polymérse, tampon)+ Ajout de l'échantillon extrait au 1/10ème
- Contrôle interne : mélange précédent + culture extraite de Mpn permet de vérifier l'absence d'inhibiteurs de PCR dans l'échantillon
- Amplification d'une gamme de concentrationCulture extraite, pure et dilutions au 1/10ème, 1/100ème et 1/1000ème
- Protocole du thermocycleur10min 95°C15 sec à 95°C1 min à 60°C 40 cycles
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Témoin + : culture de Mpn extraite et amplifiée pure, 1/10ème, 1/100, 1/1000ème
pur10-1 10-2 10-3
Interprétation
![Page 27: Diagnostic bactériologique de Mycoplasma pneumoniae par PCR en temps réel](https://reader035.vdocuments.pub/reader035/viewer/2022062314/568146a2550346895db3bdf5/html5/thumbnails/27.jpg)
En rouge : patient positif pour M. pneumoniae
Patient
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Conclusion
Y a-t-il infection par M. pneumoniae ?
PCR positive : oui, très certainement
PCR négative : ne permet pas d'éliminer le diagnostic A confronter avec le résultat de la culture et des sérologies