Die Rolle der SoxC-Proteine
in der Mausembryogenese
Den Naturwissenschaftlichen Fakultäten
der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
zur
Erlangung des Doktorgrades
vorgelegt von
Melanie Hoser
aus Donauwörth
Als Dissertation genehmigt von den Naturwissenschaftlichen Fakultäten
der Universität Erlangen-Nürnberg.
Tag der mündlichen Prüfung: 17. Dezember 2008
Vorsitzender der Prüfungskommission: Prof. Dr. Eberhard Bänsch
Erstberichterstatter: Prof. Dr. Michael Wegner
Zweitberichterstatter: Prof. Dr. Andreas Burkovski
Meiner Familie
Inhaltsverzeichnis
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V
Inhaltsverzeichnis
Zusammenfassung..................................................................................................................XI
Summary ..............................................................................................................................XIII
1 Einleitung .............................................................................................................. 1
1.1 Die Entwicklung des Nervensystems ........................................................................................... 1
1.1.1 Die Organisation des cerebralen Kortex.......................................................................................... 4
1.1.2 Der Aufbau und die Entwicklung des Kleinhirns (Cerebellum) ..................................................... 5
1.1.2.1 Aufbau............................................................................................................................................. 5
1.1.2.2 Entwicklung .................................................................................................................................... 7
1.2 Zelltypen des zentralen Nervensystems..................................................................................... 10
1.2.1 Radial-Glia .................................................................................................................................... 13
1.2.2 Bergmann-Glia – die Radial-Glia des Kleinhirns.......................................................................... 14
1.3 Das reeler-Maus-Modell.............................................................................................................. 15
1.4 Die Familie der Sox-Proteine...................................................................................................... 16
1.4.1 Sox-Proteine der Gruppe C ........................................................................................................... 17
1.4.1.1 Sox4 .............................................................................................................................................. 18
1.4.1.2 Sox11 ............................................................................................................................................ 20
1.4.1.3 Sox12 ............................................................................................................................................ 22
2 Problemstellung.................................................................................................. 25
3 Ergebnisse ........................................................................................................... 27
3.1 Herstellung und Analyse Sox12-defizienter Mäuse.................................................................. 27
3.1.1 Herstellung von spezifischen Antikörpern gegen Sox12, Sox11 und Sox4 .................................. 27
3.1.2 Generierung Sox12-defizienter Mäuse.......................................................................................... 28
3.1.3 Sox12-defiziente Mäuse zeigen keine offensichtlichen phänotypischen Veränderungen ............. 32
3.1.4 Analyse der Sox12-Expression während der Embryonalentwicklung der Maus........................... 34
3.1.5 Die DNA-Bindungseigenschaften von Sox12............................................................................... 40
3.1.6 Die Fähigkeit von Sox12 zur Transaktivierung und dessen Einfluß auf die Transaktivierungskapazität anderer SoxC- und POU-Proteine ..................................................... 43
3.1.7 Die in vivo Aktivität von Sox12 während der frühen Entwicklung des Rückenmarks im Huhn... 47
3.2 Funktionelle Analyse der Sox-Proteine der Gruppe C in Überexpressionsstudien............... 49
Inhaltsverzeichnis
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VI
3.2.1 Herstellung GFAP-Sox4-transgener Mäuse .................................................................................. 50
3.2.2 Expression des GFAP-Sox4-Transgens während der embryonalen und postnatalen Entwicklung der Maus........................................................................................................................................ 51
3.2.3 Analyse des Phänotyps GFAP-Sox4-transgener Mäuse................................................................ 53
3.2.4 Die Expression des GFAP-Sox4-Transgens im Cerebellum und in cerebellären Kulturen .......... 56
3.2.5 Die Histologie des Cerebellums GFAP-Sox4 transgener Mäuse .................................................. 59
3.2.6 Untersuchungen transgener Cerebella auf Apoptose und Proliferation......................................... 60
3.2.7 Analyse der neuronalen und glialen Zelltypen in den Cerebella GFAP-Sox4 transgener Mäuse . 61
3.2.7.1 Untersuchungen der neuronalen Subtypen in den transgenen Cerebella....................................... 61
3.2.7.2 Untersuchungen der Glia-Zellen in den transgenen Cerebella ...................................................... 63
3.2.8 Untersuchungen des cerebralen Kortex GFAP-Sox4-transgener Mäuse....................................... 65
4 Diskussion ........................................................................................................... 69
4.1 Das Sox12-defiziente Mausmodell ............................................................................................. 69
4.1.1 Bedeutung von Sox12 für die embryonale und frühe postnatale Entwicklung der Maus.............. 69
4.1.2 Funktionelle Kompensation als ein möglicher Grund für einen fehlenden Phänotyp in Sox12- defizienten Mäusen ....................................................................................................................... 71
4.1.3 Nichtreziproke funktionelle Kompensation aufgrund von Unterschieden in der embryonalen Expression der SoxC-Gene ........................................................................................................... 72
4.1.4 Nichtreziproke funktionelle Kompensation aufgrund unterschiedlicher funktioneller Eigenschaften der SoxC-Proteine.................................................................................................. 73
4.2 Das GFAP-Sox4-transgene Mausmodell ................................................................................... 76
4.2.1 Expression des Sox4-Transgens in Radial-Glia und Astrozyten des sich entwickelnden Cerebellums................................................................................................................................... 76
4.2.2 Gestörte Entwicklung der Bergmann-Glia im GFAP-Sox4-transgenen Cerebellum .................... 78
4.2.3 Das GFAP-Sox4-transgene Kleinhirn zeigt eine veränderte cerebelläre Architektur ................... 78
4.2.4 Bedeutung von Sox4 für die Reifung von Radial-Glia.................................................................. 81
5 Material ............................................................................................................... 85
5.1 Organismen.................................................................................................................................. 85
5.1.1 Mausstämme ................................................................................................................................. 85
5.1.2 Bakterienstämme........................................................................................................................... 85
5.1.3 Zelllinien ....................................................................................................................................... 85
5.2 Chemikalien und allgemeine Reagenzien.................................................................................. 86
5.3 Zusammensetzung gebräuchlicher Medien und Lösungen ..................................................... 86
5.4 Proteine und Enzyme.................................................................................................................. 89
5.5 Oligonukleotide ........................................................................................................................... 89
5.5.1 Oligonukleotide für die Genotypisierung der GFAP-Sox4-transgenen Mäuse ............................. 89
Inhaltsverzeichnis
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VII
5.5.2 Oligonukleotide für die Genotypisierung der Sox12--Mäuse........................................................ 89
5.5.3 Oligonukleotide für Klonierungen ................................................................................................ 89
5.5.4 Oligonukleotide für RT-PCR ........................................................................................................ 90
5.6 Plasmide ....................................................................................................................................... 91
5.7 in situ Sonden............................................................................................................................... 91
5.8 Southern-Blot-Sonden................................................................................................................. 92
5.9 Antikörper ................................................................................................................................... 92
5.9.1 Primärantikörper ........................................................................................................................... 92
5.9.2 Sekundärantikörper ....................................................................................................................... 94
6 Methoden............................................................................................................. 95
6.1 Tierhaltung .................................................................................................................................. 95
6.2 Zellkulturmethoden .................................................................................................................... 95
6.2.1 Transfektion von DNA in eukaryontische Zellen.......................................................................... 95
6.2.1.1 Transfektion von Säugerzellen mit Polyethylenimin (PEI)........................................................... 95
6.2.1.2 Transfektion von Säugerzellen mit Superfect ............................................................................... 96
6.2.2 Luciferase-Aktivitätstest ............................................................................................................... 96
6.2.3 Präparation primärer cerebellärer Kulturen................................................................................... 96
6.2.4 Immuncytochemie von primären cerebellären Kulturen ............................................................... 97
6.3 Allgemeine molekularbiologische Methoden ............................................................................ 98
6.3.1 Standardmethoden......................................................................................................................... 98
6.3.2 Isolierung von genomischer DNA aus Schwanz- oder Choriongewebe........................................ 98
6.3.3 Isolierung hochreiner genomischer DNA aus Schwanzgewebe.................................................... 98
6.3.4 Präparation von Gesamt-RNA....................................................................................................... 99
6.3.5 Amplifikation von DNA-Fragmenten mittels Polymerase-Kettenreaktion ................................. 100
6.3.6 Genotypisierungs-PCR-Reaktionen ............................................................................................ 100
6.3.6.1 GFAP-Sox4-transgene Mäuse..................................................................................................... 100
6.3.6.2 Sox12--Mäuse.............................................................................................................................. 101
6.3.7 Reverse Transkription und RT-PCR ........................................................................................... 102
6.3.8 DIG-Markierung von cRNA-Sonden mittels in vitro Transkription ........................................... 103
6.3.9 Radioaktive Markierung von DNA durch „Random Primer“ ..................................................... 103
6.3.10 Identifizierung von DNA-Fragmenten durch Hybridisierung ..................................................... 104
6.3.10.1 DNA-Transfer von Agarose-Gelen auf Membranen (Southern-Blot) ......................................... 104
6.3.10.2 Hybridisierung von DNA............................................................................................................ 104
6.4 Proteinbiochemische Methoden ............................................................................................... 105
Inhaltsverzeichnis
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VIII
6.4.1 Proteinbestimmung nach Bradford.............................................................................................. 105
6.4.2 Herstellung von Gesamt-Proteinextrakten aus eukaryontischen Zellen ...................................... 105
6.4.3 Denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)............................................... 105
6.4.4 Western-Blot und immunologischer Nachweis von Proteinen auf Membranen ......................... 106
6.4.5 Bakterielle Expression und Aufreinigung von His6-Tag-Fusionsproteinen ................................ 107
6.5 Histologische Methoden............................................................................................................ 108
6.5.1 Gewebepräparation...................................................................................................................... 108
6.5.2 In situ Hybridisierung.................................................................................................................. 109
6.5.3 Immunhistochemie auf Gefrierschnitten ..................................................................................... 110
6.5.4 TUNEL-Färbung ......................................................................................................................... 111
6.6 Generierung transgener Mäuse ............................................................................................... 112
6.6.1 Elektroporation embryonaler Stammzellen mit dem Transgen-Konstrukt.................................. 112
6.6.2 Blastozysteninjektion .................................................................................................................. 113
6.7 In ovo Elektroporation in den Huhn-Embryo ........................................................................ 113
7 Abkürzungsverzeichnis.................................................................................... 115
8 Literatur............................................................................................................ 119
Publikationen........................................................................................................................ 139
Lebenslauf ............................................................................................................................. 141
Danksagung........................................................................................................................... 143
Abbildungsverzeichnis ___
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IX
Abbildungsverzeichnis
Abb. 1: Die Bildung der Neuralplattengrenze und die Neurulation ............................................................... 1 Abb. 2: Die Entwicklung der neuralen Vorläuferzellen in der ventralen Ventrikulärzone ........................ 3 Abb. 3: Die Entstehung des Kortex cerebri ....................................................................................................... 5 Abb. 4: Die Struktur des Cerebellums und seine neuronale Verschaltung ................................................... 7 Abb. 5: Die Position des Isthmus-Organisators ................................................................................................ 8 Abb. 6: Die Entwicklung des Cerebellums ....................................................................................................... 9 Abb. 7: Die Zelltypen des zentralen Nervensystems ..................................................................................... 10 Abb. 8: Die Entwicklung von Oligodendrozyten ........................................................................................... 12 Abb. 9: Die Sox-Proteine der Gruppe C .......................................................................................................... 18 Abb. 10: Lokalisation der Peptide für die Herstellung spezifischer Antikörper gegen Sox4, Sox11 und Sox12 ...... 27 Abb. 11: Schema zur Generierung des Sox12-Knockout-Allels .................................................................. 29 Abb. 12: Southern-Blot Analysen zum Nachweis des rekombinierten Sox12-Allels ............................... 30 Abb. 13: Southern-Blot Analyse und Genotypisierung zum Nachweis des Sox12-Knockout-Allels .... 31 Abb. 14: RT-PCR zur Analyse der Sox12-Expression in Wildtyp- und Sox12-defizienten Mäusen ..... 31 Abb. 15: In situ Hybridisierung zur Analyse der Sox12-Expression in Sox12-defizienten Mäusen ...... 32 Abb. 16: Genotypen- und Geschlechter-Verteilung der Nachkommen aus Verpaarungen von Sox12+/--Mäusen ..... 33 Abb. 17: Bestimmung der Wachstumsparameter Sox12-defizienter Mäuse .............................................. 34 Abb. 18: RT-PCR zur Analyse der SoxC-Genexpression in Wildtyp-Embryonen ................................... 35 Abb. 19: In situ Hybridisierung und RT-PCR zur Analyse der Sox11- und Sox4-Expression in Sox12-defizienten
Embryonen ................................................................................................................................................... 36 Abb. 20: In situ Hybridisierung zur Bestimmung der frühen embryonalen Sox12-Expression .............. 37 Abb. 21: In situ Hybridisierung zur Bestimmung der Sox12-Expression an 14.5 dpc im Rumpf .......... 38 Abb. 22: In situ Hybridisierung zur Bestimmung der Sox12-Expression an 18.5 dpc im Rumpf .......... 39 Abb. 23: In situ Hybridisierung zur Bestimmung der spät-embryonalen Sox12-Expression im Kopf ... 40 Abb. 24: Die DNA-Bindungsaktivität von Sox12 .......................................................................................... 41 Abb. 25: Analyse der Fähigkeit von Sox12 zur Bildung ternärer Komplexe am FXO-Oligonukleotid . 42 Abb. 26: Western-Blot zur Bestimmung der endogenen SoxC- und POU-Proteinmengen in Zellkultur .................. 43 Abb. 27: Die Kapazität von Sox12 zur Transaktivierung des 3xSX-luc Reportergens ............................ 44 Abb. 28: Die Kapazität von Sox12 zur Transaktivierung des 3xFXO-luc Reportergens ......................... 45 Abb. 29: Einfluß von Sox12 auf die Transaktivierungskapazität von Sox11 ............................................. 45 Abb. 30: Analyse der Fähigkeit von Sox12 zur synergistischen Aktivierung des 3xFXO-luc Reportergens ............ 46 Abb. 31: Die Fähigkeit der SoxC-Proteine zur Aktivierung des neuralen Tubb3-Zielgen-Promotors ...................... 47 Abb. 32: Die Aktivität von Sox12 während der frühen Entwicklung des Rückenmarks im Huhn ............................. 48 Abb. 33: Schematische Darstellung des GFAP-Sox4-Transgen-Konstrukts .............................................. 50 Abb. 34: Southern-Blot Analyse zur Bestimmung der Kopienzahl des Transgens ................................... 51 Abb. 35: Das embryonale Expressionsmuster des GFAP-Sox4-Transgens ................................................ 52 Abb. 36: RT-PCR-Analyse zum Nachweis der Expression des GFAP-Sox4-Transgens ......................... 53 Abb. 37: Histologische Analyse des Aquaeductus mesencephali im Gehirn transgener Mäuse ............. 54 Abb. 38: Untersuchungen des Plexus Choroideus GFAP-Sox4-transgener Mäuse ................................... 55 Abb. 39: Analyse der ependymalen Cilien GFAP-Sox4-transgener Mäuse ............................................... 55 Abb. 40: Die Morphologie des Gehirns GFAP-Sox4-transgener Mäuse .................................................... 56 Abb. 41: Die Expression des GFAP-Sox4-Transgens im Cerebellum ........................................................ 57 Abb. 42: Zelltyp-spezifische Expression des GFAP-Sox4-Transgens im Cerebellum ............................. 57 Abb. 43: Die Expression des GFAP-Sox4-Transgens in cerebellären Kulturen ........................................ 58 Abb. 44: Die Histologie des Cerebellums GFAP-Sox4-transgener Mäuse ................................................ 59 Abb. 45: Untersuchungen GFAP-Sox4-transgener Cerebella auf Apoptose und Proliferation .............. 60 Abb. 46: Analyse der neuronalen Subtypen in den Cerebella GFAP-Sox4-transgener Mäuse ............... 62 Abb. 47: Analyse der glialen Zelltypen in den Cerebella GFAP-Sox4-transgener Mäuse ....................... 64 Abb. 48: Analyse der Radial-Glia im cerebralen Kortex GFAP-Sox4-transgener Mäuse ....................... 66 Abb. 49: Analyse der neuronalen Schichten im cerebralen Kortex GFAP-Sox4-transgener Mäuse ...... 67
Zusammenfassung
XI
Zusammenfassung
Transkriptionsfaktoren der Sox-Proteinfamilie sind an den verschiedensten Entwicklungs-
prozessen während der Embryogenese beteiligt. Die 20 in Säugern identifizierten Mitglieder
lassen sich in die Gruppen A-H einteilen, wobei Sox4, Sox11 und Sox12 zur Gruppe C gehören.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden das embryonale Expressionsmuster von Sox12 in der Maus und
seine biochemischen Eigenschaften im Vergleich zu Sox4 und Sox11 detailliert bestimmt. Wie
die anderen SoxC-Proteine zeigte Sox12 ein Vorkommen in vielen verschiedenen embryonalen
Geweben der Maus, unter anderem im zentralen Nervensystem, der Niere und dem Herzen, war
jedoch im Allgemeinen niedriger und gleichförmiger exprimiert. Sox12 wies darüber hinaus in
vitro ein zu Sox4 und Sox11 ähnliches DNA-Bindeverhalten auf und wirkte in vivo ebenfalls
transaktivierend. Im Vergleich zu Sox11 waren die transaktivierende Kapazität von Sox12 und die
Fähigkeit, mit Transkriptionsfaktoren der POU-Proteinfamilie synergistisch zusammen zu wirken,
jedoch sehr viel geringer.
Zur Charakterisierung der Funktion von Sox12 wurde eine Sox12-defiziente Mauslinie generiert.
Die Analyse der Sox12-Knockout-Tiere ließ allerdings keine Entwicklungsdefekte erkennen. Die
Mausmutanten waren lebensfähig, fertil und zeigten ein unauffälliges postnatales Wachstum.
Somit ist der Verlust von Sox12 durch die funktionell ähnlichen und ko-exprimierten Sox4 und
Sox11 weitgehend kompensierbar.
Da die funktionelle Redundanz zwischen SoxC-Proteinen eine Funktionsbestimmung durch
Gendeletion erschwert, wurde im zweiten Teil der Arbeit die Rolle von Sox4 nach Über-
expression in Radial-Glia-Zellen und Astrozyten untersucht. Zu diesem Zweck wurden transgene
Mäuse generiert, die das Sox4-Transgen unter dem humanen GFAP-Promotor exprimierten. Diese
Tiere entwickelten kurze Zeit nach ihrer Geburt schwere Ataxien auf Grund cerebellärer
Entwicklungsstörungen sowie einen Hydrocephalus und verstarben Ende der dritten postnatalen
Woche. Histologische Analysen ließen im Cerebellum der transgenen Mäuse fehlende Fissuren
und eine gestörte neuronale Schichtung erkennen, obwohl sich neuronale Subtypen, Astrozyten
und Oligodendrozyten in den transgenen Cerebella normal bildeten. Die pathologischen
Veränderungen der transgenen Kleinhirne ließen sich durch einen Verlust funktioneller
Bergmann-Glia erklären, der sekundär neuronale Migrationsdefekte verursachte. Sox-Proteine der
Gruppe C verhindern demnach in Gliazellen die Differenzierung. Dies kontrastiert mit dem zuvor
nachgewiesenen differenzierungsfördernden Einfluß auf Neuronen und beweist, dass die Funktion
von SoxC-Proteinen kontext-abhängig ist.
Summary
XIII
Summary
Transcription factors of the Sox protein family are involved in a diverse range of
developmental processes during embryogenesis. The 20 members which have been identified
in mammals can be divided into groups A to H, with Sox4, Sox11 and Sox12 belonging to
group C.
One aim of this study was to determine the embryonic expression pattern of Sox12 in the
mouse and its biochemical properties in comparison to Sox4 and Sox11. Similar to the other
SoxC proteins, Sox12 showed expression in many developing organs of the mouse, including
the central nervous system, the kidney, and the heart, although at lower and relatively uniform
levels. Furthermore Sox12 exhibited similar DNA-binding properties as Sox4 and Sox11 in
vitro and was also able to transactivate in vivo. The transactivation capacity of Sox12 and the
ability to function synergistically with transcription factors of the POU protein family was
however less efficient than Sox11.
To analyze the function of Sox12 a knockout mouse line was generated. Sox12-deficient mice
developed surprisingly normally and showed no gross phenotypic abnormalities. The mouse
mutant was viable, fertile and postnatal growth was unaffected. This shows that the lack of
Sox12 can largely be compensated by the functionally equivalent and coexpressed Sox4 and
Sox11.
As redundancy among SoxC proteins impedes functional analyses by gene deletion, the role
of Sox4 was additionally studied upon overexpression in radial glia and astrocytes. For this
reason, transgenic mice were generated in which the Sox4 transgene was expressed under the
control of the human GFAP promoter. These animals developed severe ataxia due to
cerebellar developmental defects as well as hydrocephaly and died around the end of the third
postnatal week. Histological stainings of the cerebellum of transgenic mice showed that
fissures were not formed and neuronal layering was dramatically disturbed, although neuronal
subtypes, astrocytes and oligodendrocytes developed normally. The cerebellar malformations
could be explained by the loss of functional Bergmann glia, which in turn led to neuronal
migration defects. Sox proteins of group C thus prevent differentiation of glial precursors.
This contrasts with previous findings of enhanced neuronal differentiation upon Sox4
overexpression and shows that the function of SoxC proteins is context-dependent.
Einleitung
1
1 Einleitung
1.1 DIE ENTWICKLUNG DES NERVENSYSTEMS
Nach Befruchtung der Eizelle und vollzogener Gastrulation besteht der Embryo aus drei
Keimblättern, dem äußeren Ektoderm, dem inneren Entoderm und dem mittleren Mesoderm.
Aus dem Entoderm entsteht das Epithel des Verdauungstraktes sowie assoziierte Organe,
während aus dem Mesoderm unter anderem Knochen, Muskeln, Bindegewebe, Herz, Nieren,
Keimdrüsen, Blut und Blutgefäße gebildet werden. Aus dem äußeren Keimblatt, dem
Ektoderm gehen die Epidermis und das Nervensystem hervor.
Die Entwicklung des Nervensystems beginnt mit der Bildung des Neuralrohrs, ein Vorgang,
der als Neurulation bezeichnet wird (Abb. 1). Dabei werden zunächst ektodermale Zellen
durch das darunter liegende paraxiale Mesoderm und die Chorda dorsalis (Notochord) dazu
veranlasst, eine entlang der dorsalen Mittelachse flächenförmig verdickte Neuralplatte
(Neuroektoderm) auszubilden (Kelly und Melton, 1995). Im weiteren Verlauf faltet sich die
Neuralplatte seitlich zu Neuralwülsten auf und eine U-förmige Neuralrinne entsteht. Die
Neuralfalten bewegen sich aufeinander zu und verschmelzen miteinander, um das Neuralrohr
zu bilden. Schließlich löst sich dieses vollständig vom Oberflächenektoderm ab (Colas und
Schoenwolf, 2001; Copp et al., 2003; Smith und Schoenwolf, 1997).
Abb. 1: Die Bildung der Neuralplattengrenze und die Neurulation Die Neuralplattengrenze wird durch Signale zwischen Neuroektoderm und dem nicht-neuralen Ektoderm und vom darunterliegenden paraxialen Mesoderm induziert. Während der Neurulation erheben sich die Neuralfalten und schließen sich zum Neuralrohr. Die Neuralleistenzellen verlassen den dorsalen Bereich des Neuralrohrs und wandern in die Peripherie. Abbildung entnommen und leicht verändert aus (Gammill und Bronner-Fraser, 2003).
Einleitung
2
An der Grenze zwischen der Neuralplatte und dem nicht-neuralen Ektoderm werden Zellen
induziert, die die Neuralleiste bilden. Während oder nach dem Verschluß der Neuralfalten
verlassen die Neuralleistenzellen den dorsalen Bereich des Neuralrohrs und wandern von
beiden Seiten ausgehend gruppenweise entlang definierter Bahnen in die Peripherie. Dort
differenzieren sie zu verschiedenen Zelltypen wie Neurone und Gliazellen des peripheren
Nervensystems, Melanozyten, Knorpel, Knochen, Bindegewebe und endokrine Zellen
(Anderson, 1997; Gammill und Bronner-Fraser, 2003; Garcia-Castro und Bronner-Fraser,
1999; Knecht und Bronner-Fraser, 2002).
Aus dem Neuralrohr selbst entwickelt sich im weiteren Verlauf das zentrale Nervensystem, zu
dem Gehirn und Rückenmark gehören. Noch bevor sich der posteriore Teil des Neuralrohrs
ausgebildet hat, formen sich im anterioren Bereich drei primäre Vesikel, die zunächst
Anlagen für Vorderhirn (Prosencephalon), Mittelhirn (Mesencephalon) und Rautenhirn
(Rhombencephalon) darstellen. Später bildet sich aus dem Prosencephalon das anterior
gelegene Endhirn (Telencephalon), das die Großhirnrinde (Kortex), die Basalganglien, den
Hippokampus und den Riechkolben (Bulbus olfactorius) hervorbringt, sowie das mehr kaudal
gelegene Zwischenhirn (Diencephalon), aus dem sich der Thalamus, Hypothalamus und die
Augenblasen formen. Das Rhombencephalon gliedert sich weiter in das Hinterhirn
(Metencephalon), aus dem die Brücke (Pons) und das Kleinhirn (Cerebellum) hervorgehen,
und das Nachhirn (Myelencephalon), das zum verlängerten Mark (Medulla oblongata) wird.
Der weitere kaudale Bereich des Neuralrohrs wird zum Rückenmark. Neben der anterior-
posterioren Regionalisierung des Neuralrohrs findet auch eine Kompartimentierung in dorsale
und ventrale Bereiche statt. Induziert wird diese Musterbildung durch Sekretion dorsaler und
ventraler Signalmoleküle (Tanabe und Jessell, 1996). Sonic Hedgehog (Shh), das aus dem
Notochord (Chorda dorsalis) freigesetzt wird, induziert die Bildung einer Bodenplatte auf der
ventralen Seite des Neuralrohrs (Abb. 2). Die Zellen der Bodenplatte sezernieren ebenfalls
Shh, das in dorsale Richtung diffundiert, wodurch ein ventral-dorsaler Konzentrationsgradient
im Neuralrohr entsteht. An der dorsalen Musterbildung sind Proteine der BMP-Familie (bone
morphogenetic proteins) beteiligt, die vom epidermalen Ektoderm und später auch von der
Deckplatte, die sich auf der dorsalen Seite des Neuralrohrs bildet, sezerniert werden. Im
embryonalen Rückenmark kommt es durch den Einfluß des BMP- und Shh-Gradienten zur
Ausbildung definierter Vorläuferdomänen entlang der Ventrikulärzone, einer proliferativen
Epithelzellschicht, die den inneren Hohlraum des Neuralrohrs auskleidet (Anderson, 2001;
Briscoe und Ericson, 2001; Caspary und Anderson, 2003; Jessell, 2000; Lee und Jessell,
Einleitung
3
1999). Aus diesen Domänen werden schließlich die verschiedenen Vorläuferzellen der
neuronalen und später auch der glialen Subtypen generiert.
Abb. 2: Die Entwicklung der neuralen Vorläuferzellen in der ventralen Ventrikulärzone Die dorso-ventrale Achse wird durch Gradienten von Shh und BMP spezifiziert, die von der Bodenplatte (FP) und Deckplatte (RP) sezerniert werden. Daraufhin unterteilt sich die Ventrikulärzone (VZ) über die abge-grenzten Homeodomänen-Proteinexpressionen in definierte Vorläuferdomänen (p0, p1, p2, pMN, p3). Aus diesen Domänen gehen verschiedene neuronale Subklassen (V3, MN, V2, V1, V0) und später auch Glia (Oligo, Astro) hervor. In dieser schematischen Darstellung ist nur die Unterteilung der ventralen Hälfte des Rücken-marks gezeigt. Abbildung entnommen aus (Anderson, 2001).
Wenn die Zellen des embryonalen Rückenmarks aus der Ventrikulärzone auswandern, bilden
sie eine neue Schicht, die Mantelzone, die später auch als graue Substanz bezeichnet wird.
Die Neuronen in der Mantelzone senden ihre Axone nach außen, so dass eine weitere Schicht
entsteht, die Marginalzone, die in der Folge zur weißen Substanz wird. Die typische weiße
Färbung ist auf den hohen Anteil an Myelin zurückzuführen, eine lipidreiche Schicht zur
Isolierung der Axone, die von den Oligodendroglia gebildet wird. Sowohl im Rückenmark als
auch in der Medulla bleibt der grundlegende dreischichtige Aufbau in Ventrikulär-, Mantel-
und Marginalzone während der Entwicklung und im adulten Organismus erhalten.
Einleitung
4
1.1.1 Die Organisation des cerebralen Kortex
Im Gegensatz zum Rückenmark und der Medulla, bei denen eine dreischichtige Architektur
zu erkennen ist, kann man in der Großhirnrinde (Kortex cerebri) Modifikationen dieses
Aufbaus feststellen. Die Entwicklung des Kortex cerebri als äußere Schicht des
Telencephalon beginnt mit der Proliferation von Vorläuferzellen in der Ventrikulärzone
(Gupta et al., 2002) (Abb. 3). Am Embryonalstadium 11 dpc (days post coitum; Tage post
coitum) der Maus wandern postmitotische Neurone aus der Ventrikulärzone in radialer
Richtung zur pialen Oberfläche des Gehirns aus und bilden die sogenannte Präplatte. Mit
fortschreitender Migration postmitotischer Neurone kommt es zu einer Spaltung der Präplatte
in eine äußere Marginalzone und eine tiefer positionierte Subplatte. Dazwischen postieren
sich die Zellen der Kortikalplatte. Während der Entwicklungsstadien 14 dpc bis 18 dpc der
Maus migrieren Populationen postmitotischer Neurone in radialer Richtung durch die
Subplatte hindurch und bilden der Reihe nach die Schichten der Kortikalplatte. Dabei
wandern jeweils später generierte Neurone an ihren Vorgängern vorbei und verbleiben direkt
unterhalb der Marginalzone. Somit erfolgt die Bildung der Großhirnrinde nach einem „inside-
out“-Prinzip, bei dem früh entstandene Nervenzellen die tiefen Schichten und später erzeugte
Neurone die weiter an der Oberfläche liegenden Schichten der Kortikalplatte besetzen
(Angevine und Sidman, 1961). Nachdem sich diese Platte vollständig ausgebildet hat, kann
man einen zerebralen Kortex mit sechs Schichten identifizieren, wobei die Marginalzone als
Schicht eins gezählt wird.
Die Entwicklung dieser neuronalen Schichten ist mit der Migration von Neuronen in radialen
und tangentialen Richtungen zu ihrem Zielort verbunden (Hatten, 2002; Kriegstein und
Noctor, 2004). Dabei gibt es für die Wanderung von Zellen in radialer Richtung offensichtlich
zwei Möglichkeiten. Eine davon ist die Migration von Neuronen entlang der Fasertrakte von
Radial-Glia-Zellen, wobei der Leitfortsatz der wandernden Zelle frei beweglich ist und dessen
Länge während der Wanderung relativ konstant bleibt. Zum anderen können sich Neurone
auch unabhängig von glialen Fasertrakten durch Translokation fortbewegen. Hierfür ist die
Zelle mit ihrem langen nach außen gerichteten Fortsatz fest an der pialen Oberfläche
verankert und der Zellnukleus bzw. das gesamte Zellsoma bewegen sich nach außen, während
sich der Leitfortsatz der Zelle verkürzt (Gupta et al., 2002; Nadarajah et al., 2001). Die
tangentiale Wanderung von Neuronen findet parallel zur inneren oder äußeren Oberfläche des
Gehirns statt und wird beispielsweise von GABAergen Interneuronen genutzt (Marin und
Rubenstein, 2001).
Einleitung
5
Abb. 3: Die Entstehung des Kortex cerebri Am Embryonalstadium 11 dpc der Maus (E11) bildet sich nach Wanderung postmitotischer Neurone von der Ventrikulärzone (VZ) zur pialen Oberfläche (PS) die Präplatte (PP) aus. An 13 dpc (E13) teilen die durch die Intermediärzone (IZ) migrierenden postmitotischen Neurone die PP in die Marginalzone (MZ) sowie die Subplatte (SP) und die Kortikalplatte (CP) entsteht. Von 14 dpc bis 18 dpc (E14-E18) vergrößern Populationen von Neuronen die CP in einem „inside-out“-Prinzip, bei dem später generierte Neurone an ihren Vorgängern vorbei wandern und unter der MZ zu liegen kommen. Im Erwachsenenalter degeneriert die SP und ein sechsschichtiger zerebraler Kortex bleibt bestehen. Die Wanderung der Zellen erfolgt hauptsächlich über radiale Glia (gezeigt als vertikale Linien). Abbildung entnommen aus (Gupta et al., 2002).
1.1.2 Der Aufbau und die Entwicklung des Kleinhirns (Cerebellum)
1.1.2.1 Aufbau
Wie für das Großhirn bereits beschrieben, lässt sich auch beim Kleinhirn eine nach außen
gewandte, nervenzellhaltige Rinde mit einem Aufbau in Schichten identifizieren. Doch
zunächst soll die Lage des Cerebellums im Gehirn und seine äußere Gestalt betrachtet werden.
Das Kleinhirn, das eine wichtige Rolle bei der Koordination und Feinabstimmung von
Bewegungsabläufen spielt, befindet sich in der hinteren Schädelgrube und ist mit dem
Hirnstamm durch die drei Kleinhirnstiele verbunden. Es sitzt dem Nachhirn (Myelencephalon)
und der Brücke (Pons) auf und bildet so das Dach des vierten Ventrikels. Morphologisch lässt
sich das Cerebellum in den zentralen Wurm (Vermis) und die beiderseits davon liegenden
Hemisphären gliedern (Abb. 4A). Die Oberfläche des Kleinhirns wird durch Furchungen
(Fissuren) in einzelne blattförmige Windungen (Folia) unterteilt (Abb. 4B). Gruppen von
Einleitung
6
Folia kann man wiederum als Läppchen (Lobuli) zusammenfassen. Im Kleinhirn von
Säugetieren lassen sich so zehn Lobuli unterscheiden.
Im Inneren des Cerebellums findet man eine dreischichtige, stark gefaltete Rinde (Kortex),
die die zentral gelegene weiße Substanz (Marklager) bedeckt (Abb. 4B). Eingebettet in dieser
Substanz liegen die Kleinhirnkerne. Zu den drei Schichten des adulten Kortex cerebelli
gehören die innere, direkt an das Mark angrenzende Körnerschicht (Stratum granulosum), die
darüber liegende Purkinjezellschicht (Stratum purkinjense) und die äußere Molekularschicht
(Stratum moleculare) (Abb. 4B, C). In der Körnerschicht befinden sich vor allem die kleinen
Körnerzellen, die die einzigen erregenden Zellen der Kleinhirnrinde sind (Abb. 4C). Die
Axone dieser Neurone steigen in die Molekularschicht auf und verzweigen sich dort unter
Bildung von Parallelfasern. Neben den Körnerzellen kann man auch GABAerge, inhibi-
torische Golgizellen in der Körnerschicht finden. Im mittleren Kortexbereich kommen in
einer einzigen Zellschicht die großen GABAergen, hemmenden Purkinjezellen zu liegen.
Diese Zellen besitzen ein birnenförmiges Soma mit einem langen nach unten in Richtung
Marklager gerichteten Axon und einem großen, stark verzweigten Dendritenbaum, der in die
Molekularschicht hineinreicht. Außerdem stellen sie die einzigen Projektionsneurone der
Kleinhirnrinde dar. Neben den Purkinjezellen lassen sich in der mittleren Schicht auch die
Somata von Bergmann-Glia-Zellen finden. Die langen Fortsätze dieser Glia reichen bis zur
pialen Oberfläche und dienen auf- und abwandernden Zellen während der Entwicklung des
Kleinhirns als Leitstruktur.
Zusätzlich zu den Dendriten der Purkinjezellen, den Axonen der Körnerzellen und Palisaden
von Bergmann-Glia-Fortsätzen sind in der äußeren Molekularschicht auch GABAerge,
inhibitorische Korb- und Sternzellen enthalten. Im Gegensatz zu den Sternzellen umspannen
die tief in der Molekularschicht liegenden Korbzellen mit ihren Axonen die Somata der
Purkinjezellen und bilden dadurch sogenannte „Faserkörbe“ aus. Schließlich lassen sich auch
Afferenzen zur Kleinhirnrinde finden, wobei hier vor allem die Moos- und Kletterfasern zu
nennen sind (Chizhikov und Millen, 2003; Voogd und Glickstein, 1998).
Einleitung
7
Abb. 4: Die Struktur des Cerebellums und seine neuronale Verschaltung (A) Dorsale Sicht auf das Cerebellum einer adulten Maus. Zu sehen sind die cerebelläre Vermis (CV) und die beiden Hemisphären (CH). (B) Ein Sagittalschnitt durch das Cerebellum. Gekennzeichnet sind die Molekularschicht (ML), die Purkinjezellschicht (PC), die interne Körnerzellschicht (IGL), die tiefen cerebellären Kerne (DCN) und die parallelen Fissuren, die die Folia unterteilen. Eine Folia ist mit einer Klammer versehen. (C) Schematische Darstellung der prinzipiellen neuronalen Verschaltungen im Cerebellum. Information wird über die präcerebellären Kerne (PCN) und Moosfasern an Körnerneurone gesendet. Über Axone der Körner-zellen (Parallelfasern) wird das Signal an Purkinjezellen weitergegeben. Auch Kletterfasern aus dem Olivenkern-komplex (IOC) können Information an Purkinjezellen schicken. Die Purkinjezellen senden ihre Axone zu den tiefen cerebellären Kernen (DCN), von wo aus die Impulse nach extracerebellär weitergeleitet werden. Abbildung entnommen und leicht verändert aus (Chizhikov und Millen, 2003).
1.1.2.2 Entwicklung
Während der Embryogenese lässt sich das Rhombencephalon entlang der anterior-posterioren
Achse in Segmente, die sogenannten Rhombomere, gliedern, wobei das Kleinhirn aus dem
ersten Rhombomer entsteht (Millet et al., 1996; Wingate, 2001; Wingate und Hatten, 1999)
(Abb. 5A). Im Grenzbereich zwischen Mittelhirn und Rhombomer 1 befindet sich ein für die
cerebelläre Entwicklung wichtiges Signalzentrum, der Isthmus-Organisator. Die Position
dieses Organisators wird durch die Grenzen der Expressionsdomänen der Transkriptions-
faktoren Otx2 (orthodenticle homologue 2) und Gbx2 (gastrulation brain homeobox 2)
bestimmt (Broccoli et al., 1999; Millet et al., 1999; Simeone, 2000; Wurst und Bally-Cuif,
2001) (Abb. 5B). Im weiteren Verlauf der Embryogenese kommt es in der Organisator-Region
zur Induktion der Gene für die Transkriptionsfaktoren Pax2 (paired box 2) und En1
(engrailed 1) sowie für das sezernierte Molekül Wnt1 (wingless 1). Etwas später werden auch
die Transkriptionsfaktoren Pax5 und En2 sowie der sezernierte Wachstumsfaktor Fgf8
(fibroblast growth factor 8) exprimiert (Crossley und Martin, 1995; Liu und Joyner, 2001).
Fgf8 wird bei der Entwicklung des Mittel- und Hinterhirns eine besondere Rolle zuge-
Einleitung
8
schrieben (Crossley und Martin, 1995). So kann dieser Faktor im embryonalen Huhngehirn
sowohl Gewebe mit Mittelhirn- als auch mit Kleinhirncharakter induzieren (Crossley et al.,
1996; Martinez et al., 1999), während eine Inaktivierung von Fgf8 zum Verlust dieser
Strukturen führt (Chi et al., 2003; Meyers et al., 1998; Reifers et al., 1998). Ebenfalls eine
Rolle bei der Entwicklung von Mittelhirn und Cerebellum spielt der Transkriptionsfaktor
Lmx1b (LIM-Homeobox 1b), der neben einigen anderen Genen auch die Expression von Fgf8
und Wnt1 reguliert (Adams et al., 2000; Guo et al., 2007; Matsunaga et al., 2002). Durch das
Zusammenspiel einer Reihe von sezernierten Molekülen und Transkriptionsfaktoren entsteht
schließlich eine Anlage, aus der später das Cerebellum hervorgeht.
Abb. 5: Die Position des Isthmus-Organisators (A) Schematische Darstellung des zentralen Nervensystems der Maus am Embryonalstadium 9.5 dpc. Das Neuralrohr ist in Segmente gegliedert. Am anterioren Ende (A) des Neuralrohrs entsteht das Vorderhirn (grün), das sich später in Telencephalon (tel) und Diencephalon (di) unterteilt. Weiter posterior (P) gelegene Regionen sind das Mittelhirn (gelb), das Rautenhirn (rot) und das Rückenmark (blau). Das Rautenhirn gliedert sich in 7 Rhombomere (rh 1-7). Das Cerebellum geht aus dem dorsalen rh 1 hervor und der Isthmus-Organisator (IsO) bildet sich an der Grenze zwischen Mittel- und Rautenhirn aus. (B) Die Grenze zwischen den Gbx2- (grün) und Otx2- (gelb) Expressionsdomänen positioniert den IsO (Pfeil) im Wildtyp (Wt) an 9.5 dpc und bestimmt die anteriore Grenze von Mittelhirn (midbrain) und Cerebellum. Auch dargestellt sind die Expressionsdomänen von Wnt1 (rot) und Fgf8 (blau). D, dorsal; V, ventral. Abbildung entnommen aus (Chizhikov und Millen, 2003).
Die unterschiedlichen Zelltypen des Kleinhirns entwickeln sich aus zwei verschiedenen
Keimregionen (Abb. 6). Dabei bringt die Ventrikulärzone die tiefen nukleären Neurone, die
Purkinjezellen, die Korb- und Sternzellen sowie die Golgizellen hervor, während die
Rautenlippe die Körnerzellen bildet (Goldowitz und Hamre, 1998). Aus der Ventrikulärzone
im Dach des vierten Ventrikels gehen als erstes die tiefen nukleären Neurone (10 dpc bis
12 dpc in der Maus) hervor. Kurz darauf werden die Purkinjezellen (11 dpc bis 13 dpc)
gebildet.
Einleitung
9
Abb. 6: Die Entwicklung des Cerebellums Schematische Darstellung des sich entwickelnden Cerebellums an den Embryonalstadien 13 dpc (e13) und 16 dpc (e16), am Postnatalstadium P6 (p6) und in der adulten Maus. Aus der Ventrikulärzone (VZ) im Dach des vierten Ventrikels (IVth ventr.) gehen Neurone der tiefen cerebellären Kerne (DCN, pink) und Purkinjezellen (rot) hervor. Die Purkinjezell-Vorläufer wandern über ein Radial-Glia-Fasersystem (vertikale schwarze Linien) in den cerebellären Kortex ein. Aus der Rautenlippe (rl) entwickeln sich die Körnerzellen (schwarz), die tangential an der cerebellären Oberfläche in den Kortex migrieren und die externe Körnerzellschicht (EGL) bilden. Nach Proliferation der Körnerzellen in der EGL beginnen diese zu differenzieren. Dabei wandern sie entlang von Bergmann-Glia-Fasern durch die Purkinjezellschicht (PC) hindurch und die interne Körner-zellschicht (IGL) entsteht. Die Pfeile zeigen die jeweilige Richtung der Zellmigration an. Abbildung entnommen aus (Chizhikov und Millen, 2003).
Anschließend wandern postmitotische Purkinjezellen aus der Ventrikulärzone (Altman und
Bayer, 1978; Miale und Sidman, 1961), vermutlich entlang eines Radial-Glia-Fasersystems
(Edwards et al., 1990), in den cerebellären Kortex ein. Dort verbleiben diese zunächst nahe
der Kleinhirnoberfläche in einer mehrlagigen Zellschicht. In den ersten fünf postnatalen
Tagen der Maus bildet sich daraus eine einlagige Purkinjezellschicht (Jankowski et al., 2004).
Zwischen den Embryonalstadien 13 dpc und 15 dpc beginnen die Körnerzellen aus der von
der beidseitigen Ausstülpung der Flügelplatte des Metencephalons gebildeten Rautenlippe
auszuwandern. Dabei migrieren sie tangential an der cerebellären Oberfläche entlang in den
Kortex und bilden dort die mitotisch aktive externe Körnerzellschicht. Auch die Golgizellen
bewegen sich zu dieser Zeit in den Kortex des Kleinhirns. Die Zellen in der externen
Körnerzellschicht bleiben während der ersten zwei postnatalen Wochen mitotisch aktiv. Um
den Zeitpunkt der Geburt herum beginnt ein Teil der Körnerzellen den Zellzyklus zu
verlassen, um sich als postmitotische Körnerzellen im inneren Bereich der externen
Körnerschicht zu postieren. Aus dieser Position heraus wandern die Zellen schließlich radial
entlang von Bergmann-Glia-Fasern nach innen in den cerebellären Kortex und bilden
unterhalb der Purkinjezellen die interne Körnerzellschicht. Die Migration und Reifung der
Körnerzellen kommt am Postnataltag 20 der Maus zum Abschluß und die grobe
morphologische Entwicklung des Cerebellums ist nach der zweiten Postnatalwoche der Maus
Einleitung
10
beendet (Chizhikov und Millen, 2003; Goldowitz und Hamre, 1998; Sillitoe und Joyner,
2007).
1.2 ZELLTYPEN DES ZENTRALEN NERVENSYSTEMS
Das zentrale Nervensystem der Vertebraten besteht aus drei Hauptklassen von Neuralzellen.
Dazu gehören die Nervenzellen sowie die zu den Makroglia gehörenden Astrozyten und
Oligodendrozyten (Miller, 2002; Rowitch, 2004), wobei alle drei Zelltypen vom
Neuroektoderm abstammen. Daneben kann man einen weiteren Zelltypus im zentralen
Nervensystem finden, der nicht aus dem Neuroektoderm, sondern aus dem Mesoderm
hervorgeht und als Mikroglia bezeichnet wird (Barron, 1995) (Abb. 7).
Abb. 7: Die Zelltypen des zentralen Nervensystems Gezeigt sind die verschiedenen Typen von Gliazellen im zentralen Nervensystem (ZNS) und ihre Interaktionen untereinander und mit Neuronen. Astrozyten sind sternförmige Zellen mit vielen Ausläufern, die die Somata, Dendriten und Axone von Neuronen, die Somata und Fortsätze von Oligodendrozyten und andere Astrozyten kontaktieren. Oligodendrozyten sind die myelinbildenden Zellen des ZNS. Sie besitzen einen kleinen, runden Zellkörper mit vielen Zellfortsätzen, mit denen sie mehrere neuronale Axone umhüllen. Neurone haben ihre Funktion in der Aufnahme, der Verarbeitung und Weiterleitung von Informationen. Über ihre fein verästelten Dendriten können sie Signale empfangen, in den Zellkörpern verarbeiten und über lange dünne Axone weitergeben. Mikroglia entstehen aus Vorläuferzellen des blutbildenden Systems und stellen die Immunzellen des ZNS dar. Abbildung entnommen und leicht verändert aus (Baumann und Pham-Dinh, 2001).
Neurone erfüllen ihre Aufgabe in der Aufnahme, Verarbeitung und Weiterleitung von
Informationen. Mit ihren fein verästelten Fortsätzen, den Dendriten, können sie Signale
empfangen und an den Zellkörper (Perikaryon, Soma) weiterleiten. Dort werden die
Einleitung
11
Informationen verarbeitet und über einen langen, dünnen Ausläufer weitergeleitet, der als
Axon (Nervenfaser, Neurit) bezeichnet wird.
Oligodendrozyten stellen die myelinbildenden Zellen des zentralen Nervensystems dar, die
mit ihren Zellfortsätzen die Axone der Nervenzellen spiralförmig umhüllen und isolieren, so
dass eine schnelle, saltatorische Erregungsleitung gewährleistet ist. Die Oligodendrozyten-
Entwicklung beginnt mit der Spezifizierung von Vorläuferzellen im Neuroepithel (Abb. 8).
Während dieser Phase kommt es in den Zellen zur Expression der bHLH (basic helix-loop-
helix)- Transkritionsfaktoren Olig1 und Olig2 (Lu et al., 2000; Zhou et al., 2000) und des
HMG-Box (high mobility group-box) Proteins Sox10 (Kuhlbrodt et al., 1998b). Etwas später
lässt sich ein weiterer Faktor in den Oligodendrozyten-Vorläuferzellen nachweisen, der
PDGFRα (platelet-derived growth factor receptor-alpha). Im Laufe der Entwicklung wandern
die bipolaren Vorläuferzellen aus der Keimzone in die Umgebung aus und proliferieren dabei
weiter. Nachdem sie als Pro-Oligodendrozyten mit der Migration aufgehört haben,
differenzieren sie schließlich zu postmitotischen, myelinbildenden Oligodendrozyten (Jessen,
2004; Woodruff et al., 2001). In dieser Phase beginnen die Zellen eine Reihe von
Myelinkomponenten wie MBP (myelin basic protein) und PLP (proteolipid protein) zu
exprimieren (Baumann und Pham-Dinh, 2001; Lemke, 1988; Pfeiffer et al., 1993). Während
jedoch die PDGFRα-Expression im Laufe der Oligodendrozyten-Entstehung abgeschaltet
wird, bleiben Olig1, Olig2 und Sox10 weiter exprimiert und können auch in adulten
Oligodendrozyten noch detektiert werden. Die Bedeutung der letztgenannten Faktoren für die
Entwicklung dieser Gliazellen konnte durch die Analyse von Mausmutanten ermittelt werden.
So lässt sich im Olig2-defizienten Rückenmark ein Spezifizierungsdefekt von Motoneuronen
und Oligodendrozyten feststellen (Lu et al., 2002; Takebayashi et al., 2002; Zhou und
Anderson, 2002), während in Abwesenheit von Sox10 diese Gliazellen im Rückenmark nicht
in der Lage sind, terminal zu differenzieren (Stolt et al., 2002).
Neben den Oligodendrozyten gibt es eine weitere Gruppe von Gliazellen im zentralen
Nervensystem, die als Astrozyten bezeichnet werden (Abb. 7). Sie haben ein unregelmäßiges,
sternförmiges Aussehen und können morphologisch in zwei Typen unterteilt werden. Die
protoplasmatischen Astrozyten besitzen kürzere, stärker verzweigte Fortsätze und befinden
sich vor allem in der grauen Substanz, wohingegen die fibrillären Astrozyten längere
Ausläufern bilden und hauptsächlich in der weißen Substanz vorkommen. Neben vielen
weiteren Funktionen sorgen diese Zellen durch die Aufnahme von Kaliumionen, die während
der Erregungsleitung von Nervenzellen freigesetzt werden, für die Aufrechterhaltung des
Ionenhaushaltes (Barres et al., 1990a; Barres et al., 1990b; Sontheimer et al., 1992). Über
Einleitung
12
cytoplasmatische Brücken, die man als gap junctions bezeichnet, stehen Astrozyten
untereinander in engem Kontakt (Brightman und Reese, 1969), wodurch ein großes Netzwerk
(funktionelles Syncytium) entsteht, über das aufgenommenes Kalium schnell weitergegeben
und abgepuffert werden kann. Daneben sind Astrozyten auch in der Lage, von den Synapsen
der Nervenzellen freigesetzte Neurotransmitter wie beispielsweise Glutamat aufzunehmen
und dadurch zu beseitigen (Rothstein et al., 1994). Dieser Gliazelltyp entwickelt sich unter
anderem durch Transdifferenzierung aus Radial-Glia-Zellen (Schmechel und Rakic, 1979;
Voigt, 1989) und wird oft durch das Intermediärfilamentprotein GFAP (glial fibrillary acidic
protein) identifiziert, das ab dem Zeitpunkt der Zelldifferenzierung exprimiert wird (Bignami
und Dahl, 1974a; Bignami et al., 1972; Eng et al., 1971).
Im Gegensatz zu den Neuronen und Makroglia entstehen Mikroglia aus Vorläuferzellen des
blutbildenden Systems. Diese stellen die Immunzellen des zentralen Nervensystems dar, die
zur Antigenpräsentation befähigt sind und sich in phagozytierende Makrophagen umwandeln
können (Barron, 1995).
Abb. 8: Die Entwicklung von Oligodendrozyten Oligodendrozyten entwickeln sich aus Vorläuferzellen im Neuroepithel, die die Transkriptionsfaktoren Olig1 und Olig2 (Olig+) exprimieren. Mit Beginn der Auswanderung kennzeichnet das Vorkommen von PDGF-Rα die Oligodendrozyten-Vorläufer. Nach der Umwandlung zu nichtwandernden Pro-Oligodendrozyten präsentieren die Zellen das Oberflächen-Antigen O4. Schließlich differenzieren sie zu Prä-myelinisierenden Oligodendrozyten mit der Expression von Galactocerebrosid (GC+) und zu myelinisierenden Oligodendrozyten mit der Bildung des basischen Myelinproteins (MBP+) und des Proteolipidproteins (PLP+). Abbildung entnommen und leicht verändert aus (Jessen, 2004).
Einleitung
13
1.2.1 Radial-Glia
Radial-Glia sind die ersten Glia-Zellen, die während der Entwicklung des zentralen
Nervensystems in Erscheinung treten und aus Neuroepithel-Zellen hervorgehen (Götz und
Huttner, 2005). Radial-Glia-Zellen lassen sich durch ihre charakteristische radiäre Morpho-
logie und ihre glialen Eigenschaften definieren. Das Soma dieser Zellen liegt in der
Ventrikulärzone und ein langer Fortsatz erstreckt sich vom Zellkörper bis zur pialen
Oberfläche (Bentivoglio und Mazzarello, 1999; Cameron und Rakic, 1991). Dieses Aussehen
zeigen jedoch nicht nur Radial-Glia, sondern auch Neuroepithel-Zellen. Diesen beiden
Zelltypen ist weiterhin gemeinsam, dass sie das Intermediärfilament Nestin und die Antigene
RC1 und RC2 (Chanas-Sacre et al., 2000; Hartfuss et al., 2001; Misson et al., 1988; Mori et
al., 2005) exprimieren. Im Unterschied dazu zeigen nur Radial-Glia eine Expression
astroglialer Marker, zu denen der Astrozyten-spezifische Glutamat-Transporter GLAST
(Hartfuss et al., 2001; Malatesta et al., 2000), die Glutamin-Synthetase (GS) (Akimoto et al.,
1993), Tenascin C (TNC) (Götz et al., 1998), Vimentin (Schnitzer et al., 1981) und BLBP
(brain lipid binding protein; auch als B-FABP (brain-related fatty acid-binding protein)
bekannt) gehören (Hartfuss et al., 2001). Diese Moleküle wiederum werden auch von
reaktiven Astroglia und neuralen Stammzellen im adulten Gehirn exprimiert. Das saure
Gliafaserprotein GFAP dagegen wird nur in Radial-Glia-Zellen einiger Spezies wie zum
Beispiel den Primaten (Choi, 1981; Levitt und Rakic, 1980) hergestellt, in Nagetieren jedoch
nicht (Bignami und Dahl, 1974b). Zudem kommt dieses Protein in reaktiven Astroglia und
neuralen Stammzellen vor (Mori et al., 2005). Somit lassen sich anhand von molekularen
Markern Radial-Glia von Neuroepithel-Zellen abgrenzen. Im Gegensatz dazu sind bisher noch
keine Marker identifiziert worden, die eine Differenzierung zwischen Radial-Glia und
reaktiven Astrozyten erlauben. Radial- und reaktive Glia können jedoch aufgrund ihrer
Morphologie unterschieden werden. Zu den Aufgaben, die von Radial-Glia-Zellen ausgeführt
werden, gehört ihre unterstützende Funktion bei der radiären neuronalen Migration, indem sie
mit ihren langen Fortsätzen eine Art Gerüst bilden, an denen Nervenzellen entlang wandern
können (Hatten, 1999; Rakic, 1972). Daneben fungieren diese mitotisch aktiven Zellen auch
als Vorläuferzellen, aus denen nicht nur Glia, sondern auch Neurone hervorgehen können
(Malatesta et al., 2000; Miyata et al., 2001; Noctor et al., 2001; Tamamaki et al., 2001).
Nachdem die Generierung und Migration von Neuronen abgeschlossen ist, kommt es
schließlich zur Transformation von Radial-Glia-Zellen zu Astrozyten (Schmechel und Rakic,
1979; Voigt, 1989). Jedoch lassen sich auch im zentralen Nervensystem erwachsener
Einleitung
14
Organismen noch Radial-Glia finden, wie zum Beispiel die Bergmann-Glia im sich
entwickelnden und adulten Cerebellum und die Müller-Glia in der Retina.
1.2.2 Bergmann-Glia – die Radial-Glia des Kleinhirns
Bergmann-Glia, auch als Golgi-Epithelzellen bezeichnet, sind reife radiäre Astrozyten im
Kleinhirn. Ihre Zell-Somata befinden sich in der Purkinjezellschicht und ihre radiären
Fortsätze erstrecken sich durch die Molekularschicht zur pialen Oberfläche. Mit ihren
Ausläufern umhüllen sie die Synapsen der Purkinjezellen (Reichenbach et al., 1995).
Außerdem können in diesen Glia-Zellen verschiedenste Rezeptoren und Transporter gefunden
werden. Zu ihnen gehören die AMPA-Rezeptoren, die für Calciumionen permeabel sind.
Werden diese Rezeptoren durch genetische Manipulationen impermeabel für Calciumionen,
ziehen sich infolge dessen die glialen Ausläufer, die die Synapsen der Purkinjezellen
umgeben, zurück (Iino et al., 2001). Neben den AMPA-Rezeptoren gibt es in Bergmann-Glia-
Zellen noch weitere Glutamatrezeptoren wie zum Beispiel die NMDA- (Lopez et al., 1997)
und Kainatrezeptoren (Ortega et al., 1991). Zu den Transportern, die sich in diesen Glia-
Zellen identifizieren lassen, zählen die Glutamat- und Glycintransporter (Lopez et al., 2005).
Durch diese Ausstattung an Rezeptoren und Transportern sind Bergmann-Glia in der Lage,
die neuronale Übertragung auf verschiedenste Weise zu beeinflussen (Muller und Kettenmann,
1995; Muller et al., 1996). Weiterhin ist bekannt, dass Bergmann-Glia während der
Entwicklung des Kleinhirns mit wandernden Körnerzellen assoziieren, weshalb das Konzept
der „Glia-geführten“ neuronalen Migration aufgestellt wurde (Rakic, 1971). Ähnlich wie
andere Radial-Glia-Populationen exprimieren auch Bergmann-Glia Vimentin, B-FABP,
Glutamin-Synthetase, GFAP und GLAST. RC2 dagegen ist nur bis zur zweiten postnatalen
Woche der Kleinhirnentwicklung zu finden (Pinto und Götz, 2007). Mit Hilfe einer
induzierbaren Form der Cre-Rekombinase (CreERT2), die im Lokus des Astrozyten-
spezifischen Glutamat-Transporters (GLAST) exprimiert wird, konnte gezeigt werden, dass
embryonale Radial-Glia-Zellen sowohl cerebelläre Neurone als auch Bergmann-Glia
hervorbringen können (Mori et al., 2006). Damit ist das Cerebellum ähnlich wie andere
Regionen des entstehenden zentralen Nervensystems im Besitz neurogener Radial-Glia-Zellen.
Über Signalwege, die die Differenzierung von Bergmann-Glia regulieren, ist bisher nicht viel
bekannt. Vor kurzem wurde jedoch Caspase-3 mit der Reifung dieser Glia-Zellen in
Verbindung gebracht. So führt die Inhibierung der Caspase-3-Aktivität zur Verringerung der
Differenzierung von Bergmann-Glia-Zellen in Kultur und zur Erhöhung der Zahl
Einleitung
15
proliferierender Vorläuferzellen (Oomman et al., 2006). Weitere Faktoren, die in Bergmann-
Glia vorkommen, sind die Rezeptoren Notch1-3, die in den ersten zwei postnatalen Wochen
deutlich in den Fortsätzen der Zellen zu detektieren sind. Danach nehmen die Signale für
diese Rezeptoren graduell ab und sind im Erwachsenenalter nicht mehr nachzuweisen. Zudem
sind in den Ausläufern von Bergmann-Glia des postnatalen Kleinhirns die Notch-Liganden
Jagged1 und 2 lokalisiert (Tanaka und Marunouchi, 2003). Schließlich kann in adulten
Bergmann-Glia die Expression der Transkriptionsfaktoren Sox1, Sox2 und Sox9, die als
Marker für neurale Stammzellen fungieren, detektiert werden (Sottile et al., 2006). Damit
könnten diese Zellen möglicherweise die Stammzellen im adulten Cerebellum repräsentieren
(Sottile et al., 2006).
1.3 DAS REELER-MAUS-MODELL
In den letzten Jahren wurden bemerkenswerte Fortschritte bei der Identifizierung und
Charakterisierung von Genen gemacht, die für die korrekte Zellpositionierung im sich
entwickelnden Gehirn von Maus und Mensch gebraucht werden (D'Arcangelo und Curran,
1998; Walsh, 1999). Die reeler-Maus, eine klassische ataktische Mausmutante, fungiert seit
längerem als Prototyp für die Untersuchung neurologischer Mutationen, durch die die
neuronale Migration und die Organisation des zentralen Nervensystem beeinträchtigt werden.
Das Kennzeichen dieser Mutante ist die gestörte neuronale Zytoarchitektur im cerebralen
Kortex, Cerebellum und Hippokampus (D'Arcangelo und Curran, 1998; Rakic und Caviness,
1995). Reelin, ein großes extrazelluläres Protein, das in reeler-Mäusen defekt ist, wird von
den Cajal-Retzius-Zellen in den kortikalen Marginalzonen und von cerebellären Körnerzellen
in der externen Körnerzellschicht sezerniert (D'Arcangelo et al., 1995; Schiffmann et al.,
1997). Auffällige Abweichungen im Cerebellum von reeler-Mäusen sind die Verlagerung der
Purkinjezellen und eine Reduktion der Körnerzellzahl. Purkinjezellen, die normalerweise
direkt unterhalb der externen Körnerzellschicht zu liegen kommen, befinden sich in diesen
Mäusen in subkortikalen Regionen, wo sie Cluster bilden (Goffinet, 1984; Goffinet et al.,
1984; Mariani et al., 1977). Als Folge dieser gestörten Zellmigration sind die Purkinjezellen
nicht nah genug an den Körnerzellen, um deren Proliferation mit Hilfe des Körnerzell-
Mitogens Shh zu unterstützen (Dahmane und Ruiz i Altaba, 1999; Wallace, 1999; Wechsler-
Reya und Scott, 1999). Kurz nachdem das Reelin-Gen identifiziert worden war, wurde ein der
reeler-Maus ähnlicher Phänotyp beschrieben. Diese neue spontane Mausmutante wurde
scrambler genannt (Sweet et al., 1996). Das scrambler-Gen ließ sich als cytoplasmatisches
Einleitung
16
Adaptorprotein Dab1 (disabled 1) identifizieren und wird in Zellen, die auf Reelin reagieren,
wie zum Beispiel die Kortikalplatten- oder Purkinjezellen, exprimiert (Howell et al., 1997;
Sheldon et al., 1997; Ware et al., 1997). Weitere reeler-ähnliche Phänotypen lassen sich in
Mäusen mit Mutationen in den beiden Lipoprotein-Rezeptoren, dem VLDLR (very low
density lipoprotein receptor) und dem ApoRE2 (apolipoprotein E receptor type 2), finden.
Reelin kann direkt an diese Rezeptoren binden, wodurch eine Kinase-Signal-Kaskade
aktiviert wird, die die Tyrosin-Phosphorylierung von Dab1 auslöst (D'Arcangelo et al., 1999;
Hiesberger et al., 1999; Trommsdorff et al., 1999). All diese Faktoren gehören vermutlich
einem gemeinsamen Signalweg an, der die Zellpositionierung im sich entwickelnden
zentralen Nervensystem kontrolliert. Reelin fungiert dabei möglicherweise als Stopsignal für
Neuronen am Ende ihres Migrationsweges.
1.4 DIE FAMILIE DER SOX-PROTEINE
Transkriptionsfaktoren der Sox-Proteinfamilie traten mit der Entdeckung des
geschlechtsbestimmenden Faktors SRY (sex determining region on Y chromosome) zum
ersten Mal in Erscheinung (Gubbay et al., 1990; Sinclair et al., 1990). SRY befindet sich auf
dem Y-Chromosom der Säugetiere und enthält eine DNA-Bindedomäne, die als HMG-Box
(high mobility group-box) oder auch als SRY-Box bezeichnet wird, wovon sich der Name der
Sox-Proteine ableitet. SRY und Sox-Proteine werden aufgrund ihrer Ähnlichkeiten in der
HMG-Domäne (mindestens 50 % Aminosäure-Identität) in eine Proteinfamilie eingeteilt und
bilden eine Untergruppe der HMG-Box Superfamilie. Diese Superfamilie kann in zwei
Unterfamilien eingeteilt werden, eine bilden die Sox- und TCF-Proteine und die andere die
HMG/UBF-Proteine. Während die Mitglieder der HMG/UBF-Familie mehrere HMG-
Domänen besitzen, mit denen sie unspezifisch an DNA binden können, haben TCF/Sox-
Proteine eine einzelne HMG-Box und binden sequenzspezifisch an DNA (Grosschedl et al.,
1994; Laudet et al., 1993). Die DNA-Bindung der Sox-Proteine erfolgt über die kleine Furche
der Doppelhelix an die heptamere Konsensussequenz 5’-A/T A/T CAA A/T G-3’ (Harley et al.,
1994; Weiss, 2001). Dadurch kommt es zu einer Beugung der DNA um einen Winkel von
70-85 ° und zu ihrer partiellen Entwindung (Connor et al., 1994; Ferrari et al., 1992; Werner
et al., 1995). Diese Eigenschaft ist ein Grund dafür, dass man Sox-Proteinen auch
architektonische Funktionen zuordnet (Werner und Burley, 1997). Über die DNA-Bindung
und -Beugung hinaus kann die HMG-Domäne auch Protein-Protein-Interaktionen vermitteln
Einleitung
17
(Ambrosetti et al., 1997; De Santa Barbara et al., 1998; Hosking et al., 2001; Wissmüller et al.,
2006).
Mitglieder der Sox-Proteinfamilie sind im gesamten Tierreich zu finden und an vielen
verschiedenen Entwicklungsprozessen beteiligt. In Säugetieren wurden 20 verschiedene Sox-
Proteine identifiziert, die aufgrund von Sequenzhomologien in acht Untergruppen (A-H)
eingeteilt werden (Bowles et al., 2000; Pevny und Lovell-Badge, 1997; Schepers et al., 2002;
Wegner, 1999). Innerhalb einer Untergruppe sind die HMG-Domänen zu mehr als 80 %
identisch. Häufig findet man bei Mitgliedern einer Untergruppe auch außerhalb der DNA-
Bindedomäne konservierte Regionen. Dazu gehört die Transaktivierungsdomäne, die sich
häufig, wie bei den Untergruppen C und E, am C-Terminus befindet (Kuhlbrodt et al., 1998a;
Pusch et al., 1998; van de Wetering et al., 1993), während sie bei Sox18 als Mitglied der
Untergruppe F zentral lokalisiert ist (Hosking et al., 1995). Bei den Mitgliedern der
Untergruppe D kann man neben der HMG-Domäne ein Leucin-Zipper Motiv mit
angrenzender Glutamin-reicher Region finden. Gemeinsam bilden diese beiden Bereiche eine
sogenannte coiled-coil-Domäne, die eine Homo- und Heterodimerisierung vermittelt
(Lefebvre et al., 1998; Takamatsu et al., 1995). Auch bei der genomischen Organisation der
Sox-Gene von Säugern kann man innerhalb der Mitglieder der einzelnen Untergruppen
Ähnlichkeiten erkennen. So sind die Sox-Gene der Gruppe B und C intronlos, während die
Mitglieder der Gruppen D bis G eine Exon-Intron-Struktur aufweisen (Wegner, 1999).
Um als Transkriptionsfaktoren an ihren Wirkort zu gelangen, muß eine Translokation der
Sox-Proteine in den Zellkern möglich sein. Für SRY und die Proteine der Gruppe E ließen
sich bereits die für den Transport erforderlichen Kern-Lokalisierungssignale (NLS) nach-
weisen (Rehberg et al., 2002; Sudbeck und Scherer, 1997). Zudem konnte in der HMG-
Domäne von Sox9 und Sox10 ein Kern-Exportsignal (NES) identifiziert werden, das einen
aktiven Transport aus dem Zellkern erlaubt (Gasca et al., 2002; Rehberg et al., 2002). Beide
Signale zusammen ermöglichen diesen Proteinen ein Shuttling zwischen Nukleus und
Cytoplasma, was für ihre Funktion von Bedeutung zu sein scheint.
1.4.1 Sox-Proteine der Gruppe C
In Drosophila melanogaster (Cremazy et al., 2001) und niederen Tierspezies gibt es nur ein
einziges Sox-Protein, das der Gruppe C zugeordnet wird, während man in Maus, Mensch und
den meisten anderen Vertebraten drei Mitglieder finden kann, die als Sox4, Sox11 und Sox12
bezeichnet werden (Abb. 9). Zumindest in Wirbeltieren werden die Mitglieder dieser Gruppe
Einleitung
18
durch Gene kodiert, in denen der offene Leserahmen ein einziges Exon umfasst. Die DNA-
Bindedomäne der zugehörigen Proteine befindet sich im N-terminalen Drittel und ist
innerhalb der Gruppe hoch konserviert. Im C-terminalen Drittel der Transkriptionsfaktoren
gibt es einen weiteren homologen Bereich, der als Transaktivierungsdomäne identifiziert
werden konnte (Bowles et al., 2000; Schepers et al., 2002; Wegner, 1999).
Abb. 9: Die Sox-Proteine der Gruppe C Schematisch dargestellt sind die Gruppe C-Proteine Sox4 und Sox11 aus der Maus (mo-SOX4, mo-SOX11), SOX12 aus dem Menschen (hu-SOX12) und Sox24 aus der Regenbogenforelle (tr-SOX24). Die Proteine besitzen keine Introns (ni). Die HMG-Boxen liegen im N-terminalen Drittel (schwarze Box), und im C-termi-nalen Drittel befinden sich die Transaktivierungsdomänen (TA, hellgrauer Kasten mit roter Umrandung) von mo-SOX4, mo-SOX11 und tr-SOX24. Die weißen Boxen am Anfang und Ende aller vier Proteine sind hoch konservierte Bereiche. Im C-terminalen Teil des mo-SOX4 läßt sich eine Serin-reiche Region (hellblaue Raute) nachweisen, die auch im mo-SOX11 vorhanden ist. Zudem besitzt das mo-SOX11-Protein eine saure Region (gelbe kreisähnliche Form), an die sich eine Prolin-Glutamin-reiche Sequenz (dunkelblauer Kasten) anschließt. Ein saurer Bereich ist ebenfalls in hu-SOX12 und tr-SOX24 zu finden. Abbildung entnommen und leicht verändert aus (Bowles et al., 2000).
Auf Grund der nahen Verwandtschaft von Sox4, Sox11 und Sox12 geht man davon aus, dass
sie sich biochemisch ähnlich verhalten und somit den Verlust der jeweiligen anderen Proteine
in den Geweben, in denen sie gemeinsam exprimiert werden, kompensieren können. Solch
eine stark überlappende Expression dieser Proteine findet man zum Beispiel im zentralen
Nervensystem (Cheung et al., 2000; Jay et al., 1997).
1.4.1.1 Sox4
Sox4 ist das erste Mitglied der Sox-Genfamilie, von dem gezeigt werden konnte, dass es als
Transaktivator der Transkription wirken kann. Seine transaktivierende Kapazität ist im
serinreichen C-Terminus des Proteins lokalisiert (Abb. 9). In derselben Studie wurde auch die
Expression von Sox4 in T- und prä-B-Lymphozyten-Zelllinien, in den Gonaden und im
fötalen Gehirn der Maus nachgewiesen (van de Wetering et al., 1993). Desweiteren wurde
eine Sox4-Expression in den Endokardkissen und Endokardleisten des Herzens der Maus am
Embryonalstadium 13 dpc festgestellt. Um die Funktion von Sox4 zu analysieren, wurde
Einleitung
19
dieses Gen in Mäusen deletiert. Sox4-defiziente Tiere sterben an 14 dpc aufgrund einer
Herzklappeninsuffizienz. Histologische Untersuchungen der mutanten Embryonen lassen eine
Fehlbildung der Taschenklappen und schwere Missbildungen der Ausstrombahn des Herzens
erkennen. Zusätzlich zeigen die Sox4-defizienten Mäuse auch eine Blockade der
Lymphozytenentwicklung auf dem pro-B-Zellstadium (Schilham et al., 1996). Desweiteren
konnte gezeigt werden, dass das Sox4-Transkript im Uterus der Maus vorkommt und die
Expression unter hormoneller Kontrolle steht (Graham et al., 1999; Hunt und Clarke, 1999).
Im sich entwickelnden zentralen Nervensystem der Maus zeigt die Analyse des
Expressionsmusters von Sox4 eine Zunahme der Expression in neuralen Vorläuferzellen, die
die proliferierende Ventrikulärzone des Neuralrohrs verlassen und nach außen wandern, wo
sie mit der Differenzierung beginnen. Während der weiteren Entwicklung der Zellen zu reifen
Neuronen wird die Expression von Sox4 abgeschaltet. Auch im sich entwickelnden Gehirn
findet man schon sehr früh hohe Mengen an Sox4-Transkript. Zu den Regionen mit hohem
Sox4-Vorkommen gehören der zerebrale Kortex, der Thalamus, der Hippokampus und der
cerebelläre Kortex. Trotz der deutlichen Expression von Sox4 sowohl im Rückenmark als
auch im Gehirn lässt sich jedoch in den Sox4-defizienten Embryonen bis zum Zeitpunkt ihres
Absterbens am Embryonalstadium 14 dpc keine abnormale Entwicklung des zentralen
Nervensystems feststellen. Ein Grund hierfür könnte sein, dass das zu Sox4 nah verwandte
Protein Sox11, das ein sehr ähnliches Expressionsmuster zeigt, den Funktionsverlust von
Sox4 im zentralen Nervensystem kompensieren könnte, zumindest zu frühen Zeitpunkten der
Entwicklung (Cheung et al., 2000). Desweiteren wird Sox4 in den embryonalen
Wachstumsfugen der Maus exprimiert und dort durch das Parathyroidhormon reguliert
(Reppe et al., 2000). In einer kürzlichen Studie konnte außerdem gezeigt werden, dass Sox4
eine wichtige Rolle bei der Regulation der postnatalen Knochenbildung spielt (Nissen-Meyer
et al., 2007).
Um neben der Maus auch den Huhn-Embryo als Modellorganismus einsetzen zu können,
wurde infolge das Sox4-Gen des Huhns isoliert und näher charakterisiert. Dabei stellte man
fest, dass sich Sox4 aus dem Huhn und aus der Maus in Struktur und Expressionsmuster sehr
ähnlich sind (Maschhoff et al., 2003). Untersuchungen des sich entwickelnden Pankreas der
Maus identifizierten dieses Organ als weiteren Expressionsort von Sox4, ohne dem Gen
jedoch eine Funktion zuzuordnen (Lioubinski et al., 2003). Weiterhin konnte sowohl in der
Maus als auch im Zebrafisch gezeigt werden, dass Sox4 eine wichtige Rolle bei der
Entwicklung des endokrinen Pankreas spielt (Mavropoulos et al., 2005; Wilson et al., 2005).
Im Zebrafisch beispielsweise lässt sich aufgrund einer Genom-Duplikation bei Knochen-
Einleitung
20
fischen sowohl ein Sox4a als auch ein Sox4b finden. Jedoch ist nur Sox4b stark im sich
entwickelnden Pankreas exprimiert und wird in erster Linie für die Differenzierung
Glukagon-sezernierender alpha-Zellen benötigt (Mavropoulos et al., 2005). Schließlich
konnte man auch eine Überexpression von Sox4 in verschiedenen Tumorarten nachweisen.
Dazu zählen beispielsweise die meisten klassischen Medulloblastome (maligne embryonale
Tumore des Kleinhirns) (Lee et al., 2002), Adenoid-zystische Karzinome (ACC) der
Speicheldrüsen (Frierson et al., 2002) und Prostatakrebs (Liu et al., 2006). Eine
Herabregulierung der Sox4-Expression durch RNA-Interferenz induziert offensichtlich
sowohl in der ACC3-Zelllinie (Pramoonjago et al., 2006) als auch in Prostata-Krebszellen
(Liu et al., 2006) Apoptose. Somit könnte Sox4 durch Förderung des Zellüberlebens zu einem
malignen Zellphänotyp beitragen.
1.4.1.2 Sox11
Nach der Identifizierung von Sox4 wurden mit Sox11 und Sox12 zwei weitere Mitglieder der
Gruppe C in der Maus gefunden (Gubbay et al., 1990; Wright et al., 1993). Untersuchungen
im Huhn lassen eine starke Homologie von Sox11 zu Sox4 in der C-terminalen Region
erkennen. Sox11 wird im zentralen Nervensystem stark in reifenden Neuronen exprimiert, die
das Neuroepithel verlassen haben. Im Laufe der weiteren neuronalen Entwicklung nimmt die
Expression von Sox11 wieder ab. Neben dem zentralen Nervensystem kann man aber auch im
peripheren Nervensystem Sox11-Transkripte nachweisen (Uwanogho et al., 1995). Im
Menschen ist SOX11 auf dem kurzen Arm des Chromosoms 2 (2p25) lokalisiert. Die
Aminosäuresequenz zwischen dem humanen SOX11 und dem Huhn-Homolog ist stark
konserviert. Im C-Terminus des Proteins befindet sich eine sehr saure Region, an die ein
Prolin-Glutamin-reicher Bereich anschließt. Eine weitere Domäne, die in Nähe des
Polypeptidendes liegt, enthält mehrere Serine. Während jedoch die saure Domäne auch im
Huhn und anderen Spezies vorhanden ist, lässt sich die Serin-reiche Region in diesem
Organismus und in Xenopus nicht auffinden (Hargrave et al., 1997; Jay et al., 1995; Miyata et
al., 1996; Uwanogho et al., 1995). Wie im Huhn so ist auch SOX11 im menschlichen Embryo
im zentralen und peripheren Nervensystem exprimiert (Jay et al., 1995). Analysen in der
Maus zeigen ebenfalls hoch konservierte C-terminale Motive (Abb. 9) und Expression im sich
entwickelnden Nervensystem. Daneben können Transkripte in Regionen des Embryos
nachgewiesen werden, in denen während der Gewebeentwicklung und Organausformung
Interaktionen zwischen Epithel und Mesenchym stattfinden. So kommt Sox11 beispielsweise
Einleitung
21
in den Branchialbögen, den Genitalhöckern, den Extremitäten, dem Gesicht, den nasalen
Einstülpungen, den Somiten, den Augen und Ohren vor. Außerdem lässt es sich im Epithel
der Speiseröhre, des Magens, des Pankreas, der Speicheldrüsen und der Zähne detektieren
und ist auch in der Lunge und der Niere vorhanden (Hargrave et al., 1997).
Untersuchungen der eigenen Arbeitsgruppe konnten Sox11 und auch Sox4 in
oligodendroglialen Zellen identifizieren. Dabei werden beide Faktoren in Oligodendrozyten-
Vorläuferzellen exprimiert und während der terminalen Differenzierung wieder
herunterreguliert (Kuhlbrodt et al., 1998a). Sox11 besitzt außerdem eine starke intrinsische
Transaktivierungskapazität, die durch eine Transaktivierungsdomäne im C-terminalen Teil
des Proteins vermittelt wird (Kuhlbrodt et al., 1998a) (Abb. 9). Genau in diesem Bereich
wurde vorher schon die transaktivierende Funktion von Sox4 aufgezeigt (van de Wetering et
al., 1993). Die carboxyterminalen Regionen beider Proteine lassen erhebliche Ähnlichkeiten
erkennen. Beide Faktoren enthalten eine Serin-reiche Domäne in diesem Abschnitt und
stimmen mit 82 % in den letzten 34 Aminosäuren überein. Deshalb ist es wahrscheinlich, dass
entweder eine dieser Domänen oder beide an der Vermittlung der transaktivierenden Funktion
beteiligt sind. Zusätzlich dazu sind sowohl Sox11 als auch Sox4 in der Lage, synergistisch mit
POU-Proteinen zu interagieren. Dabei stellen Brn-1 und Brn-2 ihre bevorzugten Partner dar.
Der Synergismus wiederum ist abhängig vom Binden beider Proteine (POU- und Sox-Protein)
an benachbarte DNA-Elemente und dem Vorhandensein der entsprechenden
Transaktivierungsdomäne in jedem Protein (Kuhlbrodt et al., 1998a).
Experimente an Zebrafischen zeigten, dass Sox11, wie Sox4, ebenfalls dupliziert als Sox11A
und Sox11B vorliegt. Die Transkripte sind im Ei angehäuft und bis zur Gastrulation in allen
Zellen vorhanden. Später sind sie auf das sich entwickelnde zentrale Nervensystem
beschränkt und im adulten Tier ist keine Expression mehr zu detektieren. Das Vorhandensein
von Sox11-Transkripten vor der Midblastula-Transition, dem Einsetzen der Transkription des
embryonalen Genoms, deutet darauf hin, dass diese Transkripte maternal abgelegt werden
(Rimini et al., 1999). Die Ergebnisse von Xenopus-Studien deuten an, dass Sox11, durch die
Expression von Chordin induziert, mit der Nemo-like Kinase (NLK) kooperiert, um die
neurale Entwicklung zu stimulieren (Hyodo-Miura et al., 2002). Eine starke Expression von
Sox11 kann auch in Tumoren wie beispielsweise den klassischen Medulloblastomen
nachgewiesen werden (Lee et al., 2002). Anhand weiterer Untersuchungen konnte eine neue
Domäne in der konservierten Region von Sox11 identifiziert werden. Diese Region scheint
eine inhibierende Wirkung auf die eigene DNA-Bindungsfähigkeit in vitro und die
Einleitung
22
Aktivierung der Reporter-Genexpression in Zellkultur zu haben. Die Domäne enthält saure
Aminosäuren und ist relativ zentral im Protein gelegen (Wiebe et al., 2003).
Um die Funktion von Sox11 während der Säuger-Embryogenese zu studieren, wurde von der
eigenen Arbeitsgruppe eine Sox11-defiziente Maus generiert (Sock et al., 2004). Diese Mäuse
sterben kurze Zeit nach ihrer Geburt. Zum Zeitpunkt der Geburt weisen die Sox11-defizienten
Tiere verschiedenste Entwicklungsdefekte auf. Dazu gehören eine Unterentwicklung der
Lunge, des Magens und des Pankreas. Desweiteren lassen sich in den mutanten Mäusen
schwere Herzfehler nachweisen. So wird die Scheidewand zwischen den beiden
Herzkammern nicht vollständig ausgebildet und in der Ausstrombahn des Herzens unterbleibt
oft die Auftrennung in Aorta und Truncus pulmonalis. Daneben kann es auch zu einer
Transposition der großen Gefäße kommen, wodurch Aorta und Lungenarterie gemeinsam aus
dem rechten Ventrikel hervorgehen. Außerdem treten in den Sox11-defizienten Tiere häufig
Lippenkiefergaumenspalten sowie Verschlussdefekte des Augenlids und der Bauchhöhle auf.
Zudem sind Defekte in der Schädelverknöcherung und der Skelettausbildung sowie ein
Fehlen der Milz zu nennen. Trotzdem lassen sich im zentralen und peripheren Nervensystem
bis zur Geburt der Sox11-defizienten Mäuse keine signifikanten Entwicklungsstörungen
nachweisen (Sock et al., 2004). Dies könnte mit der weitgehenden Ko-Expression von Sox11
mit Sox4 im sich entwickelnden Nervensystem erklärt werden. Kürzlich konnten schließlich
Beweise für eine Rolle von Sox11 und Sox4 in neuronaler Differenzierung mit Hilfe von
Elektroporationsexperimenten in das frühe Neuralrohr des Huhns erbracht werden. In dieser
Studie wurde gezeigt, dass beide Transkriptionsfaktoren für die Expression pan-neuronaler
Gene wie des Klasse III ß-Tubulin-Gens (auch unter dem Namen Tuj1 bekannt) benötigt
werden. Dieses Gen wurde als ein möglicher direkter Zielort von Sox-Proteinen der Gruppe C
identifiziert (Bergsland et al., 2006).
1.4.1.3 Sox12
Im Gegensatz zu Sox4 und Sox11 ist Sox12 als drittes Sox-Protein der Gruppe C bisher nur
wenig analysiert. Ein einziger Bericht existiert, der die Expression von SOX12 im
menschlichen Embryo beschreibt. Zu diesem Zeitpunkt war humanes SOX12 unter dem
Namen SOX22 bekannt (Jay et al., 1997). Aufgrund starker Homologien nicht nur innerhalb,
sondern auch außerhalb der HMG-Domänen von Sox12 in der Maus und von SOX22 im
Menschen sowie der chromosomalen Lokalisation beider Gene in Regionen mit konservierter
Syntenie konnte bestätigt werden, dass sie Orthologe sind. Daher wurde humanes SOX22 in
Einleitung
23
SOX12 umbenannt (Bowles et al., 2000; Jay et al., 1997; Schepers et al., 2002). Humanes
SOX12 ist auf Chromosom 20p13 lokalisiert und scheint aus einem einzigen Exon zu
bestehen. Neben der HMG-Box gibt es in der SOX12-Sequenz einen weiteren zu Sox4 und
Sox11 sehr ähnlichen Bereich, der sich im C-Terminus des Proteins befindet und in den
Gruppenmitgliedern als Transaktivierungsdomäne identifiziert werden konnte (Jay et al.,
1997; Kuhlbrodt et al., 1998a; van de Wetering et al., 1993) (Abb. 9). Für SOX12 allerdings
ist die Transaktivierungskapazität dieser Domäne bisher noch nicht gezeigt worden. SOX12-
Expression kann im menschlichen Embryo in vielen mesodermalen und in einigen
entodermalen Derivaten nachgewiesen werden. Eine starke Genexpression für Sox12 ist vor
allem im zentralen Nervensystem festzustellen mit einer großen Ähnlichkeit zum Sox4- und
Sox11-Expressionsmuster. Auch in adulten Geweben wie zum Beispiel im Herzen, Pankreas,
Testis und Ovar lässt sich SOX12-mRNA finden (Jay et al., 1997).
Problemstellung
25
2 Problemstellung
Die Mitglieder der Sox-Proteinfamilie spielen eine wichtige Rolle bei der transkriptionellen
Regulation verschiedenster Entwicklungsprozesse. Dabei gehören die Transkriptionsfaktoren
Sox4, Sox11 und Sox12 zur Gruppe C der Sox-Proteine.
Im Gegensatz zu Sox4 und Sox11 ist Sox12 bislang noch nicht funktionell charakterisiert und
seine Expression nur für den menschlichen Embryo beschrieben. Daher sollte im ersten Teil
dieser Arbeit die Expression von Sox12 im sich entwickelnden Mausembryo mit Hilfe der
RT-PCR- und in situ Hybridisierungstechnik genauer untersucht werden und mit der
Expression von Sox4 und Sox11 verglichen werden. Zusätzlich sollte die Funktion dieses
Transkriptionsfaktors anhand eines Knockout-Mausmodells analysiert werden. Anhand von
Untersuchungen embryonaler Gewebe mittels in situ Hybridisierung und RT-PCR sollte die
Auswirkung der Sox12-Defizienz auf die Expression von Sox4 und Sox11 beobachtet werden.
Daneben sollten das DNA-Bindeverhalten von Sox12 mit Hilfe der Gelshiftanalyse und eine
mögliche transaktivierende Wirkung dieses Transkriptionsfaktors durch Luciferase-Aktivi-
tätstests sowie durch in ovo Elektroporation im Huhn-Embryo erforscht werden.
Für die Gruppe C-Mitglieder Sox4 und Sox11 wird eine wichtige Rolle im sich ent-
wickelnden Nervensystem postuliert, da in früheren Arbeiten eine starke Expression dieser
Faktoren nachgewiesen werden konnte. Auf Grund einer zu vermutenden gegenseitigen
funktionellen Redundanz der beiden Proteine lassen sich im Maus-Modell weder für Sox4
noch für Sox11 neurale Defekte nach Deletion dieser Proteine nachweisen. Deshalb sollte im
zweiten Teil dieser Arbeit die Funktion der Sox-Proteine der Gruppe C in Überexpressions-
studien analysiert werden. Dafür waren transgene Mäuse generiert worden, die den
Transkriptionsfaktor Sox4 unter dem humanen GFAP-Promotor in Radial-Glia und
Astrozyten exprimieren. Mittels histologischer Methoden sollte die räumliche und zeitliche
Expression des Sox4-Transgens dokumentiert und die Auswirkungen auf die Entwicklung
von Radial-Glia-Zellen und Astrozyten aufgezeigt werden.
Ergebnisse
27
3 Ergebnisse
3.1 HERSTELLUNG UND ANALYSE SOX12-DEFIZIENTER MÄUSE
Sox12 gehört mit Sox4 und Sox11 zur Gruppe C der Sox-Proteinfamilie. Über die Funktion
von Sox12 ist im Gegensatz zu Sox4 und Sox11 nicht viel bekannt. Bislang ist das Sox12-
Expressionsmuster nur im menschlichen Embryo beschrieben (Jay et al., 1997) und dort
ähnelt es dem Vorkommen der beiden anderen SoxC-Gene (Hargrave et al., 1997; Kuhlbrodt
et al., 1998a; Schilham et al., 1996). Funktionelle Studien oder Tiermodelle für Sox12 gibt es
bisher noch nicht. Deshalb sollte im ersten Teil dieser Arbeit die Expression von Sox12 im
sich entwickelnden Mausembryo genauer charakterisiert und die Funktion von Sox12 nach
Deletion des Gens in der Maus analysiert werden.
3.1.1 Herstellung von spezifischen Antikörpern gegen Sox12, Sox11 und Sox4
Zur genaueren Charakterisierung der Sox12-Expression im sich entwickelnden Nervensystem
und um diese mit den verwandten Proteinen Sox4 und Sox11 vergleichen zu können, sollten
spezifische Antikörper gegen die drei Faktoren generiert werden.
Dafür wurden zunächst ihre Aminosäuresequenzen verglichen, um Bereiche zu identifizieren,
die spezifisch für das jeweilige Sox-Protein sind. Dabei konnte für Sox4 eine Region
bestimmt werden, die im Protein der Ratte die Aminosäuren 240-333 umspannt (Genbank-Ref.
XP_344595). Für Sox11 wurden die Aminosäuren 204-285 des Rattenproteins gewählt
(Genbank-Ref. NP_445801), während für Sox12 die Aminosäuresequenz 5-31 des
Mausproteins identifiziert wurde (Genbank-Ref. NP_035568) (Abb. 10). Die hier
verwendeten Rattensequenzen sind nahezu identisch mit denen der Maus und waren früher im
Labor kloniert worden.
Abb. 10: Lokalisation der Peptide für die Herstellung spezifischer Antikörper gegen Sox4, Sox11 und Sox12 Schematisch dargestellt sind die drei Sox-Proteine der Gruppe C Sox12, Sox11 und Sox4 mit ihren N-terminal gelegenen HMG-Domänen und den Bereichen in den Proteinen, die als Peptide für die Antikörperherstellung verwendet wurden (α).
Ergebnisse
28
Die ausgewählten Bereiche für Sox4 und Sox11 wurden, mit einem N-terminalen His6-Tag
versehen, bakteriell exprimiert. Die hergestellten rekombinanten Peptide wurden
denaturierend aufgereinigt und anschließend vom Pineda-Antikörper-Service (Berlin) für die
Immunisierung verschiedener Spezies (Ratte, Meerschweinchen, Kaninchen) verwendet. Das
Sox12-Peptid wurde kommerziell synthetisiert und aufgereinigt (Pineda-Antikörper-Service,
Berlin).
Für alle drei Peptide wurden Antikörper generiert, die im Western-Blot spezifisch das
jeweilige SoxC-Protein erkannten (siehe Abb. 26 und Daten nicht gezeigt). In immun-
histochemischen Analysen zeigten nur Antikörper gegen Sox4 und Sox11 ein spezifisches
Signal (siehe Abb. 32, Abb. 35). Die Spezifität dieser Antikörper wurde durch ein fehlendes
Signal nach Immunfärbungen auf Sox4- bzw. Sox11-defizientem embryonalem Gewebe der
Maus ersichtlich (Daten nicht gezeigt). Die Antikörper gegen Sox12 zeigten immun-
histochemisch auf Mausgewebe keine spezifische Färbung. Sowohl auf Wildtyp- als auch auf
Sox12-defizientem embryonalem Gewebe des Rückenmarks war mit diesen ein
vergleichbares Färbemuster zu erkennen (Daten nicht gezeigt). Im Huhn-Embryo dagegen
konnte mit Sox12-Antikörpern überexprimiertes Sox12 der Maus detektiert werden (siehe
Abb. 32). Zusätzlich ließen sich die Antikörper auch in Gelshift-Experimenten zum Nachweis
von Sox12 in Protein-DNA-Komplexen einsetzen (siehe Abb. 24, Abb. 25).
3.1.2 Generierung Sox12-defizienter Mäuse
In früheren Arbeiten wurde das SOX12-Gen des Menschen auf dem kurzen Arm des
Chromosoms 20 (20p13) nachgewiesen (Jay et al., 1997). Das Sox12-Gen der Maus dagegen
ist in der H1-Region des Chromosoms 2 lokalisiert. Um eine Deletion des Sox12-Gens in der
Maus zu erreichen, wurde die in Abb. 11 dargestellte Strategie entwickelt.
Zur Herstellung des Targeting-Konstrukts wurde die genomische Sequenz des Sox12-Lokus
von C57BL/6J-Mäusen aus dem BAC (bacterial artificial chromosome) -Klon RP23-396N8
(BACPAC Resources, Oakland, USA) verwendet. Ein 9,1 kb langes XbaI/ScaI-gespaltenes
Fragment, das das Sox12-Gen enthält, wurde in mehreren kleinen Sequenzabschnitten in
verschiedene Vektoren subkloniert. Über die XhoI-Restriktions-Schnittstelle in der 5’-
untranslatierten Region 268 bp stromaufwärts des Startcodons von Sox12 wurde eine loxP-
Erkennungsstelle eingefügt. Zusätzlich wurde in die HindIII-Restriktions-Schnittstelle in der
3`-untranslatierten Region von Sox12 eine Kassette eingefügt, die ein mit loxP- und FRT-
Stellen versehenenes Neomycin-Resistenzgen, eine interne ribosomale Eintrittsstelle (IRES)
Ergebnisse
29
und ein enhanced green fluorescent protein (EGFP) enthielt. Die verschiedenen
Einzelkomponenten des modifizierten Sox12-Gens wurden schließlich zwischen die XbaI-
und SalI-Restriktions-Schnittstellen in den Vektor pTV-0 (Riethmacher et al., 1995) eingefügt.
Abb. 11: Schema zur Generierung des Sox12-Knockout-Allels Schematische Darstellung des Targeting-Konstrukts, des Sox12-Wildtyp-Lokus sowie des mutierten Lokus vor und nach der Cre-vermittelten Entfernung des Sox12-Leserahmens und des Neomycin-Resistenzgens. Die transkribierte Region des Sox12-Gens ist als Kasten und die flankierenden Bereiche sind als Balken dargestellt. Außerdem sind der offene Leserahmen von Sox12 (ORF), die Position des Startcodons (ATG), die im Genom der Maus annotierte kurze Intronsequenz (I), die Neomycin-Resistenz-Selektionskassette (neo), die EGFP-Sequenz mit vorgeschalteter interner Ribosomen-Eintrittsstelle (IRES-EGFP) und die Erkennungsstellen für die Cre- und Flp-Rekombinase (loxP und FRT) im Schema gezeigt. Homologe Regionen im Wildtyp-Lokus und Targeting-Konstrukt, zwischen denen Rekombination stattfindet, sind durch gekreuzte Linien gekennzeichnet. Ebenfalls gezeigt sind Positionen der Restriktions-Schnittstellen für BamHI (B), BglII (G) und PstI (P), die Lage der 5’- und 3’-Sonde für den Southern-Blot und die Primer a-c für die Genotypisierung (Pfeilspitzen). Tk: Thymidinkinase-Selektionskassette des Herpes Simplex Virus.
In einem nächsten Schritt erfolgte die Linearisierung dieses Targeting-Vektors vor dem
vorderen Homologie-Arm durch das Restriktionsenzym ClaI. Danach wurde der geöffnete
Vektor in die embryonale Stammzell- (ES) Linie V6.5 (C57BL/6J x 129Sv) (Rideout et al.,
2000) elektroporiert und die Zellen mit G418 (Positivselektion) und Gancyclovir
(Negativselektion) selektioniert. Mittels Southern-Blot konnten unter den selektionierten ES-
Zellen schließlich solche mit homologem Rekombinationsereignis identifiziert werden (Abb.
12). Für den Nachweis der homologen Rekombination über den 5’-Homologie-Arm wurde
genomische ES-Zell-DNA mit dem Restriktionsenzym PstI gespalten (Abb. 11). Durch
Hybrisierung mit einer radioaktiv markierten, 320 bp langen 5’-Sonde, die außerhalb des
rekombinierten Bereichs liegt, konnte im Southern-Blot für das Wildtyp-Allel ein 5,3 kb
langes Fragment und für das rekombinierte Sox12-Allel ein 4,8 kb langes Fragment detektiert
Ergebnisse
30
werden (Abb. 12A). Die korrekte Integration des 3’-Bereichs des Rekombinationskonstrukts
über den 3’-Homologie-Arm wurde mit einer radioaktiv markierten, 581 bp langen 3’-Sonde
kontrolliert. Nachdem genomische ES-Zell-DNA mit BamHI gespalten worden war (Abb. 11),
konnte anhand dieser Sonde im Southern-Blot ein 7,8 kb langes Wildtyp-Fragment und ein
6,6 kb langes Fragment für das rekombinierte Sox12-Allel gefunden werden (Abb. 12B).
Abb. 12: Southern-Blot Analysen zum Nachweis des rekombinierten Sox12-Allels (A, B) Southern-Blot mit DNA aus ES-Zellen vor (+/+) und nach (+/fl) erfolgreicher homologer Rekombination. Die korrekte Integration des Targeting-Konstrukts wurde durch Spaltung der DNA mit PstI unter Verwendung der 5’-Sonde (A) und durch Spaltung der DNA mit BamHI unter Verwendung der 3’-Sonde (B) verifiziert. Die Größen der Fragmente (in kb) für das Wildyp- (+) und das rekombinierte (fl) Allel sind auf der linken Seite des jeweiligen Blots angegeben.
Die genetisch modifizierten ES-Zellen wurden anschließend in Blastozysten eingebracht und
in Ammen implantiert. Dies wurde in Zusammenarbeit mit M. Bösl am Max-Planck-Institut
für Neurobiologie in Martinsried durchgeführt. Die erhaltenen chimären Tiere wurden mit
EIIa-Cre transgenen Mäusen (Lakso et al., 1996) verpaart, um nach Keimbahntransmission
den Sox12-Leserahmen und die Neomycin-Resistenz-Selektionskassette in den Nachkommen
zu entfernen (Abb. 11, Abb. 13A). Die erfolgreiche Deletion wurde mit Southern-Blot und
genomischer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) überprüft (Abb. 13A, B). Dafür wurde DNA
aus adulten Wildtyp- (Sox12+/+), heterozygoten (Sox12+/-) und homozygoten (Sox12-/-)
Mäusen isoliert. Für den Southern-Blot erfolgte die Spaltung der genomischen DNA mit BglII
(siehe Abb. 11). Anschließend konnte durch Hybridisierung mit der radioaktiv markierten 320
bp langen 5’-Sonde ein 6,2 kb langes Fragment für das Wildtyp-Allel und ein 10,3 kb langes
Fragment für das durch die Cre-Rekombinase deletierte Sox12-Allel detektiert werden. In der
Genotypisierungs-PCR ließ sich unter Verwendung der isolierten genomischen DNA und der
in Abb. 11 dargestellten Primer a-c ein 468 bp langes Sox12-Wildtyp-Fragment und ein 580
bp langes Fragment für das deletierte Sox12-Allel identifizieren.
Ergebnisse
31
Abb. 13: Southern-Blot Analyse und Genotypisierung zum Nachweis des Sox12-Knockout-Allels (A) Southern-Blot mit DNA aus adulten Wildtyp- (+/+), heterozygoten (+/-) und homozygoten (-/-) Mäusen nach Cre-vermittelter Deletion. Der Verlust der kompletten Sequenzen zwischen der ersten und dritten loxP-Stelle, inklusive des Sox12-Leserahmens, wurde durch Spaltung der DNA mit BglII unter Verwendung der 5’-Sonde verifiziert. Die Größen der Fragmente (in kb) für das Wildyp- (+) und das deletierte (-) Allel sind auf der linken Seite des Blots angegeben. (B) Genotypisierungs-PCR mit DNA aus adulten Wildtyp- (+/+), heterozygoten (-/-) und homozygoten (-/-) Mäusen. Die untere Bande mit 468 bp repräsentiert das Wildtyp-Allel, die obere Bande mit 580 bp das deletierte Sox12-Allel.
Im Weiteren sollte untersucht werden, ob nach Deletion von Sox12 tatsächlich keine
Expression mehr in der Maus nachzuweisen war. Anhand von Reverse-Transkriptase (RT)-
PCR-Analysen mit cDNA aus Wildtyp- und Sox12-defizienten Embryonen an 12.5 dpc
konnte in den Mutanten keine Sox12-Expression detektiert werden, während in den Wildtyp-
Embryonen ein deutliches Sox12-Signal zu sehen war (Abb. 14). Die RT-PCR-Primer wurden
so gewählt, dass sie eine Region, die im Genom der Maus als eine kurze Intronsequenz mit
264 bp annotiert wurde, umspannten (Abb. 11). Die Größe des PCR-Produktes, das mit der
cDNA von Wildtyp-Embryonen erhalten wurde, zeigte jedoch, dass die putative
Intronsequenz Teil des Transkripts ist. Dies bestätigte, dass Sox12 ebenso wie die beiden
anderen SoxC-Gene Sox4 und Sox11 aus einem einzigen Exon besteht (Wegner, 1999).
Anstelle der Expression von Sox12 konnte in den mutanten Embryonen an 12.5 dpc eine
Expression von GFP detektiert werden (Abb. 14).
Abb. 14: RT-PCR zur Analyse der Sox12-Expression in Wildtyp- und Sox12-defizienten Mäusen RT-PCR mit cDNA aus den Köpfen und Rümpfen von Wildtyp- (+/+) und Sox12-defizienten (-/-) Embryonen am Entwicklungsstadium 12.5 dpc unter Verwendung von spezifischen Primern für Sox12, GFP und ß-Aktin. C: Wasserkontrolle.
Ergebnisse
32
Über die Stärke der GFP-Expression ließ sich anhand der RT-PCR-Analyse keine Aussage
treffen. Aufgrund des äußerst schwachen Signals, das in Immunfärbungen mit einem
Antikörper gegen GFP auf Sox12-defizientem Embryonalgewebe der Maus erhalten wurde
(Daten nicht gezeigt), wurde auf eine schwache GFP-Expression geschlossen.
Bestätigt wurde die fehlende Expression von Sox12 in der neu generierten Sox12-defizienten
Mutante durch in situ Hybridisierungen auf Schnitten von Embryonen an 12.5 dpc mit einer
Sonde, die gegen die 3`-untranslatierte Region von Sox12 gerichtet war (Abb. 15).
Abb. 15: In situ Hybridisierung zur Analyse der Sox12-Expression in Sox12-defizienten Mäusen In situ Hybridisierung mit einer DIG-markierten antisense-cRNA-Sonde gegen einen Teil des 3’-untranslatierten Bereichs von Sox12 auf transversalen Gefrierschnitten des Rückenmarks von Wildtyp- (+/+) und Sox12-defizienten (-/-) Embryonen am Entwicklungsstadium 12.5 dpc.
3.1.3 Sox12-defiziente Mäuse zeigen keine offensichtlichen phänotypischen
Veränderungen
Nach Deletion von Sox4 oder Sox11 in der Maus lassen sich zahlreiche Entwicklungsdefekte
in diesen Tieren nachweisen (Schilham et al., 1996; Sock et al., 2004). Aufgrund ihrer
Fehlbildungen versterben die Mäuse während der Embryogenese oder kurze Zeit nach ihrer
Geburt. Infolge dessen wurde auch für Sox12 eine ähnlich wichtige Rolle in der Entwicklung
eines oder mehrerer Gewebetypen postuliert.
Wurden jedoch Sox12-heterozygote Mäuse mit einem gemischten genetischen Hintergrund
miteinander verpaart, ließen sich in den ersten Wochen nach der Geburt bis zum Absetzen
vom Muttertier alle erwarteten Genotypen finden. Die Genotypisierung der abgesetzten
Mäuse zeigte außerdem, dass Sox12-defiziente Tiere in der nach Mendel zu erwartenden
Verteilung vorkamen (Abb. 16A). Dies deutet daraufhin, dass Sox12 für das Überleben
während der Embryogenese und der ersten postnatalen Wochen keine Rolle spielt. Im
Gegensatz dazu hatten frühere Analysen gezeigt, dass weder Sox4- noch Sox11-defiziente
Mäuse nach der Geburt lebensfähig sind (Schilham et al., 1996; Sock et al., 2004).
Ergebnisse
33
Des Weiteren ließ sich eine normale Verteilung der Geschlechter in Sox12-defizienten
Mäusen nachweisen, da jeweils etwa die Hälfte der Knockout-Tiere Männchen bzw.
Weibchen waren (Abb. 16B). Zudem ergab die Verpaarung Sox12-defizienter Mäuse
untereinander Würfe mit normaler Anzahl von Nachkommen (Daten nicht gezeigt). Diese
Ergebnisse zeigen, dass die neu generierten Sox12-defizienten Mäuse mit zum
Analysezeitpunkt gemischtem genetischem Hintergrund nicht nur lebensfähig, sondern auch
fertil sind.
Abb. 16: Genotypen- und Geschlechter-Verteilung der Nachkommen aus Verpaarungen von Sox12+/--Mäusen (A) Die Bestimmung der Genotypen aus Sox12-heterozygoten (+/-) Verpaarungen erfolgte unmittelbar nach dem Absetzen der Nachkommen vom Muttertier. Mehr als 15 Würfe wurden gezählt. Die Verteilung ist als Prozent der gesamten Nachkommen angegeben. (B) Dargestellt ist die prozentuale Verteilung der Geschlechter innerhalb der Sox12-defizienten (-/-) Nachkommen aus Sox12-heterozygoten Verpaarungen.
Bei der Bestimmung der Wachstumsparameter Sox12-defizienter Mäuse während der ersten
zwei Monate postnataler Entwicklung stellte sich heraus, dass schon zum frühesten Zeitpunkt
der Analyse die männlichen und weiblichen Sox12-defizienten Mäuse im Hinblick auf ihr
Gewicht nicht von den Wildtyp-Tieren zu unterscheiden waren (Abb. 17A, B). Die
männlichen und weiblichen Knockout-Mäuse nahmen während der folgenden Wochen
ebenfalls normal zu. Weiterhin ließen sich in beiden Geschlechtern weder zum Zeitpunkt der
Geburt noch während der darauf folgenden Wochen signifikante Unterschiede in der
Körpergröße nachweisen (Abb. 17C, D). Die Wildtyp- und Sox12-defizienten Tiere konnten
ebenfalls nicht durch ihr äußeres Erscheinungsbild im Käfig auseinander gehalten werden.
Die Untersuchung der wichtigsten inneren Organe zeigte keine offensichtlichen
Veränderungen in Lage, Form oder Größe (Daten nicht gezeigt).
Diese Daten lassen darauf schließen, dass Sox12 weder für die Embryonalentwicklung der
Maus noch für essentielle postnatale Körperfunktionen benötigt wird.
Ergebnisse
34
Abb. 17: Bestimmung der Wachstumsparameter Sox12-defizienter Mäuse (A, B) Das Körpergewicht von Wildtyp- (nicht gefüllte Kreise) und homozygoten Sox12-defizienten (gefüllte Dreiecke) weiblichen (A) und männlichen (B) Nachkommen (mehr als fünf Tiere für jeden Genotyp und jedes Geschlecht) wurde während der ersten 50 Tage nach der Geburt bestimmt. (C, D) Die Körperlänge von der Nase bis zum Anus wurde zu den angegebenen Lebenstagen von Wildtyp- (nicht gefüllte Kreise) und homozygoten Sox12-defizienten (gefüllte Dreiecke) Weibchen (C) und Männchen (D) während der ersten 50 Tage nach der Geburt (mehr als fünf Tiere für jeden Genotyp und jedes Geschlecht) gemessen. Daten sind als Mittelwerte ± Standardabweichung dargestellt. Mit dem t-Test konnten keine statistisch signifikanten Unterschiede ermittelt werden.
3.1.4 Analyse der Sox12-Expression während der Embryonalentwicklung der Maus
Um zu verstehen, weshalb die phänotypischen Auswirkungen nach Deletion von Sox12
weniger gravierend sind als nach Deletion von Sox4 oder Sox11, sollte das Expressionsmuster
aller drei SoxC-Gene während der Embryogenese untersucht werden. Mittels quantitativer
RT-PCR konnte Sox12 in der cDNA verschiedener Organe an den Entwicklungsstadien
14.5 dpc, 16.5 dpc und 18.5 dpc nachgewiesen werden (Abb. 18A). Die Mengen an Sox12-
Transkript waren im zentralen Nervensystem, der Niere und dem Herzen am höchsten.
Ansonsten waren die Unterschiede in der Sox12-Expression zwischen den einzelnen Organen
nicht gravierend. Dies zeigt, dass Sox12 in vielen Geweben und in gleichförmigen Mengen im
sich entwickelnden Maus-Embryo exprimiert vorliegt. Wie für Sox12 konnte auch für Sox4
eine Expression in vielen verschieden Organen detektiert werden (Abb. 18C). Zudem
enthielten Organe mit höheren Sox12-Transkript-Mengen gewöhnlich auch mehr Sox4. Im
Gegensatz zu Sox12 unterschied sich die Expression von Sox4 in den einzelnen Organen
jedoch deutlicher (vergleiche Abb. 18C mit Abb. 18A). Das dritte SoxC-Protein Sox11
Ergebnisse
35
dagegen kam an 14.5 dpc und 16.5 dpc vor allem im zentralen Nervensystem vor, während es
in den meisten anderen Organen niedrig exprimiert vorlag (Abb. 18B). An 18.5 dpc war auch
die Expression im zentralen Nervensystem signifikant gesunken. Dies stimmt gut mit früheren
Berichten über eine starke allgemeine Abnahme der Sox11-Expression in Embryonen ab
14.5 dpc überein (Hargrave et al., 1997; Kuhlbrodt et al., 1998a).
Abb. 18: RT-PCR zur Analyse der SoxC-Genexpression in Wildtyp-Embryonen (A-C) Die Expression von Sox12 (A), Sox11 (B) und Sox4 (C) wurde durch quantitative RT-PCR mit cDNA aus verschiedenen Geweben von Wildtyp-Embryonen an den Entwicklungsstadien 14.5 dpc, 16.5 dpc und 18.5 dpc bestimmt. Die Mengen an PCR-Produkten wurden auf die ß-Aktin-Mengen normiert. RM: Rückenmark; M-D: Magen-Darmtrakt. In Zusammenarbeit mit E. Sock.
Um herauszufinden, ob der Verlust von Sox12 möglicherweise durch eine erhöhte Expression
der anderen beiden SoxC-Gene kompensiert werden kann, sollte die Expression von Sox4 und
Sox11 auch in Sox12-defizienten Embryonen untersucht werden.
Auf Grund von in situ Hybridisierungen auf Schnitten von Wildtyp- und Sox12-defizienten
Mäusen an 12.5 dpc konnten keine beträchtlichen Unterschiede in der Expressionsstärke oder
dem -muster von Sox4 und Sox11 zwischen Mutante und Wildtyp festgestellt werden
Ergebnisse
36
(Abb. 19A). Jedoch war an 14.5 dpc und 16.5 dpc eine mäßige, meist transiente Erhöhung der
Expression von Sox4, Sox11 oder beider Gene in bestimmten Organen Sox12-defizienter
Embryonen mittels quantitativer RT-PCR nachweisbar (Abb. 19B, C). Diese ausgleichende
Erhöhung der Sox4- und/oder Sox11-Expression könnte den Verlust von Sox12 kompensieren
und zum Fehlen eines Phänotyps in Sox12-defizienten Embryonen beitragen.
Abb. 19: In situ Hybridisierung und RT-PCR zur Analyse der Sox11- und Sox4-Expression in Sox12-defizienten Embryonen (A) In situ Hybridisierung mit DIG-markierten cRNA-Sonden gegen Sox11 und Sox4 auf transversalen Gefrierschnitten von Wildtyp- (+/+) und Sox12-defizienten (-/-) Embryonen am Embryonalstadium 12.5 dpc. (B, C) Quantitative RT-PCR zur Bestimmung der Expression von Sox11 (B) und Sox4 (C) in ausgewählten Geweben Sox12-defizienter Embryonen an den Entwicklungsstadien 14.5 dpc und 16.5 dpc. Die Mengen an PCR-Produkten wurden auf die Expressionsmengen von ß-Aktin normiert und mit der entsprechenden Expression im Wildtyp verglichen. Erhöhte Transkriptmengen in den Sox12-defizienten Embryonen sind in Prozent angegeben. RM: Rückenmark.
Da das Auflösungsvermögen der quantitativen RT-PCR begrenzt ist, wurde in einem weiteren
Schritt die embryonale Sox12-Expression mittels in situ Hybridisierung analysiert. Auch in
diesem Fall wurden die verwandten Gene Sox4 und Sox11 in die Studie mit einbezogen. An
11.5 dpc und 12.5 dpc zeigten alle drei SoxC-Gene eine breite Expression im sich
entwickelnden Embryo (Abb. 20). Als gemeinsame Expressionsorte aller drei SoxC-Gene
wurden das zentrale Nervensystem, das kraniofaziale Mesenchym, das Kiemenbogen-
mesenchym, das Skelettmesenchym der Wirbelsäule, die Dorsalwurzel-Ganglien, der Darm
und das Mesenchym der Genitalhöcker nachgewiesen. Sowohl für Sox4 als auch für Sox11
war das in situ Signal im zentralen Nervensystem am höchsten.
Ergebnisse
37
Abb. 20: In situ Hybridisierung zur Bestimmung der frühen embryonalen Sox12-Expression (A-I) In situ Hybridisierung mit DIG-markierten cRNA-Sonden gegen Sox12 (A, D, G), Sox11 (B, E, H) und Sox4 (C, F, I) auf sagittalen Gefrierschnitten von Wildtyp-Embryonen an den Entwicklungsstadien 11.5 dpc (A-C) und 12.5 dpc (D-I) . Die Schnitte in A-C und G-I zeigen die Mitte der Embryonen, während die Embryonen in D-F mehr lateral durchschnitten wurden. bm: Kiemenbogenmesenchym; fb: Vorderhirn; fm: kraniofaziales Mesenchym; hb: Rhombencephalon; drg: dorsale Wurzelganglien; gt: Genitalhöcker; sc: Rückenmark; vc: Skelettmesenchym der Wirbelsäule. In Zusammenarbeit mit M. Potzner.
Sox11 zeigte außerdem eine starke Färbung in den Dorsalwurzel-Ganglien. Im Gegensatz
dazu ließ sich für Sox12 eine eher gleichmäßige Färbung der Gewebe feststellen. An 14.5 dpc
war die SoxC-Genexpression auf weniger Gewebe beschränkt als an früheren
Entwicklungsstadien. Trotzdem ließ sich beim Vergleich der Expressionsmuster immer noch
eine auffallende Ähnlichkeit feststellen (Abb. 21). Transversale Schnitte des Rumpfes zeigten
das Rückenmark, die dorsalen Wurzelganglien und sympathischen Ganglien, die Lunge, den
Darm, die Niere und Teile des sich bildenden Skeletts als wichtige Expressionsorte aller drei
SoxC-Gene (Abb. 21A-F). In der Lunge wurde eine Expression im Mesenchym und im
Epithel nachgewiesen. Dabei war für alle drei SoxC-Gene ein starkes in situ Signal im
Bronchialepithel zu beobachten (Abb. 21G-I). In der Niere ließ sich eine Expression in den
Ureterknospen und dem kondensierenden metanephrogenen Mesenchym detektieren
(Abb. 21G-I). Trotz dieser generellen Ähnlichkeit gab es auch deutliche Unterschiede im
jeweiligen Expressionsmuster. So war zum Beispiel für Sox4 eine starke Expression im
Thymus, den Endokardkissen des Atrioventrikularkanals des Herzens oder den sich bildenden
Ergebnisse
38
Haarfollikeln charakteristisch. Zudem konnte für die Expression von Sox4 im Rückenmark
ein abnehmender Gradient von dorsal nach ventral festgestellt werden (Abb. 21C, F und Daten
nicht gezeigt), der auch an 18.5 dpc immer noch vorhanden war (Abb. 22A-C). Für Sox4 und
Sox11 ließ sich in der Ventrikulärzone des Rückenmarks eine deutlich geringere Expression
detektieren als außerhalb dieser Region, während die Expression von Sox12 sowohl in der
Ventrikulärzone als auch im umgebenden Gewebe des Rückenmarks sehr gleichmäßig
erschien (Abb. 21G-I). Im Gegensatz zu Sox4 und Sox11 konnte für Sox12 auch kein
deutliches in situ Signal im Darmepithel nachgewiesen werden.
Abb. 21: In situ Hybridisierung zur Bestimmung der Sox12-Expression an 14.5 dpc im Rumpf (A-I) In situ Hybridisierung mit DIG-markierten cRNA-Sonden gegen Sox12 (A, D, G), Sox11 (B, E, H) und Sox4 (C, F, I) auf transversalen Gefrierschnitten von Wildtyp-Embryonen am Entwicklungsstadium 14.5 dpc. Verwendet wurden Schnitte vom Rumpf auf Höhe des Herzen (A-C) und auf Höhe der Niere (D-F). Die Pfeilspitzen in C und F markieren Haarfollikel mit starker Sox4-Expression. Die Vergrößerungen aus den Übersichten (A-F) zeigen das Rückenmark (RM), die Lunge, die Niere und den Darm (G-I) . In Zusammenarbeit mit M. Potzner.
Ergebnisse
39
Weitere Unterschiede wurden erst an späteren Entwicklungsstadien offensichtlich. An
14.5 dpc waren alle drei SoxC-Gene in den dorsalen Wurzelganglien und den sympathischen
Ganglien stark exprimiert. An 18.5 dpc dagegen hatte die Expression von Sox11 deutlich
abgenommen und war in den sympathischen Ganglien nahezu verschwunden (Abb. 22D-F).
Abb. 22: In situ Hybridisierung zur Bestimmung der Sox12-Expression an 18.5 dpc im Rumpf (A-F) In situ Hybridisierung mit DIG-markierten cRNA-Sonden gegen Sox12 (A, D), Sox11 (B, E) und Sox4 (C, F) auf transversalen Gefrierschnitten von Wildtyp-Embryonen am Entwicklungsstadium 18.5 dpc. Gezeigt sind das Rückenmark (A-C), die dorsalen Wurzelganglien (DRG) und die symphatischen Ganglien (SG) (D-F). In Zusammenarbeit mit M. Potzner.
Untersuchungen des Kopfes und des Gehirns ließen ebenfalls Ähnlichkeiten und Unterschiede
in den Expressionmustern der drei SoxC-Gene erkennen. So war eine starke Expression aller
drei SoxC-Gene im sich entwickelnden Kortex cerebri (zerebraler Kortex, Großhirnrinde),
Thalamus, Hippokampus und Kortex cerebelli (Kleinhirnrinde) nachzuweisen (Abb. 23A-F
und Daten nicht gezeigt). Im Gegensatz zu Sox11 waren Sox12 und Sox4 an 14.5 dpc in der
dorsalen Kortikalplatte der sich entwickelnden Großhirnrinde angereichert (Abb. 23G-I). An
18.5 konnte für Sox11 und Sox4 eine starke Expression in der Subventrikulärzone des
cerebralen Kortex nachgewiesen werden (Abb. 23K, L), die sich für Sox12 nicht finden ließ
(Abb. 23J). Alle drei SoxC-Gene wurden auch in verschiedenen Zelltypen des sich
entwickelnden Auges exprimiert. Dabei war an 14.5 dpc eine besonders starke Expression
von Sox12 in der Augenlinse auffallend (Abb. 23S-X). Im Riechepithel wiederum konnte
sowohl an 14.5 dpc als auch an 18.5 dpc überwiegend Sox11-Signal detektiert werden
(Abb. 23M-R). Zudem wurde nur Sox11 in den Verschmelzungsbereichen der zwei
Gaumenplatten an 14.5 dpc in signifikanten Mengen exprimiert (Abb. 23N), was die bei
Sox11-Knockout-Tieren auftretende Lippen-, Gaumen-, Kieferspalte erklärt. Die in situ
Ergebnisse
40
Ergebnissen zeigten somit, dass alle drei SoxC-Gene ein sehr ähnliches und überlappendes
Expressionsmuster während der Embryogenese der Maus besitzen.
Abb. 23: In situ Hybridisierung zur Bestimmung der spät-embryonalen Sox12-Expression im Kopf (A-F) In situ Hybridisierung mit DIG-markierten cRNA-Sonden gegen Sox12 (A, D, G, J, M, P, S, V), Sox11 (B, E, H, K, N, Q, T, W) und Sox4 (C, F, I, L, O, R, U, X) auf transversalen Gefrierschnitten von Wildtyp-Embryonen an den Entwicklungsstadien 14.5 dpc (A-C, G-H, M-O, S-U) und 18.5 dpc (D-F, J-L, P-R, V-X). Dargestellt sind eine telencephale Hemisphäre in niedriger Auflösung (A-F) sowie der sich entwickelnde Kortex in Vergrößerung (G-L) , das Riechepithel (M-R) und das Auge (S-X). Die fusionierenden Gaumenplatten an 14.5 dpc sind mit Pfeilspitzen markiert (M-O) . In Zusammenarbeit mit M. Potzner.
3.1.5 Die DNA-Bindungseigenschaften von Sox12
Im Folgenden wurde die DNA-Bindungsaktivität von Sox12 untersucht und mit der von Sox4
und Sox11 verglichen. Zu diesem Zweck wurden Gelshift-Experimente (EMSAs)
durchgeführt. Bisher sind nur sehr wenige Zielgene für SoxC-Proteine bekannt. In früheren
Arbeiten konnten sowohl die eigene Arbeitsgruppe als auch andere Gruppen zeigen, dass
Sox4 und Sox11 an ein Sox-Konsensusmotiv des CD3ε-Enhancers binden und dadurch
Reportergen-Aktivierung vermitteln können. Die Sequenz dieses Motivs ist im sogenannten
SX-Oligonukleotid vorhanden (Kuhlbrodt et al., 1998a; Kuhlbrodt et al., 1998b; van de
Wetering et al., 1993). Zusätzlich zu dieser Bindestelle wurde die Bindestelle S23 des Tubb3-
Gens als ein bona fide Response-Element eines neuralen SoxC-Zielgens in Gelshift-
Ergebnisse
41
Experimenten eingesetzt (Bergsland et al., 2006). Mit Extrakten aus HEK293-Zellen, die
vorher mit einem Expressionsplasmid für Sox12 transfiziert wurden, erhielt man sowohl mit
dem SX- als auch mit dem S23-Oligonukleotid einen Protein-DNA-Komplex (Abb. 24).
Durch den Einsatz von Antikörpern, die gegen Sox12 gerichtet waren, konnte die Mobilität
dieses Komplexes reduziert werden. Dies wurde als Beweis für die Anwesenheit von Sox12
in diesem Komplex gewertet. Extrakte aus nicht transfizierten HEK293-Zellen dienten als
Kontrolle und zeigten keine Komplexbildung. Nach Mutation des Sox-Konsensusmotivs im
S23-Oligonukleotid (S23M in Abb. 24) formte sich ebenfalls kein Komplex. Da frühere
Bindungsstudien mit Sox4 und Sox11 zu ähnlichen Ergebnissen geführt hatten (Bergsland et
al., 2006; Kuhlbrodt et al., 1998a), erkennen folglich alle drei SoxC-Proteine die gleichen
Bindestellen.
Abb. 24: Die DNA-Bindungsaktivität von Sox12 In Gelshift-Experimenten wurden die radioaktiv markierte SX-Sequenz und Oligonukleotide mit der Bindestelle S23 des Tubb3-Promotors in der Wildtyp- (S23) oder einer mutierten Version (S23M) mit Extrakten aus CMV- (C) oder CMV-Sox12-transfizierten HEK293-Zellen inkubiert. Komplexe, die nach Inkubation mit einem Sox12-spezifischen Antikörper (α-Sox12) erhalten wurden, sind mit einem Stern gekennzeichnet. -: kein Extrakt zugegeben. Mit freundlicher Genehmigung von E. Sock.
Weiterhin sind die beiden Proteine Sox4 und Sox11 in der Lage, mit dem FXO-
Oligonukleotid einen Komplex zu bilden (Kuhlbrodt et al., 1998a). Dies konnte in der
vorliegenden Arbeit auch für Sox12 bewiesen werden (Abb. 25).
Ergebnisse
42
Das FXO-Oligonukleotid enthält neben dem Sox-Erkennungselement des FGF4-Enhancers
(Yuan et al., 1995) auch eine benachbarte Bindestelle für POU-Proteine. In früheren Arbeiten
konnte festgestellt werden, dass sowohl Sox4 als auch Sox11 ternäre Komplexe mit Klasse III
POU-Proteinen (wie zum Beispiel Oct6 oder Brn2) an diesem Oligonukleotid bilden. Diese
gemeinsame Bindung an einem Zielgen-Enhancer könnte entscheidend für die synergistische
Aktivierung der Genexpression durch SoxC- und POU-Proteine im sich entwickelnden
Neuralrohr sein (Kuhlbrodt et al., 1998a; Tanaka et al., 2004; Wiebe et al., 2003).
Daher wurde auch die Sox12-Bindung an das FXO-Oligonukleotid in Anwesenheit von Oct6
oder Brn2 untersucht (Abb. 25).
Abb. 25: Analyse der Fähigkeit von Sox12 zur Bildung ternärer Komplexe am FXO-Oligonukleotid Ein radioaktiv markiertes FXO-Oligonukleotid mit benachbarten Bindestellen für Sox- und POU-Proteine wurde mit Extrakten aus CMV- (C), CMV-Sox12-, CMV-Brn2 oder CMV-Oct6-transfizierten HEK293-Zellen inkubiert. Bei gleichzeitiger Anwesenheit von Sox12 und einem POU-Protein zeigte sich ein zusätzlicher Komplex. Das Vorkommen beider Proteine in diesem ternären Komplex (TC) wurde durch Zugabe von Antikörpern gegen Sox12 (α-Sox12), Brn2 (α-Brn2) und Oct6 (α-Oct6) bestätigt. Diese Komplexe sind mit Sternen kenntlich gemacht. -: kein Extrakt zugegeben. Mit freundlicher Genehmigung von E. Sock.
Inkubierte man Sox12 oder das POU-Protein alleine mit dem Oligonukleotid, bildeten beide
Komplexe mit charakteristischer Mobilität. In Anwesenheit beider Proteine, Sox12 und Oct6
oder Brn2, wurde zusätzlich ein Komplex mit geringerer Mobilität sichtbar. Die Mobilität
dieses neuen Komplexes ließ sich mit Antikörpern gegen Sox12 oder gegen das
Ergebnisse
43
entsprechende POU-Protein weiter reduzieren. Dadurch bestätigte sich seine Identität als ein
ternärer Komplex, der sowohl DNA als auch Sox- und POU-Protein enthielt (Abb. 25). Dies
führte zu der Schlußfolgerung, dass Sox12 ebenso die Fähigkeit besitzt, bei benachbarten
Bindestellen an DNA einen ternären Komplex mit Klasse III POU-Proteinen zu bilden, wie
Sox11 und Sox4.
3.1.6 Die Fähigkeit von Sox12 zur Transaktivierung und dessen Einfluß auf die
Transaktivierungskapazität anderer SoxC- und POU-Proteine
Ob sich diese ähnlichen DNA-Bindungseigenschaften auch in vergleichbaren Transakti-
vierungskapazitäten niederschlagen, wurde mittels Luciferase-Aktivitätstests in transient
transfizierten HEK293-Zellen und Neuro2a-Zellen analysiert. Das Luciferase-Reportergen
war unter der Kontrolle eines artifiziellen Promotors, der aus einem Minimalpromotor mit
multimerisierten SX- oder FXO-Bindestellen bestand (Kuhlbrodt et al., 1998b).
Zunächst wurden im Western-Blot die Mengen an endogen vorhandenen SoxC-Proteinen in
Neuro2a- und HEK293-Zellen bestimmt. Dabei stellte sich heraus, dass in Neuro2a-Zellen
nur Sox4 endogen in signifikantem Maße vorkam. In HEK293-Zellen dagegen ließ sich
keines der SoxC-Proteine nachweisen (Abb. 26). Somit kann zumindest für HEK293-Zellen
eine Beeinflussung der Transfektionsversuche durch die endogene Expression eines der
SoxC-Gene ausgeschlossen werden.
Abb. 26: Western-Blot zur Bestimmung der endogenen SoxC- und POU-Proteinmengen in Zellkultur Endogene Mengen an SoxC- und POU-Proteinen in Neuro2a- und HEK293-Zellen wurden mittels Western-Blot bestimmt. Extrakte von 293-Zellen, die mit den entsprechenden Plasmiden transfiziert wurden, dienten als Positivkontrollen (C). Die Qualität der Extrakte wurde mit einem Antikörper gegen acetyliertes α-Tubulin (Tub) überprüft. Mit freundlicher Genehmigung von E. Sock.
Ergebnisse
44
Bei der Transfektion des 3xSX-luc Reporters mit steigenden Mengen von Sox4 erfolgte eine
Dosis-abhängige Aktivierung des Reportergens. Dabei stiegen die Induktionsraten in
HEK293-Zellen vom 2-fachen auf das 17-fache und in Neuro2a-Zellen vom 5-fachen auf das
58-fache an (Abb. 27A, B). Für Sox11 ließen sich sogar noch höhere Induktionsraten
ermitteln, die in HEK293-Zellen vom 4-fachen bis zum 49-fachen und in Neuro2a-Zellen
vom 14-fachen bis zum 229-fachen reichten. Diese Ergebnisse bestätigten die Erkenntnisse
aus früheren Arbeiten, dass Sox11 ein stärkerer Transkriptionsaktivator ist als Sox4
(Kuhlbrodt et al., 1998a). Bei Ko-Transfektion von Sox12 anstelle von Sox4 oder Sox11
konnte der 3xSX-luc Reporter in HEK293-Zellen zwischen 2- und 7-fach und in Neuro2a-
Zellen zwischen 8- und 20-fach aktiviert werden (Abb. 27A, B). Somit verhielt sich Sox12 mit
diesem Reporter als schwächster Transaktivator der drei SoxC-Proteine.
Abb. 27: Die Kapazität von Sox12 zur Transaktivierung des 3xSX-luc Reportergens (A, B) Transiente Transfektionen von HEK293- (A) und Neuro2a-Zellen (B) mit dem 3xSX-luc (A, B) Reporterplasmid (375 ng) in Anwesenheit steigender Mengen von Sox12, Sox11 und Sox4 (15 ng, 50 ng, 125 ng, 375 ng, 750 ng). Die Luciferase-Aktivitäten wurden in Duplikaten aus zwei unabhängigen Experimenten ermittelt und die mittlere Induktionsrate ± Standardabweichung ist dargestellt. Mit freundlicher Genehmigung von E. Sock.
Bei Verwendung des 3xFXO-luc Reporters war ein Unterschied in den Kinetiken und den
absoluten Werten der Transaktivierung feststellbar (Abb. 28). Mit diesem Reporter stiegen
zunächst die Aktivierungsraten an und fielen dann bei der höchsten Konzentration an
transfiziertem Sox-Expressionsplasmid wieder ab. Diese Kinetiken ließen sich für alle drei
SoxC-Proteine in ähnlicher Weise beobachten. Auch mit diesem Reporter zeigten sich für die
drei verschiedenen Sox-Proteine deutliche Unterschiede in der Reportergen-Aktivierung. In
HEK293-Zellen konnte Sox12 den 3xFXO-luc Reporter nur bis zu 9-fach aktivieren, während
sich für Sox4 eine 12-fache und für Sox11 eine 37-fache Induktion nachweisen ließ
(Abb. 28A). In Neuro2a-Zellen wurde eine bis zu 41-fache Aktivierung für Sox12, eine 158-
fache für Sox11 und eine 30-fache für Sox4 ermittelt (Abb. 28B). Dies bestätigte, dass Sox12
und Sox4 im Vergleich zu Sox11 schwächere Aktivatoren des Reporters sind. Die
Ergebnisse
45
Induktionsfähigkeit von Sox4 und Sox12 waren jedoch miteinander vergleichbar, wobei Sox4
in HEK293-Zellen den Reporter etwas höher aktivieren konnte als Sox12. In den Neuro2a-
Zellen war dies der umgekehrte Fall.
Abb. 28: Die Kapazität von Sox12 zur Transaktivierung des 3xFXO-luc Reportergens (A, B) Transiente Transfektionen von HEK293- (A) und Neuro2a-Zellen (B) mit dem 3xFXO-luc (A, B) Reporterplasmid (375 ng) in Anwesenheit steigender Mengen von Sox12, Sox11 und Sox4 (15 ng, 50 ng, 125 ng, 375 ng, 750 ng). Die Luciferase-Aktivitäten wurden in Duplikaten aus zwei unabhängigen Experimenten ermittelt und die mittlere Induktionsrate ± Standardabweichung ist dargestellt. Mit freundlicher Genehmigung von E. Sock.
Im nachfolgenden Experiment sollte nun untersucht werden, ob Sox11 bei der Aktivierung
der Expression des 3xSX-luc sowie des 3xFXO-luc Reporters durch die Anwesenheit von
Sox12 beeinflusst wird (Abb. 29). Zu diesem Zweck wurden Reporterplasmide mit konstanten
Gesamtmengen an Expressionsplasmiden in unterschiedlichen Verhältnissen von Sox11 zu
Sox12 transfiziert. Sowohl in Neuro2a- als auch in HEK293-Zellen spiegelte die Reportergen-
Aktivität das Verhältnis transfizierter Expressionsplasmide wider. Die Induktionsraten stiegen
mit zunehmendem Anteil an Sox11 stetig an und erreichten nach alleiniger Transfektion von
Sox11 ihr Maximum (Abb. 29A, B und Daten nicht gezeigt).
Abb. 29: Einfluß von Sox12 auf die Transaktivierungskapazität von Sox11 (A, B) Transiente Transfektionen von Neuro2a-Zellen mit dem 3xSX-luc (A) oder dem 3xFXO-luc (B) Reporterplasmid. 375 ng des jeweiligen Reporterplasmids wurden mit konstanten Gesamtmengen an Expressionsplasmiden (375 ng), aber verschiedenen Verhältnissen von Sox12 zu Sox11 (10:0, 8:2, 5:5, 2:8, 0:10) ko-transfiziert. Die Luciferase-Aktivitäten wurden in Duplikaten aus drei unabhängigen Experimenten ermittelt und die mittlere Induktionsrate ± Standardabweichung ist dargestellt. Mit freundlicher Genehmigung von E. Sock.
Ergebnisse
46
Aus diesen Ergebnissen kann geschlossen werden, dass Sox12 keinen wirksamen Einfluß auf
die Aktivität von Sox11 hat. Bei einer reprimierenden Funktion von Sox12 auf die
Induktionsfähigkeit von Sox11 müsste irgendwann ein Verhältnis von Sox12 zu Sox11
entstehen, an dem Repression und Aktivierung sich die Waage halten. Das an dieser Stelle des
Kurvenverlaufs zu erwartende Plateau konnte mit den hier erhaltenen Ergebnissen nicht
nachgewiesen werden.
In einem nächsten Schritt sollte nun die Fähigkeit von Sox12 zur synergistischen Aktivierung
der Reportergen-Expression analysiert und mit der Aktivierung der beiden anderen SoxC-
Proteine verglichen werden. Für diese Studien wurde der 3xFXO-luc Reporter mit
verschiedenen Kombinationen von SoxC- und Klasse III POU-Proteinen in Neuro2a-Zellen
ko-transfiziert (Abb. 30). Keines der hier verwendeten Klasse III POU-Proteine war endogen
in dieser Zelllinie exprimiert, was im Western-Blot mit Antikörpern gegen das jeweilige
POU-Protein gezeigt werden konnte (Abb. 26). Wie bereits veröffentlicht (Kuhlbrodt et al.,
1998a), wurde der 3xFXO-luc Reporter in Kombination von POU-Protein und Sox11 viel
stärker aktiviert als nach Einsatz des jeweiligen Proteins alleine. Die Kombination von Sox11
und Brn2 beispielsweise führte zu einer 1400-fachen Aktivierung, während nach Transfektion
von Sox11 oder Brn2 alleine die Expression des Reportergens nur 89-fach bzw. 18-fach
aktiviert wurde (Abb. 30A). Mit Sox11 und dem POU-Protein Oct6 in Kombination wurde
eine 915-fache Induktionsrate ermittelt (Abb. 30B). Damit waren die Aktivierungsraten für
Sox11 und Brn2 in Kombination 13mal und die für Sox11 und Oct6 in Kombination 8,5mal
höher als die Summe der Raten, die für jeden Faktor alleine erhalten wurden.
Abb. 30: Analyse der Fähigkeit von Sox12 zur synergistischen Aktivierung des 3xFXO-luc Reportergens (A, B) Transiente Ko-Transfektionen von Neuro2a-Zellen mit dem 3x-FXO-luc Reporterplasmid (375 ng) und verschiedenen Kombinationen der Expressionsplasmide für Sox12, Sox11, Sox4, Brn2, Oct6 oder dem leeren Vektor (jeweils 400 ng). Die Luciferase-Aktivitäten wurden in Duplikaten aus drei unabhängigen Experimenten ermittelt und die mittlere Induktionsrate ± Standardabweichung ist dargestellt. Mit freundlicher Genehmigung von E. Sock.
Ergebnisse
47
Synergistische Effekte ließen sich allerdings auch beobachten, wenn POU-Proteine mit Sox4
oder Sox12 ko-transfiziert wurden (Abb. 30). In Kombination mit Sox4 waren die
synergistischen Aktivierungsraten 7,7 bis 8,8mal höher als die Summe der Aktivierungsraten
für jeden Transkriptionsfaktor alleine. Im Falle von Sox12 wurden synergistische
Aktivierungsraten gemessen, die 3,9 bis 4,3mal höher lagen als die Summe der Einzelwerte.
Ähnliche Ergebnisse erhielt man, wenn anstelle von Neuro2a-Zellen HEK293-Zellen
eingesetzt wurden (Daten nicht gezeigt). Damit konnte gezeigt werden, dass alle drei SoxC-
Proteine die Fähigkeit besitzen, synergistisch mit Klasse III POU-Proteinen zu wirken,
wenngleich Sox12 etwas weniger effizient zu sein scheint als Sox4 und Sox11.
Zum Schluss wurde die Fähigkeit der drei SoxC-Proteine zur Aktivierung des neuralen
Tubb3-Zielgen-Promotors (Bergsland et al., 2006) miteinander verglichen. Im Gegensatz zu
den artifiziellen Promotoren wurde der Tubb3-Promotor nur in Neuro2a-Zellen, nicht aber in
HEK293-Zellen aktiviert (Abb. 31 und Daten nicht gezeigt). Auch hier war Sox11 wiederum
der stärkste Aktivator, der die Tubb3-Promotoraktivität bis zu 20-fach induzierte. Sox12
aktivierte den Promotor bis zu 14-fach, während mit Sox4 nur eine 6-fache Induktion erreicht
wurde.
Abb. 31: Die Fähigkeit der SoxC-Proteine zur Aktivierung des neuralen Tubb3-Zielgen-Promotors Transiente Transfektionen von Neuro2a-Zellen mit dem Tubb3-Luciferase-Reporterplasmid (375 ng) in Anwesenheit steigender Mengen von Sox12, Sox11 und Sox4 (15 ng, 50 ng, 125 ng, 375 ng, 750 ng). Die Luciferase-Aktivitäten wurden in Duplikaten aus drei unabhängigen Experimenten ermittelt und die mittlere Induktionsrate ± Standardabweichung ist dargestellt. Mit freundlicher Genehmigung von E. Sock.
3.1.7 Die in vivo Aktivität von Sox12 während der frühen Entwicklung des
Rückenmarks im Huhn
Zur Klärung, ob sich die erhaltenen Zellkultur-Ergebnisse ebenso auf die in vivo Situation
übertragen lassen, wurden Elektroporations-Experimente des Neuralrohrs von Huhn-
Embryonen durchgeführt. In früheren Arbeiten konnte durch derartige Versuche gezeigt
Ergebnisse
48
werden, dass die Überexpression von Sox11 und Sox4 zu einer frühzeitigen und erhöhten
Expression von Tubb3 führt (Bergsland et al., 2006).
Tatsächlich ließ sich 24 Stunden nach der Elektroporation von Sox11 oder Sox4 in das
Neuralrohr des Huhn-Embryos (Abb. 32E, F) eine vorzeitige Expression von Tubb3
(Abb. 32H, I) auf der elektroporierten Seite nachweisen. Die elektroporierte Hälfte des
embryonalen Neuralrohrs konnte durch zusätzlich eingebrachtes GFP kenntlich gemacht
werden (Abb. 32B, C).
Abb. 32: Die Aktivität von Sox12 während der frühen Entwicklung des Rückenmarks im Huhn (A-L) Immunhistochemie mit Antikörpern gegen Sox12 (D), Sox11 (E), Sox4 (F) und Tubb3 (Tuj1) (G-L) auf transversalen Gefrierschnitten von Huhn-Embryonen, die mit Expressionsplasmiden für Sox12 (A, D, G, J), für Sox11 (B, E, H, K) oder Sox4 (C, F, I, L) elektroporiert wurden, 24 (24h) (A-I) oder 48 Stunden (48h) (J-L) nach der Elektroporation. Die elektroporierte Seite zeigt nach rechts und ist durch die GFP-Autofluoreszenz (A-C) gekennzeichnet.
Selbst 48 Stunden nach dem Elektroporationsereignis war die Tubb3-Expression auf der
elektroporierten Seite immer noch erhöht, obgleich die endogene Tubb3-Expression begonnen
hatte (Abb. 32K, L). Außerdem war die Tubb3-Expression im mit Sox11 elektroporierten
Ergebnisse
49
Neuralrohr höher als im mit Sox4 elektroporierten. Dies zeigt, dass auch in vivo Sox11 ein
stärkerer Transaktivator zu sein scheint als Sox4. Wurde Sox12 in das Neuralrohr des Huhn-
Embryos eingebracht (Abb. 32D), war ebenfalls eine erhöhte Tubb3-Expression auf der
elektroporierten Seite (Abb. 32A) nachzuweisen. Dies galt sowohl 24 als auch 48 Stunden
nach der Elektroporation (Abb. 32G, J). Die Induktion von Tubb3 durch Sox12 war
vergleichbar mit der Induktion durch elektroporiertes Sox4. Im Vergleich zu elektroporiertem
Sox11 waren die Tubb3-Mengen jedoch immer niedriger. Diese Ergebnisse bestätigen in vivo,
dass alle drei SoxC-Proteine Transaktivierungskapazität besitzen, sich aber trotzdem in der
Wirksamkeit unterscheiden, mit der sie bestimmte Zielgene aktivieren.
3.2 FUNKTIONELLE ANALYSE DER SOX-PROTEINE DER GRUPPE C IN
ÜBEREXPRESSIONSSTUDIEN
In der bisher beschriebenen Analyse des Expressionsmusters von Sox4 und Sox11 sowie in
früheren Arbeiten wurde eine starke Expression dieser Faktoren im sich entwickelnden
zentralen Nervensystem gezeigt (1-3). Mögliche neurale Defekte ließen sich dennoch weder
in Sox4-defizienten (Cheung et al., 2000) noch in Sox11-defizienten Mäusen (Sock et al.,
2004) nachweisen. Auf Grund der hohen Homologie auf Aminosäureebene sowie der
weitgehenden Ko-Expression der beiden Faktoren ist zu vermuten, dass sie ähnliche
Aufgaben erfüllen. In Geweben mit Ko-Expression kann deshalb ein Faktor den Verlust des
jeweilig anderen Sox-Proteins kompensieren. Für die Untersuchung der Funktion von Sox4
und Sox11 während der Neuralentwicklung ist somit eine gleichzeitige Deletion beider Gene
im Nervensystem erforderlich. Die Klärung des eventuellen Beitrags von Sox12 zur
gegenseitigen funktionellen Kompensation der Gruppe C-Sox-Proteine erscheint ebenfalls
notwendig, da sich auch für Sox12 eine Expression im sich entwickelnden Nervensystem
feststellen lässt.
Als Vorarbeiten zu der späteren Analyse der Sox4/ Sox11 doppelt- bzw. Sox4/ Sox11/ Sox12
dreifach-defizienten Mäuse sollte im zweiten Teil dieser Arbeit die Rolle der Sox-Proteine der
Gruppe C in Überexpressionsstudien analysiert werden. Hierzu wurden transgene Mäuse
generiert, die den Transkriptionsfaktor Sox4 unter dem humanen GFAP-Promoter in Radial-
Glia-Zellen und Astrozyten exprimieren.
Ergebnisse
50
3.2.1 Herstellung GFAP-Sox4-transgener Mäuse
Zur Erzeugung GFAP-Sox4-transgener Mäuse wurde zunächst ein 2,2 kb langes Promotor-
Fragment des humanen GFAP-Gens (von Position -2163 bis +47) (Brenner et al., 1994; Nolte
et al., 2001) zwischen die Restriktions-Schnittstellen NheI und EcoRI des pIRES2-EGFP-
Vektors (Clontech, Heidelberg, Deutschland) eingefügt (Abb. 33). Bereits in früheren
Arbeiten konnte für dieses Promotor-Fragment gezeigt werden, dass es eine Expression des
Transgens in Radial-Glia-Zellen und Astrozyten ermöglicht (Brenner et al., 1994; Nolte et al.,
2001). Im Anschluss wurde ein 2 kb langes Fragment des Sox4-Gens (Rattus norvegicus;
Genbank-Ref. XM_344594) mit dem gesamten offenen Leserahmen von Sox4 über die
EcoRI-Restriktions-Schnittstellen zwischen den GFAP-Promotor und die IRES-EGFP-PolyA-
Kassette eingebracht (Abb. 33). Auf Grund der dem Sox4-Transgen folgenden IRES-EGFP-
Kassette war es möglich, die Expression des Transgens über die Ko-Expression mit EGFP zu
detektieren.
Abb. 33: Schematische Darstellung des GFAP-Sox4-Transgen-Konstrukts Das GFAP-Sox4-Transgen besteht aus dem human GFAP- (hGFAP) Promotor (Positionen -2163 bis +47), dem offenen Leserahmen von Sox4 aus der Ratte (rSox4) und einer IRES-EGFP-Kassette. Ebenfalls im Konstrukt enthalten sind die Restriktions-Schnittstellen für NheI (N), EcoRI (E) und AscI (A). pA: Poly-A-Signal. Mit freundlicher Genehmigung von E. Sock.
Zur Herstellung der transgenen Tiere wurde das GFAP-Sox4-Konstrukt über die Restriktions-
Schnittstellen NheI und AscI aus dem Vektor isoliert und dieses in Zusammenarbeit mit
M. Bösl (MPI für Neurobiologie, Martinsried) in den männlichen Pronukleus befruchteter
FVB/N-Oocyten mikroinjiziert.
Als Resultat konnten drei transgene Weibchen und ein transgenes Männchen (Founder-Tiere)
erhalten werden. Eine Analyse der Anzahl der in das Genom der Maus integrierten transgenen
Kopien wurde mittels Southern-Blot durchgeführt (Abb. 34). Nach der Spaltung von
genomischer DNA mit dem Restriktionsenzym EcoRI erfolgte eine Hybridisierung mit einer
radioaktiv markierten, 0,6 kb langen Sonde, die den Bereich des Sox4-Gens nach der HMG-
Domäne erkennt. Für das Sox4-Gen konnte hierdurch ein 3,4 kb langes Fragment und für das
Sox4-Transgen ein 2 kb langes Fragment nachgewiesen werden (Abb. 34). Die Bestimmung
der Kopienzahlen des Transgens erfolgte durch die Vermessung der Fragment-Bandenstärken
Ergebnisse
51
im Phospho-Imager. Die Kopienzahlen errechneten sich jeweils aus dem Verhältnis der
Bandenstärke des Sox4-Gens zu der des Sox4-Transgens. In den drei Founder-Weibchen
ließen sich so sieben bis zehn und im Founder-Männchen 22 integrierte Kopien des Transgens
nachweisen (Abb. 34).
Abb. 34: Southern-Blot Analyse zur Bestimmung der Kopienzahl des Transgens Southern-Blot mit genomischer DNA von Wildtyp- (wt) und transgenen Nachkommen der weiblichen Founder-Tiere (#1, #2, #3) nach der Spaltung mit EcoRI. Die Größen der Fragmente (in kb) für das Wildyp-Sox4-Gen und das Sox4-Transgen sind auf der linken Seite des Blots angegeben. Die Kopienzahlen wurden mit einem Phospho-Imager bestimmt und sind unterhalb der Spuren kenntlich gemacht. In Zusammenarbeit mit E. Sock.
Die transgenen Kopien in den Founder-Tieren waren mehrheitlich an einer Integrationsstelle
hintereinander (Konkatamere) eingefügt (Daten nicht gezeigt). Alle vier Founder-Tiere gaben
das Transgen mit einer hohen Rate an die Nachkommen weiter. Im Gegensatz zu den
Founder-Weibchen zeigten jedoch nur wenige der Nachkommen des Founder-Männchens
eine starke Expression des Transgens (Daten nicht gezeigt).
3.2.2 Expression des GFAP-Sox4-Transgens während der embryonalen und
postnatalen Entwicklung der Maus
Zur Analyse der transgenen Mäuse sollte zunächst anhand der EGFP-Autofluoreszenz das
embryonale Expressionsmuster des GFAP-Sox4-Transgens im zentralen Nervensystem
untersucht werden.
An 10.5 dpc konnte auf Gefrierschnitten im Rückenmark der Maus keine EGFP-Expression
durch Autofluoreszenz nachgewiesen werden (Abb. 35A), während an 11.5 dpc in dem am
weitesten ventral gelegenen Teil der Ventrikulärzone EGFP-Autofluoreszenz auftrat
(Abb. 35B). Einen Tag später (12.5 dpc) ließen sich EGFP-Signale auch in der dorsalen Hälfte
der Ventrikulärzone finden (Abb. 35C). In diesem Stadium der Rückenmarksentwicklung war
eine überlappende Expression von EGFP und SoxB1 in der Ventrikulärzone festzustellen.
Dies weist auf eine Expression des GFAP-Sox4-Transgens in pluripotenten proliferierenden
Ergebnisse
52
Vorläuferzellen mit Radial-Glia-Charakter hin (Bylund et al., 2003) (Abb. 35F). Sobald die
Zellen die Ventrikulärzone verlassen, werden sie spezifiziert. An 12.5 dpc entstehen so vor
allem postmitotische neuronale Vorläuferzellen. In diesen Zellen ist die SoxB1-Expression
reprimiert und die Expression von Sox11 beginnt (Bylund et al., 2003; Uwanogho et al.,
1995). In den Sox11-positiven neuronalen Vorläuferzellen, die im transgenen Rückenmark an
12.5 dpc zu finden waren, ließ sich keine EGFP-Expression mehr erkennen (Abb. 35G). Diese
blieben auch während der weiteren Differenzierung zu NeuN-positiven Neuronen EGFP-
negativ (Bylund et al., 2003) (Abb. 35H). Damit konnte gezeigt werden, dass nach der
Spezifizierung von Radial-Glia-Zellen zu neuronalen Vorläuferzellen ein sehr schnelles
Abschalten der Transgen-Expression erfolgt. An 14.5 dpc wurden zusätzlich EGFP-Signale in
Astrozyten der Mantelzone entdeckt (Abb. 35D). Am Entwicklungsstadium 18.5 dpc waren
die meisten EGFP-positiven Zellen Astrozyten (Abb. 35E). Auch während der postnatalen
Entwicklung der transgenen Mäuse wurde EGFP weiter exprimiert (siehe Abb. 42, Abb. 47
und Abb. 48).
Abb. 35: Das embryonale Expressionsmuster des GFAP-Sox4-Transgens (A-H) EGFP-Autofluoreszenz auf transversalen Gefrierschnitten des Rückenmarks GFAP-Sox4-transgener Mäuse an den Entwicklungsstadien 10.5 dpc (A), 11.5 dpc (B), 12.5 dpc (C, F-H), 14.5 dpc (D) und 18.5 dpc (E). Der gekennzeichnete Bereich in C ist in F-H vergrößert dargestellt. (F-H) Immunhistochemie mit Antikörpern gegen SoxB1 (F), Sox11 (G) und NeuN (H) (alle in rot), und EGFP-Autofluoreszenz (in grün) auf transversalen Gefrierschnitten des Rückenmarks GFAP-Sox4-transgener Embryonen am Entwicklungsstadium 12.5 dpc. Die obere Reihe zeigt die Färbungen mit spezifischen Markern, die mittlere Reihe die entsprechenden EGFP-Signale und die untere Reihe die Überlagerungen (merge) der beiden oberen Bilder. Die Balkenlängen entsprechen 100 µm.
Ergebnisse
53
Um die Expression des Sox4-Transgens direkt zu zeigen, wurde RNA aus den Vorderhirnen
und Cerebella von transgenen Nachkommen der drei Founder-Weibchen am Postnatalstadium
P15 isoliert. Mittels quantitativer RT-PCR erfolgte der Vergleich der Transkript-Mengen des
Sox4-Transgens mit denen des Wildtyp-Gens. So konnte sowohl im Vorderhirn als auch im
Cerebellum transgener Tiere eine Expression des Sox4-Transgens nachgewiesen werden.
Zudem ließ sich zwischen den Nachkommen der verschiedenen Founder-Tiere eine
unterschiedlich starke Expression des Transgens feststellen. Im Vergleich der Expression von
Sox4 im Vorderhirn von Wildtyp-Tieren mit der des Sox4-Transgens in den Mutanten war
eine zwei- bis dreizehnmal höhere Expression des Transgens ersichtlich. Eine besonders
starke Expression des Sox4-Transgens war im transgenen Cerebellum zu beobachten, die die
des Sox4-Gens im Wildtyp-Cerebellum um das 10-24 fache überstieg (Abb. 36).
Abb. 36: RT-PCR-Analyse zum Nachweis der Expression des GFAP-Sox4-Transgens Quantitative RT-PCR mit cDNA aus Vorderhirn und Cerebellum von Wildtyp-Mäusen (wt) und Nachkommen der transgenen Founder-Tiere (#1, #2, #3) am Postnatalstadium P15. Die Werte wurden auf ß-Aktin normiert und als Vielfaches der Wildtyp-Werte ± Standardabweichung dargestellt.
3.2.3 Analyse des Phänotyps GFAP-Sox4-transgener Mäuse
Zwischen der zweiten und dritten Woche nach der Geburt entwickelten die Nachkommen der
drei Founder-Weibchen Hydrocephali (Wasserkopf) und schwere Ataxien. Das Schädeldach
der Tiere wölbte sich auf und sie bekamen Probleme, die Vorder- und Hinterbeine koordiniert
zu bewegen und gerade aus zu laufen. Die Symptome der Ataxie verstärkten sich bis zu ihrem
Tod, der meist nach drei Wochen eintrat. Nur eine transgene Maus überlebte sieben Wochen.
Die Analyse des Gehirns nach dem Tod dieser Mäuse bestätigte den Hydrocephalus mit
Vergrößerung der Lateralventrikel und des dritten Ventrikels (siehe Abb. 40).
Histologische Untersuchungen von Serienschnitten der mesencephalen Region von Wildtyp-
und GFAP-Sox4-transgenen Gehirnen ließen einen deutlich verengten Aquaeductus mes-
Ergebnisse
54
encephali in den transgenen Tieren am Postnatalstadium P3 erkennen (Abb. 37). Dieser Kanal
verbindet den dritten mit dem vierten Hirnventrikel und kann bei Verschluß zu Abfluss-
störungen des Liquor cerebrospinalis (Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit) und damit zu einem
Hydrocephalus führen. Der Liquor gelangt vom vierten Ventrikel in den Zentralkanal des
Rückenmarks und über die seitlichen und untere Öffnungen (mediane Apertur; Foramen
Magendii) in den äußeren Liquorraum. Dieser Zentralkanal und die mediane Apertur des
vierten Hirnventrikels waren in den transgenen Tieren nicht verschlossen. Die Morphologie
der Zellen um den Aquaeduct zeigte sich in den transgenen und den Wildtyp-Tieren als
vergleichbar. Sie waren normal um den Aquaeduct verteilt und GFAP-positiv (Abb. 37 und
Daten nicht gezeigt).
Abb. 37: Histologische Analyse des Aquaeductus mesencephali im Gehirn transgener Mäuse Nissl-Färbungen auf Paraffinschnitten der mesencephalen Region von Wildtyp- (wt) und GFAP-Sox4-transgenen (tg) Gehirnen am Postnatalstadium P3. Der gekennzeichnete Bereich in den Übersichten, der den Aquaeductus mesencephali zeigt, ist jeweils rechts oben vergrößert dargestellt. Die Balkenlänge in der Übersicht entspricht 1mm und in der Vergrößerung 50 µm. In Zusammenarbeit mit S. Baader.
Ebenfalls konnte in den transgenen Mäusen ein Plexus Choroideus, ein baumartig verzweigtes
Adergeflecht, welches sich in jedem der vier Ventrikel des Gehirns befindet und den Liquor
cerebrospinalis bildet, identifiziert werden. Zudem zeigten sich in histologischen Analysen
und immunhistochemischen Färbungen mit Antikörpern gegen Sox9 keine offensichtlichen
morphologischen Veränderungen dieses Geflechts (Pompolo und Harley, 2001) (Abb. 38 und
Daten nicht gezeigt).
Ergebnisse
55
Abb. 38: Untersuchungen des Plexus Choroideus GFAP-Sox4-transgener Mäuse Immunhistochemische Färbung des Plexus Choroideus mit einem Antikörper gegen Sox9 auf Gefrierschnitten von Wildtyp- (wt) und GFAP-Sox4-transgenen (tg) Gehirnen am Postnatalstadium P15. Die Balkenlänge entspricht 50 µm.
Als nächstes erfolgte eine Untersuchung der Ependymzellen. Diese kleiden die Ventrikel des
Gehirns aus und sind im Besitz von Cilien, die durch ihre Bewegungen für den stetigen Fluß
des Liquors sorgen. Anhand einer Immunfärbung mit Antikörpern gegen acetyliertes α-
Tubulin konnten in den transgenen Tieren ependymale Cilien nachgewiesen werden (Abb. 39).
Eine Überprüfung der korrekten Funktion der Cilien konnte durch diese Färbung jedoch nicht
gezeigt werden.
Abb. 39: Analyse der ependymalen Cilien GFAP-Sox4-transgener Mäuse Immunhistochemische Färbung der ebendymalen Cilien mit einem Antikörper gegen acetyliertes α-Tubulin auf Gefrierschnitten von Wildtyp- (wt) und GFAP-Sox4-transgenen (tg) Gehirnen am Postnatalstadium P9. Bei den Bildern handelt es sich um konfokale Aufnahmen. Die Balkenlänge entspricht 10 µm.
Die postmortale Analyse der transgenen Tiere zeigte eine starke Hypoplasie der Cerebella,
was ein möglicher Grund für die beobachtete Koordinationsstörung sein konnte. Die
Cerebella der transgenen Tiere waren kleiner und die Windungen der beiden
Kleinhirnhemisphären und des Kleinhirnwurms (Vermis) deutlich reduziert (Abb. 40).
Ergebnisse
56
Abb. 40: Die Morphologie des Gehirns GFAP-Sox4-transgener Mäuse In der oberen Reihe sind die Gehirne von Wildtyp- (wt) und GFAP-Sox4-transgenen (tg) Mäusen am Postnatal-stadium P19 in Aufsicht gezeigt. Die untere Reihe stellt die Cerebella in Vergrößerung dar.
Der Phänotyp des Hydrocephalus, der cerebellären Fehlbildungen und des daraus
resultierenden Todes war vollständig penetrant. Deshalb konnte keine transgene Linie
generiert werden und die Analysen mussten mit den direkten Nachkommen der transgenen
Founder-Mäuse durchgeführt werden. Aufgrund der beschränkten Anzahl an transgenen
Tieren, die für die Studie verfügbar waren, wurde deshalb das Augenmerk auf die cerebelläre
Entwicklung gelegt.
3.2.4 Die Expression des GFAP-Sox4-Transgens im Cerebellum und in cerebellären
Kulturen
Im Gegensatz zum Rückenmark wurde in der cerebellären Anlage an 12.5 dpc noch keine
Expression des Transgens über die EGFP-Autofluoreszenz nachgewiesen (Abb. 41A). Erst
zwei Tage später ließen sich Signale in der Ventrikulärzone des Cerebellums detektieren
(Abb. 41B). An 18.5 dpc wurden EGFP-positive Zellen vor allem in den inneren Regionen des
Cerebellums gefunden (Abb. 41C). Regionen nahe der Oberfläche wie beispielsweise die
äußere Körnerzellschicht enthielten wenige EGFP-positive Zellen, was vermuten lässt, dass in
den meisten Körnerzell-Vorläufern keine signifikante Transgen-Expression vorhanden ist.
Ergebnisse
57
Abb. 41: Die Expression des GFAP-Sox4-Transgens im Cerebellum (A-C) EGFP-Autofluoreszenz auf sagittalen Gefrierschnitten des sich entwickelnden Cerebellums GFAP-Sox4-transgener Mäuse an den Embryonalstadien 12.5 dpc (A), 14.5 dpc (B) und 18.5 dpc (C). Die Balkenlängen entsprechen 100 µm.
Zur Bestimmung des Zelltyps, der das Transgen exprimiert, wurden ko-immunhistochemische
Färbungen mit EGFP-Antikörpern und Markern für bestimmte Zelltypen im sich ent-
wickelnden Cerebellum an P3, P9 und P15 durchgeführt (Abb. 42 und Daten nicht gezeigt).
Dabei wurde eine EGFP-Expression vor allem in B-FABP-positiven Radial-Glia-Zellen
detektiert (Abb. 42A). In Regionen mit GFAP-positiven Zellen ließ sich ebenfalls eine
Überlappung mit EGFP nachweisen, wenngleich die Ko-Expression aufgrund der unter-
schiedlichen subzellulären Lokalisation von EGFP und GFAP schwieriger zu sehen war
(Abb. 42B). Im Gegensatz dazu exprimierten an P3 nur wenige Sox10-positive Zellen EGFP.
Diese Expression war an P9 und P15 so gut wie nicht mehr nachzuweisen (Abb. 42C und
Daten nicht gezeigt).
Abb. 42: Zelltyp-spezifische Expression des GFAP-Sox4-Transgens im Cerebellum (A-D) Doppel-Immunfluoreszenz-Analysen mit Antikörpern gegen B-FABP (A), GFAP (B), Sox10 (C) und NeuN (D) als Marker für spezifische Zelltypen (alle in rot) in Kombination mit einem Antikörper gegen EGFP (in grün) auf sagittalen Gefrierschnitten GFAP-Sox4-transgener Cerebella am Postnatalstadium P9. Die obere Reihe zeigt die Färbungen mit zelltyp-spezifischen Markern, die mittlere Reihe die entsprechenden EGFP-Färbungen und die untere Reihe die Überlagerungen (merge) der beiden oberen Bilder. Die Balkenlänge entspricht 25 µm.
Ergebnisse
58
Da Sox10 einen Marker der Oligodendrozyten-Zelllinie darstellt, könnte eine Erklärung für
die Detektion von EGFP in manchen Sox10-positiven Zellen sein, dass Oligodendrozyten-
Vorläuferzellen aus pluripotenten proliferativen Vorläuferzellen entstehen, die in den
transgenen Tieren EGFP exprimieren. Direkt nach Generierung Sox10-positiver
Oligodendrozyten-Vorläufer wäre es möglich, dass ehemals in den Zellen exprimiertes EGFP
immer noch vorhanden ist. Später jedoch lässt sich die Expression des Transgens deutlich von
Oligodendrozyten abgegrenzen. Körnerzell-Vorläufer und differenzierte Neurone des
Cerebellums enthielten zu keinem Zeitpunkt signifikante Mengen an EGFP (Abb. 42D und
Daten nicht gezeigt).
Immuncytochemische Untersuchungen von primären cerebellären Kulturen bestätigten, dass
EGFP ausschließlich in B-FABP- und GFAP-positiven Zellen (Abb. 43A, B) und nicht in
Tuj1- oder MAP2-positiven Neuronen (Abb. 43C, D) exprimiert wird. Da sich die EGFP-
Expression auf B-FABP- und GFAP-positive Zellen beschränkt und die Expression dieser
Marker wiederum auf Radial-Glia-Zellen (auch Bergmann-Glia) und Astrozyten im frühen
postnatalen Cerebellum begrenzt ist, kommt das Transgen vor allem in Radial-Glia und
Astrozyten vor.
Morphologisch ließen sich die Neurone der GFAP-Sox4-transgenen cerebellären Kulturen
nicht von denen der Wildtyp-Kulturen unterscheiden (Abb. 43C, D). Im Gegensatz dazu
zeigten EGFP-exprimierende Glia-Zellen transgener Cerebella in Kultur kürzere Fortsätze als
die Glia-Zellen in Wildtyp-Kulturen. Zusätzlich fehlten oft die Endfuß-ähnlichen Strukturen
am Ende der Zell-Fortsätze (Abb. 43A, B). Trotz dieser Unterschiede wurden die EGFP-
positiven Glia-Zellen transgener Kulturen wie die Wildtyp-Glia immer noch in engem
Kontakt mit cerebellären Neuronen gefunden (Abb. 43C, D).
Abb. 43: Die Expression des GFAP-Sox4-Transgens in cerebellären Kulturen (A-D) Doppel-Immunfluoreszenz-Analysen mit Antikörpern gegen B-FABP (A), GFAP (B), Tuj1 (C) und MAP2 (D) als Marker für spezifische Zelltypen (alle in rot) in Kombination mit einem Antikörper gegen EGFP (in grün) auf primären Zellkulturen von Wildtyp- (wt) oder GFAP-Sox4-transgenen (tg) Cerebella. Die obere Reihe zeigt die Färbungen mit zelltyp-spezifischen Markern, die mittlere Reihe die entsprechenden EGFP-Färbungen und die untere Reihe die Überlagerungen (merge) der beiden oberen Bilder. Die Balkenlänge entspricht 25 µm. In Zusammenarbeit mit S. Baader.
Ergebnisse
59
3.2.5 Die Histologie des Cerebellums GFAP-Sox4 transgener Mäuse
In Hämatoxylin-Eosin-gefärbten Schnitten bestätigte sich die Hypoplasie und reduzierte
Furchung transgener Cerebella. An P3 waren die Größenunterschiede der Kleinhirne beider
Genotypen noch gering. Klar abgegrenzte Lobuli ließen sich jedoch nur in den Cerebella von
Wildtyp-Mäusen erkennen (Abb. 44A, B). Die Region unterhalb der Oberfläche des Klein-
hirns war in Wildtyp- und transgenen Mäusen ähnlich mit Nuclei angereichert, was die
Existenz einer externen Körnerzellschicht in beiden Genotypen vermuten ließ. Auch die
Dicke dieser Körnerschicht war in den transgenen Cerebella nicht verändert. Nur Regionen, in
denen sich im Wildtyp schon Fissuren gebildet hatten, zeigten in den transgenen Cerebella
eine verdickte externe Körnerzellschicht (Abb. 44A, B).
Abb. 44: Die Histologie des Cerebellums GFAP-Sox4-transgener Mäuse (A-F) Hämatoxylin-Eosin-Färbungen auf sagittalen Paraffinschnitten von Wildtyp- (wt) (A, C, E) und GFAP-Sox4-transgenen (tg) (B, D, F) Cerebella an den Postnatalstadien P3 (A, B), P9 (C, D) und P15 (E, F). Die römischen Ziffern III-X bezeichnen die verschiedenen Lobuli. Die Vergrößerungen stammen aus den gekennzeichneten Bereichen in den Übersichten und sind jeweils rechts davon dargestellt. Die Pfeile markieren die externe Körnerzellschicht, die Pfeilspitzen die Molekularschicht sowie Ansammlungen von Purkinjezellen und die Doppelpfeile zeigen die innere Körnerzellschicht sowie Ansammlungen von Körnerzellen an. Die Balkenlänge in der Übersicht A entspricht 200 µm, in C 500 µm und in E 1mm. In den Vergrößerungen A, C und E stellen die Balkenlängen 100 µm dar. Die Bilder von Wildtyp- und transgenen Cerebella wurden mit der gleichen Vergrößerung aufgenommen. fc: Fissura culminata; fp: Fissura prima; fs: Fissura secunda; fl: Fissura flocculonodularis. In Zusammenarbeit mit S. Baader.
Ergebnisse
60
An P9 war der Unterschied in der Furchung des cerebellären Kortex noch deutlicher
(Abb. 44C, D) und auch an P15 fehlten Fissuren und Lobuli noch immer vollständig in den
transgenen Mäusen (Abb. 44E, F). Mit Ausnahme der externen Körnerzellschicht waren keine
anderen Zellschichten im cerebellären Kortex GFAP-Sox4-transgener Mäuse zu erkennen.
3.2.6 Untersuchungen transgener Cerebella auf Apoptose und Proliferation
Die Analyse der Proliferationsraten in der äußeren Körnerzellschicht in Wildtyp- und GFAP-
Sox4-transgenen Mäusen an P3 zeigte keine Unterschiede zwischen den beiden Genotypen.
Jedoch waren die Teilungsraten in tieferen Regionen der transgenen Cerebella vermindert
(Abb. 45A, B). Dies ließ sich durch eine statistisch signifikante 36 %ige Reduktion an Ki67-
positiven Zellen in diesen cerebellären Regionen belegen (Abb. 45E).
Abb. 45: Untersuchungen GFAP-Sox4-transgener Cerebella auf Apoptose und Proliferation (A, B) Immunhistochemie mit einem Antikörper gegen den Proliferationsmarker Ki67 auf sagittalen Gefrier-schnitten von Wildtyp- (wt) (A) und GFAP-Sox4-transgenen (tg) (B) Cerebella am Postnatalstadium P3. (C, D) TUNEL-Färbungen auf sagittalen Gefrierschnitten von Wildtyp- (C) und GFAP-Sox4-transgenen (D) Cerebella am Postnatalstadium P3. (E, F) Quantifizierung aller Ki67-positiven Zellen außerhalb der externen Körnerzellschicht (E) und der TUNEL-positiven Zellen (F) im Cerebellum. Mindestens 12 separate Schnitte von zwei verschiedenen Cerebella wurden für jeden Genotyp gezählt. Die gezählten Zellen wurden auf die Größe der Cerebella normiert und sind als Mittelwerte pro Flächeneinheit ± Standardabweichung angegeben. Unterschiede zum Wildtyp waren nach dem t-Test für die Proliferationsraten im mutanten Genotyp statistisch signifikant (P ≤ 0.001). Die Balkenlänge in A entspricht 100 µm und gilt auch für B-D.
Ergebnisse
61
Diese verringerte Proliferation in den transgenen Tieren könnte zu den Unterschieden in den
Größen der Wildtyp- und transgenen Cerebella während der postnatalen Entwicklung
beitragen. Eine alternative Erklärung für die unterschiedlichen Größen der Cerebella könnte
auch das Absterben von Zellen während der Entwicklung sein. Daher sollte durch TUNEL-
Färbungen die Rate an apoptotischen Zellen in den Wildtyp- und transgenen Cerebella an P3
analysiert werden. Durch diese Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass die Apoptoserate,
die während dieser frühen postnatalen Periode im Cerebellum generell hoch ist (Krueger et al.,
1995), in den transgenen Cerebella ebenfalls erhöht war, ohne jedoch einen statistisch
signifikanten Unterschied zum Wildtyp zu erreichen (Abb. 45C, D, F).
3.2.7 Analyse der neuronalen und glialen Zelltypen in den Cerebella GFAP-Sox4
transgener Mäuse
3.2.7.1 Untersuchungen der neuronalen Subtypen in den transgenen Cerebella
Neuronale Zelltypen des Cerebellums lassen sich durch ihre Position und eine Kombination
immunhistochemischer Marker identifizieren. Die äußeren Körnerzellen befinden sich direkt
unterhalb der Oberfläche des Kleinhirns und exprimieren Ki67 und Pax6 (Baader et al., 1999;
Engelkamp et al., 1999). Sowohl in Wildtyp- als auch in transgenen Cerebella wurden an P3
und P9 Ki67- und Pax6-positive Zellen nahe der Oberfläche gefunden (Abb. 46A und Daten
nicht gezeigt). Im Gegensatz zum Wildtyp waren in den transgenen Cerebella an P15 jedoch
immer noch Ki67-positive proliferierende Körnerzellen zu sehen, was auf eine etwas
verzögerte oder verlängerte Entwicklung dieser Zellen hindeutet (Abb. 46F).
Nur ein geringer Teil der Zellen in der äußeren Körnerzellschicht war schwach NeuN-positiv.
Bei diesen Zellen handelt es sich um differenzierende Körnerzellen auf dem Weg von der
äußeren Zellschicht in tiefere Schichten des Cerebellums (Abb. 46B, G) (Weyer und Schilling,
2003). Dieses Färbemuster konnte sowohl in transgenen als auch in Wildtyp-Cerebella
beobachtet werden. Dagegen exprimieren differenzierende und differenzierte Körnerzellen in
tieferen Schichten der Wildtyp-Cerebella hohe Mengen an NeuN (Weyer und Schilling, 2003).
NeuN-positive Signale waren auch in tieferen Regionen der transgenen Cerebella zu finden,
was darauf hindeutet, dass die Körnerzellen in diesem Genotyp trotz des offensichtlichen
Fehlens einer geordneten internen Körnerzellschicht in der Lage sind, zu differenzieren (Abb.
46B, G).
Desweiteren ließen sich Calbindin-positive Neurone mit großen Somata in den transgenen
Cerebella nachweisen. Dies deutet darauf hin, dass Purkinjezellen spezifiziert werden und
Ergebnisse
62
sich entwickeln (Celio, 1990). Die Purkinjezellen in den transgenen Tieren konnten
verzweigte Dendritenbäume ausbilden und ließen sich auch mit Parvalbumin markieren,
wodurch eine korrekte Reifung auf zellulärer Ebene angezeigt wird (Abb. 46C, H und Daten
nicht gezeigt). Im Gegensatz zum Wildtyp formten die Purkinjezellen in den GFAP-Sox4
transgenen Mäusen jedoch keine Einzel-Zellschicht, sondern erzeugten Aggregate tief im
cerebellären Parenchym und vermischten sich dort mit Korb/Sternzellen (Abb. 46, vergleiche
C, H mit D, I und Daten nicht gezeigt). Bei den Korb/Sternzellen handelt es sich um
cerebelläre Interneurone, die wie Purkinjezellen sowohl positiv für RORα als auch positiv für
Parvalbumin sind. Eine Unterscheidung von Purkinjezellen ist jedoch aufgrund ihrer kleineren
Somata möglich (Ino, 2004). In den Purkinjezell-Aggregaten der transgenen Cerebella
konnten dagegen nur selten NeuN-positiven Körner- oder Pax2-positive Golgi-Zellen
detektiert werden (Abb. 46, vergleiche C, H mit B, G und E, J) (Weisheit et al., 2006).
Abb. 46: Analyse der neuronalen Subtypen in den Cerebella GFAP-Sox4-transgener Mäuse (A-J) Immunhistochemie mit Antikörpern gegen Ki67 (A, F), NeuN (B, G), Calbindin D28K (C, H), RORα (D, I) und Pax2 (E, J) auf sagittalen Paraffinschnitten von Wildtyp- (wt) und GFAP-Sox4-transgenen (tg) Cerebella an den Postnatalstadien P3 (A-E) und P15 (F-J). Die Bilder stammen aus dem Bereich des zentralen Lobus. Die Balkenlänge entspricht 50 µm. Die Antikörperfärbung ist als braunes Diaminobenzidin-Präzipitat sichtbar und Hämatoxylin wurde als Gegenfärbung verwendet. Die Pfeile deuten auf Golgi-Neurone, die Pfeilspitzen auf undifferenzierte und differenzierte Korb/Sternzellen in der weißen Substanz und der Molekularschicht. In Zusammenarbeit mit S. Baader.
Golgizellen lagen in den transgenen Mäusen mit Körnerzellen durchmischt vor, ähnlich wie
dies auch im Wildtyp nachzuweisen war (Abb. 46, vergleiche E, J mit B, G). Pax2- oder
Ergebnisse
63
Parvalbumin-positive Neurone waren auch in tieferen Regionen transgener Cerebella zu
finden (Abb. 46E, J und Daten nicht gezeigt). Pax2-positive Neurone wurden vor allem in der
weißen Substanz nachgewiesen und entsprechen Vorläufer-Zellen GABAerger cerebellärer
Interneurone. Im Gegensatz dazu repräsentieren Parvalbumin-positive Neurone des
cerebellären Parenchyms Zellen der tiefen cerebellären Nuclei (Maricich und Herrup, 1999).
Trotz der ordnungsgemäßen Differenzierung der wichtigsten neuronalen Zelltypen im
cerebellären Kortex und der richtigen Sortierung der Zellen war die Schichtung stark gestört.
Die Purkinjezell-Dendriten in transgenen Cerebella zeigten keine ordnungsgemäße
Orientierung in Richtung Oberfläche, obwohl sie immer noch eine Tendenz in radiale
Richtung aufwiesen (Daten nicht gezeigt). Im Vergleich zum Wildtyp schienen sich in den
transgenen Tieren auch mehr interne Körnerzellen zwischen Purkinjezellen und der
cerebellären Oberfläche zu positionieren, ohne ihren Weg bis zu ihrem Zielort fortzusetzen
(Abb. 46B, G).
Aus diesen Beobachtungen wurde geschlossen, dass alle wichtigen neuronalen Subtypen in
den transgenen Cerebella vorhanden sind und differenzieren können, dass sie jedoch
Aggregate bilden, anstelle sich in die typischen cerebellären Schichten zu organisieren.
3.2.7.2 Untersuchungen der Glia-Zellen in den transgenen Cerebella
Da das Sox4-Transgen nicht in neuronalen Vorläufern und Neuronen des Cerebellums
exprimiert wurde und die Spezifikation und Differenzierung neuronaler Subtypen weitgehend
normal erschien, wurde der Fokus auf die Analyse der Entwicklung der Glia-Zellen gelegt.
Zu allen untersuchten Zeitpunkten der cerebellären Entwicklung war es möglich, Zellen
nachzuweisen, die das Transgen exprimierten und sich mit EGFP-Antikörper markieren
ließen (Abb. 47A, F, K). Die Verteilung dieser Zellen stimmte genau mit dem B-FABP-
Färbemuster überein und deutete darauf hin, dass die meisten EGFP-exprimierenden Zellen
Radial-Glia waren (Abb. 47B, G, L). Die Färbungen für SoxB1- und Sox9-Proteine als
unabhängige Radial-Gia-Marker (Pompolo und Harley, 2001; Sottile et al., 2006) bestätigten
diese Schlussfolgerung (Abb. 47C, H, M und Daten nicht gezeigt). Zellen, die B-FABP,
SoxB1-Proteine und Sox9 exprimierten, waren in den transgenen Tieren von P3 bis P15 über
die ganze cerebelläre Region verteilt. In den Wildtyp-Cerebella hingegen positionierten sich
diese Zellen im Laufe der postnatalen Entwicklung in der Purkinjezellschicht (Abb. 47B, G, L
sowie C, H, M und Daten nicht gezeigt). Die B-FABP-markierten Zellen in der Purkinjezell-
schicht der Wildtyp-Cerebella streckten lange, radial orientierte Fasern in Richtung der
Oberfläche aus, welches ihre Entwicklung zu Bergmann-Glia anzeigt (Abb. 47B, G, L). Im
Ergebnisse
64
Gegensatz dazu bildeten B-FABP-gefärbte Zellen in den transgenen Cerebella keine radialen
Ausläufer (Abb. 47B, G, L).
Mit GFAP als Marker konnten in Wildtyp-Tieren in tieferen Regionen des Cerebellums
Astrozyten der weißen Substanz angefärbt werden. Zudem ließen sich damit in Regionen nahe
der Oberfläche Bergmann-Glia und ihre Ausläufer markieren. In den transgenen Tieren
hingegen konnten nur in tieferen cerebellären Regionen GFAP-Signale detektiert werden.
Abb. 47: Analyse der glialen Zelltypen in den Cerebella GFAP-Sox4-transgener Mäuse (A-O) Immunhistochemie auf sagittalen Gefrierschnitten von Wildtyp- (wt) und GFAP-Sox4-transgenen (tg) Cerebella an den Postnatalstadien P3 (A-E), P9 (F-J) und P15 (K-O) mit Antikörpern gegen EGFP (A, F, K), gegen den Radial- und Bergmann-Glia-Marker B-FABP (B, G, L), den Radial-Glia-Marker SoxB1 (C, H, M), den Bergmann-Glia- und Astrozyten-Marker GFAP (D, I, N) und den Oligodendrozyten-Marker Sox10 (E, J, O). Die Balkenlänge entspricht 50 µm.
Folglich scheint die Bildung von Astrozyten der weißen Substanz in transgenen Cerebella
nicht gestört zu sein. B-FABP-positive Zellen in äußeren Regionen der Cerebella waren
Ergebnisse
65
jedoch offenbar nicht in der Lage, in Anwesenheit des Sox4-Transgens in GFAP-
exprimierende Bergmann-Glia auszureifen (Abb. 47D, I, N). Die Färbungen mit dem Radial-
Glia-Zellmarker RC2 bestätigten das Fehlen von Bergmann-Glia und ihrer radialen Ausläufer
(Daten nicht gezeigt). Oligodendrozyten dagegen entwickelten sich normal, was an der
Zunahme Sox10-positiver Zellen in tieferen Regionen transgener Cerebella zu beobachten
war (Abb. 47E, J, O).
Diese Ergebnisse lassen den Schluss zu, dass das Sox4-Transgen die Expression glialer
Marker an sich nicht stört, sondern verhindert, dass Radial-Glia-Zellen im Cerebellum zur
Position der Bergmann-Glia-Zellen wandern, terminal differenzieren und den komplett
differenzierten Bergmann-Glia-Phänotyp erwerben.
3.2.8 Untersuchungen des cerebralen Kortex GFAP-Sox4-transgener Mäuse
Abschließend erfolgte eine Analyse der Radial-Glia-Zellen im Vorderhirn GFAP-Sox4-
transgener Mäuse. Nach Färbung mit Antikörpern gegen B-FABP und SoxB1 wurden in
neugeborenen transgenen Tieren EGFP-positive Radial-Glia in zum Wildtyp vergleichbarer
Anzahl gefunden (Abb. 48A, B und Daten nicht gezeigt). Am Tag der Geburt besaßen diese
Radial-Glia-Zellen im Vorderhirn radiale Ausläufer (Abb. 48B). Allerdings waren diese in
den transgenen Mäusen weniger regelmäßig angeordnet als in den Wildtyp-Tieren. Zudem
erreichten einige radiale Ausläufer in den transgenen Tieren nicht die Oberfläche (Abb. 48B).
Bei Fortschreiten der Entwicklung (an P3 und P9) ließen sich mit GFAP, B-FABP oder RC2
als Marker keine radialen Ausläufer mehr im cerebralen Kortex transgener Mäuse detektieren,
während sie im Wildtyp immer noch nachzuweisen waren (Abb. 48C und Daten nicht gezeigt).
Ab der Geburt konnte somit auch eine fortschreitende Schädigung von Radial-Glia im
Vorderhirn GFAP-Sox4-transgener Mäuse beobachtet werden. Die daraus resultierenden
Fehlbildungen neuronaler Schichten waren nicht gravierend, da die neuronale Wanderung im
cerebralen Kortex bis zum Tag der Geburt schon weit vorangeschritten ist (Fukumitsu et al.,
2006). Obwohl kleinere Abweichungen und eine verringerte Ausdehnung des cerebralen
Kortex an P9 zu beobachten waren, ließ sich die prinzipielle Schichtung erkennen.
Ergebnisse
66
Abb. 48: Analyse der Radial-Glia im cerebralen Kortex GFAP-Sox4-transgener Mäuse (A-C) Immunhistochemie auf kortikalen Gefrierschnitten von Wildtyp- (wt) und GFAP-Sox4-transgenen (tg) Vorderhirnen am Tag der Geburt (P0) (A, B) und am Postnatalstadium P3 (C) mit Antikörpern gegen EGFP (A), B-FABP (B) und GFAP (C). Die Balkenlänge in A entspricht 50 µm und gilt auch für B und C.
Dies war sowohl mit histologischen als auch mit immunhistochemischen Färbungen von
Calretinin-positiven nicht-pyramidalen Neuronen in den Schichten 1-3 (Jacobowitz und
Winsky, 1991) und Oct6-positiven Neuronen in den Schichten 2/3 und 5 nachzuweisen
(Bermingham et al., 1996) (Abb. 49A-C).
Diese Daten zeigen, dass eine Schädigung von Radial-Glia-Zellen zu einem Zeitpunkt, an
dem die Wanderung von Zellen in radialer Richtung weitgehend abgeschlossen ist, keine
gravierenden Veränderungen der Kortexschichten mehr verursacht.
Am Zeitpunkt P15 war die Größenreduktion des transgenen cerebralen Kortex weiter
fortgeschritten und die Schichtung schwieriger zu erkennen (Abb. 49D, E). Zu diesem
Zeitpunkt waren die Neuronen dicht gebündelt, ihre nukleäre Morphologie sehr heterogen
geworden und die Zahl apoptotischer Zellen erhöht (Abb. 49D). Calretinin-positive Neurone
zeigten ungewöhnlich kurze und unverzweigte Ausläufer (Abb. 49E). Diese späten
Veränderungen im cerebralen Kortex sind jedoch vermutlich degenerativ und ein Ergebnis
des zunehmenden Hydrocephalus.
Ergebnisse
67
Abb. 49: Analyse der neuronalen Schichten im cerebralen Kortex GFAP-Sox4-transgener Mäuse (A, D) Nissl-Färbungen auf kortikalen Paraffinschnitten von Wildtyp- (wt) und GFAP-Sox4-transgenen (tg) Vorderhirnen an den Postnatalstadien P9 (A) und P15 (D). (B, C, E) Immunhistochemie auf kortikalen Gefrierschnitten von Wildtyp- und GFAP-Sox4-transgenen Vorderhirnen an den Postnatalstadien P9 (B, C) und P15 (E) mit Antikörpern gegen Calretinin (Calr) (B, E) und Oct-6 (C). In A ist der Bereich gekennzeichnet, aus dem die Vergrößerungen (B, C) stammen. Die Balkenlänge in A entspricht 1mm, in B und C 100 µm, in D und E 25 µm. Die kortikalen Schichten sind mit den römischen Ziffern I-VI gekennzeichnet. In Zusammenarbeit mit S. Baader.
Diskussion
69
4 Diskussion
4.1 DAS SOX12-DEFIZIENTE MAUSMODELL
4.1.1 Bedeutung von Sox12 für die embryonale und frühe postnatale Entwicklung der
Maus
Sox12 zählt neben Sox4 und Sox11 zur Gruppe C der Sox-Proteinfamilie. Vor Beginn dieser
Studie war dieser Transkriptionsfaktor kaum untersucht. Das Expressionsmuster von Sox12
war nur im menschlichen Embryo beschrieben (Jay et al., 1997). Analysen über die Funktion
von Sox12 oder Tiermodelle waren noch nicht vorhanden. Deshalb wurde im Rahmen dieser
Arbeit das Expressionsmuster von Sox12 während der Mausembryogenese genauer bestimmt.
Darüber hinaus wurde die Funktion von Sox12 durch Generierung Sox12-defizienter Mäuse
analysiert.
In der vorliegenden Arbeit konnte für die Maus gezeigt werden, dass Sox12 ebenso wie Sox4
und Sox11 während der Säuger-Embryogenese in vielen Geweben exprimiert vorliegt.
Frühere Untersuchungen von Sox4- und Sox11-Knockout-Mäusen konnten zahlreiche
Entwicklungsdefekte in diesen Tieren nachweisen (Schilham et al., 1996; Sock et al., 2004).
In Anbetracht dessen war es überraschend, dass die Sox12-defizienten Tiere während der
embryonalen und frühen postnatalen Entwicklung keine Fehlbildungen aufwiesen. Im
Gegensatz zu Sox4-defizienten Mäusen, die um den Embryonaltag 14 sterben und Sox11-
Knockout-Tieren, die perinatal letal sind, wurden Mäuse, denen Sox12 fehlte, lebend geboren
und hatten ein normales Erscheinungsbild. Die Tiere zeigten ein unauffäliges postnatales
Wachstum und waren fortpflanzungsfähig. Dies deutet darauf hin, dass Sox12 für die
embryonale und frühe postnatale Entwicklung weitgehend entbehrlich ist. Hier muss jedoch
berücksichtigt werden, dass die Sox12-defizienten Mäuse zum Zeitpunkt der Analyse noch
einen gemischten genetischen Hintergrund besaßen. So setzte sich die ES-Zelllinie, in die das
Sox12-Targeting-Konstrukt eingebracht wurde, aus dem C57BL/6J- und dem 129Sv-Wildtyp-
Mausstamm zusammen, während die Blastozysten, in die die veränderten ES-Zellen injiziert
wurden, von C57BL/6J-Tieren stammten. Die erhaltenen Chimären wurden in der Folge mit
C57BL/6J-Mäusen, die das EIIa-Cre-Transgen enthielten, verpaart. Die anschließenden
Analysen erfolgten in den darauffolgenden drei Generationen (F2-F4). Es ist nicht
Diskussion
70
ausgeschlossen, dass ein Entwicklungsdefekt erst dann zu beobachten ist, wenn das Nullallel
durch intensives Rückkreuzen auf einen reinen genetischen Hintergrund gebracht wurde.
Erst kürzlich wurde in einer Studie über E2F-Transkriptionsfaktoren wieder deutlich, dass der
genetische Hintergrund bei der Ausprägung eines Phänotyps tatsächlich eine Rolle spielen
kann (Tsai et al., 2008). Zur Familie der E2F-Faktoren gehört das E2f3-Gen, das eine
Funktion bei der Kontrolle der Zellproliferation besitzt (Humbert et al., 2000; Wu et al., 2001).
Durch alternative Promotoren können von diesem Gen zwei Isoformen entstehen, die als
E2f3a und E2f3b bezeichnet werden (Leone et al., 2000). Wurden diese beiden Isoformen in
Mäusen mit einem gemischten genetischen Hintergrund inaktiviert, entwickelten sich die
Nachkommen dieser Tiere relativ normal (Humbert et al., 2000; Wu et al., 2001). Nachdem
die Mäuse jedoch auf einen reinen genetischen Hintergrund gebracht worden waren,
resultierte daraus eine embryonale Letalität dieser Tiere (Tsai et al., 2008).
Ähnliches wurde auch für Sox18-Knockout-Mäuse festgestellt. Sox18 wird während der
Mausembryogenese im sich entwickelnden vaskulären Endothel und in Haarfollikeln
exprimiert. Nach Deletion von Sox18 konnten zunächst keine schweren Fehlentwicklungen in
den Mäusen nachgewiesen werden (Pennisi et al., 2000). Die Züchtung der Knockout-Tiere
auf einen reinen genetischen Hintergrund führte jedoch zu erheblichen Defekten des
Vaskularsystems in diesen Mausmutanten (Francois et al., 2008). Auch in Sox8-defizienten
Mäusen lässt sich der Einfluß des genetischen Hintergrunds auf die Ausprägung des
Phänotyps erkennen. Beobachtungen der eigenen Arbeitsgruppe zeigen, dass Störungen in der
Entwicklung wie verringertes Körperwachstum und Infertilität stärker ausgeprägt werden, je
mehr diese Tiere rückgekreuzt werden.
Aus diesem Grund sollte im weiteren Verlauf der Analysen der Sox12-defizienten Mäuse der
Versuch unternommen werden, die Tiere durch wiederholte Verpaarungen mit Wildtyp-
Tieren auf einen reinen genetischen Hintergrund zu züchten. Sollte sich in den Mäusen
daraufhin kein Phänotyp ausprägen, kann zumindest ausgeschlossen werden, dass in unseren
Untersuchungen eine essentielle Funktion von Sox12 vom genetischen Hintergrund überdeckt
wurde.
Diskussion
71
4.1.2 Funktionelle Kompensation als ein möglicher Grund für einen fehlenden
Phänotyp in Sox12-defizienten Mäusen
Neben der Möglichkeit, dass der genetische Hintergrund der Sox12-defizienten Mäuse
entscheidend für die Ausprägung eines Phänotyps ist, könnte auch eine funktionelle
Redundanz als Ursache für fehlende Entwicklungsdefekte in Betracht kommen. Beim
Vergleich der Expression von Sox12 mit Sox4 und Sox11 war für alle drei SoxC-Gene ein
stark überlappendes Expressionsmuster festzustellen. Somit könnte in Sox12-defizienten
Mäusen die Funktion des fehlenden Faktors von den ko-exprimierten Genen Sox4 und/oder
Sox11 übernommen werden. Dafür spricht, dass in manchen Organen Sox12-defizienter
Mäuse eine Zunahme der Sox4- und Sox11-Expression zu beobachten war. In anderen
Organen wiederum blieben die Transkript-Mengen der beiden zu Sox12 verwandten Gene
unverändert. Dies könnte ein Hinweis darauf sein, dass die funktionelle Kompensation organ-
spezifisch ist. Auch in Studien einer anderen Arbeitsgruppe wurde eine Ko-Expression dieser
drei SoxC-Gene in vielen verschiedenen Geweben nachgewiesen (Dy et al., 2008). Eine
gemeinsame Expression von Gruppenmitgliedern ließ sich bereits für einige andere Sox-
Gruppen zeigen. So sind beispielsweise die SoxB1-Proteine Sox1, Sox2 und Sox3 in neuralen
Stammzellen des sich entwickelnden Nervensystems ko-exprimiert (Collignon et al., 1996;
Pevny et al., 1998; Rex et al., 1997). Die SoxE-Proteine wiederum kommen unter anderem in
Oligodendrozyten gemeinsam vor (Stolt et al., 2004; Stolt et al., 2003; Stolt et al., 2002).
Eine funktionelle Kompensation wird auch als Erklärung für den fehlenden Phänotyp in der
Neuralentwicklung Sox11-defizienter Mäuse vermutet. Trotz einer sehr starken Expression
dieses Gens in reifenden neuronalen Vorläuferzellen des zentralen Nervensystems zeigten
diese bei einem Fehlen von Sox11 keinen Defekt (Sock et al., 2004). Da die neuronalen
Vorläuferzellen neben Sox11 den nah verwandten Transkriptionsfaktor Sox4 (Cheung et al.,
2000) und, wie in dieser Studie gezeigt, Sox12 exprimieren, könnten diese Proteine die
Funktion von Sox11 in den Sox11-defizienten Zellen übernehmen und damit die Ausprägung
eines Phänotyps verhindern. Ebenso können Sox11 und Sox12 offenbar den Verlust von Sox4
in neuronalen Vorläuferzellen kompensieren, denn auch in Sox4-defizienten Mäusen konnte
bis zu ihrem Absterben am Entwicklungsstadium 14 dpc kein offensichtlicher Defekt im
zentralen Nervensystem festgestellt werden (Cheung et al., 2000; Schilham et al., 1996). Ob
später in der Embryogenese der Verlust der Sox4-Funktion eine Auswirkung auf die
neuronale Entwicklung hat, kann mit der konstitutiven Sox4-defizienten Maus aufgrund des
frühen Herzdefektes nicht analysiert werden. Vor kurzem wurde aber eine Maus generiert, bei
Diskussion
72
der das Sox4-Gen konditional deletiert werden kann (Penzo-Mendez et al., 2007) und in der
Untersuchungen am spätembryonalen Nervensystem möglich sind. Mit Hilfe von
verschiedenen Cre-transgenen Mauslinien lässt sich in diesen Tieren das Sox4-Allel Gewebe-
oder Zelltyp-spezifisch entfernen. Die konditionalen Sox4-defizienten Mäuse werden zur Zeit
von der eigenen Arbeitsgruppe eingesetzt, um Sox4/Sox11-doppelt-defiziente Mäuse zu
generieren, in denen Sox4 spezifisch im zentralen Nervensystem deletiert ist. Dadurch soll
eine Analyse der Funktion von Sox4 und Sox11 während der Neuralentwicklung möglich
werden. Sollte die Nervensystem-Entwicklung in den Sox4/Sox11 doppelt-defizienten Tieren
weiterhin normal erfolgen, so spräche dies für eine funktionelle Kompensation durch Sox12.
Mit Hilfe der in dieser Arbeit generierten Sox12-defizienten Mäuse kann diese Hypothese
experimentell untersucht werden. Durch die Art, wie das Sox12-Gen verändert wurde, besteht
die Möglichkeit, für solche Versuche neben dem konstitutiven Sox12-Nullallel auch ein
konditionales Sox12-Allel einzusetzen. Dieses konditionale Allel hat den Vorteil, dass Sox12
spezifisch im Nervensystem deletiert werden kann. Dadurch lassen sich Defekte vermeiden,
die außerhalb des Nervensystems im Dreifach-Knockout aufgrund funktioneller Redundanz
zwischen Sox12 und Sox11 auftauchen könnten (Sox4∆/∆, Sox11-/-, Sox12-/- versus Sox4∆/∆,
Sox11-/-, Sox12∆/∆). Zudem kann nur dieses konditionale Sox12-Allel beweisen, dass auf-
tretende Defekte zellautonom für das Nervensystem sind.
4.1.3 Nichtreziproke funktionelle Kompensation aufgrund von Unterschieden in der
embryonalen Expression der SoxC-Gene
Wenn es sich beim Fehlen eines Phänotyps in den Sox12-defizienten Mäusen tatsächlich um
eine funktionelle Kompensation handeln sollte, so muss diese nichtreziprok sein. Das
bedeutet, dass Sox4 und Sox11 den Verlust von Sox12 ausgleichen können, während Sox12
das Fehlen von Sox4 oder Sox11 nicht zu kompensieren vermag. Dies lässt sich daran
erkennen, dass in den Sox4- und Sox11-defizienten Mäusen (Schilham et al., 1996; Sock et al.,
2004) schwere Entwicklungsdefekte nachzuweisen sind, obwohl Sox12 in diesen Tieren noch
vorhanden ist.
Die hier beschriebene Situation für Sox4, Sox11 und Sox12 erinnert an frühere Erkenntnisse
über die SoxE-Proteine Sox8, Sox9 und Sox10. Auch diese drei Proteine zeigen während der
Embryogenese ein stark überlappendes Vorkommen. Das Fehlen von Sox9 oder Sox10
verursacht jeweils schwere Entwicklungsdefekte, die unter anderem Chondrozyten bzw.
verschiedene Neuralleisten-Derivate betreffen. Diese Fehlbildungen führen embryonal oder
Diskussion
73
perinatal zum Tod der Mäuse (Bi et al., 1999; Britsch et al., 2001). Im Gegensatz dazu
werden Sox8-defiziente Tiere normal geboren und zeigen nur vergleichsweise schwache
Defekte während der postnatalen Entwicklung (Sock et al., 2001). Dies lässt den Schluß zu,
dass Sox9 und Sox10 den Verlust von Sox8 kompensieren können, andersherum Sox8 jedoch
nicht in der Lage dazu ist. Diese nichtreziproke Kompensation wird offenbar durch
Unterschiede in der Expressionshöhe und durch funktionelle Abweichungen zwischen den
drei Proteinen verursacht (Kellerer et al., 2006; Maka et al., 2005).
Auch bei den SoxC-Proteinen könnten Unterschiede in der embryonalen Expression eine
Begründung für die nichtreziproke funktionelle Redundanz sein. Mittels quantitativer RT-
PCR und in situ Hybridisierungen war im Vergleich zu Sox4 und Sox11 die Expression von
Sox12 niedriger. Außerdem ließ sich im gesamten Embryo eine annähernd gleichförmige
Expression von Sox12 beobachten. Es ist bezeichnend, dass gerade in jenen Organen, die in
Sox4- oder Sox11-Mausmutanten einen Entwicklungsdefekt aufwiesen, im Wildtyp ein
besonders starkes Vorkommen von Sox4 bzw. Sox11 nachzuweisen war. Der Mangel einer
verstärkten Sox12-Expression in einzelnen Geweben könnte folglich eine Erklärung für den
fehlenden Phänotyp in Sox12-defizienten Mäusen sein. Darüber hinaus gilt zu klären,
inwieweit es zu einer verstärkten Expression von Sox12 in Sox4- und Sox11-defizienten
Mäusen kommt. Nichtsdestotrotz reicht in den jeweiligen Mausmutanten das Vorkommen
von Sox12 nicht für eine kompensatorische Wirkung aus.
4.1.4 Nichtreziproke funktionelle Kompensation aufgrund unterschiedlicher
funktioneller Eigenschaften der SoxC-Proteine
Ein weiterer Grund für eine nichtreziproke funktionelle Redundanz zwischen den SoxC-
Proteinen könnten auch unterschiedliche funktionelle Eigenschaften sein. Die Ergebnisse
dieser Studie lassen jedoch vermuten, dass diese Unterschiede nicht sehr groß sind. So konnte
Sox12 in Gelshift-Experimenten an ähnliche DNA-Sequenzen im Promotor von Zielgenen
binden wie Sox4 und Sox11 (Bergsland et al., 2006; Kuhlbrodt et al., 1998a; van de Wetering
et al., 1993). Diese Promotor-Sequenzen wurden von den SoxC-Proteinen auch verwendet,
um Zielgen-Promotoren in Zellkultur und im Neuralrohr des Huhn-Embryos zu aktivieren.
Dabei waren alle drei Proteine zur alleinigen sowie zur synergistischen Aktivierung mit POU-
Proteinen befähigt. Diese ähnlichen funktionellen Eigenschaften sind möglicherweise darauf
zurückzuführen, dass sowohl die HMG-Domäne, die für die DNA-Bindung der Proteine
verantwortlich ist, als auch der etwa 35 Aminosäuren lange C-Terminus zwischen den drei
Diskussion
74
SoxC-Proteinen stark konserviert ist (Hargrave et al., 1997; Jay et al., 1997; Kuhlbrodt et al.,
1998a). Dabei stellt die konservierte C-terminale Region vermutlich die Transaktivierungs-
domäne dar, die im Falle von Sox4 und Sox11 bislang nur auf das C-terminale Drittel
eingegrenzt worden war (Kuhlbrodt et al., 1998a; van de Wetering et al., 1993). Vor kurzem
konnten die Ergebnisse einer weiteren Forschergruppe bestätigen, dass genau diese
konservierte C-terminale Sequenz notwendig und ausreichend für die transaktivierende
Kapazität der SoxC-Proteine ist (Dy et al., 2008).
Vor Beginn dieser Arbeit war für Sox12 noch keine Transaktivierungsdomäne identifiziert
worden. Deshalb konnte nicht ausgeschlossen werden, dass dieser Transkriptionsfaktor
ebenso als Repressor fungieren könnte. Aus diesem Grund wurde auch jener Aspekt
untersucht. Ein Beweis für eine reprimierende Funktion von Sox12 auf die Transkription
konnte in der vorliegenden Studie jedoch nicht erbracht werden. Damit verhält sich Sox12
anders zu Sox4 und Sox11 als die SoxB2-Mitglieder Sox14 und Sox21 zu den SoxB1-
Proteinen Sox1, Sox2 und Sox3 (Wegner und Stolt, 2005). Für diese beiden Gruppen
verwandter Sox-Proteine konnte eine antagonistische Wirkung nachgewiesen werden. Dabei
üben die SoxB1-Proteine eine aktivierende und die SoxB2-Faktoren eine reprimierende
Funktion auf dieselben Zielgene aus (Sandberg et al., 2005; Uchikawa et al., 1999). Diese
entgegengesetzte Wirkungsweise lässt sich wahrscheinlich dadurch erklären, dass die beiden
Sox-Gruppen zwar nahezu identische HMG-Domänen für die DNA-Bindung besitzen, jedoch
in den SoxB1-Proteinen eine Transaktivierungsdomäne vorhanden ist, während die Mitglieder
der SoxB2-Gruppe eine Transrepressordomäne aufweisen.
Obgleich sich die Transaktivierungsdomänen der drei SoxC-Proteine in ihren Aminosäure-
sequenzen sehr ähneln, gibt es Unterschiede in den Transaktivierungskapazitäten dieser
Transkriptionsfaktoren. So verhielt sich Sox12 im Vergleich zu Sox11 als ein deutlich
schwächerer Transaktivator und zeigte im Gegensatz zu Sox4 und Sox11 nur relativ mäßige
synergistische Effekte mit POU-Proteinen der Klasse III. Sox12 kann folglich weniger zur
Aktivierung der SoxC-Zielgene beitragen als das ko-exprimierte Sox11. Aus diesem Grund
hätte das Fehlen von Sox12 weniger Auswirkungen als der Verlust von Sox11, selbst wenn
beide Gene gleichermaßen hoch exprimiert werden. Sox12 scheint daher eher modulierend
auf die Expression der Gene zu wirken, die unter der Kontrolle von Sox4 und Sox11 stehen.
Um den Einfluß von Sox12 auf die embryonale Entwicklung tiefergehend zu analysieren,
müssten in Zukunft Maus-Mutanten generiert werden, in denen zusätzlich zu Sox12 weitere
SoxC-Gene deletiert werden.
Diskussion
75
Die in dieser Arbeit nachgewiesene schwächere transaktivierende Wirkung von Sox12 wurde
in Untersuchungen einer anderen Arbeitsgruppe bestätigt. In dieser Studie wurde auch die
DNA-Bindeeffizienz der drei SoxC-Proteine untersucht. Dabei ließ sich feststellen, dass das
Sox4-Protein in Gelshift-Experimenten besser an DNA binden konnte als Sox12, während
Sox11 kaum eine Bindung mit der DNA einging (Dy et al., 2008). Diese mangelhafte DNA-
Bindung des Sox11-Proteins, die in dieser Studie erhalten wurde, ließ sich durch die
Ergebnisse einer weiteren Forschergruppe bestätigen (Wiebe et al., 2003). Da die HMG-
Domänen der SoxC-Proteine in ihrer Sequenz sehr ähnlich sind, wurde der Grund für die
unterschiedlichen DNA-Bindefähigkeiten in Sequenzabweichungen außerhalb dieser DNA-
Bindedomäne gesucht. Dies ließ sich dadurch beweisen, dass alle drei SoxC-Proteine nach
Entfernen der Hälfte oder eines Drittels der C-terminalen Aminosäuresequenz gleichermaßen
gut an DNA binden konnten. Dabei wurde auch festgestellt, dass möglicherweise mehrere
Regionen im Sox11- und Sox12-Protein die Fähigkeit besitzen, die Bindung der HMG-Box
an DNA in vitro zu beeinträchtigen (Dy et al., 2008).
Als mögliche Erklärung wurde von der Arbeitsgruppe um Veronique Lefebvre ein Modell der
Autorepression formuliert (Dy et al., 2008). In diesem Modell fungieren die sauren Domänen
im Protein als Gelenke, wodurch es der C-terminalen Transaktivierungsdomäne möglich wird,
das Binden von DNA an die HMG-Domäne sterisch zu verhindern. Die C-terminale Domäne
kann folglich transaktivierend wirken und gleichzeitig ihre eigene Aktivität durch ein
Blockieren der Protein-DNA-Bindung einschränken. Die Kontrolle der SoxC-Aktivität in vivo
könnte so durch Faktoren vermittelt werden, die in der Lage sind, diese negative Auto-
regulation zu verhindern. Es stellt sich jedoch die Frage, ob diese Beobachtungen der
unterschiedlichen DNA-Bindeeffizienz in vitro für die in vivo Situation relevant sind, da das
Bindeverhalten nicht wirklich mit der Transaktivierungsfähigkeit korreliert.
Diskussion
76
4.2 DAS GFAP-SOX4-TRANSGENE MAUSMODELL
Die Sox-Proteine der Gruppe C zeigen ein stark überlappendes Expressionsmuster und eine
damit verbundene zumindest teilweise redundante Funktion. Eine gemeinsame Expression der
drei SoxC-Gene lässt sich auch im zentralen Nervensystem erkennen. Aufgrund ihrer
vermuteten gegenseitigen Funktionsübernahme können allerdings weder in Sox4- noch in
Sox11-defizienten Mäusen, vor ihrem embryonalen oder perinatalen Absterben, Defekte im
zentralen Nervensystem nachgewiesen werden (Cheung et al., 2000; Sock et al., 2004). Auch
in Sox12-Mausmutanten entwickelte sich das zentrale Nervensystem in Abwesenheit von
Sox12 normal.
Zur genaueren Untersuchung der Funktion von SoxC-Proteinen in der Entwicklung des
zentralen Nervensystems müssten somit alle drei Gruppenmitglieder gleichzeitig in der Maus
deletiert werden. Die Generierung doppelt- bzw. dreifach-defizienter Embryonen ist aber
extrem aufwendig und wurde auch erst im Laufe dieser Doktorarbeit nach Erzeugung Sox12-
defizienter Mäuse möglich. Als einen alternativen Ansatz zur Ermittlung der Funktion von
Sox12-Proteinen im sich entwickelnden Nervensystem wurden deshalb Überexpressions-
experimente gewählt.
Die Expression von Sox-Genen der Gruppe C kann in vivo in neuronalen Vorläuferzellen
detektiert werden, die bereits spezifiziert, aber noch nicht terminal differenziert sind
(Uwanogho et al., 1995). Auch in den Vorläuferzellen von Oligodendrozyten läßt sich eine
Expression der SoxC-Gene nachweisen, die später während der terminalen Differenzierung
herunterreguliert wird (Kuhlbrodt et al., 1998a). Aufgrund dieses Expressionsmusters wurde
im Rahmen der vorliegenden Arbeit der humane GFAP-Promotor verwendet, der eine
Überexpression von Sox4 in Radial-Glia-Zellen erlaubt, aus denen sich neuronale
Vorläuferzellen und Astrozyten entwickeln. Nur letztere bleiben GFAP-positiv (Brenner et al.,
1994; Nolte et al., 2001). Damit sollte es möglich sein, die Folgen einer transgenen Sox4-
Expression sowohl in einem undifferenzierten als auch in einem differenzierten Zelltyp zu
analysieren.
4.2.1 Expression des Sox4-Transgens in Radial-Glia und Astrozyten des sich
entwickelnden Cerebellums
Die Überexpression von Sox4 löste in den transgenen Mäusen Ataxien, Hydrocephali und den
Tod der Tiere am Ende der dritten postnatalen Woche aus. Die cerebelläre Ataxie war nicht
durch Veränderungen in den Körnerzellvorläufern erklärbar, da diese in dem hier
Diskussion
77
beschriebenen Mausmodell normal differenzierten. Wenn auch der GFAP-Promotor unter
bestimmten Gegebenheiten eine Expression des Transgens in externen Körnerzellen
ermöglicht (Marino et al., 2000), war dies in den im Rahmen dieser Arbeit generierten
transgenen Mäusen nicht der Fall. Zu keinem der untersuchten Zeitpunkte wurden in
Körnerzellvorläufern und differenzierten Neuronen nachweisbare Mengen des GFAP-Sox4-
Transgens exprimiert. Diese Beobachtungen stimmen wiederum mit den Ergebnissen überein,
die für das GFAP-HSV-TK-Transgen erhalten wurden (Delaney et al., 1996). In diesen
transgenen Mäusen wird das Gen für die Herpes simplex Virus-Thymidinkinase unter der
Kontrolle des humanen GFAP-Promotors exprimiert. Die Behandlung der neugeborenen
transgenen Mäuse mit Ganciclovir führte in Zellen, die die Thymidinkinase exprimieren, zur
Phosphorylierung des Medikaments in ein toxisches Nukleotid-Analogon, das in der Folge die
DNA-Replikation in proliferierenden Zellen kompetitiv beeinträchtigt. Diese Tiere
entwickelten Ataxien, und histologische Untersuchungen zeigten vor allem im Cerebellum
eine gestörte Astrozytenentwicklung. Desweiteren war das Kleinhirn in seiner Größe
reduziert und an Körnerzellen verarmt. Trotz der starken Auswirkungen der Ganciclovir-
behandlung auf die sich entwickelnden Körnerzellen der transgenen Tiere konnten weder in
unreifen Vorläufern noch in reifen Körnerzellen Trankripte des Thymidinkinase-Transgens
detektiert werden (Delaney et al., 1996).
In den hier beschriebenen GFAP-Sox4-transgenen Mäusen konnte eine Expression des
Transgens in Zellen der Ventrikulärzone mit Radial-Glia-Charakter und in Astrozyten
festgestellt werden. Für die Radial-Glia-Population konnte in früheren Untersuchungen
gezeigt werden, dass sie neben der Transformation zu Astrozyten (Schmechel und Rakic,
1979; Voigt, 1989) auch als Quelle für neuronale und oligodendrozytäre Vorläuferzellen
fungieren können (Malatesta et al., 2000; Miyata et al., 2001; Noctor et al., 2001; Tamamaki
et al., 2001). In der vorliegenden Arbeit konnte im Zuge der Spezifizierung der Radial-Glia
keine Expression des GFAP-Sox4-Transgens in neuronalen Vorläuferzellen oder Neuronen
festgestellt werden. Ähnliches wurde für die Entwicklung von Oligodendrozyten beobachtet.
Auch hier ließ sich weder in unreifen noch in reifen Oligodendrozyten ein transgenes Protein
nachweisen.
Diskussion
78
4.2.2 Gestörte Entwicklung der Bergmann-Glia im GFAP-Sox4-transgenen
Cerebellum
Trotz der deutlichen Expression des GFAP-Sox4-Transgens in den Radial-Glia des sich
entwickelnden Mausembryos schienen diese Zellen in ihrer Entwicklung nicht ernsthaft
beeinträchtigt zu sein. Jedoch konnten im postnatalen Cerebellum keine Zellen detektiert
werden, die von ihrer Position im Kleinhirn und ihrer Morphologie den Bergmann-Glia
entsprachen. Bergmann-Glia sind reife radiäre Astrozyten im Cerebellum, die mit ihren
Ausläufern Neurone bei ihrer Wanderung unterstützen (Rakic, 1971). Alle in dieser Studie
verwendeten Zellmarker, zu denen B-FABP, SoxB1, Sox9, RC2 und GFAP gehörten, wurden
in den GFAP-Sox4-transgenen Cerebella weiterhin exprimiert. Während sich im Wildtyp-
Cerebellum die Bergmann-Glia-Zellen jedoch sowohl mit dem Radial-Glia-Marker B-FABP
als auch mit dem Astrozyten-Marker GFAP anfärben ließen, war es im transgenen
Cerebellum nicht möglich, einen Zelltyp zu identifizieren, der beide Proteine enthielt. Die
meisten Zellen, die das Transgen exprimierten, waren B-FABP-positiv und wurden deshalb
den Radial-Glia-Zellen zugeordnet. Allerdings bildeten diese im mutanten Cerebellum keine
radiären Ausläufer. Während sich die B-FABP-positiven Zellen im Laufe der Entwicklung
des Wildtyp-Cerebellums in der Purkinjezellschicht positionierten und GFAP-positiv wurden,
waren diese Zellen im transgenen Kleinhirn überall verteilt und zeigten kein GFAP-Signal. In
den transgenen Mäusen konnten GFAP-positive Glia nur in tieferen Regionen des Kleinhirns
detektiert werden. In diesem Bereich befinden sich im Cerebellum von Wildtyp-Mäusen die
Astrozyten der weißen Substanz. Folglich konnte daraus geschlossen werden, dass die
fortwährende Expression von Sox4 in Radial-Glia-Zellen die Differenzierung dieser Zellen zu
Bergmann-Glia verhindert.
4.2.3 Das GFAP-Sox4-transgene Kleinhirn zeigt eine veränderte cerebelläre
Architektur
Frühere Studien ließen bereits erkennen, dass fehlende oder defekte Bergmann-Glia-Zellen
Störungen in der cerebellären Architektur verursachen können. So führte beispielsweise die
Deletion von Pten (phosphatase and tensin homolog), einem Tumorsuppressorgen, in
Bergmann-Glia zu einer verfrühten Differenzierung dieser Zellpopulation und einer
darauffolgenden Störung der neuronalen Migration und der Schichtenbildung im Cerebellum
(Yue et al., 2005). Die vorzeitige Reifung der Pten-defizienten Bergmann-Glia ließ sich
Diskussion
79
anhand der Entwicklung zahlreicher Fortsätze und der Ausbildung einer Astrozyten-ähnlichen
Morphologie erkennen. Ebenfalls konnte in der Largemyd-Maus ein Defekt in den Bergmann-
Glia identifiziert werden (Qu and Smith, 2005). In dieser spontanen Mausmutante ist das Gen
deletiert, das für die putative Glykosyltransferase Large kodiert. Large wird für die
Glykosylierung von Dystroglykan, einem Transmembran-Laminin-Rezeptor, benötigt und ist
im sich entwickelnden Cerebellum am stärksten in Bergmann-Glia und Purkinjezellen
exprimiert. In der Largemyd-Maus zeigten Populationen von cerebellären Körnerzellen einen
Migrationsdefekt und verblieben in Aggregaten an der pialen Oberfläche und in der
Molekularschicht des adulten Kleinhirns. Der Verlust der Large-Genexpression löste eine
Störung der Verankerung der Bergmann-Gliazell-Endfüße und eine Desorganisation der
Bergmann-Glia-Ausläufer aus. Die Fortsätze dieser Zellen ordneten sich weniger regelmäßig
an, kreuzten sich häufiger und besaßen mehrere Verzweigungen. Einhergehend mit dieser
Störung des glialen Netzwerkes ließ sich eine abweichende Struktur der externen
Körnerzellschicht nachweisen. Eine verzögerte Körnerzellwanderung in der externen
Körnerzell- und Molekularschicht führte dazu, dass Körnerzellen an falschen Positionen im
Kleinhirn anfingen, zu differenzieren und schließlich in diesen Schichten liegen blieben. Ein
Grund für diese wenig effiziente neuronale Migration könnte im gestörten Glia-Netzwerk zu
suchen sein (Qu and Smith, 2005).
Da auch in der hier beschriebenen GFAP-Sox4-Mausmutante Bergmann-Glia und ihre
Ausläufer fehlten, sollte die cerebelläre Architektur in diesen transgenen Tieren ebenfalls
schwer gestört sein. Genau dieser Befund war zu beobachten. Der cerebelläre Kortex GFAP-
Sox4-transgener Mäuse zeigte keinen typischen, in Schichten gegliederten Aufbau und es
bildeten sich keine Fissuren und Lobuli aus. Allerdings waren die wichtigsten neuronalen
Zelltypen korrekt spezifiziert und wiesen eine normale Differenzierung auf. Purkinje-, Korb-
und Sternzellen gruppierten sich ebenso wie die Körner- und Golgizellen zusammen, wobei
keine Vermischung dieser Gruppen beobachtet werden konnte. Somit schienen die Zelltypen
ebenfalls richtig sortiert zu sein (Gliem et al., 2006). Dennoch erreichten die neuronalen
Subtypen ihren eigentlichen Bestimmungsort nicht und sammelten sich in Aggregaten an.
Somit ist der cerebelläre Phänotyp der GFAP-Sox4-transgenen Mäuse durch das Fehlen der
Bergmann-Glia erklärbar.
In anderen Studien konnten als Ursache für Störungen in der Kleinhirnarchitektur auch
intrinsische Defekte in cerebellären Neuronen oder Oligodendrozyten gefunden werden. So
löste beispielsweise eine Mutation des extrazellulären Matrixmoleküls Reelin, das unter
anderem von cerebellären Körnerzellen sezerniert wird, eine gestörte Migration der
Diskussion
80
Purkinjezellen aus. Dadurch bildeten diese keine einlagige Purkinjezellschicht aus, sondern
verblieben größtenteils in Zellhaufen tief im cerebellären Kortex (Goffinet et al., 1984).
Die Rolle der Oligodendrozyten bei der Entstehung der cerebellären Architektur ließ sich
durch ein transgenes Mausmodell ermitteln, bei dem diese Gliazellen selektiv in einem
gewünschten Zeitrahmen entfernt werden konnten. Die hierfür verwendeten MBP-TK
transgenen Mäuse exprimierten das Herpes Simplex Virus 1 Thymidinkinasegen unter der
Kontrolle des MBP (basisches Myelin Protein)-Promotors spezifisch in Oligodendrozyten
(Mathis et al., 2003). Durch die Injektion des nicht gesundheitsschädlichen Nukleosid-
analogons FIAU, das in den transgenen Mäusen durch die Thymidinkinaseaktivität in ein
toxisches Produkt umgewandelt wurde, konnten Oligodendrozyten in einer zeitlich
induzierbaren Art und Weise zerstört werden. Der Verlust von Oligodendrozyten während der
ersten postnatalen Wochen führte zu einer Störung der cerebellären Zytoarchitektur. Die
kortikalen Schichten waren desorganisiert und eine abnormale Ausbildung der Folia ließ sich
erkennen. Die Purkinjezellen kamen in einer mehrzelligen Schicht zu liegen und ihre
Dendritenbäume waren schlecht entwickelt. Zusätzlich konnte eine verringerte
Körnerzelldichte und ein ungeordnetes Bergmann-Glia-Netzwerk festgestellt werden.
Desweiteren beeinträchtigte das Fehlen von Oligodendrozyten die Migration von
Interneuronen in die Molekularschicht (Mathis et al., 2003).
Auch in den Untersuchungen der GFAP-Sox4-transgenen Mäuse war ein neuronaler oder
oligodendroglialer Beitrag zum cerebellären Defekt in den transgenen Tieren theoretisch
denkbar. Denn sowohl Neurone als auch Oligodendrozyten können aus Radial-Glia-Zellen
hervorgehen (Malatesta et al., 2000; Miyata et al., 2001; Noctor et al., 2001; Tamamaki et al.,
2001) und diese Vorläuferzellen exprimierten das GFAP-Sox4-Transgen. Jedoch kann davon
ausgegangen werden, dass diese Beiträge eher eine geringe Rolle spielen, da die
Spezifizierung der GFAP-Sox4-exprimierenden Zellen normal war. Ebenso wurde die
Expression des Transgens im Zuge der Spezifizierung in neuronalen und Oligodendrozyten-
Vorläufern abgeschaltet. Die Tatsache, dass in diesen Vorläuferzellen Sox4 und Sox11 bereits
endogen exprimiert werden (Cheung et al., 2000; Kuhlbrodt et al., 1998a; Uwanogho et al.,
1995), sprechen ebenfalls gegen einen störenden Einfluß von möglicherweise noch
vorhandenen Restmengen des GFAP-Sox4-Transgens in diesen Zellen.
Diskussion
81
4.2.4 Bedeutung von Sox4 für die Reifung von Radial-Glia
Aufgrund ihres Expressionsmusters wurde den Sox-Proteinen der Gruppe C eine Rolle bei der
neuronalen und glialen Reifung zugeordnet. Ihr Vorkommen läßt sich in neuronalen und
oligodendroglialen Vorläuferzellen nachweisen, die aus der Ventrikulärzone ausgewandert
sind. Während der terminalen Differenzierung dieser Zellen kommt es schließlich zum
Abschalten der Genexpression (Hargrave et al., 1997; Kuhlbrodt et al., 1998a). In der hier
vorliegenden Arbeit gibt es Hinweise, dass die fortwährende Anwesenheit von Sox4 eine
Beeinträchtigung der Reifung von Radial-Glia-Zellen zur Folge hat. Somit kann die
Hypothese aufgestellt werden, dass SoxC-Proteine in glialen Vorläuferzellen vorhanden sind,
damit diese Zellen in einem undifferenzierten Zustand gehalten werden. Um eine terminale
Differenzierung der Zellen zu ermöglichen, muß die Expression der SoxC-Gene abgeschaltet
werden.
Ähnliches konnte in Überexpressionsstudien von Engrailed-2 in Purkinjezellen festgestellt
werden. Der Transkriptionsfaktor Engrailed-2 ist während der Embryonalentwicklung der
Maus in cerebellären Purkinjezellen exprimiert und wird nach ihrer Geburt in diesen Zellen
herunterreguliert. Zu diesem Zeitpunkt beginnen die Purkinjezellen zu differenzieren. Um
herauszufinden, ob das Abschalten der Expression von Engrailed-2 für die Reifung dieser
Zellen notwendig ist, wurden Untersuchungen an L7En-2 transgenen Mäusen durchgeführt
(Jankowski et al., 2004). In diesen Tieren kommt es zu einer fortlaufenden Expression von
Engrailed-2 in Purkinjezellen über den Tag der Geburt hinaus. Die verlängerte Expression
dieses Transkriptionsfaktors bewirkte eine verzögerte Reifung der Purkinjezellen. Dies zeigte
sich vor allem in einer verlangsamten Dendritogenese dieser Neurone und einer verspäteten
Ausbildung der einlagigen Purkinjezellschicht. Zusätzlich war auch die Expression von Parv-
albumin in den transgenen Purkinjezellen um einige Tage verzögert (Jankowski et al., 2004).
In einer anderen Studie der Arbeitsgruppe konnte gezeigt werden, dass auch eine verlängerte
Expression von Sox4 in Oligodendrozyten eine vollständige Reifung dieser Zellen verhinderte.
Für diese Untersuchungen wurden MBP-Sox4-transgene Mäuse generiert, in denen Sox4
unter dem MBP-Promotor exprimiert wurde (Potzner et al., 2007). Dieser Promotor
ermöglichte eine Transkription des Transgens in terminal differenzierenden Oligodendrozyten
des zentralen Nervensystems. Nach den ersten postnatalen Wochen der Mausentwicklung
wurde die Transgenexpression jedoch wieder abgeschaltet. Während Sox4 normalerweise in
reifenden Oligodendrozyten herunterreguliert wird, blieb die Expression in den transgenen
Mäusen aufgrund der Aktivität des MBP-Sox4-Transgens über dieses Stadium hinaus erhalten.
Diskussion
82
Das Ergebnis der verlängerten Sox4-Produktion war eine schwere Hypomyelinisierung
während der ersten postnatalen Wochen der Mausentwicklung. Die Myelin-Genexpression
war stark reduziert und die Myelinscheiden in einigen Regionen des zentralen Nervensystems
sehr dünn. Erst nachdem die Expression des MBP-Sox4-Transgens abgeschaltet wurde,
konnte eine Besserung des Phänotyps erfolgen (Potzner et al., 2007). Diese Beispiele deuten
darauf hin, dass Zellen nach dem Austritt aus dem Mitosezyklus den Weg der Differenzierung
einschlagen und dass dieser Prozess blockiert werden muß, um eine Zelle in einem
undifferenzierten und wandernden Zustand zu halten.
Bei der Analyse des Einflusses der Sox-Proteine der Gruppe C auf die Neurogenese durch
Überexpressionsstudien im frühen Huhn-Embryo wurden entgegengesetzte Ergebnisse
erhalten. Diese Studie zeigte, dass sowohl Sox4 als auch Sox11 vorzeitig pan-neuronale
Eigenschaften in unreifen neuronalen Vorläuferzellen induzieren. Offensichtlich scheinen sich
die Sox-Proteine der Gruppe C gegensätzlich auf die neuronale und gliale Differenzierung
auszuwirken. Dabei wird die neuronale Reifung gefördert, während es bei der glialen
Differenzierung zur Repression kommt (Bergsland et al., 2006).
Der in den GFAP-Sox4-transgenen Mäusen auftretende Hydrocephalus könnte ebenfalls auf
einen Reifungsdefekt der Radial-Glia-Zellen in diesen Tieren zurückzuführen sein. Ein
Hydrocephalus lässt sich oft beobachten, wenn Ependymzellen fehlen oder nicht
funktionieren. Diese Zellen entwickeln sich ähnlich wie Bergmann-Glia aus Radial-Glia-
Zellen (Spassky et al., 2005). Sie kleiden die Wände der Gehirnventrikel aus und spielen eine
wichtige Rolle beim Transport der Cerebrospinalflüssigkeit (CSF) durch das Ventrikelsystem.
Um dies bewerkstelligen zu können, sind die gewöhnlichen Ependymzellen im Besitz von
beweglichen Flimmerhaaren, den Kinocilien. Kommt es zum Verlust der Beweglichkeit der
ependymalen Cilien, kann dies zu einer Beeinträchtigung des Flüssigkeitsstroms in den
Gehirnventrikeln und zu einem Hydrocephalus führen. Dieser Phänotyp war beispielsweise in
Untersuchungen von Mäusen mit Mutationen des axonemalen Dyneins Mdnah5 (dynein,
axonemal, heavy chain 5) zu beobachten (Ibanez-Tallon et al., 2004). Mdnah5 wird in
Ependymzellen exprimiert und ist wichtig für die ultrastrukturelle und funktionelle
Unversehrtheit der ependymalen Cilien. Wird das Mdnah5-Gen mutiert, führt dies zu einer
gestörten Beweglichkeit der ependymalen Cilien und zum Verlust einer gerichteten
Fließbewegung der Cerebrospinalflüssigkeit. Das Fehlen eines Flüssigkeitsstroms in den
Mdnah5-defizienten Mäusen verursachte einen Verschluß des cerebralen Aquädukts
(Aquaeductus cerebri oder auch Aquaeductus mesencephali) während der frühen postnatalen
Gehirnentwicklung. Als Folge dessen kam es zur Ausbildung eines Hydrocephalus. Mit dieser
Diskussion
83
Studie wurde zum ersten Mal gezeigt, dass ein direkter funktioneller Zusammenhang
zwischen der Flüssigkeitsströmung, die durch die Bewegungen der ependymalen Cilien
erzeugt wird, und der korrekten Ausbildung des Ventrikelsystems während der frühen
postnatalen Gehirnentwicklung besteht (Ibanez-Tallon et al., 2004). In den hier analysierten
GFAP-Sox4-transgenen Mäusen ließen sich Ependymzellen mit Cilien nachweisen.
Allerdings konnte aufgrund der begrenzten Zahl an verfügbaren Tieren nicht analysiert
werden, ob diese Zellen und ihre Cilien funktionsfähig waren. Ähnlich wie bei den Mdnah5-
defizienten Mäusen ließ sich auch in den GFAP-Sox4-transgenen Mäusen ein verengter
Aquaeductus mesencephali beobachten. Dies könnte ebenfalls auf einen Defekt der
ependymalen Cilien in den transgenen Tieren und dem daraus resultierenden Hydrocephalus
hindeuten.
Zusammenfassend konnten in dieser Arbeit wichtige Funktionen der SoxC-Proteine
aufgezeigt werden. Diese Faktoren sind entscheidend an der Aufrechterhaltung des
undifferenzierten Zustands glialer Vorläuferzellen beteiligt. Erst nach Abschalten der SoxC-
Genexpression wird eine terminale Differenzierung dieser Zellen möglich. Zudem konnte
nachgewiesen werden, dass alle drei Gruppenmitglieder ähnliche biochemische Eigenschaften
und eine überlappende Expression während der Embryogenese der Maus aufweisen.
Aufgrund der fehlenden Entwicklungsdefekte in den analysierten Sox12-defizienten Mäusen
kann eine kompensatorische Wirkung von Sox4 und Sox11 angenommen werden. Diese
Vermutung ließ sich durch den Nachweis einer erhöhten Expression der beiden Faktoren in
einzelnen Organen Sox12-defizienter Tiere bekräftigen.
Material
85
5 Material
5.1 ORGANISMEN
5.1.1 Mausstämme
Für die Zucht der im Rahmen dieser Arbeit generierten, gentechnisch veränderten Mauslinien
wurden der Wildtyp-Inzucht-Mausstamm FVB/N (Charles River Deutschland, Sulzfeld) und
die genetisch veränderte EIIaCre-Mauslinie (Lakso et al., 1996) verwendet.
5.1.2 Bakterienstämme
Folgende Bakterienstämme der Firma Stratagene (La Jolla, USA) wurden in dieser Arbeit
verwendet:
Bezeichnung Genotyp
XL1 Blue recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac
[F’ proAB lacIqZ∆M15 Tn10 (Tetr)]
BL21 (DE3) pLysS E.coli B F- dcm ompT hsdS(rB- mB
-) gal λ(DE3) [pLysS Camr]
5.1.3 Zelllinien
Folgende Zelllinien wurden in dieser Arbeit verwendet:
Linie Herkunft Referenz
HEK293 Mensch, embryonale Nierenzellen American Type Culture Collection
(ATCC)
Neuro2a Maus, Neuroblastom American Type Culture Collection
(ATCC)
Material
86
5.2 CHEMIKALIEN UND ALLGEMEINE REAGENZIEN
Salze, Lösungsmittel, Chemikalien und allgemeine Reagenzien stammten, soweit nicht anders
vermerkt, von den Firmen Carl Roth (Karlsruhe), Merck (Darmstadt) und Sigma (München).
Medien, Puffersubstanzen und Materialien für die Zellkultur wurden von den Firmen
Gibco/BRL (Eggenstein), Invitrogen (Karlsruhe), Serva (Heidelberg), Sarstedt (Nümbrecht),
Renner (Darmstadt) und TPP (Trasadingen, Schweiz) bezogen.
Radiochemikalien wurden von der Firma Amersham (Braunschweig) erhalten.
5.3 ZUSAMMENSETZUNG GEBRÄUCHLICHER MEDIEN UND LÖSUNGEN
Für die Herstellung von Lösungen, Puffern und Verdünnungen wurde Reinstwasser aus einer
Deionisationsanlage MilliQ der Firma Millipore (Eschborn) mit einem spezifischen
Widerstand von 18,2 MΩ/cm3 verwendet.
Medien/ Lösungen Zusammensetzung
AP-Puffer
100 mM Tris, pH 9,5; 50 mM MgCl2; 100 mM NaCl;
steril filtrieren; vor Gebrauch 5 µl 20 % Tween-20 und 1 µl
1 M Levamisol pro ml Puffer zugeben
Citratpuffer 9 ml Stammlösung A; 41 ml Stammlösung B; 450 ml H2O
Citrat-Stammlösung A 100 mM Citronensäure
Citrat-Stammlösung B 100 mM Natriumcitrat
Coomassie-Färbelösung 0,1 % Coomassie brilliant blue R-250; 10 % Eisessig;
40 % Ethanol
Coomassie-Entfärbelösung 10 % Eisessig, 40 % Ethanol
Denaturierungslösung 0,5 M NaOH; 1,5 M NaCl
Denhardt (50 x) 1 % Ficoll 400; 1 % Polyvinylpyrrolidon; 1 % BSA
Digestion-Puffer 10 mM Tris, pH 8,0; 100 mM NaCl; 25 mM EDTA;
0,5 % SDS
10 x DNA-Probenpuffer 50 % TE; 50 % Glycerin; 0,05 % Xylencyanol;
0,05 % Bromphenolblau
ECL Lösung A 0,025 % Luminol; 0,1 M Tris, pH 8,6
Material
87
Medien/ Lösungen Zusammensetzung
ECL Lösung B 0,11 % p-Hydroxy-Cumarinsäure in DMSO
ECL Entwicklerlösung 6 ml Lösung A; 60 µl Lösung B; 1,8 µl H2O2
ES-Lysispuffer
50 mM Tris, pH 8,0; 10 mM EDTA; 10 mM NaCl;
0,1 % SDS; vor Gebrauch 100 µg/ml RNase A und 1 mg/ml
Proteinase K zugeben
Hanks-Lösung
137 mM NaCl; 5 mM KCl; 0,7 mM Na2HPO4;
5 mM Glucose; 2,5 mM CaCl2; 1,2 mM MgSO4;
4,17 mM NaHCO3; pH 7,2; steril filtrieren; bei 4 °C lagern
Hybridisierungspuffer
(in situ)
1 ml 10 x Salz; 5 ml Formamid; 2 ml 50 % Dextransulfat;
1 ml Yeast-RNA (10 mg/ml); 100 µl 50 x Denhardt-Reagenz;
900 µl H2O
3 x Lämmli-Probenpuffer 187 mM Tris, pH 6,8; 6 % SDS; 30 % Glycerin;
0,02 % Bromphenolblau; 15 % β-Mercaptoethanol
LB-Agar LB-Medium; 1,5 % Agar
LB-Medium 1 % Bacto-Trypton; 0,5 % Hefe-Extrakt; 0,5 % NaCl
Lower-Tris 1,5 M Tris, pH 8,8; 0,4 % SDS
Luciferase-Lysispuffer
88 mM Tris, pH 7,8; 88 mM MES, pH 7,8;
12,5 mM MgOAc; 1 mM DTT; 0,1 % Triton X-100;
2,5 mM ATP
MABT-Puffer 100 mM Maleinsäure, pH 7,5; 150 mM NaCl; Lösung
autoklavieren; vor Gebrauch 0,1 % Tween-20 zugeben
Mowiol
6,0 g Glycerin und 2,4 g Mowiol 488 in 6 ml H2O geben; 2 h
bei RT inkubieren; 12 ml 0,2 M Tris pH 8,5 zugeben; 24 h
bei 53 °C rotieren; bei 4000 Upm zentrifugieren, aliquotieren
Narkotikum
(Ketamin/Rompun)
1,2 ml Ketamin (10 %); 0,8 ml Rompun (2 %); 8 ml isotone
NaCl-Lösung; 10 µl pro g Gewicht der Maus einsetzen
PBS (1 x) 140 mM NaCl; 2,7 KCl; 10 mM Na2HPO4;
1,2 mM KH2PO4; pH 7,3
PBS-T PBS mit 0,1 % Tween-20; pH 7,3
Material
88
Medien/ Lösungen Zusammensetzung
PFA (4 %) 20 g Paraformaldehyd (PFA) in 300 ml H2O (65 °C) lösen;
50 ml 10 x PBS; ad 500 ml H2O; pH 7,4; steril filtrieren
Prähybridisierungslösung
(für Southern-Blot)
50 % Formamid; 5 x SSC; 5 x Denhardt-Reagenz;
1,5 % SDS; 100 µg/ml denaturierte (3 min bei 96 °C)
Lachsspermien-DNA
Puffer A
6 M Guanidinhydrochlorid; 0,1 M NaH2PO4;
0,01 M Tris; pH 8,0 bzw. für die Aufreinigung des Sox4-
Peptids Zugabe von 10 mM Imidazol und 0,01 % NP-40
Puffer B
8 M Harnstoff; 0,1 M NaH2PO4; 0,01 M Tris bzw. für die
Aufreinigung des Sox4-Peptids Zugabe von 10 mM Imidazol
und 0,01 % NP-40
10 x Salz 126 mM Tris, pH 7,5; 1,85 M NaCl; 100 mM NaH2PO4;
50 mM EDTA
SDS-Laufpuffer 25 mM Tris, pH 8,3; 190 mM Glycin; 0,1 % SDS
SSC (20 x) 3 M NaCl; 0,3 M Natriumcitrat; pH 7,0
TAE (1 x) 40 mM Tris-Acetat; 1 mM EDTA; pH 8,0
Tail-Lysispuffer 50 mM Tris, pH 8,0; 100 mM EDTA, pH 8,0; 0,5 % SDS
TBE (1 x) 90 mM Tris; 90 mM Borsäure; 2,5 mM EDTA; pH 8,3
TE-Puffer 10 mM Tris; 0,1 mM EDTA; pH 8,0
Upper-Tris 0,5 M Tris, pH 6,8; 0,4 % SDS
Waschpuffer (in situ) 1 x SSC; 50 % Formamid; 0,1 % Tween-20
Western-Transferpuffer 48 mM Tris; 39 mM Glycin; 0,04 % w/v SDS;
20 % v/v Methanol
Zell-Lysispuffer
10 mM HEPES, pH 7,9; 10 mM KCl; 5 mM MgCl2; 350 mM
NaCl; 0,1 mM EDTA; 0,1 mM EGTA; 0,75 % NP-40; 2 mM
DTT; 10 % Glycerin; 5 µg/ml Aprotinin; 5 µg/ml Leupeptin
Material
89
5.4 PROTEINE UND ENZYME
Alle in dieser Arbeit verwendeten Enzyme wurden von Gibco/BRL(Eggenstein) MBI
Fermentas (St. Leon-Roth), NewEngland Biolabs (Frankfurt) oder Roche Diagnostics
(Mannheim) bezogen.
5.5 OLIGONUKLEOTIDE
Die im Folgenden aufgelisteten Oligonukleotide wurden von der Firma Invitrogen (Karlsruhe)
hergestellt und für die angegebenen Anwendungen eingesetzt.
5.5.1 Oligonukleotide für die Genotypisierung der GFAP-Sox4-transgenen Mäuse
Name Sequenz (5’-3’) Primer
GFAP-tg1 TCG CCA GTC TAG CCC ACT CC 5’
rnSox4-tg1 GAA AGC GAC ATC GTC TCT AGC 3’
5.5.2 Oligonukleotide für die Genotypisierung der Sox12--Mäuse
Name Sequenz (5’-3’) Primer
mmSox12-19 (Primer a) GGA GAA CAG ATG GGC AGC G 5’
mmSox12-20 (Primer b) GGC CAG TAG AGC TCC TCC G 3’
mmSox12-21 (Primer c) CGC ACA CCG GCC TTA TTC C 3’
5.5.3 Oligonukleotide für Klonierungen
Name Sequenz (5’-3’) Pr. Matrize Position Anwendung
mmSox12-11 GAA TGA GCT GAT
GGA CTA GC 5’
pBKS-Sox12up-
8,4kb 5.2 8438-8457
mmSox12-12 CCA TAT GAA AAT
ACC GAA TCA G 3’
pBKS-Sox12up-
8,4kb 5.2 8757-8736
Herstellung
der 5`-Sonde
für Southern-
Blot
Material
90
5.5.4 Oligonukleotide für RT-PCR
Name Sequenz (5’-3’) Pr. Genbank-Ref. Position Anwendung
Actin-1 CCT GGG CAT GGA
GTC CTG 5’ ------- -------
Actin-2 GGA GCA ATG ATC
TTG ATC TTC 3’ ------- -------
für quantitative
und Standard-
RT-PCR
mmSox11-60 ACC CAC AGA AAC
CAT TAC GG 5’ NM_009234 3652-3671
mmSox11-61 CTT CCT CAC CAT
GGA AAA CG 3’ NM_009234 4014-3995
für quantitative
RT-PCR
mmSox12-25 CGA GGT TAC CGA
GAT GAT CG 5’ NM_011438 1224-1243
mmSox12-26 GAG GGA TGG TTC
AAG CTG AG 3’ NM_011438 1813-1794
für Standard-
RT-PCR (um-
fassen putatives
Sox12-Intron)
mmSox12-27 CAG TCT GGG GAC
AGA GTT CC 5’ NM_011438 2224-2243
mmSox12-28 GAC CAG TGG AGC
AGA CTT GG 3’ NM_011438 2624-2605
für quantitative
RT-PCR
PLP/GFP1 CGG TCA CGA ACT
CCA GCA GG 5’ ------- -------
PLP/GFP2 GCG ACG TAA ACG
GCC ACA AG 3’ ------- -------
für Standard-
RT-PCR
Sox4-23 mm/rat TCG TGA ACT GCA
ATC GAC TG 5’ XM_344594 321-340
Sox4-24 mm/rat CGC GTT GTT GGT
CTG TTG TA 3’ XM_344594 677-658
quant./ erkennen
Transkripte des
Sox4-Gens und
Sox4-Transgens
Sox4-25 mm/rat AGC TTC TTG GCT
TCC TAC CT 5’ NM_009238 168-187
Sox4-26 mm/rat TTG GTA GCC GGA
GTA TCT TC 3’ NM_009238 428-409
für quantitative
RT-PCR
Material
91
5.6 PLASMIDE
Gen Plasmid Verwendung kloniert/ erhalten
von
mmSox12 (ORF) pBKS Vorlage für die Klonierung und für die
in situ Sonde M. Hoser
Sox12up-8,4kb 5.2 pBKS Vorlage für die 5’-Southern-Sonde M. Hoser
mmSox4 pCING-B in ovo Elektroporation E. Sock
mmSox11 pCING-B in ovo Elektroporation E. Sock
mmSox12 pCING-A in ovo Elektroporation E. Sock
rnSox4 pCMV5 Transfektionen, Zellextrakte E. Sock
rnSox11 pCMV5 Transfektionen, Zellextrakte E. Sock
mmSox12 (ORF) pCMV5 Transfektionen, Zellextrakte M. Hoser
delta-Sox4rat pET28a für die Peptidsynthese M. Hoser
delta-Sox11rat pET28c für die Peptidsynthese M. Hoser
delta-Sox12mouse pET28a für die Peptidsynthese M. Hoser
5.7 IN SITU SONDEN
Gen Plasmid Linearisierung
für antisense
RNA-
Pol.
Genbank-
Ref. Position
kloniert
von
rnSox4 pZL1-Sox4 BglII SP6 XM_344594 2015-3142 E. Sock
rnSox11 pZL1-Sox11 BglII SP6 NM_053349 543-2035 E. Sock
mmSox12 pBKS-
mmSox12 BglII T7 NM_011438 559-1293 M. Hoser
mmSox12-
3’UTR
pBKS-Sox12-
3’UTR XhoI T7 NM_011438 1932-2620 M. Hoser
Material
92
5.8 SOUTHERN-BLOT -SONDEN
Name Sonde Länge Herkunft
5’-Sonde PCR-Produkt; Primer mmSox12-11/12 320 bp pBKS-Sox12up-8,4kb 5.2
3’-Sonde Spaltung mit BamHI/PstI 581 bp pBKS-Sox12-3’South-
Sonde 4
5.9 ANTIKÖRPER
Die im Folgenden aufgelisteten Antikörper und -konjugate wurden für Western-Blot (WB),
Gelshift (GS), Immuncytochemie (ICC) bzw. Immunhistochemie (IHC) verwendet.
5.9.1 Primärantikörper
Antigen Bezeichnung Spezies Anw. Verd. Herkunft
α-acetyliertes
α-Tubulin C3B9 Maus, monoklonal IHC 1:100
K. Gull, Uni
Oxford, UK
α-acetyliertes
α-Tubulin
6-11B-1
T 6793 Maus, monoklonal WB 1:2000
Sigma, St. Louis,
MO
α-B-FABP ------- Kaninchen,
Antiserum
IHC
ICC
1:10.000
1:40.000
T. Müller, MDC,
Berlin
α-Brn2 α-Brn2-ET Kaninchen,
Antiserum
WB
GS
1:2000
0,2 µl
M. Wegner,
Erlangen
α-Calbindin
D28k CB-38
Kaninchen,
Antiserum IHC 1:3000
Swant, Bellinzona,
Schweiz
α-Calretinin 7699/4 Kaninchen,
Antiserum IHC 1:2000
Swant, Bellinzona,
Schweiz
α-DIG-AP-
konj. 1093 274
Schaf Fab-
Fragmente in situ -------
Roche Diagnostics,
Mannheim
α-DIG-
Rhodamin S7165 ApopTag Red Kit TUNEL -------
Serologicals/QBio-
gene, Heidelberg
α-GFAP G-A-5
MAB3402 Maus, monoklonal
IHC
ICC
1:1000
1:4000
Millipore,
Temecula, CA
Material
93
Antigen Bezeichnung Spezies Anw. Verd. Herkunft
α-GFP 1 814 460 Maus, monoklonal IHC 1:100 Roche Diagnostics,
Mannheim
α-GFP A11122 Kaninchen,
Antiserum
IHC
ICC
1:500
1:2000
Molecular Probes,
Göttingen
α-Ki67 RM-9106 Kaninchen,
monoklonal IHC 1:500
Lab Vision,
Fremont, CA
α-MAP2 M1406 Maus, monoklonal ICC 1:500 Sigma, St. Louis,
MO
α-NeuN MAB377 Maus, monoklonal IHC 1:500 Millipore,
Temecula, CA
α-Oct6 5499
(α-Tst-1)
Kaninchen,
Antiserum
IHC
WB
1:1000
1:3000 M. Wegner
α-Pax2 71-6000 Kaninchen,
Antiserum IHC 1:200
Zymed, San
Francisco, CA
RC2 ------- Maus, monoklonal,
IgM IHC 1:200
DSHB, Uni Iowa,
USA
α-RORα sc-6062 Ziege, Antiserum IHC 1:100 Santa Cruz Biotech.,
Santa Cruz, CA
α-SoxB1 ------- Kaninchen,
Antiserum IHC 1:500
Hisato Kondoh, Uni
Osaka, Japan
α-Sox4 α-Sox4 gp2
8°
Meerschweinchen,
Antiserum
IHC
WB
1:1000
1:3000 M. Hoser, Pineda
α-Sox9 O9-1 aff.pur. Kaninchen,
Antiserum, aff.-pur. IHC 1:2000 E. Sock, Pineda
α-Sox10 α-Sox10-1 gp Meerschweinchen,
Antiserum IHC 1:1000 E. Sock, Pineda
α-Sox11 α-Sox11 gp2
3°
Meerschweinchen,
Antiserum
IHC
WB
1:1000
1:3000 M. Hoser, Pineda
α-Sox12 α-Sox12
Nterm rb2 aff
Kaninchen,
Antiserum, aff.-pur. IHC 1:1000 Pineda
α-Sox12 α-Sox12 Nt
gp2
Meerschweinchen,
Antiserum
WB
GS
1:3000
0,2 µl Pineda
α-Tuj1 MMS-435P Maus, monoklonal IHC
ICC
1:5000
1:20.000
Covance, Denver,
PA
Material
94
5.9.2 Sekundärantikörper
Antigen Spezies Konjugat Anwendung Verd. Herkunft
α-Kaninchen Ziege Cy2
Cy3 IHC, ICC
1:100
1:200
Dianova,
Hamburg
α-Maus Ziege Cy2
Cy3 IHC, ICC
1:100
1:200
Dianova,
Hamburg
α-Maus IgM Ziege Alexa Fluor 546 IHC 1:500 Mol. Probes,
Göttingen
α-Meerschweinchen Ziege Cy2
Cy3 IHC
1:100
1:200
Dianova,
Hamburg
α-Maus Ziege HRP WB 1:3000 Biorad,
München
ProteinA ------- HRP WB 1:3000 Biorad,
München
Methoden
95
6 Methoden
6.1 TIERHALTUNG
Die Mäuse wurden gemäß dem Tierschutzgesetz (TSchG) artgerecht gehalten. Um das Sox12-
-Allel zu generieren, wurden die chimären Tiere mit der EIIa-Cre-Mauslinie (C57BL/6J)
(Lakso et al., 1996) verpaart. Die Sox12--Mäuse wurden im heterozygoten Zustand mit dem
Wildtyp-Inzucht-Stamm FVB/N (bezogen von Charles River Deutschland, Sulzfeld)
weitergezüchtet. Zur Erzeugung von Sox12-/--Tieren wurden heterozygote Tiere untereinander
verpaart. Die Analysen der Sox12-Mausmutanten wurden in dieser Arbeit mit den Nach-
kommen der zweiten bis vierten Generation (F2-F4) durchgeführt. Die GFAP-Sox4-
transgenen Tiere basieren ebenfalls auf Verpaarungen mit dem Wildtyp-Inzucht-Stamm
FVB/N (bezogen von Charles River Deutschland, Sulzfeld).
6.2 ZELLKULTURMETHODEN
6.2.1 Transfektion von DNA in eukaryontische Zellen
Die in der vorliegenden Arbeit verwendeten Zelllinien wurden in DMEM- (+ Glutamax I;
Gibco/BRL, Eggenstein) Medium in Gegenwart von 10 % fötalem Kälberserum (FKS) sowie
100 U/ml Penicillin und 10 mg/ml Streptomycin kultiviert und je nach Zelllinie alle drei bis
fünf Tage im Verhältnis 1:3 bis 1:10 verdünnt. Das Ablösen der adhärenten Zellen zur
Subkultivierung erfolgte durch Inkubation mit Trypsin-EDTA (Gibco/BRL, Eggenstein). Die
Inkubation der Zellkulturplatten fand bei 37 °C in einer 5 %igen CO2-Atmosphäre statt.
6.2.1.1 Transfektion von Säugerzellen mit Polyethylenimin (PEI)
Transiente Transfektionen von HEK293-Zellen zur Luciferase-Aktivitätsmessung wurden in
3,5 cm Zellkulturplatten (Sarstedt, Nümbrecht) durchgeführt. Die entsprechenden Mengen
Luciferase-Reporter- und Effektor-Plasmid wurden in 500 µl serumfreiem DMEM-Medium
gelöst. Nach Zugabe von 6 µl 1 x PEI (Sigma, München) wurden die Ansätze gut durchmischt,
10 min bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend 250 µl pro Zellkulturplatte in das
Medium der Zellen gegeben. Nach 48 h wurden die Zellen geerntet und für den Luciferasetest
verwendet (siehe 6.2.2).
Methoden
96
Transiente Transfektionen von HEK293-Zellen zur Gewinnung rekombinanter Proteine
erfolgte in 10 cm Zellkulturplatten (Sarstedt, Nümbrecht). 10 µg CMV-Expressionsplasmid
wurden in 500 µl serumfreiem DMEM-Medium gelöst. Nach Zugabe von 30 µl 1 x PEI
wurden die Ansätze gut durchmischt, 10 min bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend
in das Medium der Zellen gegeben. 48 h nach der Transfektion wurden die Zellen geerntet
und Proteinextrakte hergestellt (siehe 6.4.2).
6.2.1.2 Transfektion von Säugerzellen mit Superfect
Transiente Transfektionen von Neuro2a-Zellen zur Luziferase-Aktivitätsmessung erfolgten
unter Verwendung von SuperFect (Qiagen, Hilden) nach den Angaben des Herstellers in
3,5 cm Zellkulturplatten. Ab der Transfektion wurden die Zellen in DMEM mit 5 % FKS
kultiviert. Die mit den entsprechenden Mengen Luziferase-Reporter- und Effektor-Plasmid
transfizierten Zellen wurden nach 48 h geerntet und für den Luziferasetest verwendet (siehe
6.2.2).
6.2.2 Luciferase-Aktivitätstest
Nachdem das Medium von den Zellkulturplatten (3,5 cm) abgesaugt worden war, wurden je
200 µl Luziferase-Lysispuffer gleichmäßig auf den Platten verteilt. Nach Lyse der Zellen
konnten je 150 µl der Zellextrakte in Luminometerröhrchen überführt werden. Die Messung
wurde mit dem Luminometer Lumat LB 9501 (Berthold, Bad Wildbad) und 0,5 mM Luciferin
(Serva, Heidelberg) in 5 mM Kaliumphosphat, pH 7,8 durchgeführt. Nach automatischer
Injektion von 100 µl Luciferinlösung wurden die relativen Lichteinheiten direkt bestimmt.
6.2.3 Präparation primärer cerebellärer Kulturen
Für die Kultivierung der primären cerebellären Zellen wurden 24-Well-Zellkulturplatten (TPP,
Trasadingen, Schweiz) mit Glasplättchen versehen und mit einer Poly-L-Lysin-Lösung
(200 µg/ml in PBS) über Nacht bei RT unter sterilen Bedingungen beschichtet. Tags darauf
wurden die einzelnen Wells dreimal mit sterilem H2O gewaschen und unter der Sterilbank ca.
1 h getrocknet.
Für die Herstellung primärer cerebellärer Kulturen wurden die Cerebella von Mäusen am
Postnatalstadium P9 verwendet. Unter mehrmaligem Wechsel der kalten Hanks-Lösung und
der 5 cm Kulturschalen wurden die Cerebella herauspräpariert und von den Meningen befreit.
Methoden
97
Anschließend wurde das Gewebe mechanisch zerkleinert und für 15 min bei 37 °C mit 10 ml
0,1 % Trypsin-EDTA in PBS behandelt. Die Zellsuspension wurde in 20 ml 15 % FKS in
PBS überführt, durch ein Zellsieb (250 µm) filtriert und das Filtrat für 10 min bei RT und
1200 Upm in einer Eppendorf Centrifuge 5810 R (Eppendorf, Hamburg) abzentrifugiert. Das
Zellpellet wurde in 5 ml Neurobasal-Medium (Gibco/BRL, Eggenstein), das mit 2 % B-27
Supplement und 2 mM Glutamax (Gibco/BRL, Eggenstein) versetzt war, resuspendiert und
die Zellzahl mit einer Neubauer-Zählkammer bestimmt. Schließlich wurden 2 x 105 Zellen in
die mit Glasplättchen versehenen und beschichteten Vertiefungen (siehe oben) einer 24-Well-
Zellkulturplatte gegeben. Nach 24 h wurde das Medium einmal gewechselt und die Zellen für
weitere sieben Tage kultiviert.
6.2.4 Immuncytochemie von primären cerebellären Kulturen
Nach Absaugen des Mediums wurden die auf Glasplättchen kultivierten primären
cerebellären Zellen ( 6.2.3) bei RT 15 min mit 3 % Paraformaldehyd in PBS fixiert und
anschließend dreimal mit PBS gewaschen. Zur Unterdrückung der Eigenfluoreszenz wurden
die Kulturen für 5 min mit 100 mM NH4Cl in PBS inkubiert. Nach zweimaligem Waschen für
je 2 min mit PBS wurden die Zellen mit 0,1 % Triton-X100 in PBS für 3 min permeabilisiert
und umgehend dreimal mit PBS gewaschen. Danach wurde für 1-2 h mit 10 % FKS,
1 % BSA in PBS blockiert. Es folgte eine einstündige Inkubation des Primärantikörpers
(Verdünnung in PBS mit 10 % FKS und 1 % BSA). Überschüssiger Antikörper wurde durch
sechsmaliges Waschen mit PBS von den Zellen entfernt und der jeweilige
fluoreszenzmarkierte Sekundärantikörper in PBS (10 % FKS, 1 % BSA) auf die Zellen
gegeben. Die Inkubation erfolgte im Dunkeln für 1 h. Nach erneutem sechsmaligem Waschen
wurde eine zweiminütige Kernfärbung mit DAPI (0,5 µg/ml in PBS; Sigma, München)
durchgeführt. Anschließend wurden die Zellen dreimal in PBS gewaschen. Die Deckgläschen
wurden zur Konservierung und Dokumentation mit Mowiol (Calbiochem/Merk Biosciences,
Bad Sonden) eingedeckt. Nach dem Aushärten erfolgte die Dokumentation mit einem
inversen Fluoreszenzmikroskop (DMIRB, Leica Microsystems, Bensheim) und einer
gekühlten SPOT-CCD-Kamera (Diagnostic Instruments, Michigan, USA) und die
Auswertung mittels IPLab- und Adobe Photoshop Software.
Methoden
98
6.3 ALLGEMEINE MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN
6.3.1 Standardmethoden
Standardmethoden wie die Isolierung von Plasmid-DNA in analytischem und präparativem
Maßstab, Reinigung von Nukleinsäuren durch Phenolextraktion und Ethanolfällung,
Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren, Gelelektrophoretische Auftrennung von
Nukleinsäuren, Elution von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen, Spaltung von DNA mit
Restriktions-Endonukleasen, Modifikation von DNA-Enden, Ligation von DNA-Fragmenten
in linearisierte Plasmidvektoren und Transformation von DNA in E. coli wurden allgemeinen
Methodensammlungen entnommen (Ausubel et al., 2002; Sambrook et al., 2001).
6.3.2 Isolierung von genomischer DNA aus Schwanz- oder Choriongewebe
Zur Genotypisierung der verschiedenen Mauslinien wurde den Tieren im Alter von
3-6 Wochen ein etwa 3 mm langes Schwanzstück abgenommen. Bei der Präparation von
Embryonen wurde ein Teil des Dottersacks oder ein kleines Stück Schwanz aufbewahrt. Die
Gewebebiopsie wurden in 250 µl Tail-Lysispuffer und 10 µl Proteinase K (16 mg/ml, Roth,
Karlsruhe) bei 55 °C unter ständigem Schütteln für 1-2 h lysiert. Danach wurde die DNA mit
200 µl Isopropanol gefällt und 10 min bei 13.200 Upm in einer Tischzentrifuge (Centrifuge
5415 D, Eppendorf, Hamburg) abzentrifugiert. Nach dem Waschen des DNA-Pellets in
500 µl 70 % Ethanol wurde es getrocknet und anschließend in 300-600 µl H2O aufgenommen.
Von dieser genomischen DNA-Lösung wurden 0,5-1 µl für die verschiedenen Geno-
typisierungs-PCR-Reaktionen verwendet.
6.3.3 Isolierung hochreiner genomischer DNA aus Schwanzgewebe
Zur Isolierung hochreiner genomischer DNA für den Einsatz im Southern-Blot wurde den
Mäusen ein etwa 5 mm langes Schwanzstück abgenommen. Die Gewebebiopsie wurde in
500 µl Digestion-Puffer mit 2,5 µl RNase A (10 mg/ml, Roche Diagnostics, Mannheim) und
5 µl Proteinase K (16 mg/ml, Roth, Karlsruhe) bei 55 °C unter leichtem Schütteln 2 h bis über
Nacht lysiert. Zur Proteinextraktion wurden 500 µl Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol
(25: 24: 1) zugegeben, kurz geschüttelt und zur Phasentrennung 5 min bei 13.200 Upm in
einer Tischzentrifuge (Centrifuge 5415 D, Eppendorf, Hamburg) zentrifugiert. Der Überstand
Methoden
99
wurde vorsichtig abgenommen und in ein neues Reaktionsgefäß überführt. Anschließend
wurden nochmals 500 µl Phenol:Chlorophorm:Isoamylalkohol zugefügt, 30-60 min kopfüber
rotiert und die Phasen durch Zentrifugation getrennt. Nach Abnahme des DNA-haltigen
Überstandes wurde das gleiche Volumen an Chlorphorm:Isoamylalkohol (24: 1) zugesetzt
und nach kurzem Schütteln 5 min zentrifugiert. Der Überstand wurde in ein neues
Reaktionsgefäß überführt und die DNA durch Zugabe von 0,1 Vol 3 M Natriumacetat (pH 5,2)
und 2,5 Vol reinen Ethanols präzipitiert. Nach Zentrifugation für 10 min bei 13.200 Upm
wurde die sedimentierte DNA mit 70 % Ethanol gewaschen. Es erfolgte das Trocknen des
DNA-Pellets, das anschließend in einem geeigneten Volumen 1 mM Tris-Puffer (pH 8,5)
resuspendiert wurde.
6.3.4 Präparation von Gesamt-RNA
Aus verschiedenen Geweben von Mäusen unterschiedlicher Entwicklungsstadien wurde
Gesamt-RNA isoliert. Die Gewebe wurden zügig herauspräpariert, in Trizol (1 ml Trizol pro
50-100 mg Gewebe; Invitrogen, Karlsruhe) überführt und mit einem Polytron PT1200C-
Homogenisator (Kinamatica AG, Littau, Schweiz) homogenisiert. Nach 5 min Inkubation bei
RT wurden 0,2 ml Chlorophorm pro ml Trizol zugegeben, 15 s kräftig geschüttelt und für
weitere 3 min bei RT inkubiert. Danach wurde die Probe je nach Volumen für 15 min bei
4 °C und 11.000 Upm in einer Heraeus Sepatech Biofuge B Zentrifuge (Heraeus, Hanau) bzw.
bei 10.000 Upm in einer Sorvall RC 5B Plus Zentrifuge mit SS-34-Rotor (Kendro,
Rodenbach) zentrifugiert. Die obere, wässrige Phase wurde in ein frisches Reaktiongefäß bzw.
Polypropylen-Röhrchen (Greiner, Solingen) überführt, mit 0,5 ml Isopropanol pro
eingesetztem ml Trizol versetzt, gut gemischt, für 10 min bei RT inkubiert und erneut 10 min
zentrifugiert. Nach Verwerfen des Überstandes wurde das RNA-Pellet getrocknet und in
RNase-freiem Wasser (Roth, Karlsruhe) resuspendiert. Anschließend konnte die
Konzentration der RNA-Lösung photometrisch mit Hilfe eines UltroSpec 3000 UV-
Photometers (Pharmacia Biotech, Freiburg) bestimmt werden.
Methoden
100
6.3.5 Amplifikation von DNA-Fragmenten mittels Polymerase-Kettenreaktion
Mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) konnten spezifische DNA-Fragmente hergestellt
werden. Dafür wurde folgender Standardansatz verwendet:
Reagenz Menge
Matrizen-DNA 10-100 ng
10 x-Reaktionspuffer +/- (NH4)2SO4 (MBI-Fermentas, St. Leon-Roth) 5 µl
MgCl2 (25 mM) 3 µl
dNTP-Mix (je 2,5 mM) 4 µl
DMSO 0-5 µl
forward Primer (40 pmol/µl) 2 µl
reverse Primer (40 pmol/µl) 2 µl
Taq-DNA-Polymerase (2,5 U/µl) (MBI-Fermentas, St. Leon-Roth) 1 µl
ddH2O ad 50 µl
Die Proben wurden in ein 0,2 ml PCR-Reaktionsgefäß gegeben und durchliefen in einem T3-
Thermocycler (Biometra, Göttingen) folgendes Standardprogramm:
Programmpunkt Variablen Zyklen
Initiale Denaturierung 2 min, 94 °C
Denaturierung 30 s, 94 °C
Annealing 30 s, den Primern angepasste Temperatur
Elongation 1 min/ kb Fragmentlänge, 72 °C
25-32 x
Finale Elongation 5 min, 72 °C
Kühlung 5 min, 4 °C
6.3.6 Genotypisierungs-PCR-Reaktionen
6.3.6.1 GFAP-Sox4-transgene Mäuse
Für die Genotypisierung der GFAP-Sox4-transgenen Mäuse wurden die Primer GFAP-tg1
und rnSox4-tg1 (siehe 5.5.1) im folgenden Reaktionsansatz verwendet:
Methoden
101
Reagenz Menge
Matrizen-DNA 0,5 µl
10 x-Reaktionspuffer +(NH4)2SO4 (MBI-Fermentas, St. Leon-Roth) 2 µl
MgCl2 (25 mM) 1,2 µl
dNTP-Mix (je 2,5 mM) 1 µl
DMSO 1 µl
GFAP-tg1 (40 pmol/µl) 0,2 µl
rnSox4-tg1 (40 pmol/µl) 0,2 µl
Taq-DNA-Polymerase (2,5 U/µl) (MBI-Fermentas, St. Leon-Roth) 0,4 µl
ddH2O ad 20 µl
Die Amplifikation der DNA erfolgte mit dem folgenden PCR-Programm:
Programmpunkt Variablen Zyklen
Initiale Denaturierung 94 °C, 1 min
Denaturierung 94 °C, 30 s
Annealing 30 s, 60 °C
Elongation 30 s, 72 °C
35 x
Kühlung 2 min, 4 °C
6.3.6.2 Sox12--Mäuse
Für die Genotypisierung der Sox12--Mäuse wurden die Primer mmSox12-19, mmSox12-20
und mmSox12-21 (siehe 5.5.2) im folgenden Reaktionsansatz verwendet:
Reagenz Menge
Matrizen-DNA 0,5 µl
10 x-Reaktionspuffer +(NH4)2SO4 (MBI-Fermentas, St. Leon-Roth) 2 µl
MgCl2 (25 mM) 1,2 µl
dNTP-Mix (je 2,5 mM) 1 µl
DMSO 2 µl
mmSox12-19 (40 pmol/µl) 0,3 µl
mmSox12-20 (40 pmol/µl) 0,2 µl
mmSox12-21 (40 pmol/µl) 0,2 µl
Taq-DNA-Polymerase (2,5 U/µl) (MBI-Fermentas, St. Leon-Roth) 0,4 µl
ddH2O ad 20 µl
Methoden
102
Die Amplifikation der DNA erfolgte mit dem folgenden PCR-Programm:
Programmpunkt Variablen Zyklen
Initiale Denaturierung 94 °C, 2 min
Denaturierung 94 °C, 30 s
Annealing 30 s, 62 °C
Elongation 30 s, 72 °C
35 x
Kühlung 2 min, 4 °C
6.3.7 Reverse Transkription und RT-PCR
Mittels der Reversen Transkription wurde aus 2 µg Gesamt-RNA cDNA hergestellt. Dafür
wurde die RNA in 14 µl RNase-freiem Wasser (Roth, Karlsruhe) verdünnt. Nach Zugabe von
1 µl Oligo(dT)-Primer (100 pmol/µl) wurde der Ansatz für 10 min bei 70 °C inkubiert und
anschließend auf Eis abgekühlt. Danach wurden 2,5 µl 10 x Reverse Transkriptase Puffer
(New England Biolabs, Frankfurt), 2 µl dNTP-Mix (je 2,5mM), 4,5 µl RNase-freies Wasser
(Roth, Karlsruhe), sowie 1 µl M-MuLV Reverse Transkriptase (200 U/µl; New England
Biolabs, Frankfurt) zugegeben und 1 h bei 37 °C inkubiert. Abschließend erfolgte eine
fünfminütige Inaktivierung bei 70 °C. Für die RT-PCR-Analysen wurden in der Regel 0,5 µl
cDNA in einem Reaktionsansatz mit einem Endvolumen von 25 µl eingesetzt.
Für quantitative RT-PCR-Analysen wurde eine Rapid Cycle Real-Time PCR mit Hilfe eines
LightCyclers (Roche Diagnostics, Mannheim) durchgeführt. Dabei bindet in jedem Zyklus
der DNA-Synthese ein Farbstoff an das amplifizierte PCR-Produkt, das somit anhand seiner
Fluoreszenz detektiert werden kann. In einem 10 µl Ansatz wurden 0,2-0,5 µl cDNA mit
0,5 µl Primer 1 (10 pmol/µl), 0,5 µl Primer 2 (10 pmol/µl), 1 µl DMSO (kein DMSO bei
Verwendung der Primer mmSox11-60/61) und 2 µl Fast Start DNA Master SYBR Green I –
Mix (Roche Diagnostics, Mannheim) gemischt. Der Fast Start DNA Master SYBR Green I –
Mix enthält den Farbstoff und die Taq-DNA-Polymerase. Das PCR-Programm bestand aus 4
Schritten: Denaturierung (8 min 95 °C), Amplifikation (45 Zyklen aus: 0 sec 95 °C, 7 sec 56-
60 °C, 20 sec 72 °C), Schmelzkurve (0 sec 95 °C, 10 sec 66 °C, 5 min ansteigend bis 95 °C
bei 0,1 °C/sec) und Kühlung (5 sec 40 °C). Die Auswertung erfolgte unter Verwendung der
LightCycler Software (Version 3.5), wobei über β-Aktin normalisiert wurde.
Methoden
103
6.3.8 DIG-Markierung von cRNA-Sonden mittels in vitro Transkription
Zur gezielten Detektion einer mRNA durch nicht-radioaktive in situ Hybridisierung wurde
eine komplementäre RNA als Sonde verwendet. Dazu wurde eine cDNA-Sequenz der zu
detektierenden mRNA in ein Plasmid eingefügt, dessen multiple Klonierungstelle von
Promotoren einer RNA-Polymerase (T3, T7 oder SP6) flankiert ist. Für die Transkription
einer komplementären RNA-Sonde wurden 10 µg Plasmid-DNA stromaufwärts der cDNA-
Sequenz mit einem geeigneten Restriktionsenzym (am besten mit 5’-Überhang) gespalten.
Die linearisierte DNA wurde mit Hilfe des High Pure PCR Product Purification Kits (Roche
Diagnostics, Mannheim) nach den Herstellerangaben aufgereinigt.
1 µg linearisierte, aufgereinigte DNA wurde für die in vitro Transkription mit dem DIG RNA
Labeling Kit (Roche Diagnostics, Mannheim) verwendet. Entsprechend den Angaben des
Herstellers wurde die DNA in einem Reaktionsansatz von 20 µl mit 2 µl
10 x Transkriptionspuffer, 2 µl DIG RNA Labeling Mix, 0,5 µl RNase Inhibitor (40 U/µl) und
2 µl der entsprechenden RNA-Polymerase (T3, T7 oder SP6) versetzt. Nach einer Inkubation
von 3 h bei 37 °C erfolgte der Abbau der DNA-Matrize durch Zugabe von 2 µl DNase I für
15 min bei 37 °C. Anschließend wurde die Reaktion mit 2 µl 0,2 M EDTA pH 8,0 abgestoppt.
Die DIG-markierte cRNA wurde mit Hilfe der mini Quick Spin Columns (Roche Diagnostics,
Mannheim) nach den Angaben des Herstellers aufgereinigt, mit RNase-freiem Wasser (Roth,
Karlsruhe) auf ein Volumen von 50 µl aufgefüllt, mit 50 µl Formamid versetzt, aliquotiert
und bei –80 °C gelagert. Die Qualität der RNA-Sonde wurde durch Agarose-Gelelektro-
phorese überprüft.
6.3.9 Radioaktive Markierung von DNA durch „Random Primer“
Die Markierung von Sonden für die Hybridisierung mit DNA nach dem Southern-Blot (siehe
6.3.10.1) erfolgte mit dem Random Primer DNA Labeling System (Gibco/BRL, Eggenstein).
Dafür wurden 40 ng DNA mit H2O auf 23 µl aufgefüllt und durch fünfminütiges Kochen
denaturiert. Danach wurde der Ansatz sofort auf Eis abgekühlt, wodurch ein Rehybridisieren
der Einzelstränge verhindert werden sollte. Es folgte die Zugabe von je 2 µl 0,5 mM
dATP/dGTP/dTTP, 15 µl einer Mischung aus degenerierten Primern (0,67 M HEPES, 0,17 M
Tris/HCl, 17 mM MgCl2, 33 mM 2-Mercaptoethanol, 1,33 mg/ml BSA, 18 OD260 Einheiten
pro ml Oligodesoxyribonukleotid-Primer Hexamere, pH 6,8), 5 µl α-32P-dCTP (10 µCi/µl,
Amersham, Braunschweig) sowie 1 µl Klenow-Enzym (2,5 U/µl). Der Ansatz wurde 1 h bei
Methoden
104
RT inkubiert und nach Angaben des Herstellers durch mini Quick Spin Columns (Roche
Diagnostics, Mannheim) zentrifugiert. Dadurch konnte die Reaktion abgestoppt und die freien
(radioaktiven) Nukleotide abgetrennt werden. Abschließend wurde 1 µl der Sonde im
Szintillationszähler (Tri-Carb 2800TR, Perkin Elmer) vermessen.
6.3.10 Identifizierung von DNA-Fragmenten durch Hybridisierung
6.3.10.1 DNA-Transfer von Agarose-Gelen auf Membranen (Southern-Blot)
Genomische DNA wurde nach entsprechendem Restriktions-Verdau auf ein mit TAE-Puffer
hergestelltes 0,7 %iges Agarose-Gel aufgetragen und aufgetrennt (TAE-Puffer-System). Zur
Vorbereitung für einen alkalischen Southern-Blot erfolgte eine Bestrahlung des Gels mit UV-
Licht (0,005 J) im UV-Crosslinker BLX-254 (Vilber Lourmat, Marne la Vallee, Frankreich).
Dabei werden die DNA-Fragmente gespalten und so deren Transfer erleichtert. Durch
zweimalige Inkubation des Gels für 20 min in Denaturierungslösung wurde die DNA in
hybridisierbare Einzelstränge denaturiert. Danach wurde eine positiv geladene Nylon-
Membran (Appligene, Illkirch, Frankreich) kurz in H2O und in Denaturierungslösung
äquilibriert. Der Transfer der DNA auf die Membran erfolgte über Nacht durch Kapillarkraft
in Denaturierungslösung. Dafür wurden auf einen Stapel Haushaltspapier drei trockene und
zwei in Denaturierungspuffer äquilibrierte Whatman 3MM Papiere (Whatman, Maidstone,
USA) gelegt, auf die die angefeuchtete Nylon-Membran, das Gel und drei weitere in Puffer
äquilibrierte Whatman 3MM Papiere folgten. Nachdem mit drei feuchten Whatman 3MM
Papieren eine Brücke vom Stapel zu einem Gefäß mit Denaturierungslösung hergestellt
worden war, wurde der gesamte Aufbau mit einem Gewicht beschwert. Im Anschluß an den
Transfer wurde die Membran kurz in H2O gewaschen und für 10 min in 50 mM Natrium-
Phosphat-Puffer (pH 6,5) neutralisiert. Vor dem Hybridisieren (siehe 6.3.10.2) erfolgte die
Fixierung der transferierten DNA durch Bestrahlung der feuchten Membran im UV-
Crosslinker (0,125 J).
6.3.10.2 Hybridisierung von DNA
Die mit DNA behaftete Nylon-Membran aus dem Southern-Blot wurde in eine 100 ml
Glasröhre (Schott) gegeben und in 20 ml Prähybridisierungslösung für mindestens 1 h bei
42 °C prähybridisiert. Nach Zugabe von 5 % Dextransulfat und α-32P-dCTP markierter DNA-
Sonde (siehe 6.3.10.1; 1x 106 cpm/ml Hybridisierungslösung), die vorher für 5 min bei 96 °C
Methoden
105
denaturiert worden war, erfolgte die Hybridisierung über Nacht bei 42 °C. Danach wurde die
unspezifisch gebundene Sonde durch mehrere Waschschritte entfernt. Zunächst wurde die
Membran für 5 min bei RT in 2 x SSC mit 0,5 % SDS inkubiert, danach für 15 min bei RT in
2 x SSC mit 0,1 % SDS und zum Schluß für 30 min bei 65 °C in 0,1x SSC mit 0,1 % SDS.
Die Membran wurde in einer lichtdichten Filmkassette in Anwesenheit einer signal-
verstärkenden Folie bei -80 °C für 1-7 Tage gegen einen Biomax MS Röntgenfilm (Kodak)
exponiert.
6.4 PROTEINBIOCHEMISCHE METHODEN
6.4.1 Proteinbestimmung nach Bradford
Die Bestimmung von Proteinkonzentrationen erfolgte nach der Methode von Bradford
(Bradford, 1976). Dabei wurden 5-20 µl der zu analysierenden Proteinlösung mit PBS auf
800 µl aufgefüllt, mit 200 µl Protein-Färbereagenz (Biorad, München) gemischt und für
10 min bei RT inkubiert. Durch Messung der Absorption bei 595 nm konnte die
Proteinkonzentration indirekt über eine Eichgerade ermittelt werden. Die Eichkurve wurde
durch Messung von BSA-Lösungen bekannter Konzentration erstellt.
6.4.2 Herstellung von Gesamt-Proteinextrakten aus eukaryontischen Zellen
Zur Herstellung eines Gesamtzellextraktes aus Säugerzellen wurden die Zellkulturplatten
zweimal mit 5 ml kaltem PBS gewaschen und die Zellen mit Hilfe eines Zellkulturspatels in
1 ml PBS abgeschabt und in ein Reaktionsgefäß überführt. Nach Pelletieren der Zellen durch
kurzes Abzentrifugieren in einer Tischzentrifuge (Centrifuge 5415 D, Eppendorf, Hamburg)
wurden diese je nach Plattengröße in 50-500 µl Zell-Lysispuffer resuspendiert. Nach
zehnminütiger Lyse der Zellen auf Eis wurde das Lysat für 10 min bei 4 °C und 11.000 Upm
in einer Heraeus Sepatech Biofuge B Zentrifuge (Heraeus, Hanau) zentrifugiert. Der
proteinhaltige Überstand wurde in ein neues Reaktionsgefäß überführt und bei -80 °C gelagert.
6.4.3 Denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)
Mit der denaturierenden Polyacrylamid-Gelelektrophorese konnten Proteine entsprechend
ihrer Größe aufgetrennt werden. Dabei wurden Gele verwendet, die sich aus einem unteren
Methoden
106
Trenngel unterschiedlicher Prozentigkeit und einem oberen 5 % igen Sammelgel
zusammensetzten. In der folgenden Tabelle ist die Zusammensetzung der Trenngele und des
Sammelgels angegeben:
Trenngel 8 % 10 % 12 % 15 % Sammelgel 5 %
40 % Acrylamid 2,4 ml 3 ml 3,75 ml 4,5 ml 40 % Acrylamid 650 µl
Lower-Tris pH 8,8 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml Upper-Tris pH 6,8 1,25 ml
20 % APS 45 µl 45 µl 45 µl 45 µl 20 % APS 15 µl
TEMED 10 µl 10 µl 10 µl 10 µl TEMED 6 µl
ddH2O 6,6 ml 6 ml 5,25 ml 4,5 ml ddH2O 3 ml
Zum Gießen der Gele und für die Elektrophorese wurden Mini-PROTEAN 3-Apparaturen
(Biorad, München) benutzt. Die zu analysierenden Proteinproben wurden vor dem Auftragen
auf das Gel mit 3 x Lämmli-Probenpuffer versetzt und für 5 min bei 95 °C denaturiert. Die
Gelelektrophorese erfolgte bei 80-120 V und wurde beendet, sobald das Bromphenolblau im
Probenpuffer den unteren Gelrand erreicht hatte.
6.4.4 Western-Blot und immunologischer Nachweis von Proteinen auf Membranen
Die durch SDS-PAGE aufgetrennten Proteine (siehe 6.4.3) wurden mit einer Semi-Dry
Blotapparatur vom Typ Fastblot B-44 (Biometra, Göttingen) auf eine Protran BA 85-
Nitrozellulosemembran (Schleicher&Schüll, Dassel) transferiert. Dafür wurden sechs auf die
Gelgröße zugeschnittene Whatman 3MM Papiere (Whatman, Mainstone, USA) und die
Nitrocellulosemembran in Western-Transferpuffer getränkt. Anschließend wurden drei der
angefeuchteten Whatman 3MM Papiere auf die Anode der Apparatur gelegt. Darauf folgten
die äquilibrierte Nitrozellulosemembran, das Proteingel und drei weitere befeuchtete
Whatman-Papiere. Nach Beseitigung eventuell eingeschlossener Luftblasen wurde die
Kathodenplatte aufgelegt. Der elektrophoretische Transfer der Proteine aus dem Gel auf die
Membran erfolgte für 30 min bei 350 mA.
Nachdem die Proteine auf die Nitrocellulosemembran transferiert worden waren, wurde diese
kurz mit PBS-T gewaschen. Zur Blockierung aller möglichen unspezifischen Antikörper-
bindungsstellen auf der Membran folgte eine Inkubation über Nacht bei 4 °C in 5 %
Magermilchpulver in PBS-T. Nach kurzem Waschen der Membran mit PBS-T wurde der in
PBS-T verdünnte Primärantikörper zugegeben und für 1 h bei RT inkubiert. Anschließend
Methoden
107
wurde ungebundener Primärantikörper durch dreimaliges Waschen der Membran mit PBS-T
für je 15 min bei RT entfernt. Es folgte eine Inkubation des in PBS-T verdünnten HRP-
gekoppelten Sekundärantikörpers für 25-45 min bei RT. Danach wurde nicht gebundener
Sekundärantikörper durch dreimaliges Waschen mit PBS-T für je 20 min beseitigt. Für die
Detektion der Protein-Antikörper-Komplexe wurde das ECL-Reagenz verwendet, welches für
eine Minute auf die Membran gegeben wurde. Danach wurde ein Röntgenfilm (Fuji Super RX)
für 30 s bis 5 min bei RT aufgelegt und dieser anschließend mit einem Röntgenfilmentwickler
(Kodak X-OMat 1000) entwickelt.
6.4.5 Bakterielle Expression und Aufreinigung von His6-Tag-Fusionsproteinen
Der pET-Expressionsvektor wurde in den E. coli Stamm BL21 (DE3) pLysS transformiert
und auf LB-Platten mit Kanamycin (50 µg/ml) ausplattiert. Von diesen Platten wurde ein
Einzelklon in 60 ml LB-Medium mit Kanamycin (50 µg/ml) gegeben und über Nacht bei
37 °C geschüttelt. Am nächsten Morgen wurden 1050-1500 ml LB-Medium mit Kanamycin
(50 µg/ml) mit 45-60 ml Vorkultur versetzt und bis zum Erreichen einer OD600 von 0,8 bei
37 °C geschüttelt. Sobald die passende optische Dichte erreicht war, wurden den Kulturen zur
Induktion der Genexpression 1M IPTG (Endkonzentration: 1,5 mM) zugesetzt und diese für
5 h bei 16 °C (für das Sox4-Peptid) oder für 4 h bei 37°C (für das Sox11-Peptid) geschüttelt.
Anschließend wurde die Bakteriensuspension für 15 min bei 4 °C und 5.000 Upm
zentrifugiert (Zentrifuge RC 5B Plus, Rotor SLA 3000, Sorvall). Das Bakterienpellet wurde
in 7 ml Puffer A pro 100 ml Kultur resuspendiert und über Nacht bei RT unter Schütteln
lysiert. Es folgte die Zentrifugation (Zentrifuge RC 5B Plus, Rotor SLA 1500, Sorvall) des
Bakterienlysats für 45 min bei 8.500 Upm. Währenddessen wurden 4-5 ml Ni2+-NTA-
Agarose (50 % v/v; Qiagen, Hilden) zweimal mit je 10 ml Puffer A gewaschen. Anschließend
wurde der Überstand des Bakterienlysats zu der gewaschenen Ni2+-NTA-Agarose gegeben
und mindestens 4 h bei RT rotiert. Nach erneutem Zentrifugieren (30-40 min, RT, 2.000 Upm
in der Eppendorf Centrifuge 5810 R, Hamburg) wurde das Ni2+-NTA-Agarose-Pellet fünfmal
mit je 26 ml Puffer B pH 8,0 und dreimal mit je 26 ml Puffer B pH 6,6 gewaschen. Die
Elution der über den His6-tag gebundenen Proteine erfolgte viermal mit je ca. 3 ml Puffer B
pH 4,5.
Die Expression und Aufreinigung der His6-Tag-Proteine konnten auf einem denaturierenden
SDS-Polyacryamidgel kontrolliert werden. Dazu wurde das Proteingel nach der Elektro-
Methoden
108
phorese für mindestens 1 h bei RT in Coomassie-Färbelösung geschwenkt. Zur Entfernung
des nicht gebundenen Farbstoffes wurde das Gel in Entfärbelösung gewaschen.
Die Eluate wurden mehrmals über Nacht bei 4 °C gegen PBS dialysiert. Anschließend wurde
die Proteinkonzentration der Dialysefraktionen vermessen und 1,5 mg des Proteins zur
Herstellung polyklonaler Antikörper in Meerschweinchen, Kaninchen bzw. Ratten nach
Standardprotokoll verwendet (Pineda-Antikörper-Service, Berlin).
6.5 HISTOLOGISCHE METHODEN
6.5.1 Gewebepräparation
Die Embryonen wurden im gewünschten Entwicklungsstadium per Kaiserschnitt aus dem
Bauchraum der Mutter entnommen und auf Eis in PBS präpariert. Je nach Alter wurden die
Embryonen 2-4 h oder über Nacht bei 4 °C in 4 % PFA in PBS fixiert. Für eine bessere
Penetration des Fixativs wurden ältere Embryonen enthauptet und gehäutet.
Mäuse im postnatalen Entwicklungsstadium wurden über ihren Blutkreislauf mit einem
Fixativ perfundiert. Dafür wurden die Tiere durch Injektion einer Ketamin-Rompun-
Mischung betäubt und anschließend ihr Brustkorb geöffnet. Nach Freilegung des Herzens
wurde eine Kanüle in die linke Herzkammer eingeführt. Als erstes wurde eine 0,9 % NaCl-
Lösung mit Heparin (1:1000) in den Blutkreislauf gespült. Durch einen Schnitt in die Vena
cava konnten Blut und Lösungen nach Passage durch den Körperkreislauf abfließen. Nach
Durchspülen mit 0,9 % NaCl-Lösung ohne Heparin erfolgte die Fixierung des Gewebes mit
4 % PFA in PBS. Anschließend wurden die gewünschten Gewebe herauspräpariert und über
Nacht in 4 % PFA in PBS bei 4 °C nachfixiert.
Die Präparation der Huhn-Embryonen erfolgte 24 h bzw. 48 h nach dem Elektroporations-
ereignis. Anschließend wurde das Gewebe für ca. 1 h mit 4 % PFA in PBS fixiert.
Zur Herstellung von Gefrierschnitten wurden die Huhn-Embryonen nach dem Fixiervorgang
etwa zweimal für die Dauer von 15 min, die Maus-Embryonen mindestens viermal (15 min)
und die postnatalen Gewebe mindestens sechsmal (30 min) in PBS auf Eis gewaschen.
Danach erfolgte die Inkubation der Gewebe über Nacht bis 3 Tage in 30 % Sucrose in PBS
bei 4 °C. Anschließend wurden die Gewebe in Gefriermedium (Jung HistoService, Nussloch)
eingebettet, auf Trockeneis eingefroren und bei -80 °C gelagert. Mit dem Cryostat CM 3050 S
(Leica Microsystems, Nussloch) wurden 10-14 µm Gefrierschnitte angefertigt, auf
HistoBond-Adhäsions-Objektträger (Jung HistoService, Nussloch) aufgeschmolzen und für
Methoden
109
mindestens 2 h bei RT getrocknet. Dann wurden die Objektträger in Gefrierboxen bei -80 °C
gelagert.
Zur Herstellung von Paraffinschnitten wurden die postnatalen Gewebe nach dem Fixieren für
mehrere Tage in Leitungswasser bei 4 °C gewaschen. Währenddessen erfolgte ein
mehrmaliger Austausch der Flüssigkeit. Anschließend wurde das Gewebe in einer
aufsteigenden Ethanolreihe (30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, jeweils mindestens 2,5-4,5 h)
dehydriert. In 70 % Ethanol konnte das Gewebe bis zum Einbetten in Paraffin bei 4 °C
gelagert werden. Für die Paraffineinbettung wurde das Gewebe 20-30 min in 90 % Ethanol,
zweimal für jeweils 20-30 min in 96 % Ethanol, zweimal für jeweils 20-30 min in reinem
Ethanol und dreimal für jeweils 20-30 min in Xylol inkubiert. Danach wurde das Gewebe
dreimal (20-30 min, 30-60 min und 60 min bis über Nacht) mit flüssigem Paraffin (bei ca.
60 °C) infiltriert und in Paraffin eingebettet. Die Paraffinblöcke konnten bis zur weiteren
Verwendung bei RT gelagert werden. Die Herstellung von 10 µm Paraffinschnitten und die
immunhistochemischen und histologischen Färbungen auf diesen Schnitten wurden in der
Arbeitsgruppe von S. Baader am Institut für Anatomie und Zellbiologie (Bonn) durchgeführt.
6.5.2 In situ Hybridisierung
Die in situ Hybridisierung wurde auf 14 µm Gefrierschnitten (siehe 6.5.1) durchgeführt. Die
Schnitte wurden in der Gefrierbox aufgetaut und die Objektträger anschließend zum
Befeuchten jeweils mit ca. 1 ml Hybridisierungspuffer ohne Dextransulfat und ohne Yeast-
RNA überschichtet. Die DIG-markierte cRNA wurde 5 min bei 95 °C denaturiert und sofort
wieder auf Eis gestellt. Nach einer Verdünnung der Sonde in Hybridisierungspuffer (1:100)
wurde diese nochmals 10 min bei 70 °C denaturiert und anschließend auf Eis gelagert. 120 µl
der denaturierten Sonde wurden auf die Objektträger gegeben und mit einem Deckglas
bedeckt. Die Hybridisierung erfolgte in einer mit 50 ml Waschlösung getränkten feuchten
Kammer im Hybridisierungsofen bei 68 °C über Nacht. Am nächsten Tag wurde das Gewebe
zweimal für jeweils 30 min mit vorgewärmtem Waschpuffer bei 68°C in einer Küvette
gewaschen. Anschließend wurden die Schnitte zweimal für je 30 min in MABT-Puffer bei RT
inkubiert. Die Objektträger wurden in eine mit H2O befeuchtete Kammer gelegt, mit 350 µl
MABT-Puffer überschichtet und für 1 h bei RT belassen. Zum Blockieren wurden die
Schnitte mit 350 µl 20 % FKS in MABT (Blockierlösung) für 1 h bei RT in der feuchten
Kammer inkubiert. Währenddessen wurde der DIG-markierte und AP-konjugierte Antikörper
(Roche Diagnostics, Mannheim) in Blockierlösung verdünnt (1:3000) und 1 h auf Eis gestellt.
Methoden
110
Nach Entfernen der Blockierlösung von den Objektträgen wurden diese anschließend mit
120 µl der Antikörperlösung überschichtet, mit einem Deckglas bedeckt und über Nacht bei
RT in der feuchten Kammer inkubiert. Tags darauf wurden die Objekkträger in eine Küvette
mit MABT-Puffer überführt und für 1 h bei RT belassen. Die Schnitte wurden in die feuchte
Kammer gelegt und zweimal mit je 350 µl AP-Puffer bei RT gewaschen. Anschließend
wurden 120 µl der Färbelösung (4,5 µl NBT und 3,5 µl BCIP (Roche) pro ml AP-Puffer) auf
die Objektträger gegeben und mit einem Deckglas abgedeckt, wodurch die Bildung
unspezifischer Präzipitate durch Luftkontakt verhindert werden sollte. Die Färbung erfolgte in
der feuchten Kammer über mehrere Stunden bis über Nacht im Dunkeln bei RT. Zum
Abstoppen der Farbreaktion wurden die Schnitte in eine Küvette mit PBS überführt und
zweimal für jeweils 5 min in PBS gewaschen. Es folgte eine Refixierung mit 4 % PFA in PBS
über Nacht im Dunkeln bei 4 °C in der feuchten Kammer. Zum Schluß wurden die Schnitte
mit Glycerol-Gelatine (GG-1, Sigma, München) eingedeckt.
6.5.3 Immunhistochemie auf Gefrierschnitten
Die Objektträger mit den 10 µm Gefrierschnitten (siehe 6.5.1) wurden nach dem Auftauen mit
PAP-Stift (PAP penDako, Hamburg) umrandet und zweimal für 5 min mit PBS gewaschen.
Kam später ein muriner monoklonalen Primärantikörper zum Einsatz, wurden die Schnitte in
10 mM Citratpuffer (pH 6,0) für 3 min bei 300 Watt in einer Mikrowelle gekocht, auf Eis
abgekühlt, kurz mit H20 gespült und zweimal für je 5 min in PBS gewaschen. Anschließend
wurden sowohl das Mikrowellen-behandelte als auch das unbehandelte Gewebe zur
Permeabilisierung für 10 min in PBS mit 0,1 % Triton-X100 bei RT inkubiert und einmal für
5 min mit PBS gewaschen. Zum Blockieren wurde das Gewebe mit 10 % FKS/ 1 % BSA in
PBS in einer feuchten Kammer für 1–2 h bei RT inkubiert. Der Primärantikörper wurde mit
10 % FKS/ 1 % BSA in PBS verdünnt und das Gewebe mit 250 µl dieser Lösung
überschichtet. Es folgte eine Inkubation über Nacht bei 4 °C in einer feuchten Kammer.
Nachdem überschüssiger Primärantikörper durch sechsmaliges Waschen mit PBS für je
10 min entfernt worden war, wurden 250 µl einer Verdünnung des jeweiligen
Sekundärantikörpers mit 10 % FKS/ 1 % BSA in PBS auf das Gewebe gegeben und in der
feuchten Kammer für 1,5 h bei RT inkubiert. Die Sekundärantikörper waren zur
Signaldetektion mit einem Cy2-, Cy3- (Dianova, Hamburg) oder Alexa-Fluoreszenzfarbstoff
(Molecular Probes, Göttingen) konjugiert. Durch sechsmaliges Waschen mit PBS für jeweils
10 min wurde überschüssiger Sekundärantikörper entfernt. Anschließend erfolgte eine
Methoden
111
Kernfärbung durch eine Inkubation für 1–2 min mit DAPI (1:1000 in PBS, Sigma, München).
Nachdem das Gewebe für 5 min in PBS gewaschen worden war, wurde dieses mit Mowiol
(Calbiochem/Merck Biosciences, Bad Soden) eingedeckt. Nach Aushärten wurden die Proben
mit einem inversen Fluoreszenz-Mikroskop (DMIRB, Leica Microsystems, Bensheim) und
einer gekühlten SPOT-CCD-Kamera (Diagnostic Instruments, Michigan, USA) oder einem
konfokalen Mikroskop TCS SL (Leica Microsystems, Bensheim) dokumentiert.
6.5.4 TUNEL-Färbung
Zur Detektion apoptotischer Zellen wurde eine TUNEL-(terminal dUTP nick end labeling)-
Färbung mit dem ApopTag Red Kit (#S7165, Serologicals/QBiogene, Heidelberg) auf 10 µm
Gefrierschnitten (siehe 6.5.1) durchgeführt. Dafür wurde das Gewebe aufgetaut und die
Objektträger mit einem PAP-Stift (PAP pen, Dako, Hamburg) umrandet. Danach folgte ein
fünfminütiger Waschschritt mit PBS und eine Permeabilisierung für 10 min mit 0,5 % Triton-
X100 in PBS bei RT. Nach Spülen der Objektträger für 5 min mit PBS wurden diese in eine
vorgekühlte Mischung aus Ethanol/Eisesseig (2:1) gegeben und für 5 min bei -20 °C inkubiert.
Nach zweimaligem Waschen für je 5 min in PBS wurden pro Objektträger 75 µl
Equilibrations-Puffer aufgetragen und für etwa 10 min bei RT darauf belassen. Nach
Entfernen dieser Lösung wurde das Gewebe mit 55 µl verdünnter TdT (Terminale
Desoxynukleotid-Transferase)-Enzymlösung überschichtet und mit einem Plastik-Deck-
gläschen überdeckt, um eine gleichmäßige Verteilung der Lösung zu gewährleisten und ein
Austrocknen zu verhindern. Die TdT-Reaktion wurde für 1 h bei 37 °C in der feuchten
Kammer durchgeführt. Zum Abstoppen der Reaktion wurden die Träger in einem
Stop/ Wasch-Puffer für 15 s geschwenkt, weitere 10 min bei RT inkubiert und 3 x 5 min in
PBS bei RT gewaschen. Danach wurden 65 µl einer anti-DIG-Antikörperverdünnung auf die
Objektträger aufgetragen und mit einem Plastik-Deckgläschen überdeckt. Der Antikörper war
direkt mit dem Fluoreszenzfarbstoff Rhodamin konjugiert. Die Inkubation der
Antikörperlösung erfolgte für 2 h bei RT in der feuchten Kammer. Danach wurde 4 x 5 min
mit PBS gewaschen, kurz mit DAPI (1:1000 in PBS, Sigma, München) gegengefärbt und das
Gewebe mit Mowiol (Calbiochem/Merck Biosciences, Bad Soden) eingedeckt.
Methoden
112
6.6 GENERIERUNG TRANSGENER MÄUSE
Für die Generierung sogenannter Knockout-Mäuse wird ein Rekombinations-Konstrukt in
embryonale Stammzellen (ES-Zellen) eingebracht. Nach der homologen Rekombination
(Doetschman et al., 1987; Thomas and Capecchi, 1987) werden die mutanten ES-Zellen per
Mikroinjektion in Blastozysten transferiert (Bradley et al., 1984).
6.6.1 Elektroporation embryonaler Stammzellen mit dem Transgen-Konstrukt
Zum Einbringen des transgenen Konstruktes wurden 7-8 x 107 embryonale Stammzellen
(Linie V6.5; C57BL/6J x 129Sv) mit 800 µl PBS vermischt und in einer 4 mm
Elektroporationsküvette mit 10-20 µg linearisierter DNA elektroporiert. Die hierfür
verwendete DNA wurde Endotoxin-frei präpariert (EndoFree Plasmid Maxi-Kit, Qiagen). Die
Elektroporation erfolgte mit Hilfe des Elektroporations-Impulsgenerators (Dr. Fischer,
Heidelberg) bei 300 V mit einer Impulslänge von 2 ms. Nach der Elektroporation wurden die
ES-Zellen auf 3 gelatinierte 10 cm Feeder-Zell-Platten verteilt und bei 37 °C inkubiert. Durch
Zusatz von Geneticinsulfat (G418; 400 µg/µl) und Ganciclovir (2 µM) zum ES-Zell-Medium
konnte eine Positiv- und Negativselektion der ES-Zellen erreicht werden. Die unter diesen
Bedingungen wachsenden ES-Zell-Einzelklone wurden in 96-Well-Schalen verteilt, bei 37 °C
inkubiert und anschließend bei -80 °C eingefroren.
Zur Selektion wurde DNA der ES-Zell-Einzelklone per Southern-Blot (siehe 6.3.10) auf
homologe Rekombinationsereignisse untersucht. Rekombinante ES-Zellklone wurden
aufgetaut und expandiert. Die Präparation der ES-Zell-DNA für die spätere Analyse erfolgte
durch Lyse der ES-Zell-Einzelklone in der 96-Well-Schale mit je 50 µl ES-Lysispuffer pro
Well bei 55 °C über Nacht in einer feuchten Kammer. Am nächsten Tag wurden die lysierten
Zellen mit 5 µl 8 M LiCl und 100 µl reinem Ethanol pro Vertiefung versetzt und mindestens
1 h bei 4 °C inkubiert. Nach Zentrifugation für 30 min bei 3500 Upm und 4 °C in einer
Eppendorf Centrifuge 5810 R (Eppendorf, Hamburg) wurden die Zellen dreimal mit je 100 µl
70 % Ethanol gewaschen. Nach jedem Waschschritt wurde 10 min bei 3500 Upm und 4 °C
zentrifugiert. Zum Schluß wurde die ES-Zell-DNA bei RT getrocknet und anschließend in
50-60 µl 1 mM Tris-HCl pH 8,5 über mehrere Stunden unter Schütteln gelöst.
Methoden
113
6.6.2 Blastozysteninjektion
Die Injektion der positiv gescreenten ES-Zellen in Blastozysten von Mäusen der Linie
C57BL/6J wurde von M. Bösl am Max-Planck-Institut für Neurobiologie (Martinsried)
durchgeführt. Die daraus erhaltenen chimären Tiere, die das mutierte Allel an die
Nachkommen weitergaben, wurden als Gründer der Maus-Linie verwendet.
6.7 IN OVO ELEKTROPORATION IN DEN HUHN-EMBRYO
Für die in ovo Elektroporation im Huhn-Embryo wurden befruchtete Eier von der Firma
Lohmann (Cuxhaven) bezogen. Enstprechend der Stadieneinteilung nach Hamburger und
Hamilton (Bellairs and Osmond, 2005) wurden die Eier liegend bei 37,8 °C und unter
gelegentlichem Wenden in einer feuchten Kammer inkubiert, bis sie das gewünschte Stadium
erreicht hatten. Um Embryonen der Stadien HH10 bis HH11 zu erhalten, erfolgte eine ca. 43-
44 stündige Inkubation der Eier. Zunächst wurde mit einer Nadel (1,1 mm x 40 mm) in die
Spitze des Eis gestochen und mit einer 10 ml Spritze etwas Eiweiß abgesaugt. Anschließend
wurde mit einer Schere ein kleines Loch in die Eischale geschnitten. Mit einer
dünngezogenen Glaskapillare (1 mm Durchmesser) wurde die mit Fast Green versetzte DNA
in den Zentralkanal des Embryos injiziert. Zwei Elektroden wurden um den Embryo platziert
und die DNA mit einem BTX ECM Elektroporationsgerät (50 ms, 30 V) in den Huhn-
Embryo eingebracht. Nach der Elektroporation wurde das Ei-Fenster mit Parafilm ver-
schlossen und für weitere 24 oder 48 h bei 37,8 °C in einer feuchten Kammer inkubiert.
Anschließend erfolgte die Präparation der Huhn-Embryonen (siehe 6.5.1).
Abkürzungsverzeichnis
115
7 Abkürzungsverzeichnis
α Anti
Abb. Abbildung
aff.-pur. affinitätsgereinigt
Amp Ampicillin
Anw. Anwendung
AP Alkalische Phosphatase
APS Ammoniumperoxosisulfat
ATP Adenosin-5´-triphosphat
BCIP 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-phosphat-p-Toluidinsalz
bp Basenpaare
BSA Rinderserumalbumin
cAMP 3´,5´-Cyclo-Adenosin-Monophosphat
cDNA komplementäre DNA
CH cerebelläre Hemisphäre
µCi Mikrocurie
CMV Cytomegalievirus
CP Kortikalplatte
cpm gezählte Zerfälle pro Minute (counts per minute)
CRE cAMP responsive element
cRNA komplementäre RNA
d Tag(e)
DAPI 4´,6´-Diamin-2´-phenylindol-dihydrochlorid
DCN tiefe cerebelläre Kerne
DIG Digoxygenin
DMEM Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium
DMSO Dimethyl-sulfoxid
DNA Desoxyribonukleinsäure
DNase Desoxyribonuklease
dNTP Desoxyribonukleosid-5´-triphosphat
dpc Tag post coitum der embryonalen Entwicklung
DTT Dithiothreitol
ECM Extracelluläre Matrix
EDTA Etylendiamin-tetraacetat
EGL externe Körnerzellschicht
EGTA Ethylenglycol-bis(2-aminoethylether)-tetraessigsäure
ENS enterisches Nervensystem
ES-Zellen embryonale Stammzellen
FKS Fötales Kälberserum
Abkürzungsverzeichnis
116
FP Bodenplatte
h Stunde
HEPES N-2-Hydroxyethylpiperazin-N´-2´-ethansulfonsäure
HH-Stadium Entwicklungsstadium nach Hamburger und Hamilton
His6-Tag Polypeptid aus 6 Histidin Aminosäuren
HMG-Box high-mobility-group-DNA-Bindedomäne
HRP Meerrettichperoxidase (horseradish peroxidase)
IgG, IgM Immunglobuline der Subklasse G oder M
IGL interne Körnerzellschicht
IOC Olivenkernkomplex
IPTG Isopropyl-b-D-thiogalactopyranosid
IRES Internal ribosome entry site
IZ Intermediärzone
kb Kilobasenpaare
kDa Kilodalton
LB Luria broth
mA Milliampere
MES 2-N-Morpholino-ethansulfonsäure
mg, µg Milligramm, Mikrogramm
ML Molekularschicht
ml, µl Milliliter, Mikroliter
M, mM, µM molar, millimolar, mikromolar
mm, µm Millimeter, Mikrometer
mRNA Boten-RNA (messenger-RNA)
MZ Marginalzone
NBT Nitro Tetrazolium Blue Chloride NES Kernexport-Signal (nuclear export signal)
NLS Kernlokalisierungssignal (nuclear localization signal)
nM nanomolar
nm Nanometer
NP-40 Nonidet P40
ODx optische Dichte bei x nm
ORF offenes Leseraster (open reading frame)
p0, p1, p2, p3-Domänen neuronale progenitor-Domänen der ventralen VZ
PBS Phosphat-gepufferte Salzlösung
PC Purkinjezellschicht
PCN präcerebelläre Kerne
PCR Polymerase Kettenreaktion (Polymerase chain reaction)
PEI Polyethylenimin
PFA p-Formaldehyd
pMN Motoneuron-progenitor-Domäne
Abkürzungsverzeichnis
117
PNS peripheres Nervensystem
Pol. Polymerase
Ref. Referenz
RNA Ribonukleinsäure
RNase Ribonuklease
RP Deckplatte
PP Präplatte
Pr. Primer
PS piale Oberfläche
RT Raumtemperatur
RT-PCR Reverse Transkription PCR
SDS Natrium-Dodecylsulfat
SDS-PAGE denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophorese
SOX SRY-like box protein
SP Subplatte
SRY sex determing region on Y chromosome
SSC Natriumsalz-Citrat-Puffer(sodium salt citrate)
SVZ Subventrikulärzone
TAE Tris/ Essigsäure/ EDTA
TBE Tris/ Borsäure/ EDTA
TBS Tris-gepufferte Salzlösung
TdT Terminale Desoxynukleotid-Transferase
TE Tris-Puffer mit EDTA
TEMED Tetramethyl-ethylen-diamin
tg Transgen
Tm Hybridisierungstemperatur
Tris Tris-hydroxymethyl-aminomethan
TUNEL terminal dUTP nick end labeling
Tween-20 Polyoxyethylen-sorbitanmonolaureat
TSchG Tierschutzgesetz
UTR untranslatierte Region
Upm Umdrehungen pro Minute
V0, V1, V2, V3-Interneuronen ventraler neuronaler Subtyp
Verd. Verdünnung
Vol Volumen
VZ Ventrikulärzone
wt Wildtyp
ZNS Zentrales Nervensystem
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Publikationen
139
Publikationen
Hoser, M., Baader, S. L., Bösl, M. R., Ihmer, A., Wegner, M. und Sock, E. (2007).
Prolonged glial expression of Sox4 in the CNS leads to architectural cerebellar defects and
ataxia. J Neurosci 27, 5495-505.
Hoser, M., Potzner, M. R., Koch, J. M. C., Bösl, M. R., Wegner, M. & Sock, E. (2008).
Sox12 deletion in the mouse reveals nonreciprocal redundancy with the related Sox4 and
Sox11 transcription factors. Mol Cell Biol 28, 4675-87.
Präsentationen
Hoser, M., Baader, S. L., Bösl, M. R., Ihmer, A., Wegner, M. und Sock, E. (2007).
Prolonged glial expression of Sox4 in the CNS leads to architectural cerebellar defects and
ataxia. 7th Göttingen Meeting of the German Neuroscience Society, Göttingen, Poster.
Hoser, M., Baader, S. L., Bösl, M. R., Ihmer, A., Wegner, M. und Sock, E. (2007).
Prolonged glial expression of Sox4 in the CNS leads to architectural cerebellar defects and
ataxia. 8th Meeting of the UK Glial Club, London, Poster.
Lebenslauf
141
Lebenslauf
Persönliche Daten _________________________________________________________________________________________________________________
Name: Melanie Hoser
Geburtsdatum und Ort: 07.08.1976 in Donauwörth
Staatsangehörigkeit: deutsch
Familienstand: ledig
Schulbildung _________________________________________________________________________________________________________________
1983-1987 Grundschule Donauwörth
1987-1988 Hauptschule Donauwörth
1988-1997 Gymnasium Donauwörth
1997 Erwerb der Allgemeinen Hochschulreife
Studium und studienbegleitende Tätigkeiten _________________________________________________________________________________________________________________
1997-2004 Studium der Biologie, Universität Würzburg
1999 Diplom-Vorprüfung
2001-2002 Biochemisches Praktikum am CNRS-IPBS in Toulouse
2003 Diplom-Hauptprüfung
2003-2004 Diplomarbeit am Institut für Biochemie der Universität
Würzburg
Etablierung von Expressionssystemen und
Charakterisierung von FMRP, dem Krankheitsgenprodukt
des Fragilen-X Syndroms
2004 Diplom in Biologie
Promotion _________________________________________________________________________________________________________________
2004-2008 Dissertation am Lehrstuhl für Biochemie und
Pathobiochemie der FAU Erlangen-Nürnberg
Die Rolle der SoxC-Proteine in der
Mausembryogenese
Danksagung
143
Danksagung
Mein ganz besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. Michael Wegner für die Überlassung des
spannenden Themas, für die hervorragende Betreuung während der gesamten Zeit der
Doktorarbeit und nicht zuletzt für die Durchsicht der Arbeit.
Herrn Prof. Dr. Andreas Burkovski danke ich für die freundliche und bereitwillige
Übernahme der Zweitberichterstattung an der Naturwissenschaftlichen Fakultät II der
Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg.
Ein besonders großer Dank geht an PD. Dr. Elisabeth Sock und PD. Dr. Claus Stolt für die
immer hilfsbereite Unterstützung bei allen Fragen und Problemen, die sich während dieser
Zeit ergaben und für das Korrekturlesen der Arbeit.
Danke auch an Prof. Dr. Stephan Baader für die großartige Zusammenarbeit beim GFAP-
Sox4-Mausprojekt.
Bei Michaela Potzner bedanke ich mich für die vielen schönen „Tee“-Stunden auf der Treppe,
für die sehr gute Zusammenarbeit, für die Freundschaft, die sich während der Zeit im Labor
entwickelt hat und natürlich auch für das Korrekturlesen der Arbeit.
Bei den Arbeitskollegen aus Labor 2 bedanke ich mich herzlich für die vielen lustigen
Stunden im Labor und die jederzeit große Hilfsbereitschaft und Unterstützung im Laboralltag.
An PD. Dr. Claus Stolt ein großes Danke schön für die allseits vorhandene Diskussions-
bereitschaft und die unermüdliche Hilfe bei Fragen um die Technik.
Dr. Silke Schreiner und Simone Hillgärtner danke ich herzlich für die Durchführung aller
Arbeiten in der ES-Zellkultur.
Allen Kollegen der Arbeitsgruppe danke ich für die sehr gute Zusammenarbeit und das
hervorragende Arbeitsklima.
Ein besonderer Dank geht an Simon Otter für das Verständnis und die großartige
Unterstützung während dieser Zeit.
Zum Abschluß möchte ich mich bei meiner Familie für all das danken, was sie mir im Leben
ermöglicht haben.