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Biossistemas e Biorreações
Prof. Maria Alice Zarur Coelho
Programa de Pós-graduação em Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos
Escola de QuímicaUFRJ
Redes de Reações Bioquímicas
Evolução resultou em uma complexa rede metabólica para garantir as funções adequadas das células vivas
Quando o conjunto de reações da rede metabólica éagrupado em uma única reação:
Modelos caixa-preta
utéis para fechar os balanços de massa (carbono) �entrada e saída da célula
Um olhar para dentro da célula
� Aumenta a complexidade do sistema conforme as reações intracelulares são consideradas
� Balanço constante entre a formação e o consumo de metabólitos intracelulares
impõe um grande número de restrições nos fluxosatravés dos diferentes ramos da rede metabólica
Mesmo que a complexidade aumente, o número de grausde liberdade do sistema não necessariamente aumenta!
Conceitos Básicos
Uso dos fluxos de entrada e saída de material da célula: diretamente mensurados
In vivo versus In vitro:Controle enzimático é perdido nas medidas in vitroMedidas de atividade enzimática usam a concentração de
substrato e de todos os metabólitos que influenciam a cinética enzimática
Os fluxos in vivo podem ser calculados através dos diferentes ramos da rede� balanço metabólico
Considere uma rede na qual sejam identificados:
J fluxos ou v1 … vJ taxas de reaçõesN substratosM produtos metabólicos (excretados)µµµµ - taxa específica de crescimento da biomassa
Taxas mensuráveis: r1, …, rN+M+1
Restrições impostas pelos balanços de massa: a concentração de um dado metabólito é constante, i.e., a taxa líquida de produção do metabólito é zero
Formalmente�para todos os metabólitos intracelulares, os fluxos quechegam a um dado metabólito são balanceados pelosfluxos que partem deste metabólito, não havendoacúmulo líquido do mesmo.
EMP - Exemplo
r3PG = 0
Balanço Redox� Resultado da oxidação do substrato a produto� Reações podem envolver mais de um tipo de espécie
redox (NADH ou NADPH)
� Compartimentalização da célula: NADH do citosol versus NADH da mitocôndria
não são intercambiáveis...
“Equivalentes” de energia
Expressos em ATPConversão de um metabólito em outro com menor nível
energético: � liberação de ATP ou� dissipação de calor (diferença energia livre de Gibbs)
Exemplo: Fermentação anaeróbia de levedura
estequiometria:- CH2O + 0.510 CH3O1/2 + 0.275 CO2 + 0.137 X + 0.077 CH8/3O = 0
balanço redox: - 4 x 1 + (6 x 0.510 + 0 x 0.275 + 4.18 x 0.137 + 4.67 x 0.077) = -0.0078 ≈ 0
O grau de redução é especificado pela combinação linear dos balanços elementares onde os fatores de multiplicação, na combinação linear, são os níveis redox (ou grau de redução) dos elementos.
Não introduz nenhum balanço extra... Quando todos os balanços elementares são satisfeitos, o balanço redox fecha automaticamente.
Crescimento EnergéticoConteúdo intracelular de ATP deve ser rigorosamente
controlado.... balanço entre a energia livre produzida pelos processos catabólicos e o subseqüente uso na biossíntese dos constituintes celulares no anabolismo.
turnover de ATP é baixo
Consumo de ATP para manutenção celular
Metabolismo endógeno (Hebert, 1959)resulta no decréscimo da biomassa cuja degradação seria
um processo de 1ª ordem:µe = taxa específica de degradação da biomassa
(-rS) = YXS µ + YXS µe
parte associada ao crescimento
mS � coeficiente de manutenção celular(Pirt, 1965)
degradação da massa celular
Processos de manutenção celular
� Manutenção de gradientes (H+) e potencial elétrico através da membrana celular
� Ciclos fúteis:geração de calor na hidrólise de ATPfrutose-6P ! frutose 1,6-P ! frutose-6P
� Turnover de macromoléculas (p.ex. mRNA)
ATP
Altas taxas de crescimento: maior turnover de macromoléculasaumento da atividade intracelularmaior perda de energia em ciclos fúteis
ATP requerido para síntese da biomassa
determinado com precisão em condições anaeróbicas
rATP = YX,ATP µ - mATP
Meios complexos fornecem valoresmenores que em meios mínimos
Energética de Processos Anaeróbios
� Nao há consumo de oxigênio� Obtém ATP para crescimento ao nível da fosforilação do
substrato (usa outros aceptores finais de elétrons)� Muitos microrganismos anaeróbios facultativos não
possuem a via da fosforilação oxidativa
bactérias do ácido lático � ausência de citocromo Cpresença de O2 ajuda a manter baixos os níveis de NADH
através da ação das NADH-oxidases que usam O2 comoaceptores de elétrons
� Produtos finais do catabolismo em crescimentoanaeróbico: etanol, ácido lático e acetato
� Outros produtos como acetoína, acetona e butanolpodem ser formados em condições anaeróbicas(Clostridium acetobutylicum)
� Microrganismos heterofermentativos ! formam mais de um produto para balancear co-fatores NADH e NADPH (exceto para crescimento em meio rico)
Rede metabólica mais complexa
Produção de ácido lático correlacionada com a produção de ATP(1 mol de ATP por mol de ác. lático produzido):
µ> 0.3 h-1 YX,ATP = 15 mmoles ATP (g p.s.)-1 mATP = 18 mmoles ATP (g p.s. h)-1
Meio rico, i.e. célula usa ATP para reações de polimerização
µ < 0.3 h-1 YX,ATP = 50 mmoles ATP (g p.s.)-1 mATP = 7 mmoles ATP (g p.s. h)-1
Exaustão de um ou mais componentes do meio - uso de ATP para crescimento é maior
Célula demonstra habilidade em se ajustar ao ambiente hostil,
reduzindo o consumo de ATP nos processos de manutenção celular
� Obtém mais energia pela completa oxidação do substrato
� ATP é formado na fosforilação oxidativa� Processo de crescimento celular começa com a
formação de precursores metabólicos (1); blocos de construção são sintetizados (2) a partir destesprecursores; e depois polimerizados emmacromoléculas (3)
Energética de Processos Aeróbios
(1) CO2 e NADH são obtidos como co-produtos(2) NADPH e ATP são requeridos(3) requer ATP
Síntese de Biomassa:
biomassa + Yxc CO2 + YX,NADH NADH � (1+YXC) CH2O � YX,ATP ATP � YX,NADPH NADPH = 0
Redes Metabólicas Simples
(i) Crescimento anaeróbio de S. cerevisiae
Etanol = principal produto metabólicoGlicerol = formado como resultado do balanço redox
(balancear nível de NADH)
di-hidroxi-acetona fosfato glicerol � 3P glicerol
NAD NADH
V1: -1.12 CH2O + CH1.74O0.6N0.12 + 0.12 CO2 + 0.15 NADH � 2.42 ATP = 0
V2: -1.5 CH2O + CH2O0.5 + 0.5 CO2 + 0.5 NADH + 0.5 ATP = 0
V3: - CH2O0.5 + CH3O0.5 � 0.5 NADH = 0
V4: - CH2O + CH8/3O � 0.333 NADH � 0.333 ATP = 0
V5 = V2 – V3
Glicose (s)
Biomassa (x)
v1
Glicerol (g)
v4
v2
P
v3
Etanol (p)
v5Acetaldeído (a)
Análise de fluxos em grandes redes metabólicas
� Identificação da estrutura da rede metabólica (topologia)� Quantificação dos fluxos através dos ramos da rede
Ensaios enzimáticos para confirmar presença de enzimasespecíficas e determinar as exigências em co-fatores;
Substratos marcados (glicose � 13C)
Emprego de taxas mensuráveis
Abordagem similar aos modelos de redes metabólicassimplificadas, e.g.
" EMP" Ciclo TCA" Via do glioxilato" Carboxilação do piruvato" Formação de macromaléculas (proteínas,
carboidratos e lipídios)
� 16 compostos� 8 metabólitos intracelulares� Taxas de formação e consumo mensuráveis para:
glicose, amonia, CO2, citrato, isocitrato, proteína, carboidratos e lipídios
� Pseudo estado estacionário para os metabólitosintracelulares: glicose – 6P, piruvato, acetil-CoA, 2-oxoglutarato, succinato, malato, oxaloacetato e glioxilato.
� Citrato e isocitrato constantemente produzidos
Com 15 fluxos e 8 equações de balanço = 7 graus de liberdade� 7 taxas de reação a serem especificadas, a saber:
1. Consumo de glicose2. Produção de CO2
3. Produção de acido cítrico4. Produção de isocitrato5. Síntese de proteína6. Síntese de carboidrato
Impor uma restrição colocando uma das taxas da rede igual a zero (Aiba e Matsuoka, 1979)
Modelo 1: via do glioxilato inativa; v11 = 0Modelo 2: piruvato carboxilase inativa; v4 = 0Modelo 3: ciclo TCA incompleto; v8 = 0
Medidas in vitro das atividades das enzimas piruvato carboxilase, citrato sintase, isocitrato desidrogenase e isocitrato liase
Via do glioxilato é inativa ou opera com uma taxa reduzida emC.lipolytica sob condições de produção de ácido cítrico
Emprego de substratos marcados
O enriquecimento dos metabólitos intermediários
de uma via depende daatividade desta via.
Biossíntese de lisina
Fluxo relativo aumenta com o aumento da concentração de amôniae ao mesmo tempo eleva a secreção de lisina ! super-produção