Effekte von Stress durch Sojabohnenmehl im Futter auf das
Immunsystem von Regenbogenforellen
Dr. med. vet. Henrike Seibel
BLE gefördertesDrittmittelprojekt
Etablierung von chronischen Stressparametern auf mRNA Basis
aus Vollblut zur Tierwohleinschätzung bei Regenbogenforellen
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Erzeugung von Stress über Fütterung von nativen Sojabohnenmehl in steigenden Anteilen
Definition von Stress“… unspezifische Reaktion des Körpers auf jegliche Anforderung.” (Selye, 1973)
Stressorz.B.
Organismus
Reaktion
Äußere Anforderungsbedingung,
in deren Folge es zur Auslösung einer
Stressreaktion kommt
„… Zustand, in dem die körpereigene Homöostase bedroht ist, bzw. angenommen wird, dass sie bedroht ist.“ (Chrousos, 1998)
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Angeborenes Immunsystem(Entzündung, Abwehr)
Insult / NekrosePathogen „Gefahr“
„Pattern“ Erkennung
Antigen
Adaptives Immunsystem(Immunantwort, klonale
Expansion)
„Fremd“ Erkennung
Reparatur Immunität
Secombes et al. 2001; Tort et al. 2003; Lieschke und Trede 2009; Bayne und Gerwick 2001 u.v.m.
ZytokinKostimulation
Zytokine, T-ZellenAntikörper
Komplement
Kein Stress Geringer Stress Mittlerer Stress Hochgradiger Stress
Austausch des Fischmehlanteils (50% in Basaldiät) durch SBM:
0 % 33 % 66 % 100 %
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Fütterungsexperiment mit Sojabohnenmehl (SBM) - Modell für Fütterungsstress -
Anteil von SBM in der Ration:
0 % 16 % 33 % 50 %
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isonitrogene und isoenergetische Diät; energierestriktiv (Pellets)
Diät CD [%] SBM16 [%] SBM33 [%] SBM50 [%]Fischmehl 50,00 33,50 17,00 0,00Blutmehl 5,00 5,00 5,00 5,00Gelantine 3,00 3,00 3,00 3,00Sojabohnenmehl 0,00 16,40 33,00 50,00Erbsenprotein Isolate 6,50 6,50 6,50 6,50Weizengluten 7,00 10,59 14,05 17,25Weizenstärke 19,50 15,00 10,55 5,50Fischöl 8,00 8,55 9,05 10,03Vit / Mineralien 0,50 0,50 0,50 0,50
Bentonit 0,00 0,47 0,85 1,22
Calciumhydrogenphosphat 0,5 0,5 0,5 0,5Biolys 0,00 0,00 0,00 0,50
Fütterungsexperiment mit Sojabohnenmehl (SBM)- Futterformulierung -
CD = Kontrollgruppe
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Bedeutung Sojabohnenmehl in der Fischernährung
Produkte aus Sojabohnen (Glycine max L.) zurzeit am weitesten verbreitete Alternative für das kostenintensive Fischmehl
hoher Proteingehalt (44-48 %) niedriger Preis hohe Produktverfügbarkeit
Hoher Anteil an antinutritiven Faktoren (ANF), wie z.B. Saponine, Lectine, Phytinsäure
Alexis 1990; Chou et al. 2004; Merrifield et al. 2011
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“Entzündungs-Modell” Soja
Austausch von Fischmehl durch natives SBM resultiert in Entzündungen des hinteren Darmabschnitts bei Salmoniden
Bakke-McKellep et al. 2000; Krogdahl et al. 2000; Knudsen et al. 2007; Francis et al. 2001; Merrifield et al. 2011
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“Entzündungs-Modell” Soja
Austausch von Fischmehl durch SBM resultiert in Entzündungen des hinteren Darmabschnitts bei Salmoniden
Histologisch findet sich bspw.: Entzündungszellen Verkürzung der Darmzotten Verlust der supranukleären Vakuolisierung
Endozytose wird geblockt
Bakke-McKellep et al. 2000; Krogdahl et al. 2000; Knudsen et al. 2007; Francis et al. 2001; Merrifield et al. 2011
A normal B
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“Entzündungs-Modell” Soja
Austausch von Fischmehl durch SBM resultiert in Entzündungen des hinteren Darmabschnitts bei Salmoniden
Histologisch findet sich bspw.: Verlust der supranukleären Vakuolisierung Verkürzung der Darmzotten Vermehrung der Becherzellen
Endozytose wird geblockt
Durch diverse schädigende Auswirkungen der ANFs Immunsuppression mit erhöhten Risiko für Sekundärinfektionen
Was finden wir bei den Forellen?
Bakke-McKellep et al. 2000; Krogdahl et al. 2000; Knudsen et al. 2007; Francis et al. 2001; Merrifield et al. 2011
nach 4 Wochen
nach 8 Wochen
Cortisol und Kondition
V0 InitialbeprobungCD KontrolldiätSBM Sojabohnenmehl16, 33, 50 Anteile SBM
Scheinbar konnte Stress durch SBM Verwendung erzeugt werden
Signifikanter Abfall im Wachstum bei 50%SBM (SGR 0,44 ± 0,21 %*d-1)
Nach 8 Wochen scheinbar weniger Cortisol bei 16%SBM als in
Kontrollgruppe
0
5
10
15
20
25
30
35
Cor
tisol
[ng/
mL]
Durchfall
Durchfall
V0 CD 16% SBM 33% SBM 50% SBM
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Durchfall
Molekularbiologie
Fluidigm Biomark HD-Systemund Aria MX qPCR System
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Verschiedene Immun- und Entzündungsmarker, Gene der akuten Phase Reaktion und andere „Marker-Gene“auf mRNA Expressionsunterschiede zwischen den Gruppen getestet
Toll like Rezeptoren
(versch.)
NOS2
SAA
SOD1
TCRB
PSMB7
IL1b, IL4, 6, 10,12, 22
MAPK Pathway
Gene
MPO
C3, C5, C7FGL2
Forellen spez. CC
und viele mehr!
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„Eine entzündliche Reaktion ist die charakteristische Manifestation des angeborenen
Immunsystems“ (Lieschke und Trede 2009)
Angeborenes Immunsystem(Entzündung, Abwehr)
Insult
„Pattern“ Erkennung
Reparatur
ZytokinKostimulation
Komplement
Toll-Like-RezeptorenMAP3K1
g-Typ Lyozym
MyeloperoxidaseSerum Amyloid A
Adaptives Immunsystem(Immunantwort, klonale
Expansion)
Immunglobulin MZytokine, T-Zellen
Antikörper
Uncoupling Protein 2
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Entzündungsparameter (Bsp.)
p=0,029
Myeloperoxidase (MPO) Wichtiges Enzym von
neutrophilen Granulozyten Reguliert Entzündungsreaktionen
p=0,079
Serum Amyloid A (SAA) Bestandteil der Akuten Phase
Reaktion Rekrutiert Immunzellen
Fazit: keine Entzündung in 16%SBM Gruppe
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p=0,073
Lysozym g-Typ 1 (LYG1) Von Monozyten und
Makrophagen sezerniert Direkte antibakterielle Wirkung Fungiert als Akute-Phase Protein
MAP-Kinase (MAP3K) Signaltransduktionsweg Beteiligt an Zelldifferentierung,
Zellwachstum und Apoptose
Fazit: „aktiviertes“ angeborenes Immunsystem bei 16% SBM
p=0,040
Angeborenes Immunsystem
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Toll Like Rezeptor 3 Erkennt Pathogen-assoziierte
Moleküle (PAMPs) Induziert angeborene Immunantwort
p=0,014
Angeborenes Immunsystem
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Adaptives Immunsystem
Immunglobulin M (IgM) Erster Antikörper bei Insult Aktiviert das Komplementsystem
Marker für nicht spezifische zytotoxische Zellen
Marker für B-Zellen
p=0,055
Antikörperwechsel zu bspw. IgT, IgD
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Energiehaushalt auf Zellebene
p=0,014
Uncoupling Protein 2 (UCP2) Indikator für metabolische Reaktionen Mitochondrales Anionen Carrier Gen Entkoppelt die Atmungskette Wird von Makrophagen und Lymphozyten ausgeschüttet
Zusammenfassung
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Zu viel (50%) SBM führt zu Entzündungserscheinungen im Darm 16%SBM zeigt histologisch die beste Darmgesundheit von allen
Gruppen Klassische Entzündungsmarker bei 16%SBM wie Kontrolle
(MPO) oder geringer (SAA) 33%SBM leichte Entzündungserscheinungen ohne
„überschießende“ immunologische Reaktion 16%SBM scheint auf eine Art „ausgleichende“ Funktion auf
Stressreaktionen und das Immunsystem zu haben: Cortisol scheint geringer als Kontrolle nach 8 Wochen Lysozym und MAPK3 aktiv während TLR3 und IgM reduziert Metabolische Reaktionen (USP2) deutlich herunterreguliert
Fazit: vielleicht ist ein bisschen „Stress“ durch SBM förderlich?
Viele offene Fragen Es wurden nur bestimmte Konzentrationen SBM untersucht
Welches ist die optimale Menge an SBM, damit sich ein“ausgleichender” Effekt einstellt?
Wie lange hält der Effekt an?
Wie sind die tatsächlichen zeitlichen Dynamiken? Welche Gene spielen noch eine Rolle?
“Bei Fischen hängt die Immunkompetenz mehr vom Gewicht als vomAlter ab.” (Tort et al. 2003) Größeneffekte müssen bei der Auswertung berücksichtigt
werden
Es wird eine größere Stichprobe benötigt, um Standardabweichungen zu minieren
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Carsten Schulz Alexander Rebl, Tom Goldammer und Team (FBN Dummerstorf)Kati Schlachter Stephanie C. Hornburg und Frederick Kaiser Jonas Müller Laura Schynawa
Michael Schlachter, Claudia Torno und alle anderen Kollegen der GMA
Herzlichen Dank!
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Dr. Henrike [email protected]