Université Paris XIFaculté de Médecine Paris-Sud
THESE
pour obtenir le grade de
Docteur de l’Université Paris XI Spécialité : [Radiobiologie]
présentée et soutenue publiquement
parJean-Pierre Pouget
Date de soutenance : le 7 mars 2000
Effet du rayonnement ionisant sur l’ADN cellulaire :mesure des bases puriques et pyrimidiques modifiées
Titre :
Directeur de thèse : Monsieur Jean Cadet
JURY
Monsieur J.-M. CossetMadame E. SageMonsieur P. GauduchonMadame M. Gardès-AlbertMonsieur J.-L. Ravanat
PrésidentRapporteurRapporteurExaminateurExaminateur
Monsieur J. Cadet Examinateur
Thèse préparée au sein du laboratoire des Lésions des Acides NucléiquesService de Chimie Inorganique et Biologique/Département de Recherche Fondamentale
sur la Matière Condensée, Commissariat à l’Energie Atomique, Grenoble
« Car, enfin, qu’est ce que l’homme dans la nature ? Un néant
à l’égard de l’infini, un tout à l’égard de l’infini, un tout à
l’égard du néant, un milieu entre rien du tout. Infiniment
éloigné de comprendre les extrêmes, la fin des choses et leurs
principes sont pour lui invinciblement cachés dans un secret
impénétrable, également incapable de voir le néant d’où il est
tiré, et l’infini où il est englouti. »
Blaise Pascal, Pensées
J’exprime toute ma gratitude,
à Monsieur Jean Cadet pour m’avoir accueilli dans son laboratoire. Je le remerciepour sa disponibilité, ses compétences scientifiques ainsi que pour laconfiance qu’il m’a témoigné en toute circonstance .
à Madame Evelyne Sage, à Madame Monique Gardès-Albert ainsi qu’à MonsieurPascal Gauduchon pour avoir accepté de juger ce travail.
à Monsieur Jean-Marc Cosset qui a bien voulu présider mon jury de thèse et pour sonsoutien au cours de ces quatre années.
J’exprime ma profonde reconnaissance,
à Madame Marie-Jeanne Richard qui m’a accueilli au sein du Laboratoire de Biologiedu Stress Oxydant, pour nos nombreuses discussions et pour sonesprit critique,
à Monsieur Serge Boiteux pour le don des enzymes de réparation Fpg et endo III,
à Monsieur Jean-Luc Ravanat, à Monsieur Thierry Douki et à Madame SylvieSauvaigo, pour leurs nombreux conseils et pour leur aide tout au longde ces trois années, ainsi que pour nos mémorables déplacements.
Je remercie Monsieur Serge Candeias pour m’avoir accueilli dans son laboratoire de culturescellulaires.
J’adresse mes plus vifs remerciements,
à Messieurs les Professeurs Vrousos et Bolla, chefs du service de Radiothérapie duCHU Michallon, pour avoir mis à ma disposition les accélérateurslinéaires de particules et la source d’irradiation de cobalt 60,
à Madame le Docteur H. Kollodié du service de Radiothérapie pour son soutien,
aux radiophysiciens du service de Radiothérapie, Mesdames Andrée Dusserre et CécileCohard ainsi qu’à Monsieur Jean-Yves Giraud, pour leurscompétences et pour leur aide lors de la mise en place des séancesd’irradiations.
Je remercie chaleureusement Mesdames Jacqueline Méo, Sandra Grange, Lise Ydoux duLBSO et Madame Francette Odin pour les soins qu’elles ont apporté àmes cultures cellulaires.
Mes remerciements s’adressent aussi,
à Mademoiselle Isabelle Testard et à Monsieur Emmanuel Balanzat pour leur accueilau sein du Centre Interdisciplinaire de Recherche avec les Ions lourds(CIRIL) et pour la mise en place des scéances d’irradiations,
à Monsieur Dimitri Angelov pour ses compétences et la disponibilité dont il a faitpreuve lors des irradiations lASER des échantillons.
Je remercie Monsieur Maurice Berger pour m’avoir permis de partager son bureau à monarrivée et pour nos discussions Lozériennes.
Je remercie aussi tous mes compagnons de paillasse mais plus particulièrement SandrineFrelon pour son aide dans les mesures par CLHP-SM/SM, Anne-Gaëlle Bourdat pour son soutien dans ma recherche d’emploi, VictorDuarte et Florence Rivière pour leur disponibilité, Anthony Romieupour le Scientifique qu’il est, Thierry Delatour et Cédric D’Ham pourl’excursion « Néron », enfin Christine Didier et Eric Jourdan pourleur accueil au sein du LBSO.
Je remercie Madame Zohra Termache pour sa formidable efficacité et pour sa disponibilité.
« Calogero Tornabene » me remercie pour tous les conseils que je lui ai donné sur la vie. Jele remercie quant à moi pour les fournitures de petit matériel avant 15heures ... et pour les bons moments que nous avons passés ensemble.
Enfin, je dédie ces années à Marie-Claude et à la mémoire de mon père
- Sommaire -CHAPITRE I : Etude bibliographique
I. Rayonnements ionisants et Société __________________________________________________10
II. Effets des rayonnements ionisants __________________________________________________33
III. Rayonnements ultra-violets et visible ______________________________________________51
IV. La réponse du matériel biologique face aux rayonnements______________________________55
OBJECTIFS DE L’ÉTUDE ____________________________________________ 63
CHAPITRE II : Mise au point de méthodes chromatographiques
I. La technique de postmarquage et les méthodes immunologiques __________________________67
II. Optimisation de la méthode d’extraction de l’ADN cellulaire ____________________________70
III. Utilisation de la technique de CG-SM ______________________________________________78
IV. Utilisation de la technique de CLHP-SM/SM ________________________________________86
V. Conclusion ___________________________________________________________________102
CHAPITRE III : Mesure des dommages radio- et photo-induits dans l’ADN cellulairepar des méthodes chromatographiquesI. Formation de dommages de bases dans l’ADN de monocytes exposés au rayonnementγ du 60Co _______________________________________________________________________104
II. Ionisation de l’ADN cellulaire par des impulsions UV LASER __________________________109
III. Formation des dommages de bases dans l’ADN de monocytes exposés au rayonnement UVA ____114
IV. Formation des dommages de bases dans l’ADN de monocytes photosensibilisés____________114
V. Discussion des résultats _________________________________________________________117
CHAPITRE IV : Mesure des dommages de l’ADN par la méthode des comètes
I. Méthodes de mesure des coupures de brins de l’ADN __________________________________129
II. Optimisation de la mesure des dommages de l’ADN par la méthode des comètes____________134
III. Utilisation de la méthode des comètes couplée à Fpg et endo III ________________________141
IV. Méthode des comètes en milieu neutre_____________________________________________149
V. Expériences mettant en jeu la réparation des lesions___________________________________152
VI. Discussion des résultats ________________________________________________________153
CHAPITRE V : Calibration de la méthode des comètes et aspects mécanistiques
I. Principe de la calibration de la méthode des comètes ___________________________________160
II. Calibration ___________________________________________________________________166
III. Expression des dommages ______________________________________________________170
IV. Discussion des résultats ________________________________________________________173
CHAPITRE VI : Effets des ions lourds chargés 12C6+ sur l’ADN cellulaire
I. Brefs rappels bibliographiques sur les ions lourds _____________________________________180
II. Mesure de la 5-HmdUrd, de la 5-FordUrd, des diols de thymidine, de la 8-oxodGuo et de la 8-oxodAdo par CLHP-SM/SM________________________________________________________182
III. Utilisation de la méthode modifiée des comètes _____________________________________184
IV. Discussion des résultats _______________________________________________________185
CONCLUSION ET PERSPECTIVES_____________________________________ 188
CHAPITRE VII : Partie expérimentale
I. Produits chimiques _____________________________________________________________194
II. Lignée et culture cellulaire_______________________________________________________194
III. Courbe de survie cellulaire______________________________________________________194
IV. Irradiations et réactions de photosensibilisation______________________________________195
V. Méthode de Microélectrophorèse sur gel____________________________________________198
VI. Méthode d’extraction de l’ADN cellulaire__________________________________________200
VII. Analyses chromatographiques___________________________________________________201
VIII. Stabilité des dérivés Fapy purines en milieu alcalin _________________________________208
RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES __________________________________ 211
TABLE DES MATIÈRES________________________________________________ 234
Liste des principales abréviations
ADN : acide désoxyribonucléiqueA. O. : acridine orangeARN : acide ribonucléiqueATP : adénosine triphosphateBSA : albumine de sérum de veauBSTFA : N-bis(triméthylsilyle)trifluoroacétamideD. O. : densité optiqueCIPR : commission internationale de protection contre les rayonnementsC18 : groupements octadécylsilylesCG-SM : chromatographie gazeuse couplée à une détection par spectrométrie
de masseCLHP-DE : chromatographie liquide couplée à une détection électrochimiqueCLHP-DE-UV : chromatographie liquide couplée à une détection électrochimique et
ultra-violetteCLHP-SM/SM : chromatographie liquide couplée à une détection par spectrométrie de
masse en mode tandemCSB : cassure simple brinCDB : cassure double brinCB : somme des coupures simple et double brin et des sites alcali-labilesCBP : cyclobutadipyrimidinesdAdo : 2’-désoxyadénosinedCyd : 2’-désoxycytidinedGMP : 2’-désoxyguanosine monophosphatedGuo : 2’-désoxyguanosinedR : 2-désoxyribosedThd : 2’-désoxythymidineEBR : efficacité biologique relativeendo III : endonucléase IIIeV : électronvoltFapyAde : 4,6-diamino-5-formamidopyrimidineFapydAdo : 4,6-diamino-5-formamidopyrimidine 2’-désoxyadénosineFapyGua : 2,6-diamino-4-hydroxy-5-formamidopyrimidineFCS : sérum de veau foetal5-FordUrd : 5-formyl-2’-désoxyuridineFpg : formamidopyrimidine glycosylaseGy : Gray5-HmdUrd : 5-(hydroxyméthyl)-2’-désoxyuridineJ : JouleMRM : « multiple reaction monitoring »MTBDSTFA : N-tertbutyldiméthylsilyl-N-méthyl-trifluoroacétamideMTT : bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényl-tétrazolium5-OHdUrd : 5-hydroxy-2’-désoxyuridine8-OxoAde : 8-oxo-7,8-dihydroadénine
8-OxodAdo : 8-oxo-7,8-dihydro-2’-désoxyadénosine8-OxodGuo : 8-oxo-7,8-dihydro-2’-désoxyguanosine8-OxoGua : 8-oxo-7,8-dihydroguaninePBS : solution saline isotonique à base de phosphatePRV : phosphodiestérase de rate de veauPVS : phosphodiestérase de venin de serpentRMN : résonance magnétique nucléaireRNase : ribonucléaseR. B. : rose bengalSAL : site alcali-labileSIM : « single ion monitoring »TEL : transfert d’énergie linéiqueTg : diols de thymineuma : unité de masse atomiqueUNSCEAR : « United Nation Scientific Committee on the Effects of Atomic
Radiation »UV : ultra-violetUVA : ultra-violet de type A
- Chapitre I -
Etude bibliographique
Chapitre I : Etude bibliographique 10
I. RAYONNEMENTS IONISANTS ET SOCIETE
A. IntroductionLa découverte des rayons X en 1895, celle du radium et du polonium par Pierre et Marie
Curie en 1898 et la découverte de la radioactivité de l’uranium en 1896 par Becquerel, ont donné le
signal de progrès qui vont révolutionner la physique et la médecine du 20ème siècle. En 1897,
Thomson découvre l’électron à partir d’expériences effectuées sur l’ionisation des gaz. Il inaugure
une voie qui conduira à la détermination de son rôle dans la matière et à l’électronique. Planck
propose la mécanique quantique en 1903. Einstein établit l’équivalence matière-énergie en 1905 et
ouvre la voie de l’énergie nucléaire. Il met en évidence, la même année, la double nature
corpusculaire et ondulatoire des photons. La structure des atomes est avancée par Rutherford en 1912
à partir d’expériences effectuées à l’aide d’un faisceau de particules alpha dirigé contre une mince
feuille d’or. Le domaine médical a bénéficié également très tôt de ces avancées scientifiques. La
Radiologie va naître sous l’impulsion de Barthélémy et Oudin qui obtiennent la première radiographie
en 1896. Les images ne sont encore que des projections où se superposent tous les tissus traversés. La
même année, la radiothérapie apparaît à Lyon sous l’initiative de Despeignes. Elle rend compte de la
possibilité de traiter un cancer sans intervention chirurgicale. La dosimétrie biologique fait son
apparition (1902) avec l’utilisation de l’érythème cutané comme référence. L’Institut du Radium, qui
s’appellera plus tard Institut Curie, est fondé en 1914. Regaud et ses collaborateurs montrent en 1919,
à la fondation Curie, l’influence du fractionnement de dose qui permet de favoriser les tissus sains au
détriment des tissus cancéreux, plus radiosensibles.
La radiobiologie naît dans ces années et se présente rapidement comme une science puissante.
Elle va permettre l’étude du cycle cellulaire et de ses mécanismes de régulation. Elle prend tout son
essor avec la découverte de la molécule d’ADN. La biologie moléculaire a également vu son domaine
d’études étendu par l’utilisation d’isotopes radioactifs pour le marquage de molécules.
Les premiers érythèmes et leucémies radio-induits, mis en évidence chez les utilisateurs de
rayons X, vont conduire en 1921 les radiologues anglais, à mettre en place le « Comité pour la
protection contre les rayons X et le radium ». Définir des règles de radioprotection est alors une
priorité. La CIPR (Commission Internationale de Protection Radiologique) est créée en 1928 à
Stockholm à l’occasion du deuxième Congrès international de Radiologie. Sa mission est d’édicter les
premières réglementations en matière de protection contre les effets immédiats des rayonnements
ionisants. Regroupant des experts de toutes nationalités, ses travaux, complétés par ceux de
l’UNSCEAR (United Nations Scientific Committee on Effects of Atomic Radiation) servent
aujourd’hui encore à l’établissement des réglementations en vigueur dans tous les pays. Elles sont
reprises sous un aspect pratique par les directives d’Euratom qui obligent les états signataires à les
appliquer.
11 Chapitre I : Etude bibliographique
La dosimétrie utilisée jusque là en radiothérapie, était basée sur la dose seuil d’apparition de
l’érythème (DSE). La DSE correspondait à la dose unique de rayons X nécessaire pour provoquer un
érythème. Elle sera remplacée par une approche plus physique de cette discipline. Ainsi, la
Commission Internationale des Unités et grandeurs Radiologiques (ICRU) créée en 1925 donne une
première définition du roentgen qui sera complétée en 1927. Mais, il faut attendre 1950 pour que le
concept de dose absorbée fasse son apparition.
Les conséquences dramatiques des bombardements d’Hiroshima et Nagasaki en 1945 et la
prise de conscience par l’opinion publique des potentialités de l’énergie nucléaire ont accéléré la mise
en place de règles de radioprotection. Ces règles doivent assurer la protection du public et des
travailleurs. Elles s’appliquent également au domaine médical dans le respect du rapport
bénéfice/risque. Toutes ces normes évoluent au fil des progrès de la connaissance scientifique des
effets biologiques des rayonnements.
L’étude de ces effets sur l’homme peut être abordée d’un point de vue clinique,
épidémiologique ou encore fondamental. C’est dans cette dernière démarche que s’inscrivent les
travaux rapportés dans ce mémoire. Nous allons, en effet, nous intéresser dans cette étude, au dosage
des lésions induites par le rayonnements gamma du cobalt 60 sur la molécule d’ADN. Pour cela, notre
exposé s’articulera autour de deux approches. La première consiste à effectuer des mesures directes
des dommages de l’ADN à l’aide de méthodes physico-chimiques. La deuxième repose sur
l’utilisation de méthodes dédiées à la mesure des coupures de brin de l’ADN. Afin de mieux
comprendre l’effet du rayonnement gamma, nous aurons également recours à d’autres systèmes
induisant des lésions de l’ADN tels que le rayonnement ultra-violet de type A, le rayonnement UV
LASER, un flux de particules de 12C6+ ou encore à des réactions de photosensibilisations. Le choix de
ces agents oxydatifs sera développé dans les chapitres IV, V et VI de ce travail.
B. Rayonnements ionisantsAvant d’aborder les effets des radiations ionisantes sur l’ADN, nous allons définir ce qu’est
un rayonnement ionisant et en donner les principales caractéristiques. Il est nécessaire de connaître la
façon dont le rayonnement interagit avec la matière pour pouvoir aborder les notions de base de la
dosimétrie. Il est aussi important de pouvoir relier un effet observé à la dose. Un des enjeux de la
Radiobiologie est de mieux comprendre les mécanismes qui conduisent à la formation des lésions de
l’ADN et d’autres constituants cellulaires. De manière complémentaire, il est intéressant de savoir
dans quelles proportions ces lésions sont formées et aussi de connaître les mécanismes de réponse des
cellules, tissus ou organismes, face à ces dommages. Si les effets des fortes doses sont de mieux en
mieux cernés, beaucoup de questions concernant les effets des faibles doses restent en suspend. La
connaissance de ces effets est primordiale afin de déterminer les risques éventuels associés aux
nombreuses applications industrielles et médicales des rayonnements ionisants.
Chapitre I : Etude bibliographique 12
1. Définition d’un rayonnement ionisant On entend par rayonnement ionisant tout rayonnement susceptible d’arracher un électron à la
matière. L’atome le plus facilement ionisable étant le potassium, avec une énergie d’ionisation de 4,3
eV, tout rayonnement d’une longueur d’onde inférieure à 288 nm peut être considéré comme ionisant.
Cette longueur d’onde correspond à la limite inférieure du spectre solaire au niveau de la mer.
Toutefois, lors de l’interaction du rayonnement avec la matière, toute l’énergie n’est pas déposée sur
une cible unique. Des phénomènes d’excitation de la matière ont lieu et conduisent à une perte
d’énergie de l’onde incidente. On considère qu’il faut environ 35 eV pour ioniser la matière ce qui
correspond à un rayonnement dont la longueur d’onde est inférieure à 35,4 nm.
Cette énergie est à comparer avec les énergies de liaison C-C (3,6 eV) et celle de la liaison O-H (5,16
eV) (Tableau I). Elle est suffisante pour entraîner la dissociation des molécules. Bien qu’elle paraisse
faible (quelques électronvolts), au niveau d’une mole, elle représente des énergies considérables. Une
énergie de 1 eV par atome représente 96,5 kJ.mol-1 (23 kilocalories par mole).
Tableau I : Quelques énergies physiologiques d’après L. Stryer, la Biochimie, Flamarion Médecine
Sciences (Paris)
Energie thermique < 1 kcal/mole < 4,8 kJ.mol-1
Liaison faible 3 kcal/mole 12,5 kJ.mol-1
ATP 12 kcal/mole 50 kJ.mol-1
Lumière verte 52 kcal/mole 217 kJ.mol-1
Liaison C-C 83 kcal/mole 347 kJ.mol-1
2. Quelques notions de base de physique nucléaireLes rayonnements ionisants trouvent leur origine dans un phénomène physique : la radioactivité.
a) La radioactivité
(1) Historique
La radioactivité, propriété essentiellement nucléaire a été découverte par Becquerel, bien
avant que la structure intime de l’atome soit connue. Ayant posé à l’obscurité un composé d’uranium
sur une plaque photographique enveloppée de papier noir, il observa après développement une image.
Il en conclut que l’uranium émettait un rayonnement capable de traverser le papier en l’absence de
fluorescence. La radioactivité était découverte.
13 Chapitre I : Etude bibliographique
(2) Qu’est ce que la radioactivité ?
(a) L’atome
Quel que soit son état, liquide, gazeux ou solide, la matière est un assemblage d’atomes.
L’atome est constitué d’un noyau très dense de très petite dimension (10-13 m) contenant des nucléons.
Ces nucléons peuvent être électriquement neutres, ce sont des neutrons (N) ou électriquement positifs
(Z), ce sont des protons. Autour du noyau gravitent Z électrons de charge opposée à celle du proton de
façon à assurer la neutralité de l’atome. A est le nombre de masse tel que A = Z + N. On caractérisera
un nucléide X par A et Z : On le note X (A, Z).
(b) Lois fondamentales
La physique nucléaire et les désintégrations radioactives obéissent à des principes ou lois
fondamentales que nous allons énumérer brièvement.
1) Equivalence de la masse et de l’énergie :
A toute masse mo correspond une énergie E (c, vitesse de la lumière)
E = mo.c2
L’unité d’énergie est l’électronvolt (eV).
1 eV = 1,602 10-19 J
On peut exprimer les masses des atomes en unité de masse atomique (uma) :
1 uma = masse d’un atome de 12C/12 = 1,660 10-27 kg
Par équivalence masse-énergie, on en déduit que :
1 uma = 931,502 MeV/c2
2) Conservation de la charge
3) Conservation du nombre de nucléons
4) Conservation de l’énergie
Chaque particule possède une énergie somme de son énergie de masse au repos et de son
énergie cinétique :
E = moc2 + Ecin. = mc2 ➊
où m est la masse relativiste,
mo
(1-β2)↔m =
avec β = v/c.
Chapitre I : Etude bibliographique 14
5) Conservation de l’impulsion
Une particule en mouvement a une impulsion :
p = mv ➋
Des équations ➊ et ➋ on déduit une relation très importante reliant l’énergie à l’impulsion :
E2 = (pc)2 + (moc2)2 ➌
6) Dualité onde-corpuscule
A toute onde électromagnétique peut être associé un corpuscule appelé photon d’énergie
quantifiée E (Einstein, 1905) :
E = hν ➍
où h = 6,62 10-34 J.s, est la constante de Planck et ν, la fréquence du rayonnement.
Des équations ➌ et ➍ , on déduit :
E = pc ↔ p= E/c =hν/c= h/λ
où λ est la longueur d’onde associée à une particule en mouvement (de Broglie, 1924).
(c) Stabilité des noyaux
Des lois précédentes, il découle qu’un noyau (A, Z) au repos a une énergie :
M(A,Z)c2 = ZMpc2 + NMnc2 - B
avec :
Mpc2 : énergie de masse du proton,
Mnc2 : énergie de masse du neutron,
B : énergie de liaison totale des A nucléons.
Il a été montré que dans le cas de noyaux naturels, l’énergie moyenne de liaison des nucléons,
égale à B/A variait peu en fonction de A. Cette énergie est très élevée et proche de 8 MeV. Elle
s’explique par l’existence d’une force attractive intense et de courte portée entre les nucléons appelée
interaction nucléaire forte. Elle assure la cohésion des nucléons entre eux, et est proportionnelle à A.
Par opposition, le noyau est aussi l’objet d’interactions coulombiennes fortes qui entraînent une
répulsion des protons entre eux et qui est proportionnelle à Z. Un noyau est stable tant que l’équilibre
entre ces deux forces est respecté, i.e. tant que le rapport entre le nombre de protons et de neutrons
suit une ligne dite ligne de stabilité bêta. Il est instable ou radioactif dans le cas contraire. Pour
retrouver sa stabilité, il doit alors céder une partie de son énergie interne en émettant un rayonnement
particulaire ou photonique.
(3) Définition de l’activité et de la période radioactive
Un noyau instable modifie sa structure pour retrouver sa stabilité. Toutefois il n’est pas
possible pour un noyau donné de connaître l’instant où cette transformation va se produire. On ne
peut définir que la probabilité de désintégration, λ. Elle s’exprime en s-1 et est appelée constante
radioactive.
15 Chapitre I : Etude bibliographique
Si on considère une population de N noyaux instables, le nombre de ceux qui disparaissent pendant
l’unité de temps est égal à λN. On parle d’activité, A, de cette substance. L’activité correspond donc
au nombre de désintégrations subies par unité de temps. Cette valeur varie au cours du temps et suit
une loi exponentielle.
A(t) = λ.N = A0. e-λt
où A0 représente l’activité initiale à un instant t donné.
L’unité de radioactivité est le Becquerel (Bq) et correspond à une désintégration par seconde. La
période radioactive est la durée nécessaire pour que la moitié des noyaux présents initialement se soit
désintégrée.
T = ln2/λ
(4) Isotopes stables et isotopes radioactifs
Parmi toutes les possibilités de grouper des protons et des neutrons, seules certaines
configurations sont stables. On en connaît aujourd’hui 274 sur les 2000 noyaux artificiels et naturels.
51 noyaux naturels sont instables.
b) Différents modes de radioactivité
La ligne de stabilité bêta définit une zone étroite dans un diagramme N-Z où Z est porté en
abscisse et N en ordonnée (Figure 1). Seuls les noyaux les plus légers ont tendance à avoir un nombre
égal de protons et de neutrons.
N = ZZone 1
Zone 2
Zone 3
Z
N
80400
Z = 83
β+ ou capt. électronique
β-
α
β-
40 N + Z = A =cte
120
140
ou fis
sion
Figure 1 : Les désintégrations radioactives : évolution vers la stabilité
Lorsque Z augmente, la répulsion coulombienne augmente aussi. Cette force peut être
neutralisée par l’ajout de neutrons au noyau, ce qui a pour conséquence d’augmenter la cohésion du
Chapitre I : Etude bibliographique 16
noyau. Tous les atomes instables cherchent à se rapprocher de cette ligne. Le processus physique qui
leur permettra de s’en rapprocher est appelé radioactivité ou désintégration radioactive. On distingue
ainsi trois zones qui vont conduire à trois types de désintégration. Les zones 1 et 2 regroupent de
façon prépondérante la plupart des noyaux instables. La zone 1 regroupe les noyaux possédant trop de
neutrons (désintégrations β-) et la zone 2 ceux possédant trop de protons (désintégrations β+). La zone
3 concerne les noyaux les plus lourds qui peuvent se désintégrer par émission α ou par fission.
C. Le cobalt 60Nous allons à travers l’exemple du cobalt 60 aborder quelques notions de dosimétrie. Le 60Co
a été utilisé dans tout ce travail comme la source de rayonnement gamma.
1. Schéma de désintégration du 60CoLe cobalt 60 est un élément de transition appartenant au groupe VIII de la classification
périodique des éléments, de numéro atomique 27 et de nombre de masse 60. Il est instable et se
désintègre selon le schéma suivant (Figure 2):
2626,1 KeV
2505,7 KeV
2158,8 KeV
1332,5 KeV
60Co
60Ni stable
0 KeV
β1
β2
β3
β4
5,271 ans
γ2
γ1 γ4
γ3 γ6
γ5
γ7
2823,6 KeV
100 %
100 %
100 %
Figure 2 : Schéma de désintégration du cobalt 60
2. Désintégration ββββ-
Le 60Co est un émetteur β−. Au cours de la désintégrations β-, un neutron se transforme en un
proton avec émission d’un électron. Ainsi, le nucléide (A, Z) est converti en nucléide (A, Z+1).
n →→→→ p + e -+ νννν
L’énergie libérée par la réaction est constante mais elle se répartie de façon aléatoire entre l’électron
émis et l’anti-neutrino. Lorsque l’on représente la distribution énergétique des électrons émis, on
obtient un spectre continu entre une énergie nulle (l’anti-neutrino emporte toute l’énergie) et une
énergie maximale, Emax de 318 keV (l’électron emporte toute l’énergie). L’énergie moyenne emportée
17 Chapitre I : Etude bibliographique
par l’électron est Emax/3. Dans le cas du 60Co, cette désintégration aboutit majoritairement à deux états
excités du noyau fils.
3. Emission gammaA la suite de la désintégration radioactive β-, le noyau se retrouve dans un état excité. Pour
retrouver son niveau fondamental, il cède ce trop plein d’énergie par l’émission d’une onde
électromagnétique appelée photon γ, caractéristique de la transition. Cette désexcitation du noyau peut
s’effectuer en une seule ou plusieurs étapes. L’émission β- du 60Co est ainsi suivie de l’émission de
deux photons γ sous forme de cascade d’énergies respectivement égales à 1173,2 keV et 1332,5 keV.
D. Coefficients d’interactionLes rayonnements peuvent être classés en rayonnements directement ionisants qui délivrent
leur énergie à la matière, et en rayonnements indirectement ionisants (x, γ) qui sont susceptibles de
transférer une importante fraction ou la totalité de leur énergie en une seule interaction à des
particules chargées. Lorsqu’un rayonnement pénètre dans un milieu matériel, il a une certaine
probabilité d’interagir avec les atomes du milieu traversé et de leur transférer de l’énergie. Les
échanges énergétiques sont explicités à l’aide de coefficients.
1. Pouvoir massique total de ralentissementLe pouvoir massique total de ralentissement d’un matériau, relatif à des particules chargées,
d’un certain type et d’une énergie donnée est égal à :
=Sρ
dEρ dl
dE est l’énergie perdue au cours de la traversée d’une distance dl dans un matériau de masse
volumique ρ. Ce coefficient correspond à une force de freinage et s'exprime en J.m2.kg-1 , en pratique
en MeV.cm2g-1. Dans le cas de l’interaction d’électrons d’énergie moyenne de 100 keV avec les
tissus, la valeur de ce coefficient est de 20,8 MeV.cm2g-1 (Tableau II).
Tableau II: Pouvoir de ralentissement des électrons (en MeV.cm2g-1)
Energie (keV) Cuivre Air Tissus
10 13,26 19,69 22,90
1000 1,26 1,66 1,82
2000 1,27 1,68 1,81
Chapitre I : Etude bibliographique 18
2. Coefficient massique de transfert d’énergie µtr/ρρρρCe coefficient, relatif à des rayonnements indirectement ionisants est égal, pour un matériau
donné, à:
=1
ρENµtrρ
dEtrdl
....
Il s’exprime en cm2.g-1. E est l’énergie de chaque particule, N est le nombre de particules. dEtr/EN est
la fraction de l’énergie transférée aux électrons secondaires au cours d’interactions se produisant à la
traversée d’une distance dl dans le matériau de masse volumique ρ. Le coefficient massique
d’absorption d’énergie prend en compte la fraction g, d’énergie transmise aux électrons secondaires
mais perdue sous forme de rayonnement de freinage. Dans le cas de l’interaction des photons du
cobalt 60 avec les tissus, g est égal à zéro et µtr/ρ = 0,0300 cm2.g-1 (Tableau III).
=µenρ
µtrρ
(1-g)
Tableau III: Coefficient massique d’absorption en énergie (en cm2.g-1)
Energie (keV) Cuivre Air Tissus
10 160 4,5401 4,8242
1000 0,0257 0,0279 0,0307
2000 0,0216 0,0260 0,0258
E. Nature des interactionsAfin d’aborder les notions de dosimétrie, il est nécessaire de préciser comment les
rayonnements électronique et photonique interagissent avec la matière.
1. Interaction des particules chargéesLa force d’interaction dominante est l’interaction coulombienne entre la particule incidente et
les électrons du milieu. Le ralentissement de l’électron dans la matière est caractérisé par S, pouvoir
de ralentissement exprimé à l’aide de la formule de Bethe :
dEdx
S = - = 4 π εοmοv2e 4.z2.Z. N . ln (2 mov 2
I
(- ln 1- v2 v2
c 2 (( (
c 2
(
-
mo, e : masse au repos et charge de l’électron, respectivement,
v, z : vitesse et charge de la particule, respectivement,
N, Z : densité et numéro atomique des atomes du milieu, respectivement,
19 Chapitre I : Etude bibliographique
I : constante caractéristique de l’espèce atomique considérée, définie comme une énergie moyenne
d’excitation et d’ionisation des atomes du milieu.
a) Electrons de faible énergie : collision
Les électrons interagissent essentiellement avec les électrons de la matière par répulsion
coulombienne. Chaque interaction donne lieu à un défléchissement de leur trajectoire et leur parcours
dans la matière suit une ligne brisée dont chacune des angulations représente une ionisation ou une
excitation. On peut appliquer la formule de Bethe relative au pouvoir de ralentissement des électrons
tant que l’énergie de ces derniers est faible (< 50 keV).
Les électrons peuvent également interagir avec les noyaux par diffusion élastique. L’électron diffuse
mais sans perte d’énergie appréciable. La probabilité de ce phénomène varie comme le carré du
numéro atomique Z du matériau et comme l’inverse de l’énergie de l’électron.
b) Electrons de grande énergie : freinage
Pour des énergies supérieures à 50 keV, les électrons peuvent être considérés comme
relativistes. Le rayonnement de freinage (Bremsstrahlung) est le type d’interaction prédominante. Il
affecte les électrons de grande énergie cinétique qui, au voisinage des noyaux, subissent une brusque
accélération (répulsion coulombienne) en s’accompagnant d’un changement de direction et de
l’émission d’une onde électromagnétique. L’énergie emportée par cette dernière entraîne un
ralentissement de l’électron.
c) Pouvoir de ralentissement total
Il prend en compte les deux types d’interaction, collision (col.) et freinage (frein.) :
= dE dl
dEdl ][ ] [+
col. frein.
Sρ[ ] 1
ρ ( ) = E.Z700
E est l’énergie de l’électron incident (MeV). Z et ρ sont respectivement, le numéro atomique et la
masse volumique du milieu traversé. 700 est un facteur déterminé expérimentalement. On définit pour
chaque matériau une énergie critique qui sépare les deux domaines de prédominance, ionisation-
excitation et freinage (Figure 3).
Chapitre I : Etude bibliographique 20
0,5 5 500500
0,050,005
collision
10
15
5
plomb
dE
dx
(
(
-1 ρ(M
eV/g
/cm
2 )
Energie (MeV)
Tota
l
rayo
nnem
ent
Figure 3 : Pouvoir de ralentissement massique des électrons dans le plomb
2. Interaction du rayonnement γγγγ avec la matièreLes rayonnements électromagnétiques peuvent en une seule interaction céder toute leur
énergie au milieu ou bien parcourir une longue distance sans interagir. L’interaction avec la matière
peut s’effectuer selon trois processus principaux : l’effet photoélectrique, la diffusion Compton et
l’effet de création de paires. Le coefficient linéique d’interaction, µl, caractérise la probabilité
d’interaction, pi, d’un rayonnement par unité de longueur d’un matériau traversé. µl =dN/(dl N) =
pi/dl. On utilise très souvent µm/ρ, coefficient massique d’atténuation, où ρ est la masse volumique de
l’écran.
a) Nature des interactions
(1) Diffusion Compton
Dans le cas de la diffusion Compton, une partie de l’énergie du photon incident est cédée à un
électron du cortège électronique. Le photon d’énergie hν change de direction et repart avec une
énergie hν’ inférieure à hν. L’électron cible est extrait du cortège avec une énergie cinétique et dans
une direction déterminée. L’énergie du photon incident, E, se distribue sur le photon diffusé, on la
note Es, et sur l’électron Compton, on la note Ea. On peut définir une énergie moyenne diffusée au
cours de chaque interaction. Lorsqu’un faisceau primaire, constitué de N photons d’énergie E traverse
un écran matériel d’épaisseur ∆X, il subit une atténuation en nombre (loi d’atténuation d’un faisceau
de photons) et une atténuation en énergie (perte d’énergie égale à ∆N.E). La perte en nombre peut
s’exprimer à l’aide de la section efficace σ =∆N/(N.X) où ∆N est le nombre de photons ayant interagi.
L’énergie perdue par le faisceau est égale au produit de l’énergie moyenne perdue au cours de chaque
interaction par le nombre de photons ayant interagi :
∆N.E = ∆N.Es + ∆N.Ea
En divisant par le produit N. E, on obtient :
21 Chapitre I : Etude bibliographique
N E∆N.Es + ∆N.EaN.E N.E
∆N.E = σdX = σsdx +σadx=
On définit deux coefficients σs et σa caractéristiques, respectivement, de la diffusion et de l’absorption
Compton.
Eσs =
σ.EsE
σa =σ.Eaet
(2) Effet Photoélectrique
Il s’agit de l’absorption complète du photon par le milieu traversé. Le photon incident cède
toute son énergie à un électron qui se trouve éjecté de son orbitale atomique. Le réarrangement
électronique s’accompagne de l’émission d’électrons Auger et de photons X. En appliquant le même
raisonnement et formalisme que précédemment, l’atténuation représentant la diminution en nombre de
photons primaires, d’énergie E est caractérisée par τ =∆N/(N.X). L’énergie des électrons secondaires
est absorbée localement et le coefficient d’absorption photoélectrique s’écrit :
1 - W + f. W EE
τa = ( (
τ
E: énergie du photon incident,
w : énergie moyenne emportée par les photons X,
f : probabilité d’émission d’électrons Auger.
Le coefficient de diffusion photoélectrique τs peut s’exprimer ainsi:
W - f. W EE
τs = ( (
τ
(3) Effet de création de paires ou de matérialisation
Lorsqu’un photon pénètre dans le champ coulombien d’un noyau, il peut disparaître en se
convertissant en un électron et en un positon. Le photon incident doit au moins posséder une énergie
supérieure à 1,022 MeV. Le coefficient de l’effet de matérialisation s’écrit : π =∆N/(N.X).
Le coefficient d’absorption de matérialisation qui représente la part d’énergie absorbée localement
s’écrit :
E - 1,02E
πa = ( (
π
Le coefficient de diffusion de matérialisation est défini de la manière suivante :
Eπs =π.1,02
Chapitre I : Etude bibliographique 22
b) Importance relative des différents effets
Le coefficient massique d’atténuation global µ/ρ est la somme des coefficients massiques
d’atténuation propres à chaque type d’interaction. De la même manière, il sera possible de définir le
coefficient d’absorption massique global d’absorption µtr/ρ comme étant la somme de σa, τa et πa.
1 - W + f W EE
( (
τE
σ.Ea+ +E - 1,02E
µtr/ρ = ( (
πρ ρ ρ
En considérant les 3 principaux types d’interaction des photons avec la matière, on peut diviser le
domaine d’énergie en trois catégories (Figure 4) : celui où l’effet photoélectrique prédomine (E<E1),
celui relatif à l’effet Compton pour E1<E>E2 et celui de l’effet de matérialisation. Les valeurs de E
dépendent du milieu traversé. Pour l’aluminium, E1 = 60 keV et E2 vaut 18 MeV. Dans le plomb, les
valeurs des énergies sont respectivement de 500 keV et de 5 MeV.
Effet photoélectriquedominant
Production de paires
dominante
Effet Comptondominant
0,01 0,05 0,1 5 10 50 1001
Num
éro
atom
ique
de
l’abs
orbe
ur
Energie du photon incident (MeV)
Figure 4 : Importance relative des trois modes d’interaction des photons avec la matière
F. Notions de radiométrieL’action du rayonnement sur la matière se traduit en terme d’effets par l’apparition d’ions, de
radicaux ou de molécules excitées. L’importance des espèces ainsi produites dépend de la quantité
d’énergie cédée par le rayonnement au milieu. Cette valeur est estimée à l’aide de grandeurs
physiques, telles que le Kerma et la Dose absorbée. Nous allons présenter ces grandeurs dans les
paragraphes suivants.
1. Les unités de radiométrie
a) Champ de rayonnement
Pour connaître l’action d’un rayonnement dans un milieu donné, on définit un espace, le
champ de rayonnement. Ce dernier est caractérisé par une fonction mathématique Φu qui représente le
nombre de particules N se propageant en un point P de l’espace de coordonnée r, dans une direction u,
23 Chapitre I : Etude bibliographique
dans un angle solide dΩ, autour de u, avec une énergie E à l’instant t. Cette fonction s’appelle
distribution angulaire de fluence (Figure 5).
θ
z'
y'x'z
y
x
φ
P
r
dΩ
u
Φ : Nombre de particules traversantune sphère élémentaire de diamètre da (L-2)
Fluence de particules
Φ =dNda
N : Nombre de particules émises transféréesou reçues pendant un intervalle de temps dt (T--1)
Flux de particules
N = dNdt
Figure 5 : Définition du champ de rayonnement
A partir du champ de rayonnement on définit l’énergie rayonnante, ainsi que les flux et
fluences énergétiques de particules.
Re: Energie totale des particules émise, transférée, reçue (J)
Energie rayonnante
Re =∫ E.dEdNdE
.
R: Energie totale des particules émise, transférée, reçue (W) ,pendant un intervalle de temps dt
Flux énergétique
.d2NdE
R =E.dEdt∫
Fluence énergétiqueR: Energie totale des particules émisetransférée, recue dans une sphère élémentairede diamètre da (J.m-2 )
d2NdE
R= E.dEda∫
ΦE: Nombre de particules traversant une sphèreélémentaire de section diamétrale da, d'énergie comprise entre E et E+ dE
Fluence différentielle en énergie
ΦE =d2NdE da
b) Dose absorbée et Kerma
L’énergie communiquée par un rayonnement ionisant à un volume de matière cible est :
ε = Re- Rs + ΣQ
ε est une quantité stochastique avec :
Re : énergie rayonnante entrant dans le volume,
Chapitre I : Etude bibliographique 24
Rs : énergie rayonnante sortant du volume,
ΣQ : somme des énergies rayonnantes produites après déduction de la somme des énergies
rayonnantes utilisées dans des transferts internes au volume de matière.
L’énergie spécifique communiquée Z (en Gray) est une quantité stochastique :
εZ =m
La dose absorbée D dans un volume de matière de masse dm est :dεD =dm
= Zlim0m →
ε : énergie moyenne communiquée est une quantité déterministe,
Z : énergie moyenne communiquée est une quantité déterministe.
(1) Particules chargées
=∫ E.dEdNdE
. ∫ (E-∆E).dEdNdE
.-s Rε = e - R ∫ ∆E.dEdNdE
.=
où ∆E est la fraction d’énergie perdue par chaque particule chargée d’énergie E.
∆E = Scoll..l , avec l, longueur moyenne des cordes d'une sphère de rayon R, égale à 4/3 R.
DTRdε=dm
= Z =lim0m →
∫ 1.dNdE
.a
Sρ[ ]
coll..dElim
0m →= ∫ 2d
aSρ[ ]
coll..dE où a est la surface diamétrale i.e. a = πRlim[ Ν.]
dE
da.dEor ΦE = d2N , on en déduit que :
coll.Sρ
[∫ ] .ΦE.dEDMR=
DMR, dose absorbée relative à la matière (par exemple pour un tissu T, on la note DTR) et à un
rayonnement R. Son unité est le Gray (Gy).
25 Chapitre I : Etude bibliographique
(2) Rayonnements électromagnétiques
Il faut déterminer la relation entre la fluence de photons primaires en un point M d’un
matériau et l’énergie transférée en ce même point par ces photons primaires aux électrons secondaires
mis en mouvement. On considère un photon d’énergie E pénétrant dans une sphère élémentaire dont
le diamètre est très inférieur au libre parcours moyen de ce photon dans le milieu. Celui-ci à la suite
d’une interaction communique une énergie moyenne Etr à la matière de la sphère.
Le coefficient de transfert d’énergie est donné par la formule :
= dEtr où dx représente la longueur l de la corde moyenne découpée par le photonE.dx
µtr (E)
L’énergie moyenne transférée est dans ce cas égale à :
Etr(E) = µtr(E).E.l
L’énergie totale transférée par l’ensemble des photons est :
dΕdN(E) .dE où dN(E) est le nombre de photons avec une énergie comprise entre E et E + dEEtr(E)Etr(E) .=
La définition du Kerma est :
dEtrdmK= = lim
Etrm→0 m
En remplaçant Etr(E) par son expression (vide supra) et en considérant que l = 4/3R = V/a
K =∫ da
µtr (E)ρ
.E. dElim[ Ν (E)]dE
or ΦE = dad N(E)= lim
aN(E)
K =∫ µtr (E)ρ
.E. dEE Φ .
Son unité est le Gray (Gy).
2. Energie transférée et énergie absorbée localementLe faisceau primaire transfère une partie de son énergie au cours d’interactions avec la
matière. Cette énergie est communiquée à des électrons secondaires sous forme d’énergie cinétique
qui est progressivement absorbée par le milieu au cours du ralentissement des électrons. L’énergie
transférée aux électrons peut être élevée et le parcours des électrons dans la matière peut être grand si
bien que l’énergie transférée peut être très différente de l’énergie absorbée localement.
Toutefois, lorsque les conditions d’équilibre électronique sont satisfaites on peut considérer
que l’énergie transférée et l’énergie absorbée sont égales. Dans ces conditions, et seulement dans ces
conditions, on peut connaître la dose absorbée localement. Elle est donnée par l’expression suivante :
Chapitre I : Etude bibliographique 26
DTR =∫ µen(E)ρ
.E. dEE Φ .
3. Variation de la dose en fonction de la profondeurDans le cas de l’interaction des électrons émis par le cobalt 60 avec les tissus, le rayonnement
de freinage est nul et le principal mode d’interaction des électrons reste le mode par collision. Par
ailleurs, le parcours maximal de ces électrons est de 66 cm dans l’air et de 0,85 mm dans l’eau. Par
conséquent, dans la plupart des conditions expérimentales, la composante électronique de l’émission
du 60Co sera négligeable.
Profondeur (cm)
Figure 6 : Rendement en profondeur de la dose (dans 2 mm de cuivre)
Dans la Figure 6, on représente la courbe de rendement en profondeur de la dose établie par
simulation Monte Carlo, lors de l’interaction des photons du cobalt 60 avec le cuivre. La dose
augmente donc jusqu’à ce que l’équilibre électronique soit atteint et diminue ensuite du fait de
l’atténuation du faisceau de photons incidents.
G. La qualité du rayonnement et la radiosensibilité des tissusLorsqu’on s’intéresse aux effets biologiques des rayonnements ionisants, la dose absorbée ne
suffit pas toujours à expliquer les dommages produits. Elle ne donne qu’une vision macroscopique du
dépôt d’énergie et ne rend pas compte de l’hétérogénéité de ce dépôt d’énergie.
Pour illustrer cela, prenons par exemple une dose de 1 Gy (1 J.kg-1) délivrée à un tissu (ρ = 1) (1). Il
faut 35 eV pour créer une ionisation : le nombre de paires d’ions créées est de 1,841017. Le litre n’est
pas le volume d’intérêt pour le radiobiologiste. Considérons un cylindre cible correspondant à un
maillon élémentaire de la molécule d’ADN, d’une hauteur de 1,7 nm et de rayon 2 nm. Le volume V
s’exprime par :
27 Chapitre I : Etude bibliographique
V =π d2
4. h = 534, 1 nm3 et 103 cm3 =10 24 nm3
ce qui représente 9,8 10-7 ionisations pour le volume considéré. La grande majorité des mailles est
donc épargnée. Pour l’ADN (2 109 nm de long), ce sont 1152 ionisations qui auront été produites. Cet
exemple illustre bien l’importance de la distribution spatiale des ionisations (notion de volume cible)
Une forte densité d’ionisation s’accompagnera de dommages nombreux et d’une plus grande difficulté
pour la cellule pour réparer ces lésions.
1. Le Transfert d’Energie Linéique (TEL)Pour tenir compte de la distribution spatiale des ionisations, la notion de TEL a été introduite.
Le Transfert d’Energie Linéique (TEL ou L∆) correspond à la quantité d’énergie cédée par une
particule chargée lors de collisions avec des électrons en traversant une distance dl, collisions au
cours desquelles, les pertes d’énergies sont inférieures à ∆.
L∆ =dEdx ∆ et L = Scoll.∞
Le TEL moyenne la valeur du dépôt d’énergie dE sur tout le parcours dx et ne prend pas en compte :
- la perte d’énergie par les électrons secondaires,
- la variation intrinsèque tout au long du parcours,
- la longueur et la non linéarité de la trajectoire.
2. L’Efficacité Biologique Relative (EBR)L’EBR permet, à effets biologiques identiques, de comparer deux rayonnements. Elle découle
de la notion de TEL (2).
EBR = dose absorbée d'un rayonnement de référence
dose absorbée de rayonnement conduisant aux mêmes effets biologiques
Si on s’intéresse aux effets aléatoires, on parlera de facteur de qualité (Q(L)) qui est déduit des
valeurs des EBR pour les effets stochastiques. La relation entre facteur de qualité Q et TEL est
donnée dans le Tableau IV (3).
Chapitre I : Etude bibliographique 28
Tableau IV : Expression du facteur de qualité Q en fonction du TEL (3)
Transfert d’Energie Linéique
L (keV.µm-1) Q (L)< 10 1
10 - 100 0,32 L -2,2
> 100 300 /(L)1/2
Le cobalt 60 avec un TEL de 0,2 keV/µm possède un facteur de qualité de 1. La CIPR 60 a
introduit la notion de facteur de pondération pour le rayonnement, Wr. Ceci évite certaines
imprécisions dues à l’application formelle du facteur Q. Toutefois, Q et Wr donnent dans la plupart
des cas des valeurs très proches (Tableau V).
Tableau V : Valeurs du facteur Wr en fonction de la nature du rayonnement (3)
Nature du rayonnement Facteur Wr
Photons 1
Electrons 1
Neutrons E < 10 keV 5
10 keV < E < 100 keV 10
100 keV < E < 2 MeV 20
2 MeV < E < 20 MeV 10
> 20 MeV 5
Protons E > 2 MeV 5
Particules αααα, fragments de fission 20
Noyaux lourds 20
3. La dose équivalenteLa dose équivalente HTR dans un tissu irradié T par un rayonnement R est le produit de la dose
absorbée DTR par le facteur de pondération Wr. Son unité est le Sievert (Sv).
4. La dose efficaceLa dose efficace E est le produit de la dose équivalente par un facteur de pondération
tissulaire WT (qui prend en compte la radiosensibilité du tissu face aux effets stochastiques) propre à
chaque tissu. Son unité est le Sievert (Sv). On a ΣWT = 1.
E = WT.Wr.DTR
29 Chapitre I : Etude bibliographique
Les organes les plus radiosensibles sont pourvus pour les effets stochastiques d’un coefficient élevé
(Tableau VI).
Tableau VI : Valeur de Wt selon le tissu ou l’organe (3)
Tissu ou organe Facteur Wt
Gonades 0,20
Moelle osseuse 0,12
Colon 0,12
Poumon 0,12
Thyroïde 0,05
Peau 0,01
5. Les grandeurs opérationnellesLes grandeurs opérationnelles de la radioprotection, les seules grandeurs qui soient
effectivement mesurables, sont basées sur le concept d’équivalent de dose. Pour que ces grandeurs
soient acceptables en terme de radioprotection des individus, ces grandeurs doivent toujours être
supérieures aux grandeurs primaires, HTR, E. A partir de mesures de grandeurs physiques (Kerma,
fluence de particules ou dose) effectuées par les instruments de radioprotection, un facteur de
conversion (qui prend en compte la qualité du rayonnement), permet d’obtenir la valeur de la
grandeur opérationnelle qu’il s’agisse d’équivalent de dose personnel (dans le cas de la dosimétrie
individuelle), d’équivalent de dose ambiant ou d’équivalent de dose directionnel (dans le cas de la
dosimétrie de zone).
H. Sources d’expositionSi notre modèle de travail est le rayonnement gamma du cobalt 60, les sources de
rayonnements auxquelles les individus peuvent être soumis sont diverses et sont classées en plusieurs
catégories (Figure 7). Il nous paraît important d’en donner ici quelques exemples. Pour une activité de
radioéléments donnée, les limites d’exposition fixées par la réglementation peuvent être atteintes pour
des durées d’exposition très variables selon la nature du radionucléide rencontré. De plus, la
connaissance de ces sources d’exposition permet de définir ce que l’on entend par faible dose selon
que l’on est industriel, médecin ou scientifique. On considère cependant, en radioprotection, qu’une
faible dose est comprise entre 1 et 30 mSv.
Chapitre I : Etude bibliographique 30
applications médicales
1,2 mSv (31,3%)
autres (indutries, etc.)
0,01 mSv (0,3%)radon
1,3 mSv (37%)
rayonnements telluriques
0,46 mSv (13,2%)
rayonnements cosmiques
0,39 mSv (11%)
radionucléides de l'organisme
0,23 mSv (6,5%)
Figure 7 : Composantes moyennes de l’exposition humaine en France (4)Nous allons présenter ces différents composantes.
1. Sources d’irradiation industriellesLe cycle du combustible nucléaire met en jeu les plus grosses quantités de matières
radioactives. Toutefois, la mise en place par cette industrie de moyens de radioprotection très
importants fait que la plupart des accidents industriels d’irradiation sont liés à l’industrie non
nucléaire utilisant des sources radioactives (appareils de gammagraphie par exemple).
a) Industrie électronucléaire
L’exposition du public, minime (200 µSv) en condition normale, est liée aux rejets d’effluents
radioactifs gazeux ou liquides des centrales ou usines de retraitement (Figure 8). Ces effluents
contiennent de nombreux radionucléides émetteurs de rayonnement alpha, gamma ou bêta. Avec des
expositions comprises entre 4 mSv et 25 mSv, ce sont les mines d’uranium qui constituent la partie du
cycle où l’exposition des travailleurs est la plus élevée. Cette exposition est due au radon, émetteur
alpha et à ses descendants. Les mineurs d’uranium ont d’ailleurs fait l’objet de plusieurs études
épidémiologiques (5, 6).
31 Chapitre I : Etude bibliographique
produits de fission (β, γ) (β, γ) (β, γ) (β, γ) 133Xe, 85Kr, 131I, 137Cs, 90Sr, etc.
58Co et 60Co, 51Cr, 59Fe, 3H, etc.
produits d’activation (β, γ) (β, γ) (β, γ) (β, γ)
242Pu, Pu, Pu, Pu, 242 237238 239 240 241 Pu, Np,
241Am, Cm et 244Cm, etc.
transuraniens (α, γ) (α, γ) (α, γ) (α, γ)
1 à 200 µSv
population la plus exposée
Extractiondéchets
centralenucléaire
Fabricationdu combustible
Retraitement
Enrichissement
222Rn, 220Rn, 218Po (αααα)
214Bi, 214Pb, 234Th, 234mPa (ββββ)
exposition des travailleurs (5 à 30 mS v)
85Kr, 129I, 3H
134Cs, 241 137 Cs, Am
effluents gazeux
effluents liquides
239Pu
235U
effluents gazeux et liquides
Xe, Kr, 133 85 131I, 137 129Cs, 134 Cs I
Figure 8 : Exposition générée par l’industrie nucléaire
b) Applications en sources scellées et non scellées
On trouve de nombreuses autres applications industrielles des rayonnements ionisants (γ, X,
électrons ou neutrons) qui en fonctionnement normal ne présentent pas de danger pour le public. C’est
par exemple, la radiographie industrielle (contrôle des soudures et d’éléments de structure), les
techniques analytiques (cristallographie, analyse de minerais par fluorescence, dosage de pesticide par
capture électronique, etc.), les jauges radiométriques, les applications en agro-alimentaire
(stérilisation des aliments, accroissement de la durée de conservation par ionisation, etc.), la
stérilisation du matériel médical, etc..
2. Sources d’irradiation médicalesL’irradiation médicale avec 1,2 mSv par an est la deuxième source d’exposition du public
dans les pays développés. Les rayonnements ionisants sont utilisés au sein de trois disciplines :
radiodiagnostic (radiographie conventionnelle, mammographie, scanographie, l’angiographie et la
radiologie interventionnelle), radiothérapie et curiethérapie et enfin médecine nucléaire (Figure 9).
Chapitre I : Etude bibliographique 32
Applications médicales (1,2 mSv)
? mSv.an-1 )(0,2
visées diagnostique et curative(sources non scellées)
100 µSvmédecine nucléaire
exposition interne
rayonnements β, γ123I99mTc, 59Fe, 201Tl ,
131I51Cr, 133
Xe,
16,7 mSv.an -1)(0,3
Scintigraphie thyroïdienne 0,24 mSv Scintigraphie myocardique 23 mSv
radiodiagnostic1 mSv
0,3 mSv (radiographie dentaire)6 mSv (tomodensitométrie pelvienne)10,9 mSv (urographie intraveineuse)
exposition externe
rayonnement X
visée diagnostique(sources scellées)
radiographie conventionnelle
mammographiescannographie
angiographie
radiologie interventionnelle
38,4 mSv.an-1)(0,2
1,4 mSv.an-1)(0,2
1
visée curative(sources scellées)
radiothérapie0,01 µSv
exposition externe
curiethérapie99,99 µSv
exposition interne
rayonnement X rayonnements β , X, - γ192Ir, 137Cs, 125I,
5,6 mSv.an -1)(0,2
20 Gy à 70 Gy (2 Gy/scéance)
1 1
gamme de dose efficace reçue par la catégorie professionnelle la plus exposée
1
dose efficace reçue par le patientIV ème Conférence Internationale de l'ACOMEN,Grenoble 5-7 mai 1993
20 Gy à 70 Gy 1
Figure 9 : Sources d’irradiation médicales
L’exposition de la population qui résulte de ces activités dépend, d’une part, du nombre d’actes et de
la dose délivrée au cours d’un acte. La nature des rayonnements utilisés est rapportée dans la Figure 9
ci-dessus.
3. Sources d’irradiation naturellesL’homme a de tout temps été exposé à des rayonnements ionisants, de par son environnement
et de par les atomes qui le constituent (Figure 10) (4, 7, 8). Les radionucléides primordiaux qui
constituent l’écorce terrestre (l’235U, l’238U, le 232Th) mais aussi le potassium 40, présent dans l’eau et
dans l’air sont responsables de l’exposition externe.
A cette composante tellurique, s’ajoute la composante cosmique constituée essentiellement, lors de
son arrivée sur Terre de protons, photons γ, neutrons (Figure 10). La composante la plus importante,
de l’exposition naturelle, est d’origine interne. Elle résulte surtout de l’inhalation du 222Rn et de ses
descendants métalliques (9, 10). Appartenant à la famille de l’238U, le 222Rn est un gaz émetteur alpha,
qui se désintègre avec une période de 3,8 jours. La contribution de ses éléments de filiation, le 218Po,
le 214Bi et le 214Po, est beaucoup plus importante que celle du radon lui-même. A côté du radon inhalé,
on trouve des radionucléides présents tout au long de la chaîne alimentaire et qui sont ingérés. Ils
contribuent pour 0,3 mSv à l’exposition interne de l’homme due à la présence d’environ 4500 Bq de40K, 3700 Bq de 14 C, et 13 Bq de 226Ra.
33 Chapitre I : Etude bibliographique
γγγγrayonnement solaire
(protons)
Homme
238U, 235U, 232Th, 40K (sol)
238U, 235U, 232Th, 40K (eau, air)
β β β β +
π +π +π +π +
γγγγ
nβ β β β - β β β β +
protons(87%)
alphas (12%)
noyaux lourds (C, O, N, Fe, Ca)
π°π°π°π°n p
p
20 Km
Rayonnementcosmique secondaire (10 2 à 105 MeV)
Rayonnement2 13
cosmique primaire (10 à 10 MeV)
60 Km d'altitude
5 Km
gerbes d'Auger
νννν
exposition externe tellurique 0,46 mSvRadon 222
Radon 222
exposition interne 1,3 mSv
aliments et descendants
et descendants
10 éruptions de basseénérgie/an (10 à 100 MeV)
4 à 5 éruptions de hauteénérgie/an (GeV)
Rayonnement capté par le champ géomagnétique terrestre
(ceintures de Van Allen)e-, p
Soleil
exposition externe cosmique 0,39 mSv
Figure 10 : Sources d’exposition naturelles
II. EFFETS DES RAYONNEMENTS IONISANTS
Après avoir évoqué la nature des rayonnements auxquels notre organisme est soumis, et la
façon dont ils interagissent avec la matière, nous allons maintenant présenter les conséquences
biologiques de ces interactions. Il est aujourd’hui admis que l’ADN est la molécule cible des effets
biologiques produits par les rayonnements ionisants. Une dose de 250 Gy délivrée au cytoplasme n’a
pas d’effet sur la prolifération cellulaire alors qu’une dose de 1,5 Gy délivrée au noyau empêche la
division de 50% des cellules. Toutefois, plusieurs travaux ont également souligné l’implication des
structures membranaires, en particulier de la membrane nucléaire, dans les effets biologiques des
rayonnements ionisants.
A. Effets direct et indirect du rayonnement gamma du 60Co Les effets des rayonnements ionisants sur la molécule cible peuvent être produits par
interaction directe du rayonnement avec la molécule ou par l’intermédiaire de l’eau environnant la
molécule (11).
1. Effet directIl résulte d’un dépôt d’énergie sur le substrat qui peut conduire à une ionisation ou à une
excitation de la matière.
2. Effet indirectIl résulte de l’interaction du rayonnement avec la molécule d’eau (Figure 11).
Chapitre I : Etude bibliographique 34
Excitation Ionisation
H2O* H2O°+ + e-sec
-
Durée de vie de l'événement (s)
H3O+ + °OHDissociation
+ H2OSolvatation
H2 H2O2
10-17à 10-16
-1410
10-13
0.3 x 10 -12
-1110 à 10
-7
Recombinaison
e-aq
(2,7)
(0,4) (0,7)
H° + °OH(0,6) (0,6)
(2,7) (2,7)
H2ORayonnements
ionisants
Etape prédiffusionnelle
Etape diffusionnelle
Etape de recombinaison
( ) : rendements radiolytiques des espèces exprimés en nombre de molécules/100 eV
Figure 11 : Radiolyse de l’eau d’après (12)
C’est le type d’interaction prédominante observée avec les rayonnements à faible TEL,
comme les rayonnements gamma ou électronique. On estime, en effet qu’environ 75% des
interactions des rayons γ avec la matière se font par cette voie (13). La radiolyse de l’eau comporte
plusieurs étapes qui conduisent à la formation d’espèces radicalaires et ioniques (°OH et H°, e-aq, H+)
selon les processus décrits ci-dessus. Lors de leur formation, ces espèces ne sont pas distribuées de
façon homogène dans le milieu. Elles s’accumulent dans des zones appelées grappes qui sont situées à
l’extrémité des trajectoires des électrons secondaires. Au cours de l’étape de diffusion, leur
concentration décroît dans ces zones par réaction de recombinaison radicalaire, avec formation de H2,
H2O2, mais aussi par diffusion dans tout le milieu ou encore par réaction avec des solutés éventuels.
35 Chapitre I : Etude bibliographique
3. Trace d’un rayonnement de faible TEL
hν
hν hν'
hν'
Figure 12 : Trace d’un rayonnement à faible TEL dans le noyau cellulaire (14)
La Figure 12 représente la répartition des ionisations produites par un rayonnement de faible
TEL dans un volume cible donné. On distingue les grappes d’ionisations présentes à l’extrémité des
trajectoires des électrons secondaires. Une répartition des ionisations beaucoup plus dense et moins
dispersée est observée avec des rayonnements de TEL plus élevé (14-17).
B. Effets sur les membranesLes membranes étant constituées d’un double feuillet phospholipidique, les radicaux générés
lors de la radiolyse de l’eau, en particulier les radicaux hydroxyle sont susceptibles de réagir avec les
chaînes d’acides gras insaturés au niveau des doubles liaisons. Outre l’altération de la membrane, les
peroxydes formés par cette réaction, ou les produits de dégradation de ces dérivés comme le
malonedialdéhyde (MDA) (18) ou le 4-hydroxynonenal (4-HNE) (19) peuvent modifier à leur tour
l’ADN. Toute altération de la membrane par les radicaux peut en particulier être responsable de la
modification des flux calciques, lesquels sont impliqués dans les mécanismes apoptotiques (20).
C. Effets sur l’ADN
1. Structure de l’ADNLa transmission des caractères héréditaires d’une génération à une autre repose sur la
transmission d’une molécule, présente dans toutes les formes du règne vivant, l’acide
désoxyribonucléique (ADN). Mise en évidence dès la fin du XIXème siècle par Miescher, Altmann et
Kossel, l’ADN à été modélisé en 1953, par Watson et Crick (Figure 13). Cette molécule universelle
contient, sous forme d’un code appelé code génétique, toutes les informations nécessaires à la vie et
les caractéristiques de chaque individu. L’ADN se présente sous la forme d’un polymère constitué par
l’enchaînement de nucléotides. Le nucléotide est lui-même une entité constituée d’un phosphate relié
à un sucre, le 2-désoxyribose lui même relié par une liaison N-glycosidique à une base. Des liaisons
phosphodiester en 3’ et 5’ des 2-désoxyriboses relient ensuite les nucléotides entre eux. L’ADN
comprend 4 bases principales, dont l’enchaînement définit le code génétique. L’adénine (A) et la
Chapitre I : Etude bibliographique 36
guanine (G) qui constituent les bases puriques et la thymine (T) et la cytosine (C) qui constituent les
bases pyrimidiques. La polymérisation des nucléotides permet la constitution d’un brin orienté 5’-3’
caractérisé par la succession des nucléotides (A , T , G , ou C).
Extrémité 5'OH
2)
sucre
phosphate
base
N
NH
OHO P
O
OO
O
OH3C
N
N
OHO P
O
OO
O
NH2
N
NO
O
OPOOH
N
N
NH2
O
OO
O
NH
NN
N
NH2
Adénine
Guanine
Thymine
Cytosine
Bases pyrimidiques
Bases puriques
Extrémité 3'OH1) 2)
Figure 13 : Structure de l’ADN
Le brin ainsi formé adopte une structure hélicoïdale qui s’associe de façon complémentaire à
un deuxième brin d’ADN antiparallèle.
Chaîne sucre-phosphate
Liaisons hydrogènes
Base
pas d’hélice(3,4 nm)
3)
Figure 13 : Structure de l’ADN (suite)
Cette association se fait par l’intermédiaire de liaisons hydrogène entre bases
complémentaires. Les bases complémentaires sont respectivement la guanine et la cytosine (reliées
par trois liaisons hydrogène), l’adénine et la thymine (reliées par deux liaisons hydrogène). Six
milliards de paires de bases constituent le génome humain et sont réparties dans 23 paires de
chromosomes. L’ADN est ensuite associé chez les eucaryotes à des protéines, les histones pour
37 Chapitre I : Etude bibliographique
constituer une fibre de chromatine de 30 nm de diamètre. Cette dernière structure est présente quelle
que soit la phase du cycle cellulaire. Toutefois, lorsque la cellule se divise, elle est condensée dans
une nouvelle structure, le chromosome. L’ADN nucléaire humain déroulé représenterait une double
hélice de 1,8 m. Cette double hélice doit être condensée d’environ 1000 fois pour tenir dans un noyau
interphasique de 6 µm de diamètre et de 6000 à 10000 fois dans le chromosome métaphasique.
L’ADN apparaît comme une structure dynamique et non statique dont la conformation et l’hydratation
peuvent influer sur la radiosensibilité cellulaire (21).
2. Fonctions de l’ADN
a) Activité homolytique : la réplication
Plusieurs complexes enzymatiques (hélicases, ADN polymérases, ligases) interviennent au
cours de chaque division cellulaire pour synthétiser une copie fidèle de la molécule d’ADN détenue
par la cellule mère. Cette copie dite semi-conservative s’effectue par ouverture de la double hélice et
synthèse d’un nouveau brin par complémentarité avec le brin parental. Des systèmes de réparation
présents dans les cellules assureront la rigoureuse duplication de l’information génétique.
b) Activité hétérolytique : la transcription
La deuxième fonction de l’ADN est de coder pour des protéines. Une partie de l’ADN
seulement, dite partie codante, va être transcrite en ARN. A l’instar de l’ADN, l’ARN ou acide
ribonucléique est aussi constitué d’un enchaînement de nucléotides, mais le 2-désoxyribose est ici
remplacé par un ribose et la thymine par l’uracile. De plus, il se présente sous la forme d’une chaîne
monobrin. Après transcription, l’ARN pourra, chez les eucaryotes être maturé avant d’être traduit en
protéine au niveau de structures appelées ribosomes. Le code génétique assure la correspondance
entre une information détenue au niveau de l’ADN sous forme d’une séquence de nucléotides et un
acide aminé essentiel qui participera à l’élaboration d’une protéine. L’enchaînement de trois bases (A,
T, G, C) suffit à coder les 20 acides aminés qui sont les motifs de base des protéines.
3. Lésions radio-induites de l’ADN
a) L’effet indirect
Les espèces radicalaires °OH, H° et les électrons solvatés produits au cours de la radiolyse de
l’eau peuvent réagir avec les bases ou avec le 2-désoxyribose de la molécule d’ADN.
Chapitre I : Etude bibliographique 38
coupure de chaîne(simple brin)
pontageADN-protéine
coupure de chaîne(double brin)formation
de site abasique
modification de la base(oxydation, alkylation,
réarrangements)
TT A
A
AX
C
Figure 14 : Lésions radio-induites de l’ADN
Le produit de ces réactions conduit à la formation de coupures simple ou double brin, de
bases modifiées, de sites abasiques et de pontages entre ADN et protéines (Figure 14) (22-25) .
(1) Les coupures de brins
(a) Les coupures simple brin (CSB)
Leur nombre est estimé à environ 1000 par cellule de mammifère et par Gy pour un
rayonnement de faible TEL (14, 26). Elles sont dues à la rupture des liaisons phosphate-sucre (25,
27) consécutivement à un arrachement d’un atome d’hydrogène du sucre par le radical °OH.
L’arrachement d’un atome d’hydrogène du 2-désoxyribose par le radical 5-hydroxy-5,6-
dihydropyrimid-6-yle peut aussi conduire à la formation d’une coupure de chaîne de l’ADN (28, 29).
Toutefois, ce processus est peu efficace. Le taux de formation des cassures simple brin est linéaire
avec la dose et est plus faible lorsque le TEL du rayonnement augmente. Il s’agit de lésions
relativement vite réparées (en moins d’une heure) et qui ont peu d’impact en matière de létalité
cellulaire.
(b) Les coupures double brin (CDB)
Il s’agit sans doute d’une catégorie de lésions parmi les plus délétères. Elles correspondent àune rupture des deux chaînes en des sites proches l’un de l’autre. Leur nombre est estimé entre 40 et
100 dans une cellule de mammifère par Gy de rayonnement de faible TEL (14). Deux mécanismes
sont avancés pour expliquer leur formation. Le premier suppose l’action d’un seul radical °OH sur le
2-désoxyribose (30) avec transfert du radical sur le deuxième brin. Le deuxième implique l’attaque de
l’ADN par plusieurs radicaux hydroxyle dans des zones rapprochées (31). La réparation des CDB, qui
39 Chapitre I : Etude bibliographique
peut être relativement longue, intervient comme un critère important dans la radiosensibilité cellulaire
(32-35). L’efficacité de leur formation augmente avec l’augmentation du TEL.
(2) Les bases modifiées
De nombreuses bases modifiées par l’irradiation gamma ont été identifiées (24, 25, 36, 37).La nature des produits obtenus dépend des propriétés redox des espèces mises en jeu et de leurenvironnement (présence d’oxygène ou non). Le nombre de bases modifiées radio-induites est estiméà environ 2000 par cellule eucaryote par Gy de rayonnement de faible TEL.
(a) Les bases pyrimidiques modifiées (pour revue (38))
Les modifications résultent essentiellement de l’attaque des radicaux hydroxyle sur le cyclearomatique des pyrimidines (Figures 15 et 16). Les radicaux °OH étant très électrophiles, cetteattaque s’effectue préférentiellement en position 5 du cycle de la thymine et de la cytosine. L’additiondu radical °OH sur la liaison 5,6 pyrimidique conduit à la formation de radicaux 5-hydroxy-6-yle ou6-hydroxy-5-yle.
HN
NO
OCH3
OH
HH
°
O2
HN
NO
OCH3OH
OO°H
H
O2
OH
OHH
CH3
O
O N
HN
HNH
HN
O
O
OHCH3
HNH2
O
H
HN
NO
OCH3OH
OOHH
H
HN
NO
OCH3OH
O
HN
NO
OCH3
H
H
HN
NO
OCH3OH
HH
O2H°
H°
O2
H
HN
NO
OCH3H
HH
°OH
HN
NO
OCH3
OH
OOHH
H
HN
NO
OCH3
OH
OO°H
H
HN
NO
OCH3
HOH
°
H
°OH35%60%
HN
NO
OCH2OOH
H
HN
NO
OCH2°
H
HN
NO
OCH2OH
H
HN
NO
OCHO
H5-formyluracile5-(hydroxyméthyl)uracile
°OH5%
Thymine
5,6-dihydrothymine
5-hydroxy-5,6-dihydrothymine
5-hydroxy-5-méthylhydantoïne diols de thymineformylamine
O2
HN
NO
OCH2OO°
H
Figure 15 : Schéma d’oxydation de la thymine proposé par Cadet et al. (38)
Chapitre I : Etude bibliographique 40
On note aussi la formation d’un radical allylyle lorsque le radical °OH réagit avec le
groupement méthyle de la thymine par arrachement d’un atome d’hydrogène. En milieu aéré, les
radicaux formés réagissent avec le dioxygène pour former des radicaux peroxyles (39, 40). Ces
derniers peuvent être transformés en hydroperoxydes consécutivement à une réaction de transfert
d’électron au radical superoxyde, suivie d’une réaction de protonation. Ces peroxydes qui ont été
isolés et caractérisés dans le cas de la thymine et de la thymidine sont instables (39, 41). Ils se
décomposent en divers produits par perte d’un atome d’oxygène ou d’une molécule d’eau, ouverture
de cycle et transposition.
N
NO
NH2
N
NO
NH2
H
OHH
°
N
NO
NH2
OOH
OHHH
H
H
H
H
OO°H
OH
H
NH2
O N
N
OH° OH°90% 10%
réaction de cyclisation
N
NO
NH2
OHHH
OOH
H
H
HOO°H
OH
NH2
O N
N
N
N
O
O OHH
H
H
HNH2
O
H
HN
NO
O
HOHOH
HN
NO
NH2OH
H
N
NO
NH2
HOHOH
H
H- NH3
H2O H2O
5-hydroxyhydantoïne formylamine
diols d'uracile 5-hydroxycytosine
O2O2
Cytosine
N
NO
NH2
OHH
H
H
°
Figure 16 : Schéma d’oxydation de la cytosine proposé par Cadet et al. (38)
L’addition de l’e-aq sur la cytosine ou la thymine conduit à la formation après protonation de
radicaux 5,6-dihydropyrimid-5 yle. Ces radicaux peuvent être réduits ou oxydés pour donner
respectivement les 5,6-dihydropyrimidines et les 5,6-dihydroxy-5,6-dihydropyrimidines. L’attaque des
bases par les radicaux H° peut avoir lieu parallèlement en milieu hypoxique ou anoxique conduisant à
des produits d’addition préférentielle sur le C-5.
41 Chapitre I : Etude bibliographique
(b) Les bases puriques modifiées (pour revue (38))
L’addition des radicaux °OH peut avoir lieu en position 4 ou 8 des purines (38). L’addition
des radicaux °OH en position 8, conduit à la formation d’un radical neutre intermédiaire, qui selon la
nature du milieu, oxydant ou réducteur, pourra donner, respectivement, la 8-oxo-7,8-dihydroguanine
(et la 8-oxo-7,8-dihydroadénine dans le cas de l’adénine) ou le 2,6-diamino-4-hydroxy-5-
formamidopyrimidine (4,6-diamino-5-formamidopyrimidine dans le cas de l’adénine) (Figures 17 et
18) (38, 42). Des réactions de cyclisation entre la position 5’ du sucre et 8 de la base se produisent de
manière compétitive (43-45).
NH
NN
N
O
H NH2
HN
N N
N°O
OHH
HH2N
Oxydation Réduction
HN
N N
N
O
HH2N
+°
+H2O/-H+
(ADN)
(-e-)Guanine
radical neutreréducteur
cation radical
°OH
°OH
HN
N NH
N
O
H2N OH
°
N
N NH
N
O°
H2N
radical neutreoxydant
- H+
- H2O
N
NO NH2
H2N
H2O
O2
O
NO
H2N
NH2
NH2 oxazolone
imidazolone
2,6-diamino-4-hydroxy-5-formamidopyrimidine (FapyGua)
HHN
N NH2
N
O
O
HH2N
HHN
N N
N
O
O
HH2N
8-oxo-7,8-dihydroguanine(8-oxoGua)
Figure 17 : Schéma d’oxydation de la guanine proposé par Cadet et al. (38)
Ces réactions, initiées par arrachement d’un atome d’hydrogène en position 5’ du sucre, sont
favorisées en milieu anoxique. Elles peuvent conduire à la formation de nucléosides cycliques (liaison
covalente entre les positions 5’ et 8). L'addition du radical °OH en position 4 de la guanine conduit à
la formation d'oxazolone, après déshydratation du radical guanyle formé initialement. Cela implique
dans une étape ultérieure la fixation de O2 et plusieurs transpositions. Dans le cas de l'adénine un
schéma d'oxydation similaire a été déterminé puisque l'attaque de la base en position 8 par le radical
Chapitre I : Etude bibliographique 42
hydroxyle conduit à la formation de 8-oxo-7,8-dihydroadénine ou de 4,6-diamino-5-
formamidopyrimidine (Figure 18). Toutefois, les produits issus de l'attaque en position 4, n'ont
toujours pas été caractérisés. La formation de 2-hydroxyadénine a également été proposée (46, 47).
Oxydation Réduction
N
N N
N
NH2
H
+°
+H2O/-H+
(ADN)
(-e-)
8-oxo-7,8-dihydroadénine(8-oxoAde)
4,6-diamino-5-formamidopyrimidine (FapyAde)
Adénine
radical neutreréducteur
cation radicalN
N NH
N
NH2
OH
°
N
N N
N°NH2
OHH
H
N
NHN
N
NH2
- H2O-H°
°OH
°OH
HN
N NH
N
O
N
N NH
N
NH°
HN
N NH2
N
NH2
O
H
HN
N NH
N
NH2
O
Figure 18 : Schéma d’oxydation de l’adénine proposé par Cadet et al. (38)
(3) Pontages ADN-protéines
Des pontages intra-chaîne ou inter-chaînes ou entre l’ADN et les protéines environnantes
peuvent aussi se former sous l’effet du rayonnement ionisant. Dans ce cas, le radical hydroxyle peut
être impliqué (48). Le nombre des pontages radio-induits entre ADN et protéines est d’environ 30 par
cellule par Gy de rayonnement de faible TEL. Ils peuvent se former (en absence d’oxygène) lorsque
deux radicaux sont générés à la fois sur l’ADN et au niveau des acides aminés constitutifs des
protéines proches de l’ADN. Des travaux ont mis en évidence la formation de pontage entre la
tyrosine et la thymine (49, 50) mais aussi entre d’autres acides aminés et la thymine ou la cytosine
(49-51).
43 Chapitre I : Etude bibliographique
(4) Altération des sucres
L’attaque du 2-désoxyribose par les radicaux °OH qui se traduit initialement par un
arrachement d’un atome d’hydrogène, peut conduire à :
- une libération du sucre entraînant la formation d’une coupure de brin,
- un sucre altéré mais toujours relié en 3’ et 5’ au squelette phosphodiester (site abasique),
- un sucre altéré et seulement relié en 3’ ou 5’ au squelette phosphodiester (formation d’une
coupure de brin).
Plusieurs produits d’altération ont été identifiés (25, 52).
b) L’effet direct (pour revue (38))
Des travaux sur des composés modèles et sur l’ADN isolé ont montré que les effets direct
(ionisation) et indirect du rayonnement gamma conduisaient à la formation de bases modifiées
identiques mais produites en quantités différentes (53). L’effet direct consiste en un arrachement
d’électron avec formation d’un cation radical.
(1) Le 2-désoxyribose
Cet effet peut concerner le 2-désoxyribose et conduire à la formation d’un cation radical qui
après déprotonation et réaction avec l’oxygène, conduit à une coupure de la chaîne d’ADN.
(2) La 2’-désoxyguanosine
La guanine qui possède le potentiel d’oxydation le plus bas est la plus sensible aux réactions
d’ionisation. Le schéma d’oxydation par un électron de la guanine proposé par Cadet et al. (38) est
présenté dans la Figure 17. La perte d’un électron par la guanine conduit à la formation d’un cation
radical qui peut perdre un proton pour conduire à la formation d’oxazolone ou s’hydrater pour
engendrer la 8-oxodGuo et la FapyGua.
(3) La 2’-désoxyadénosine
Le cation radical obtenu par arrachement d’un électron à la base de la 2’-désoxyadénosine
peut perdre un proton pour donner un radical aminyle qui peut se désaminer et donner l’hypoxanthine.
Le radical cation peut aussi s’hydrater et conduire à la formation de 8-oxodAdo et de FapydAdo.
(4) La 2’-désoxythymidine
L’arrachement d’un électron de la thymidine conduit à la formation d’un cation radical qui
peut perdre un proton ou bien s’hydrater en respectivement le radical intermédiaire 5-méthyl-2’-
désoxyuridyle (dans 30% des cas) ou le radical 6-hydroxy-5,6-dihydrothymidyl-5-yle (dans 70% des
cas). Dans le premier cas, la réaction de l’oxygène avec le radical formé conduit à la formation de 5-
HmdUrd ou de 5-FordUrd. Dans le second cas, la réaction de l’oxygène avec le radical en position 6
Chapitre I : Etude bibliographique 44
conduit à la formation de 5-hydroperoxy-6-hydroperoxy-5,6-dihydrothymidine. La dégradation de cet
intermédiaire a déjà été discuté dans la présentation de l’effet indirect.
(5) La 2’-désoxycytidine
Le cation radical formé par arrachement d’un électron à la base de la 2’-désoxycytidine peut
perdre un proton au niveau de l’amine exocyclique en position 4 ou au niveau du carbone 1 du 2-
désoxyribose. Les radicaux ainsi produits (17% au total des réactions) conduiront à la formation (en
présence de dioxygène) de 2-désoxy-D-ribono-1,4-lactone et de cytosine ou de 2’-désoxyuridine.
Toutefois, la réaction majoritaire du cation radical de la cytosine est une hydratation en position 6
pour donner le radical intermédiaire 6-hydroxy-5,6-dihydro-2’désoxycytidyl-5yle.
4. Lésions spontanées de l’ADNLes constituants de l’ADN cellulaire sont en permanence l’objet d’altérations chimiques
(Tableau VII). Ces modifications constituent le « bruit de fond ou niveau basal de lésions ». 2000 à 10
000 purines sont ainsi libérées « spontanément » de l’ADN cellulaire chaque jour et forment des sites
abasiques. Cette libération des bases résulte de la rupture des liaisons N-glycosidiques. Cette réaction
d’hydrolyse affecte plus les purines que les pyrimidines (54). Des réactions de désaminations de
l’adénine, de la guanine et de la cytosine se produisent pour former respectivement l’hypoxanthine, la
xanthine et l’uracile. Des coupures de brin de l’ADN peuvent également se former. Il est intéressant
de comparer le niveau basal des produits d’oxydation de l’ADN cellulaire à celui induit par une dose
de rayonnement (13, 55).
Tableau VII : Nombre de dommages de l’ADN par cellule de mammifère
Lésions spontanées
Evénement par heure par année dommages del’ADN/cGy
cassures simple et double brin ≈ 5 103 ≈ 4,4 107 10
dépurination ≈ 1,5 103 ≈ 1,4 107 0,4
pertes de bases ≈ 1,25 103 ≈ 1,1 107 9,5
Total ≈≈≈≈ 8,0 103 ≈≈≈≈ 7 107 20
Les doses rencontrées en radioprotection sont pour une année de l’ordre du mGy. En
prenant une marge de sécurité (100 lésions produites par centiGray) pour tenir compte d’autres
lésions comme les pontages ou modifications de bases qui ne sont pas répertoriées dans ce Tableau,
une exposition de cet ordre se traduit par la formation additionnelle de 100 lésions au niveau basal
d’environ 7 107 lésions. Bien sûr, cette comparaison n’est donnée qu’à titre indicatif. La seule
45 Chapitre I : Etude bibliographique
comparaison des taux de formation des lésions ne prend pas en compte la nature de ces lésions (sites
multi-lésés par exemple, etc.) ni le caractère global de l’irradiation (atteintes des tissus et des grandes
fonctions physiologiques de l’organisme). Une telle comparaison signifierait en effet qu’un individu
pourrait recevoir une dose un million de fois plus élevée sans aucun risque, ce qui n’est pas le cas.
D. Effets d’une irradiation sur les chromosomes : Aberrationschromosomiques
Nous ne détaillerons pas ce type de lésions. Toutefois, comme il s’agit de dommages très
importants dans les effets des ions lourds, nous en donnerons néanmoins les principales
caractéristiques. L’utilisation de coloration au GIEMSA, de coloration différentielle (bandes R et S),
l’utilisation de 5-bromodésoyuridine ou de l’hybridation fluorescente in situ (FISH), ont permis la
mise en évidence des remaniements des chromosomes après irradiation.
1. Nature des aberrationsSi l’irradiation a lieu avant la phase S du cycle cellulaire, il peut s’agir d’échanges
intrachromosomiques (délétion, anneau centrique, etc.), d’échanges interchromosomiques
(dicentriques, etc.). Si l’irradiation a lieu après la phase S, en G2, les aberrations induites sont de type
chromatidiennes (lacunes, fragments, etc.) (56). Dans ce cas, une chromatide seulement sur les deux
de chaque chromosome sera touchée. Plusieurs mécanismes conduisant à la formation des aberrations
chromosomiques ont été proposés. Ils sont rapportés dans les travaux de Sax (57) qui sont aujourd’hui
confirmés par d’autres études (58), et dans les investigations de Revell (59). Il semble cependant que
l’événement prépondérant soit la formation d’une cassure double brin (60). Les échanges
chromosomiques sont le résultat d’une cassure de chromatide suivie par la fusion des extrémités
coupées. Certaines cassures ne sont pas réparées et donnent lieu à la formation de fragments.
2. Transmission des aberrations à la descendanceSeules les aberrations stables (translocations, inversions) seront transmises à la descendance
et pourront être mises en évidence plusieurs générations cellulaires post-irradiation. Les aberrations
les plus complexes (anneaux dicentriques, acentriques) comportant au moins trois points de cassures
sont difficilement transmissibles (61).
3. Dosimétrie biologiqueL’étude des remaniements chromosomiques, et en particulier des dicentriques, montre que la
fréquence d’apparition de cette dernière classe de lésions est dose-dépendante avec une relation
linéaire quadratique. La persistance de ces lésions, pendant plusieurs semaines, au sein des
chromosomes de lymphocytes d’un individu irradié permet de remonter à la dose reçue (62).
Chapitre I : Etude bibliographique 46
E. Effets d’une irradiation sur le corps humainL’atteinte des constituants cellulaires (ADN, membranes cellulaire et nucléaire, etc. ) se
traduit au niveau de l’organisme par l’apparition de symptômes cliniques que l’on peut classer en
deux catégories (Figure 19) (63-65).
Irradiation globale
effets aléatoires
dose seuil ?probabilité d’apparition = f (dose)
délai d’apparition long (plusieurs années)
effets déterministes
dose seuil d’apparitioneffet = f (dose)
délai d’apparition court
syndrome hématopoïétiquehémorragie, infection (2< dose < 10 Gy)
syndrome nerveux(50 Gy < dose)
syndrome prodromafatigue, nausées (dose < 2Gy)
syndrome gastrointestinalnausées, vomissement, diarrhées hémorragiques10 < dose < 50 Gy)
cancers mortels (4,0 10 -2 /Sv)
cancers non mortels (0,8 10-2/Sv)
effets héréditaires (0,8 10-2/Sv)
détriment 5,610-2/Sv (travailleurs, CIPR 60)
Figure 19 : Effets d’une irradiation globale sur l’homme
1. Effets déterministesLeurs principaux aspects sont indiqués sur la Figure 19. Les signes cliniques qui les
caractérisent peuvent être regroupés au sein de 4 syndromes indissociables les uns des autres. Ils
s’inscrivent dans une chronologie post-irradiation qui comporte trois phases. Une phase initiale
d’apparition des symptômes suivie d’une période de latence plus ou moins longue et enfin une phase
aiguë ou critique où les atteintes tissulaires s’expriment.
2. Effets aléatoiresLes effets aléatoires ou tardifs ont pour conséquence l’apparition de cancers et d’effets
héréditaires (3, 64, 66, 67).
a) Instabilité génique-chromosomique
Il s’agit de morts cellulaires, de mutations, de transformations cellulaires ou encore
d’instabilité chromosomique pouvant apparaître plus de 100 générations cellulaires après l’exposition
au rayonnement. L’origine de cette instabilité est encore méconnue même si la mutation de gènes
intervenant dans le maintien de cette stabilité est avancée (68).
47 Chapitre I : Etude bibliographique
b) Cancérogenèse : Effet somatique
Ce terme recouvre un grand nombre de maladies (plus d’une centaine). Ces maladies résultent
toutes d’une prolifération anarchique de cellules conduisant à l’apparition d’une tumeur. Chaque
cancer présente ses caractéristiques propres mais les mécanismes qui engendrent les tumeurs
présentent des similitudes. Si cette prolifération reste confinée, on parlera de tumeur bénigne, si elle
s’étend de manière anarchique, on parlera de tumeur maligne.
(1) Approche épidémiologique
Le premier type d’effets associé à l’exposition à des rayonnements ionisants est le cancer
radio-induit. Le premier cancer radio-induit (cancer de la peau) reconnu date de 1902. De nombreux
travaux ont depuis établi des corrélations entre exposition au rayonnement ionisant et cancer (69, 70).
S’il est démontré qu’au delà d’une dose estimée à environ 500 mSv, la probabilité d’apparition d’un
cancer augmente avec la dose délivrée, aucun excès de tumeurs et leucémies n’a pu être démontré
pour des doses inférieures à 200 mSv. Il s’agit donc, pour mettre en place un système de protection
des travailleurs comme du public, de savoir si l’on peut extrapoler les données obtenues aux fortes
doses (> 500 mSv) au domaine des faibles doses (< 200 mSv) et s’il existe une dose minimale pour
l’apparition des cancers (notion de seuil). Les différents moyens d’analyse reposent sur des études
épidémiologiques mais aussi sur des travaux effectués en laboratoire (expérimentations animales ou
transformation de cellules). Les principales études épidémiologiques reposent sur l’analyse des
données concernant la cohorte des survivants d’Hiroshima-Nagasaki (71, 72), les malades traités par
radiothérapie (73), les radiologistes (74), les travailleurs du nucléaire (75), et certaines populations
vivant dans des zones à fortes exposition naturelle (plateau du Kérala en Inde) (10).
(2) Approche moléculaire de la radiocancérogenèse
(a) le cancer
Le nombre de cellules transformées est indépendant du nombre de cellules irradiées. Une
tumeur provient d’une seule cellule dont la division échappe à tout contrôle. La division cellulaire
étant sous le contrôle de gènes, c’est la modification du code génétique (mutation) de ces gènes qui
est responsable de l’initiation du processus tumoral (76-78). Ce processus implique plusieurs étapes
(79). Plus de 250 gènes sont aujourd’hui connus comme étant impliqués dans le contrôle de la
prolifération, i.e. dans le contrôle de la signalisation intercellulaire et du cycle cellulaire. Ces gènes
sont classés en deux catégories :
- Les oncogènes (PDGF, erb-B, RET, Ki-ras, N-ras, c-myc, N-myc, Bcl-2, MDM2, etc.) qui
favorisent la croissance cellulaire,
- Les antioncogènes ou gènes suppresseurs de tumeurs (NF-1, NF-2, RB, p53, etc.).
(b) le cancer radio-induit
Chapitre I : Etude bibliographique 48
S’il est difficile de distinguer un cancer radio-induit d’un autre, l’étude de certains gènes
semble indiquer que le spectre de mutations induit par le rayonnement ionisant diffère du spectre de
mutations spontanées. L’étude des remaniements chromosomiques observés dans certains cancers
suggère deux processus possibles de cancérisation. Le cancer peut être initié par activation d’un
oncogène (une translocation spécifique active un oncogène) ou par inactivation d’antioncogènes. On
considère, pour des raisons de balistique, qu’il est plus facile à un rayonnement de produire la perte
d’une fonction que la création d’une nouvelle. Il a en effet été constaté que les rayonnements ionisants
produisent surtout des délétions qui aboutissent à la perte de fonction d’un allèle (80). Chaque gène
comportant deux allèles, la perte d’un seul ne s’accompagnera pas, la plupart du temps, d’une perte de
fonction du gène. La phase de promotion du cancer ne sera atteinte que si l’allèle restant subit à son
tour une mutation dans un délai plus ou moins long. La cellule acquerra une totale indépendance et ne
répondra plus à aucun contrôle de son environnement au cours de la phase suivante, dite de
progression. Les cancers radio-induits ne devraient survenir que chez les personnes âgées ou irradiées
relativement jeunes. C’est bien le cas de carcinomes, de certains sarcomes ou leucémies.
Une deuxième caractéristique de l’effet des rayonnements ionisants est l’instabilité
chromosomique qu’ils génèrent. Il faut attendre 20 à 30 générations après l’irradiation pour qu’une
mutagenèse très forte se produise. Des dicentriques, des délétions sont alors susceptibles de se
produire.
c) Effets génétiques héréditaires
Les effets héréditaires regroupent l’ensemble des mutations pouvant être transmises à la
descendance. Du fait de l’existence de mutations spontanées au sein de la population, il est difficile
d’estimer le risque héréditaire d’un agent mutagène pour les générations futures. Les mutations
spontanées sont essentiellement générées au cours de l’étape de réplication de la molécule d’ADN. Ce
taux est d’environ une mutation par milliard de bases copiées. Une naissance sur 10 viable est
porteuse d’une anomalie génétique et représente en quelque sorte « le bruit de fond » naturel
d’anomalies génétiques (Figure 20) (4).
anomalies/naissance viable
Mendéliennes Chromosomiques
0,4 %autosomiques récessives 0,25 %
autosomiques dominantes 0,9 %
liées au chromosome X 0,1 %
affections multifactorielles
9 %
Figure 20 : Anomalies génétiques de la population
49 Chapitre I : Etude bibliographique
Aucun effet héréditaire n’a été montré dans la cohorte des survivants d’Hiroshima - Nagasaki,
même chez les individus irradiés à forte dose. De ce fait, l’estimation du risque pour les besoins de la
radioprotection est effectuée à partir des études animales.
F. Radioprotection : Les trois principesL’établissement de normes de Radioprotection repose sur les données scientifiques apportées
par les études cliniques, épidémiologiques ou fondamentales. Ces normes réglementaires sont basées
sur les rapports de la CIPR (3) et prennent en compte les effets déterministes et les effets aléatoires
des rayonnements ionisants.
1. Les effets déterministesCe sont les effets les mieux connus. Ils apparaissent comme nous l’avons vu au delà d’une
dose seuil, relativement élevée, et leur gravité est fonction de la dose et du débit de dose. La
réglementation fixe en fait des limites d’exposition très inférieures à leur dose-seuil d’apparition.
2. Les effets aléatoiresExiste-t-il un seuil d’apparition des effets tardifs ? Tant que la démonstration n’en a pas été
faite, la radioprotection applique le principe de précaution. Toute irradiation est susceptible d’engager
un processus cancéreux. Toutefois, ce principe est indissociable du principe de responsabilité basé à
la fois sur la notion de transfert de risque et de prise en compte des facteurs économiques liés à
l’activité mettant en jeu les rayonnements ionisants.
a) Démarche ALARA
Ces principes débouchent sur la démarche ALARA (« As Low As Reasonably Achievable »),
qui sous-entend de réduire les expositions à un niveau aussi faible que les contraintes économiques le
permettent.
Une limite est ainsi fixée. Au dessus de la limite, on trouve le domaine des expositions
inacceptables. En dessous, on trouve le domaine des expositions tolérables. Le risque est dit accepté
pour toutes les expositions situées sous le niveau ALARA.
b) Choix des limites
Elles reposent d’une part sur les données épidémiologiques (qui permettent d’estimer le risque
lié à une exposition) et d’autre part sur le risque que la société est prête à accepter. Pour évaluer le
risque lié à l’exposition aux rayonnements ionisants, on utilise la notion de détriment. Le détriment
prend en compte les effets tardifs (génétiques et carcinogénétiques mortels et non mortels). Le
détriment est ainsi estimé pour le travailleurs à 5,610-2 Sv-1, ce qui veut dire que sur une population de
100 000 personnes ayant reçu une dose efficace de 1 mSv, 5,6 cancers seraient induits par les
rayonnements ionisants. Néanmoins, une limite d’exposition de 20 mSv correspondrait à un risque de
20 10-3 4 10-2, soit 8 décès pour 10 000 travailleurs. 4 10-2 Sv-1 représente le risque de cancers
mortels. L’abaissement des limites d’exposition à 20 mSv/an, fixé par la nouvelle directive, tolère un
Chapitre I : Etude bibliographique 50
risque de décès huit fois supérieur à celui rencontré dans l’industrie du bâtiment (qui est pourtant
l’industrie estimée être la plus dangereuse).
Partant de cette démarche, la directive de la CIPR 60 pose trois principes liés à l’utilisation des
rayonnements ionisants.
3. JustificationToute activité mettant en œuvre des rayonnements ionisants doit être justifiée par le bénéfice
qui en est retiré.
4. LimitationAucun individu ne doit être soumis à un risque jugé inacceptable.
5. OptimisationLe niveau des expositions, le nombre de personnes exposées, et la probabilité des expositions
doivent être aussi bas que raisonnablement possible compte tenu des facteurs économiques et sociaux.
6. Limites d’exposition des travailleursLes travailleurs exposés aux rayonnements ionisants sont classés en deux catégories en
fonction des doses d’exposition qu’ils sont susceptibles de recevoir (81). Ce classement conditionne
leur suivi médical et les taches qu’ils sont susceptibles d’effectuer. La CIPR 60 recommande de ne
pas dépasser 100 mSv sur cinq ans pour les travailleurs de catégorie A tout en ne dépassant pas 50
mSv par an (3). Elle recommande une limite d’exposition de 1 mSv par an pour le public, ce qui est
déjà inférieur à l’exposition naturelle.
51 Chapitre I : Etude bibliographique
III. RAYONNEMENTS ULTRA-VIOLETS ET VISIBLE
Nous présentons dans ce sous-chapitre quelques données bibliographiques relatives aux
rayonnements ultra-violets et visible et à leurs effets biologiques.
A. IntroductionLe nombre croissant de 5 à 7% par an de cancers de la peau (carcinomes et mélanomes) et de
cataractes pose un problème de santé publique (82). Cette augmentation a conduit les pouvoirs
publics à mettre en place des campagnes de prévention des risques liés à une exposition au
rayonnement solaire et en particulier au rayonnement UV dont l’implication dans les processus de
cancérogenèse est désormais établie.
Il a été initialement admis que la partie génotoxique des UV était liée aux UVB (83). Aussi,
nombre de produits de protection solaire sont susceptibles de protéger le corps humain contre ces
rayonnements. Or depuis une dizaine d’années, les données scientifiques semblent souligner les effets
génotoxiques des UVA (84-87), qui sont la composante essentielle des rayonnements UV. De plus, le
rayonnement UVA pénètre plus profondément dans l’épiderme que les UVB.
B. OrigineLe soleil est un réacteur nucléaire qui est une source considérable de rayonnements ionisants
et non ionisants.
Més
osph
ère
Stra
tosp
hère
Tro
posp
hère
10 km
50 km
rayons cosmiques
rayons γ
rayons x
couche d'ozone
UV
B
UV
A
UV
C
Epiderme
Derme
Infra
-Rou
ge
Hypoderme
10-1
10-2
10-3
10-4
10-5
Action relative du rayonnement UV(normalisée à 254 nm)
1
Action létale
Action mutagène
300 350 400 450
Spectre de l'absorption de l'ADN
Longueur d'onde (nm)
a) b)
Figure 21 : a) Spectre solaire (88), b) Spectre d’action biologique (létale et mutagène) du
rayonnement UV comparé au spectre d’absorption UV de l’ADN (89)Nous avons évoqué dans la première partie de notre exposé la nature des rayonnements
ionisants issus de ces réactions nucléaires. La majeure partie des rayonnements issue de ces réactions,
Chapitre I : Etude bibliographique 52
qui atteint la Terre, est constituée de radiations non ionisantes (Figure 21a). Le spectre des
rayonnements non ionisants peut être divisé en plusieurs sous-groupes. Il comporte une composante
infra-rouge (800-10000 nm), une composante visible (400-800 nm), une composante ultra-violette qui
se divise en 3 parties. On distingue le domaine des ultra-violets de type A (320-400 nm), celui des
ultra-violets de type B (290-320 nm) et des ultra-violets de type C (190-290 nm).
C. Spectre solaireLa couche d’ozone stratosphérique (entre 15 et 25 km d’altitude) filtre les rayonnements UV
de plus courte longueur d'onde, i.e. les UVC et une partie des UVB. L’énergie lumineuse qui atteint le
sol est constituée d’environ 50% de rayonnements appartenant à l’infra-rouge, 40% au spectre visible
et 10% à l’ultra-violet. La proportion d’UVB arrêtée dépend d’une part de l’altitude, de la latitude, de
paramètres météorologiques et de la saison.
Seuls les rayonnements de type UVA (90% du rayonnement ultra-violet) et UVB atteignent la
surface de la Terre (90). Comme le montre la Figure 21b, le spectre d’absorption et le spectre d’action
mutagène et létale du rayonnement UV ne coïncident que dans une gamme de longueurs d’onde
comprises entre 254 nm et 290 nm. Ceci suppose que deux mécanismes soient impliqués dans l’effet
des UV et ceci en fonction de la longueur d’onde.
D. Mode d’action des rayonnements ultra-violets et visibleLes rayonnements UV doivent, pour être actifs biologiquement, être absorbés par la matière
vivante (Figure 22). L’ADN est capable d’absorber les photons de l’UVB et de l’UVA les plus
énergétiques. L’existence dans les cellules de chromophores, encore appelés photosensibilisateurs,
permet l’absorption des longueurs d’onde plus élevées (> 350 nm) (91-93). Il peut s’agir de flavines,
de porphyrines, d’acides aminés, de quinones, de stéroïdes, de protéines à hème, etc.. Après
absorption de l’énergie, le chromophore au préalable à l’état fondamental, passe dans un état excité
singulet. Cette énergie excédentaire peut conduire à plusieurs réactions.
1. Des réactions directes par transfert d’énergie intramoléculaireLe principal chromophore impliqué dans les effets du rayonnement solaire sur le matériel
biologique est constitué par l’ADN. Il présente un pic d’absorption maximal à 260 nm (UVC).
L’absorption peut alors être suivie de réactions entre bases pyrimidiques adjacentes avec formation de
deux liaisons covalentes (dimères de pyrimidines) ou d’une seule (pyrimidine (6-4) pyrimidone) (94-
96). D’autres chromophores cellulaires comme l’acide trans-urocanique sont également impliqués
dans ce type de processus .
2. Des réactions de photosensibilisationLes rayonnements UVA et visible n’étant pas ou très peu absorbés par l’ADN, leur action fait
intervenir des réactions de photosensibilsation impliquant d’autres chromophores que l’ADN. Le
photosensibilisateur peut être de nature endogène (97). Il peut également être de nature exogène
53 Chapitre I : Etude bibliographique
comme des médicaments (anti-bactériens, des anti-inflammatoires, des anti-fongiques), des teintures
(thiazines, bleu de méthylène, rose bengal, acridine orange etc.), etc.. Ces réactions ont lieu entre le
chromophore dans un état excité triplet, et un substrat qui peut être l’ADN lui même, ou d’autres
molécules biologiques (lipides ou protéines) ou l’oxygène. Le temps de vie de l’état triplet est
relativement long (10 à 10-5 s) pour permettre cette réaction. On distingue deux types de réactions
possibles (98).
a) Réactions de type I
Elle font intervenir une réaction entre le photosensibilisateur et le substrat, par arrachement
soit d’un électron, soit d’un atome d’hydrogène. Cette réaction dépend de l’énergie de l’état excité du
photosensibilisateur et du potentiel d’oxydation du substrat à l’état fondamental. La guanine qui
possède le potentiel d’ionisation le plus bas est la plus sensible des 4 bases de l’ADN à ce type de
réaction (99).
La réaction de type I peut également conduire indirectement à la formation d’anion
superoxyde. En effet, suite à une réaction de type I, le photosenbilisateur sous sa forme anionique
radicalaire, peut céder à l’oxygène l’électron non apparié et former ainsi O2°-. Dans une étape
ultérieure, O2°- peut se dismuter en H2O2 (dont la présence dans des cellules exposées au rayonnement
UVA a été démontrée), spontanément ou par voie enzymatique (100). Le radical °OH pourra ensuite
se former par réaction de Fenton impliquant la présence de métaux de transition réduits à proximité de
la double hélice d’ADN.
b) Réactions de type II
Ces réactions se traduisent par la formation de l’oxygène singulet consécutivement à un
processus de transfert d’énergie entre le photosensibilisateur excité et l’oxygène fondamental à l’état
triplet. Au sein de l’ADN, cette espèce réactive de l’oxygène peut réagir ensuite de façon
préférentielle avec la guanine pour produire de la 8-oxo-7,8-dihydroguanine, une des principales bases
oxydées de l’ADN (101-103). La Figure 22 résume les principaux mécanismes d’action des
rayonnements UV et visible sur l’ADN.
Chapitre I : Etude bibliographique 54
λ (nm)
100
290
320
400
800
UVC
UVB
UVAphotosensibilisateur
endogène excité1O2
type II
type Iarrachement d’e-
visible
absorption directe par l’ADN modifications
..-O2
Fe 2+OHH2O2
cyclobuta-dipyrimidinespyrimidine (6-4) pyrimidone
cation radical
O2
e-
O2
Figure 22 : Mode d’action des rayonnements UV et visible
E. Effets du rayonnement solaire
1. Effets à court termeL’érythème actinique est le principal signe clinique d’un exposition prolongée aux UVB.
C’est le « coup de soleil ». Le mécanisme qui conduit à son apparition n’est pas encore clairement
établi. Il faut ajouter les photodermatoses qui regroupent l’ensemble des affections qui ne sont
présentes que chez certains individus. Elles se caractérisent par une réactivité cutanée anormale à
l’exposition lumineuse. On trouve également les photokératites et photoconjonctivites qui sont des
affections de l’oeil liées à l’absorption du rayonnement UV par les liquides oculaires.
2. Effets à long termeLes effets des UVB à long terme (vieillissement de la peau et cancérogenèse) sont connus
depuis longtemps.
a) Vieillissement cutané
Le vieillissement cutané (104) peut être de deux sortes (actinique ou« chronologique ») selon
qu’il s’agit de zones exposées au soleil ou non.
b) Cancers
Les carcinomes basocellulaires, les carcinomes spinocellulaires et les mélanomes malins
semblent essentiellement dus aux UVB (94, 105). Toutefois, les UVA pourraient potentialiser l’effet
carcinogène des UVB (106). Des études ont montré leur pouvoir tumorigène chez l’animal (107,
108) et génotoxique sur des cellules en culture (109).
55 Chapitre I : Etude bibliographique
3. Effets génotoxiques
a) Effets génotoxiques des UVB et UVC
Les effets génotoxiques des rayonnements UVB et UVC s’expliqueraient essentiellement par
la formation de pontages intra-brin, sous forme de dimères de pyrimidines et d’adduits de type
pyrimidine(6-4)pyrimidone. L’altération de gènes codant pour des protéines ras oncogènes et p53
dans plusieurs cancers cutanés à des sites bi-pyrimidiques semble indiquer l’implication de ces lésions
dans les processus tumoraux. Des mutations de type C→T et CC→TT sont en effet observées aux sites
de dimères de pyrimidines (110, 111) (95). La formation en très faible quantité de 8-oxo-7,8-
dihydroguanine a également été mise en évidence après exposition de kératinocytes de souris aux
UVB (112).
b) Effets génotoxiques des UVA
Bien que le spectre solaire soit principalement constitué d’UVA, ces derniers ont longtemps
été considérés comme n’intervenant pas ou peu dans l’apparition de cancers cutanés. Ceci s’explique
en partie par le fait qu’il faut des doses d’irradiation d’UVA bien supérieures à celles des UVB pour
obtenir un taux de mortalité identique. Nous détaillerons les effets génotoxiques des UVA dans les
chapitres III et IV.
4. Effets cytotoxiquesLe pourcentage de cellules survivantes après exposition à des rayonnements UVA ou UVB
dépend de la longueur d’onde. Une dose d’UVA environ 800 fois plus élevée que la dose d’UVB est
requise pour obtenir un même effet cytotoxique.
5. Autres effets du rayonnement solaireLes UVB sont responsables de l’induction de la cataracte (113) et d’atteintes du système
immunitaire. L’exposition solaire revêt cependant aussi des aspects bénéfiques pour la santé, puisque
les UVB sont responsables de la synthèse de la vitamine D3 hydrolysée ensuite en vitamine D
(connue pour son action antirachitique) (114). Les infra-rouges ont une action calorique et le soleil
possède un rôle fondamental dans la régulation des cycles circadiens.
IV. LA REPONSE DU MATERIEL BIOLOGIQUE FACE AUX RAYONNEMENTS
L’ADN et les différents constituants cellulaires sont en permanence soumis à des agressions
d’origine endogène ou exogène. On estime que 10 000 à 15 000 bases modifiées, en partie d’origine
oxydative, sont produites par jour et par cellule (115). Afin de prévenir ou minimiser l’altération
oxydative de l’ADN et d’autres molécules essentielles à la vie cellulaire, les cellules ont mis en place
des systèmes de défense. Ces derniers comportent des molécules antioxydantes ayant pour fonction
d’éliminer les espèces radicalaires. Il faut ajouter la présence de complexes enzymatiques qui
Chapitre I : Etude bibliographique 56
interviennent, le cas échéant, pour restaurer l’intégrité de la molécule d’ADN. Ce sont les systèmes de
réparation.
A. Les défenses antioxydantes de la celluleDe nombreux ouvrages ou revues traitent des défenses antioxydantes (116-118). Nous n’en
donnerons ici que les principales caractéristiques.
L’oxygène est indispensable à la respiration cellulaire. Il est présent au sein des cellules à une
concentration proche de 10 µM. Il est au cours du métabolisme respiratoire réduit en anion
superoxyde (0,01-0,001 nM). Ce dernier est ensuite réduit en peroxyde d’hydrogène par une
superoxyde dismutase (1-100 nM), et finalement en eau par l’intermédiaire d’une catalase ou d’une
glutathion peroxydase (78, 119). Cette réduction à 4 électrons s’effectue essentiellement par
l’intermédiaire de réducteurs puissants comme le NADPH et le NADH que l’on trouve au niveau de
complexes de cytochrome oxydase localisés dans les membranes mitochondriales. D’autres systèmes
biochimiques peuvent être responsables de réduction à un ou plusieurs électrons. On trouve ces
systèmes au niveau du réticulum endoplasmique ou des membranes plasmiques de certaines cellules.
On peut mentionner qu’en présence de métaux (Fe2+, Cu2+) le peroxyde d’hydrogène peut être réduit
en radical °OH par la réaction de Fenton :
H2O2 + Fe2+ → Fe3+ + OH- + °OH
Fe3+ + O2°- → Fe2+ + O2
soit le produit final de la réaction :
H2O2 + O2°- → OH- + O2 + °OH
Du fait de leur très grande réactivité, les espèces réactives de l’oxygène peuvent réagir avec la
plupart des composés cellulaires. Parmi ces composés, les vitamines E et A, les carotènes au niveau
des membranes jouent un rôle dans la protection contre les peroxydations lipidiques en chaîne. On
trouve des composés hydrophiles comme l’acide ascorbique (O2°-, °OH), le glutathion, l’acide urique
(piégeur de °OH, etc.) etc..
B. Les systèmes de réparation des lésions
1. Cycle cellulaireLes systèmes antioxydants qui assurent la première ligne de défense, par la présence de
molécules capables de piéger les espèces réactives de l’oxygène et de l’azote, peuvent être dépassés.
Ces espèces peuvent alors réagir avec les phospholipides membranaires, les protéines ou les acides
nucléiques. Pour pouvoir survivre, mais surtout transmettre une information génétique correcte à sa
descendance, la cellule a mis en place des systèmes de reconnaissance et de réparation de ces lésions.
Il existe d’une part des systèmes de réparation fidèles, dirigés de façon préférentielle contre un type
de dommage donné, et d’autre part des systèmes dits fautifs. La radiosensibilité d’une cellule dépend
de la phase du cycle cellulaire dans laquelle elle se trouve. La cellule peut être quiescente (phase G0),
57 Chapitre I : Etude bibliographique
elle peut être engagée dans un cycle cellulaire (phase G1), dupliquer son ADN en phase S, se situer en
phase G2 (avant mitose) ou enfin entrer en mitose (répartition du matériel génétique entre les deux
cellules filles). L’essentiel pour la cellule est de transmettre une information génétique correcte à sa
descendance.
cycD-Cdk4/6
M
G1
S
G2
cycE-Cdk2
cycA-Cdk2
cycB-cdc2
cycA-cdc2
P21
P53
Figure 23 : Contrôle du cycle cellulaire
La progression dans le cycle cellulaire est assurée par la formation de complexes impliquant
des cyclines et des protéines kinase (Figure 23). Le complexe formé peut être ensuite un substrat pour
des protéines kinase. Le complexe le plus connu est celui permettant le passage des cellules en mitose
« Mitosis Promoting Factor » constitué de l’association d’une kinase p34cdc2 et d’une cycline B. Il est
sous le contrôle de kinases (cdk7, wee1) et d’une phosphatase (cdc25). Des protéines comme p53,
p21, p27, pRB sont également impliquées dans la régulation de l’activité de ces complexes.
L’effet d’une exposition de la cellule à plusieurs Gy se traduit par un retard à la mitose. Ce
retard qui peut être d’une durée variable permet essentiellement à la cellule de réparer les lésions
produites, si ces dernières ne sont pas trop importantes. Les principaux arrêts ont lieu en phase G2 et
G1 (120, 121). La durée de l’arrêt en phase G2 dépend de la dose et de la qualité du rayonnement.
Pour les particules de TEL élevé, cet arrêt peut être irréversible. L’arrêt en phase G1 a également été
observé avec les ions très lourds comme l’uranium (122). L’indice mitotique diminue linéairement
avec l’augmentation de la dose délivrée. On peut ajouter que le retard est d’autant plus important que
les cellules sont irradiées à une phase avancée du cycle cellulaire. La radiosensibilité liée au cycle
cellulaire tient au fait que les cellules disposent d’un laps de temps plus ou moins long pour réparer
les dommages. Les conséquences d’une réparation fautive peuvent être des aberrations
chromosomiques ou des mutations chromosomiques létales pour la cellule.
Lors d’une atteinte cellulaire, de nombreux facteurs entrent en jeu (Figure 24). Nous ne
détaillerons pas ici les mécanismes complexes mis en jeu, bien établis ou encore hypothétiques, qui
sont impliqués dans le devenir de la cellule. Néanmoins on peut distinguer tout d’abord une étape de
reconnaissance du dommage (par la Poly (ADP ribose) polymérase (PARP), par des protéines kinase
Chapitre I : Etude bibliographique 58
dépendantes de l’ADN (DNA-PK), par la protéine codée par le gène muté de l’ataxie télangiectasie
(ATM), etc.). Il semblerait qu’à ce niveau, les cassures double brin de l’ADN soient reconnues
comme un élément critique pour la cellule. Il y a ensuite arrêt du cycle cellulaire sous le contrôle de
plusieurs protéines citées précédemment pour permettre la réparation des lésions ou pour engager un
processus apoptotique (pour revue (123)).
p21
p53
ATM DNA-PKSystème de détection des dommages
Lésions de l'ADN
p53 Chk1
ATR
CDC25
CDC2CDK
RB
MDM2
GADD45
PCNAapoptose
arrêt phase G1
inhibition de la réplication
arrêt phase G2
BAX
Radiations ionisantes
Figure 24 : Modulations du cycle cellulaire après irradiation
2. Les systèmes de réparationLa restauration de l’ADN endommagé fait intervenir des systèmes de réparation qui peuvent
être plus ou moins fidèles. Les principaux modes de réparation sont indiqués dans la Figure 25. Nous
n’aborderons que le système de réparation par excision de bases (REB), auquel nous aurons recours
dans la suite de ce travail pour mettre en évidence les dommages de bases de l’ADN.
59 Chapitre I : Etude bibliographique
synt
hèse
synt
hèse
tran
s-lé
sion
tran
s-lé
sion
incorporation d'une base au hasard
recombinaison hom
ologue
recombinaison hom
ologue
exple: réparation des CSB
exple: réparation des 1) CBP et des2) pyrimidines (6-4) pyrimidones
réparation par
réparation par
excision de nucléotides
excision de nucléotides
1)
réparation par réversion
réparation par réversion
réparation desréparation desmésappariementsmésappariements
réparation fidèle
répa
ratio
n par
répar
ation
par
excis
ion de
base
excis
ion de
base
exple: réparation de la 8-oxoGua
exple: réparation des CBP
recombinaison
recombinaison
non homologue
non homologue
exple: réparation des CDB
réparation fautive
HN
N N
NO
O
HH2N
H
HN
N
CH3OH
O
OH
N
N
CH3
HOH2)
H
HN
N
CH3
H
O
OH
NH
N
H3C
H
O
O
G
P PdR dR
PdR
A A
P P P
C
dR dR dR
T G
Figure 25 : Différents systèmes de réparation des lésions de l’ADN
3. La réparation par excision de bases (REB)C’est le système de réparation des bases oxydées, alkylées, fragmentées et des sites abasiques
(124, 125). Il est présent à la fois chez les eucaryotes et les procaryotes en faisant intervenir de
nombreuses enzymes. La réparation s’effectue en quatre étapes. La première correspond à
l’élimination de la base modifiée par coupure de la liaison N-glycosidique qui conduit à la formation
d’un site abasique (AP). Les enzymes qui sont responsables de cette excision sont appelées des ADN
N-glycosylases.
Une fois le site abasique formé, il y a coupure de la liaison phosphodiester en 3’ du site AP, et
éventuellement en 5’, par l’action d’une AP endonucléase. Les dernières étapes de la réparation
impliquent une ADN polymérase et une ligase. Les glycosylases peuvent être classées en plusieurs
catégories. Elles peuvent reconnaître des bases alkylées (AlkA d’E. coli), les cyclobutadipyrimidines
(T4 endo V du phage T4), l’uracile dans l’ADN (Ung d’E. coli), les pyrimidines modifiées (endo III
d’E. coli), les purines modifiées (Fpg d’E. coli), ou les mésappariements (Mut Y d’E. coli).
a) La Formamidopyrimidine glycosylase (Fpg)
Extraite d’Escherichia coli, cette enzyme à doigt de zinc (dans sa partie C terminale) est
composée de 269 acides aminés. Codée par le gène fpg (ou Mut M), elle possède une double activité
de type glycosylase et de type endonucléase en 3’ et 5’ du site abasique formé. L’affinité de l’enzyme
Chapitre I : Etude bibliographique 60
pour ses substrats dépend tout d’abord de leur nature (8-oxoGua, FapyGua, FapyAde, 5-OHcyt, 5-
OHUra, etc.) mais aussi de la base avec laquelle ils sont appariés. Des études quantitatives ont
néanmoins montré que la 8-oxoGua, la FapyGua et la FapyAde étaient d’excellents substrats pour la
protéine Fpg (126, 127).
Des analogues fonctionnels ont été isolés chez la levure (protéine yOgg1) et les mammifères (protéine
Ogg1). yOgg1, bien que différente structurellement, présente une activité relativement proche de celle
de Fpg.
b) L’endonucléase III (endo III)
Extraite d’Eschérichia coli, cette protéine qui comporte 211 acides aminés est codée par le
gène nth (128, 129). Elle possède une activité de type glycosylase mais aussi une activité
endonucléase qui lui permet de rompre la liaison phosphodiester en 3’. Elle a une spécificité de
substrats très large et reconnaît principalement les pyrimidines modifiées. Parmi ces dernières, on
peut citer la 5-hydroxy-5-méthylhydantoïne, la 5-hydroxyuracile, la 5-hydroxycytosine, les diols de
thymine, la 6-hydroxy-5,6-dihydrocytosine, la 6-hydroxy-5,6-dihydrouracile, la 6-hydroxy-5,6-
dihydrocytosine, les diols d’uracile, la 5-hydroxyhydantoïne, la 5,6-dihydrothymine, l’urée, les sites
abasiques, etc.. Toutefois, des études comparatives entre les différents substrats sont nécessaires pour
déterminer la spécificité de l’enzyme. Wang et Essigman ont montré à l’aide d’oligonucléotides
contenant les trois lésions suivantes qu’endo III reconnaissait de façon préférentielle les diols
d’uracile, la 5-hydroxycytosine, et la 5-hydroxyuracile (130). Il a aussi été montré que les diols de
thymine étaient de meilleurs substrats que la 5,6-dihydrothymine pour endo III (131). Des analogues
fonctionnels ont été isolés chez la levure (protéine ntg1 et ntg2) et l’homme (protéine hNth).
c) Mécanismes d’action de Fpg et d’endo III
Les mécanismes d’action de Fpg et endo III sont assez proches (Figure 26). Il y a d’abord
excision de la base modifiée et coupure du brin d’ADN par un mécanisme concerté. L’excision de la
base modifiée repose sur la formation d’une base de Schiff avec un intermédiaire imino entre un acide
aminé de la glycosylase d’une part et le 2-désoxyribose d’autre part. Deux mécanismes conduisent
ensuite à la formation d'une coupure. Une β-élimination pour endo III (cadre A) (suivie d’une
hydrolyse) ou une β-δ-élimination pour Fpg (cadre B).
61 Chapitre I : Etude bibliographique
OB*
NH
HH
enz
HA enz
B enz
OHenz
H
N
OHenz
HN
H B enz
OHenz
H
NOH
enzH
N
P5'
H2O
5'P
OHO
5'P
OHenz
HN
Henz B
OHenz
HN
P5' 5'
P
OHenz
HN
P3' 3'
POH
O
P5'
H2O
A
B
Base de SchiffB*
ββββ-élimination
δδδδ-élimination
Endo III
Fpg
Figure 26 : Mécanismes d’action présumés de Fpg et d’endo III
C. La mort cellulaireLa mort cellulaire est un processus qui intervient dès que les atteintes de molécules cibles sont
trop importantes. Une très forte dose d’irradiation s’accompagne en quelques heures de l’arrêt des
fonctions cellulaires et d’une cytolyse. Pour des doses moins élevées, les lésions ne s’exprimeront, si
la cellule n’a pas eu le temps de les réparer, qu’au moment de la division cellulaire. On considère
qu’une cellule qui a franchi six divisions cellulaires est en vie. La mort cellulaire peut impliquer deux
mécanismes, la nécrose et l’apoptose (ou mort programmée).
La nécrose se produit lorsque la cellule est soumise à des agressions (hypoxie, hyperthermie,
toxines, rayonnements ionisants, etc.). Les traits morphologiques de la cellule impliquent un oedème
cytoplasmique et mitochondrial, une condensation de la chromatine et le phénomène est associé à un
processus inflammatoire.
L’apoptose elle, intervient dans les processus physiologiques des organismes pluricellulaires
tels que l’embryogenèse, la métamorphose ou l’atrophie de tissus, etc.. La morphologie des cellules se
caractérise par une rupture des jonctions intercellulaires et une fragmentation de l’ADN sous l’action
d’endonucléases (132). Elle intervient également lorsque la cellule subit d’importantes altérations de
son patrimoine génétique afin d’éliminer les cellules porteuses de dommages. De nombreux gènes de
contrôle du cycle cellulaire sont impliqués dans le déclenchement de ce phénomène (133).
Objectif de l’étude
Objectifs de l’étude 63
Objectifs de l’étudeLes réactions d’oxydation de l’ADN d’origine endogène (métabolisme cellulaire, processus
inflammatoires) ou d’origine exogène (rayonnements, pollution atmosphérique, tabagisme, etc.)
peuvent être à l’origine de processus cancérigènes ou de vieillissement dans la mesure où les
modifications affectent des gènes indispensables au maintien de l’intégrité de la cellule (78, 134). La
mesure des bases modifiées revêt donc un intérêt tout particulier et certaines modifications peuvent
servir de biomarqueur du stress oxydatif. On distingue deux approches de mesures de dommages de
bases qui impliquent des méthodes directes et des méthodes indirectes (135, 136). Les méthodes
directes regroupent les techniques de postmarquage, l’immunologie et l’ensemble des méthodes
chromatographiques comme la chromatographie liquide haute performance couplée à une détection
électrochimique (CLHP-DE), la chromatographie gazeuse couplée à une détection par spectrométrie
de masse (CG-SM) et enfin la chromatographie liquide haute performance couplée à une détection par
spectrométrie de masse en mode tandem (CLHP-SM/SM). L’approche indirecte implique des
techniques initialement dédiées à la mesure des coupures de brin d’ADN. Il s’agit principalement de
la méthode d’élution alcaline sur filtre et de la méthode des comètes. Ces techniques sont associées à
l’utilisation d’enzymes de réparation (par exemple Fpg ou endo III) qui convertissent les bases
modifiées en coupures. Elles permettent ainsi de façon indirecte la mesure des dommages de bases.
Cette approche sera présentée dans les chapitres IV et V.
Parmi toutes les modifications des bases, la 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoGua) ou son
nucléoside correspondant, la 8-oxo-7,8-dihydroguanine-2’-désoxyguanosine (8-oxodGuo) a fait
l’objet de nombreux travaux. La 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoGua) qui est un des principaux
produits d’oxydation de la guanine a été mise en évidence pour la première fois en 1984 dans l’ADN
exposé aux rayons X (137). Il a été montré qu’elle était formée sous l’action de nombreux agents du
stress oxydant (38, 138-142). Ainsi, l’oxydation de la guanine par ionisation, par le radical °OH ou
par l’oxygène singulet conduit à la formation de 8-oxoGua (38, 143). Si cette lésion n’est pas réparée
par les systèmes dont dispose la cellule (101, 141), elle peut conduire à des mutations de type
G:C→T:A (144-146). Son éventuelle implication dans des processus de carcinogenèse a été émise
dès 1983 par Ames (147, 148). Des niveaux élevés de 8-oxodGuo mesurés dans l’ADN cellulaire ont
par ailleurs été associés avec plusieurs pathologies telles que l’anémie de Fanconi (149) et le diabète
léger (mellitus) (150).
La mesure de la 8-oxoGua peut être effectuée par CG-SM (47, 151-155), CLHP-DE (156),
postmarquage (157, 158), des techniques immunologiques ou des approches indirectes impliquant la
méthode des comètes ou la technique d’élution alcaline sur filtre couplées avec Fpg (159, 160). Le
niveau basal mesuré dans les cellules en absence de tout stress exogène a fait l’objet de nombreux
64 Objectifs de l’étude
débats qui s’expliquent par les écarts importants observés entre les résultats des différentes méthodes
de mesure (161). Sa mesure sera présentée et discutée tout au long de ce mémoire.
Des incohérences similaires ont été mises en évidence lors de la mesure d’autres lésions, et
ont conduit à la remise en question des méthodologies communément utilisées de CG-SM et de
CLHP-DE. Il a en particulier été montré que des possibilités d’oxydation artéfactuelle des bases ou
nucléosides normaux étaient susceptibles de se produire lors de la préparation des échantillons (78,
161-166).
L’objectif de ce travail était de quantifier les dommages radio-induits des bases puriques et
pyrimidiques dans l’ADN cellulaire après irradiation gamma. Pour cela, nous devions disposer de
techniques de mesure fiables qui ne soient pas sujettes aux problèmes d’oxydation artéfactuelle
évoqués ci-dessus. Les seules informations satisfaisantes, relatives à la formation de bases modifiées
dans l’ADN, que nous possédions avant de commencer cette étude, étaient tirés de travaux portant sur
l’irradiation en solution aqueuse aérée, de bases, de nucléosides, ou d’ADN isolé. Ces informations
ont en partie guidé le choix des lésions auxquelles nous nous sommes intéressés dans la suite de ce
mémoire. Ce choix était également tributaire des techniques mais aussi surtout des protocoles que
nous avions à notre disposition. L’extrapolation à l’ADN cellulaire des résultats obtenus sur des
modèles simplifiés n’était évidemment pas possible. En effet, bien que l’ADN isolé constitue le
modèle le plus proche de l’ADN cellulaire, il n’en reste pas moins très différent, car ce dernier est
compacté dans une structure par association avec des protéines. Toutefois, bien que plus simples que
l’ADN cellulaire, ces modèles ont permis de déterminer la nature d’un grand nombre de lésions ainsi
que leur mécanismes de formation. Ils sont de plus très utiles à la mise au point de méthodes
d’analyse fiables. Nous avons, au travers des différents mesures de bases modifiées que nous avons
effectuées, chercher à confirmer, au niveau de l’ADN cellulaire, l’existence de ces lésions ainsi que
leurs mécanismes de formation. Pour cela, il fallait disposer de techniques de mesure des dommages
de bases suffisamment sensibles puisqu’une des principales difficultés rencontrées était de pouvoir
mesurer de faibles taux de formation de bases modifiées. Cette caractéristique s’explique par
l’existence des systèmes de défense au sein de la cellule pour protéger l’ADN (antioxydants,
compactions dans des structures protéiques, enzymes de réparation) et le rendre moins vulnérable à
l’attaque des espèces radicalaires. Il fallait donc disposer de techniques très sensibles, mais aussi de
protocoles d’analyse qui n’entraînent pas l’oxydation artéfactuelle des bases normales. L’ADN isolé
de thymus veau qui est couramment utilisé illustre bien ce dilemme. Les étapes de purification que
subit cet ADN commercial en font un produit relativement pur et adapté à la mise au point de
méthodes chromatographiques ainsi qu’aux études mécanistiques. Toutefois, ces étapes de
purification sont aussi responsables de l’oxydation artéfactuelle des bases normales. Ceci se traduit
par des taux de bases modifiées, dans les échantillons contrôle, nettement supérieurs à ceux
déterminés dans l’ADN cellulaire.
Objectifs de l’étude 65
Nous présentons dans le chapitre II, les améliorations que nous avons apportées à ces
méthodes de mesure en précisant leurs conditions d’utilisation. Parmi ces mises au point, nous nous
sommes efforcés d’améliorer la technique d’extraction de l’ADN cellulaire afin de limiter les artefacts
liés à la manipulation et à la préparation des échantillons avant l’analyse. Nous avons utilisé la mesure
du niveau de 8-oxodGuo dans les cellules contrôle, comme critère de cette optimisation. Nous
présentons également les conditions d’utilisation de la méthode CG-SM et de la technique de CLHP-
SM/SM. L’application des ces méthodes de mesure aux dommages induits par les rayonnements
gamma, UVA, UV LASER de haute intensité ou encore par des photosensibilisateurs exogènes sera
illustrée dans le chapitre III.
Dans le chapitre IV est abordée l’approche indirecte des mesures de dommages de bases de l’ADN
induits par les agents oxydants cités ci-dessus. Cette approche repose sur l’utilisation de la méthode
des comètes couplée à des enzymes de réparation. Les résultats de mesure obtenus par cette technique
sont qualitatifs. Aussi une calibration de la méthode sera-t-elle traitée dans le chapitre V. Elle rendra
possible la « confrontation » des approches directe et indirecte et permettra d’aborder les aspects
mécanistiques conduisant à la formation des dommages étudiés.
Enfin, dans le chapitre VI sont présentés les résultats d’expérimentations conduites avec un
rayonnement de particules chargées de carbone, afin d’étudier l’influence du TEL sur la nature et la
répartition des dommages de bases dans l’ADN.
- Chapitre II -
Mise au point
de méthodes chromatographiques
Chapitre II : Mise au point de méthodes chromatographiques 67
IntroductionL’approche la plus couramment utilisée et la plus ancienne pour mesurer les dommages des
bases de l’ADN repose sur l’utilisation de méthodes directes. Les premiers travaux effectués dans ce
domaine datent des années 70 (167). Ils font appel à des méthodes immunochimiques, à la technique
de postmarquage, aux analyses de chromatographie liquide (CL) ou gazeuse (CG) couplées à une
détection par spectrométrie de masse (SM) ou électrochimique (DE). La quantification des dommages
porte sur la base, le nucléoside ou le nucléotide modifié. La mesure au niveau cellulaire nécessite au
préalable une étape d’extraction de l’ADN cellulaire. L’ADN extrait est ensuite hydrolysé en
monomères, bases, nucléosides ou nucléotides avant que la lésion soit finalement analysée.
Nous allons, avant d’aborder l’optimisation de la méthode d’extraction de l’ADN cellulaire,
présenter le principe de la technique de postmarquage et des méthodes immunologiques. Ces
techniques ne seront néanmoins pas utilisées dans la suite de ce travail.
I. LA TECHNIQUE DE POSTMARQUAGE ET LES METHODESIMMUNOLOGIQUES
La méthode de postmarquage est utilisée depuis une vingtaine d’années (168, 169) pour la
mesure de divers adduits de l’ADN. L’utilisation d’un signal radioactif en fait un outil très sensible (1
adduit pour 108 nucléotides normaux) qui pourrait être très adapté à la mesure des dommages radio-
induits de bases. Un autre atout de la méthode est qu’elle ne nécessite qu’une quantité très faible
d’ADN (quelques µg).
A. La technique de postmarquage
1. PrincipeLa méthodologie consiste en une hydrolyse enzymatique de l’ADN sous forme de nucléosides
3’-monophosphate (à l’aide d’une nucléase micrococcale et d’une phosphodiestérase de rate de veau).
Une (T4 polynucléotide) kinase permet d’introduire, un groupement phosphate radioactif en utilisant
de l’[γ-32P]ATP comme donneur, sur la fonction 5’-OH du nucléoside 3’-monophosphate (Figure 27).
Une séparation par chromatographie sur couche mince de cellulose échangeuse d’anion permettra de
séparer les nucléotides normaux et modifiés avant de les quantifier.
2. Mesure des adduits et des bases oxydées de l’ADNCette approche a rendu possible la mesure d’adduits aromatiques de l’ADN. Elle implique
que les nucléotides modifiés aient un comportement chromatographique suffisamment différent de
celui des nucléotides normaux pour que leur séparation soit possible. Ce n’est pas le cas de la plupart
des bases oxydées de l’ADN. En effet, plusieurs travaux sur la mesure de la 8-oxo-7,8-dihydroguanine
sous la forme nucléoside 3’-monophosphate (8-oxo-dGMP) dans de l’ADN isolé de thymus de veau
68 Chapitre II : Mise au point de méthodes chromatographiques
(170) ont souligné l’intérêt d’étapes de purification par CLHP afin d’améliorer la sensibilité de la
méthode (171) et de pouvoir ainsi l’étendre à des mesures dans l’ADN cellulaire (172, 173).
L’utilisation de la nucléase P1, après l’étape de phosphorylation du nucléoside 3’-
monophosphate pour obtenir des nucléosides 5’-monophosphate a permis de séparer la 8-oxodGMP
de la dGMP, et d’accroître ainsi la sensibilité de la méthode (174).
Base oxydée
OH
OHO
OPOOH
Base oxydée
OH
O*P
OPOOH
OHO
OH
Base oxydée
OH
OHO
OPOOH
Base
OH
OHO
OPOOH
Base
OH
OHO
OPOOH
Base
OH
O*P
OPOOH
OHO
OH
Purification CLHP
Nucléase P1
[32P*]-ATP T4 kinase
*PO
H
O
OH
OH
Base oxydée
Séparation CLHP
ADNNucléase microccocalePhosphodiestérase II
+
+
+
+
Séparation par chromatographie sur couche mince
Base oxydée*POOH
H
OOH (en faibles quantités)
(en faibles quantités)
(en faibles quantités)
*POOH
H
OOH
Base
Figure 27: Principe du postmarquage au 32P
Toutefois la technique avec une sensibilité de 1 modification pour 104 bases normales est
d’utilisation limitée en raison de l’existence de processus de radiolyse des nucléotides normaux par le
rayonnement β du 32P (174, 175). Une autre difficulté rencontrée lors de la mesure de l’adénine N1-
oxyde et de la 5-hydroxyméthyluracile (176-178) est la faible valeur des rendements de marquage du
Chapitre II : Mise au point de méthodes chromatographiques 69
nucléotide modifié. Ainsi, il est apparu nécessaire d’utiliser des standards internes pour une meilleure
définition de l’aspect quantitatif des mesures (172, 179-181).
Le dosage des diols de thymine dans l’ADN isolé de thymus de veau, sous forme de
dinucléosides monophosphate, a également été permis par l’utilisation d’une phosphodiestérase de
venin de serpent (182, 183) et d’une T4 polynucléotide kinase (184). Une approche similaire a été
mise en œuvre pour la mesure d’adduits ou de pontages de l’ADN (185-187).
B. Approche immunologique
1. PrincipeElle repose sur l’utilisation d’anticorps poly ou monoclonaux dirigés contre les modifications
de l’ADN. Une des principales difficultés consiste à obtenir des anticorps spécifiques d’un dommage
oxydatif donné. Pour préparer un système antigénique, une des stratégies est de fixer le nucléoside
modifié sur une protéine qui sera reconnue par les défenses immunitaires d’un système hôte. La
difficulté d’obtention des anticorps est liée à la variabilité des réponses entre les individus, au choix
de l’haptène et aux réactions croisées possibles. Ceci explique l’absence quasi-totale d’anticorps
suffisamment spécifiques pour la mesure des bases oxydées de l’ADN. Une exception concerne
l’anticorps monoclonal dirigé contre les diols de thymidine (188).
2. Exemples d’utilisation
a) Diols de thymine (Tg)
Les premiers anticorps poly et monoclonaux dirigés contre les diols de thymine (Tg) ont été
obtenus par West et al. (189) et Leadon et Hanawalt (190). D’autres anticorps ont été préparés en
utilisant un diol de thymidine (Tg) monophosphate couplé à une protéine, comme haptène. Les limites
de détection ont montré une faible spécificité de 1 Tg pour 104 (191), et de 1 Tg pour 103 paires de
bases qui ont permis de mettre en évidence des résidus Tg dans de l’ADN isolé exposé à 20 (192) et
10 Gy (193). Toutefois cette sensibilité est insuffisante pour mesurer le niveau basal de Tg estimé
entre 1 et 20 pour 106 nucléotides normaux (194). L’utilisation d’un anticorps monoclonal, obtenu par
fixation d’un poly (dT) fixé à une protéine bovine et par réaction d’immunisation chez le lapin ou la
souris (monoclonaux), a permis de détecter 1 Tg pour 2 105 thymines par la méthode ELISA. Il a
toutefois été montré que ces anticorps pouvaient aussi reconnaître des dimères cyclobutyle de thymine
(195, 196).
b) La 8-oxo-7,8-dihydroguanine et la 8-oxo-7,8-dihydroadénine
Le premier anticorps dirigé contre la 8-oxo-7,8-dihydroguanine a été proposé par Kasaï et
Nishimura (138). D’autres anticorps polyclonaux ou monoclonaux, ont depuis été préparés,
respectivement, par Degan et al. et par Park et al. (197, 198). Ils ont été utilisés dans le cadre
d’analyses par chromatographie d’immunoaffinité. La préparation des anticorps était basée sur le
70 Chapitre II : Mise au point de méthodes chromatographiques
protocole décrit par Erlanger et Beiser (1964) (199). Les premières mesures dans l’ADN cellulaire
ont été effectuées par « ImmunoSlotBlot » sur des cellules traitées avec 10 µM de peroxyde
d’hydrogène (200). Le taux de 8-oxo-7,8-dihydroguanine ainsi mesuré avec des valeurs voisines de 1
lésion pour 15 bases normales est très élevé. Il témoigne, soit du manque de spécificité de l’anticorps,
soit d’artefacts liés à la méthode elle-même. D’autres anticorps, bien que plus spécifiques ne
permettent la mesure que de 1 résidu 8-oxodGuo pour 105 dGuo (201). Les niveaux obtenus sont
toutefois 6 fois supérieurs aux mesures effectuées par CLHP-DE sur les mêmes échantillons.
L’anticorps monoclonal mis au point par Osawa et al., N45.1, a suscité beaucoup d’intérêt car
il apparaît être beaucoup plus spécifique. Sa préparation a impliqué la fixation covalente d’une 8-
oxodGuo sur une protéine (202). Cet anticorps ne donne pas lieu à des réactions croisées avec l’urée,
la créatinine, la guanine ou la 8-oxo-7,8-dihydroguanine. Il est utilisé pour la mesure de la 8-oxodGuo
dans l’urine (203) et pour des études immunohistochimiques (204), bien que l’aspect quantitatif et sa
spécificité n’aient pas été établis.
Des anticorps dirigés contre la 8-oxo-7,8-dihydroadénine ont été mis au point par West et al.
(205) et par Ide et al. (206). Ils n’ont pas montré une spécificité suffisante (40 femtomoles pour
l’anticorps de West et al. ; et 1 8-oxo-7,8-dihydroadénine pour 104 adénines pour Ide et al.) pour
permettre la détermination du niveau basal de 8-oxo-7,8-dihydroadénine dans l’ADN cellulaire.
II. OPTIMISATION DE LA METHODE D’EXTRACTION DE L’ADN CELLULAIRE
A. ProblématiqueLa technique d’extraction de l’ADN cellulaire consiste à isoler ce polymère biologique de
tous les autres constituants cellulaires. Pour cela, l’extraction s’effectue en plusieurs étapes et
commence, quel que soit le protocole, par une lyse des membranes plasmique et nucléaire. L’ADN est
ensuite purifié par précipitation ou passage sur colonne avant d’être hydrolysé et analysé. De
nombreuses techniques d’extraction sont disponibles, soit sous forme de « kits » commerciaux, soit
sous forme de protocoles définis par chaque utilisateur. L’extraction de l’ADN cellulaire étant utilisée
dans de nombreux laboratoires et à de nombreuses fins, les protocoles existants ne prennent pas
toujours en compte les mêmes critères de qualité. Parmi ceux-ci, nous avons surtout retenu la
réduction de l’artefact lié à l’oxydation des bases normales. Ces réactions, si elles concernent les
quatre bases de l’ADN, semblent affecter plus particulièrement la guanine, qui est la plus sensible aux
processus d’oxydation. Les valeurs des taux de 8-oxodGuo mesurés dans l’ADN de cellules non
irradiées montrent, que le niveau de cette lésion, dépend pour beaucoup de la technique d’extraction
utilisée. Cette oxydation artéfactuelle liée à la méthode peut être réduite en prenant un
Chapitre II : Mise au point de méthodes chromatographiques 71
soin tout particulier à la préparation des échantillons (conservation à + 4°C des échantillons, absence
d’étape d’évaporation à sec, etc.), par l’utilisation de chélateurs de métaux qui inhibent la réaction de
Fenton, par une optimisation des quantités d’enzymes et des temps d’incubation. Des critères ont été
retenus pour pouvoir comparer les différentes techniques d’extraction entre elles. Nous avons ainsi
choisi de considérer le rendement d’extraction ainsi que la pureté de l’ADN obtenu mais surtout le
niveau de 8-oxodGuo mesuré par CLHP-DE. Avant d’aborder les différentes méthode d’extraction,
nous allons donc présenter la méthode permettant le dosage de la 8-oxodGuo par CLHP-DE qui est la
technique la plus adaptée à la mesure de cette modification. Nous comparerons ensuite les différentes
techniques d’extraction entre elles.
B. Technique de CLHP-DE : Application à la mesure de la 8-oxodGuo
La méthode la plus utilisée pour la mesure de la 8-oxodGuo est, en raison de sa sensibilité et
de sa facilité de mise en œuvre, la technique décrite par Floyd et al. en 1986 (Figure 28) (156). Elle
est basée sur une analyse par chromatographie liquide haute performance couplée à une détection
électrochimique (CLHP-DE).
1. Présentation de la technique de CLHP-DELa sensibilité de la méthode tient au mode de détection utilisé que nous allons présenter
maintenant.
a) La détection électrochimique
Elle s’adresse à des composés dits électroactifs, i.e. des composés facilement oxydables qui
peuvent perdre un électron sous l’action d’une différence de potentiel appliqué. Le système de
détection est constitué d’une cellule de détection qui contient deux électrodes de graphite permettant
de travailler à deux potentiels d’oxydation différents. Entre chaque électrode et l’électrode de
référence (à base de palladium) est établie une différence de potentiel modulable. Dans notre système
d’analyse, la première électrode possède un potentiel d’oxydation inférieur à celui du composé à
doser. Elle permet d’oxyder toutes les molécules qui ne présentent pas d’intérêt et qui sont
susceptibles de contaminer l’échantillon. Leur signal n’est donc pas recueilli. La détection est assurée
par la deuxième électrode. Son potentiel est suffisamment élevé pour permettre l’arrachement d’un
électron lors du passage du composé d’intérêt dans la cellule. Les électrons ainsi arrachés produisent
un courant qui est amplifié et dont l’intensité est proportionnelle à la quantité de produit à doser. Pour
séparer les différents constituants cellulaires, cette étape de détection est précédée d’une étape de
purification par chromatographie liquide haute performance (CLHP).
b) Principe de la CLHP-DE
Un système de chromatographie liquide haute performance permet la séparation des composés
(le plus souvent des nucléosides) sur une colonne de silice à polarité de phase inversée en fonction de
72 Chapitre II : Mise au point de méthodes chromatographiques
leur polarité. Ils pourront être détectés, en sortie de colonne, selon le principe décrit ci-dessus. La
gamme de potentiels redox utilisables pour les bases modifiées de l’ADN se situe entre 200 et 700
mV. De tels potentiels permettent la mesure des nucléosides modifiés sans détecter les nucléosides
normaux dont le potentiel est plus élevé. Les premières mesures de nucléosides modifiés ont concerné
la 8-oxodGuo, au niveau de l’ADN cellulaire (141, 156, 207-209), bactérien (210), ou
mitochondrial (211). Elles ont ensuite été étendues aux dosages de 8-oxodGuo dans les urines (78,
207, 212) ou dans divers tissus (213). Il est possible de mesurer d’autres nucléosides modifiées
comme la 5-hydroxy-2’-désoxycytidine ou la 5-hydroxy-2’-désoxyuridine (214) ou encore la 8-oxo-
7,8-dihydro-2’-désoxyadénosine. Toutefois, le mode de détection électrochimique, s’il est parmi les
plus sensibles (100 femtomoles pour la 8-oxodGuo) nécessite des échantillons de bonne pureté afin
d’éviter tout interférence de pics parasites avec le signal. Il est par exemple possible de mesurer la 5-
hydroxy-2’-désoxycytidine ou la 5-hydroxy-2’-désoxyuridine dans le foie de rats, alors que la mesure
dans l’ADN de cellules en culture n’a pas pu être effectuée.
2. Mesure de la 8-oxodGuoL’ADN extrait est enzymatiquement hydrolysé sous forme de nucléosides, et le mélange
résultant est injecté sur une colonne chromatographique (Figure 28). En sortie de colonne, un
détecteur UV recueille le signal des nucléosides normaux et un détecteur électrochimique, celui de la
8-oxodGuo (Figures 28 et 29).
injection
colonneanalytique
pompe
!!!! dosage de l’ADN
détecteurélectrochimique
!!!! dosage de la 8-oxodGuo
détecteurUV
nucléosides
Extraction de l'ADN
Figure 28 : Principe du dosage de la 8-oxodGuo par CLHP-UV-DE
Une calibration externe rend possible la quantification des signaux provenant des détecteurs
ultra-violet et électrochimique. Les signaux obtenus par le détecteur ultra-violet comportent 4 pics
correspondant aux quatre nucléosides normaux. Dans l’ordre croissant d’élution, on trouve dCyd >
dGuo > dThd > dAdo. Le signal électrochimique, comporte en général, dans le cas d’échantillons
Chapitre II : Mise au point de méthodes chromatographiques 73
biologiques, de nombreux pics correspondant à la présence de composés électroactifs qui peuvent
interférer avec la détection de la 8-oxodGuo.
8-oxodGuo
0 18 29141250temps post-injection (min) temps post-injection (min)
dThd
dGuo
dCyd
dAdo
détection électrochimique détection ultra-violette
Figure 29 : Profils d’élution chromatographique correspondant respectivement, à la détection de la8-oxodGuo et des nucléosides normaux (280 nm) dans l’ADN de cellules exposées à une dose de 40
Gy de rayonnement gamma du60Co.
Ceci souligne l’importance de la préparation des échantillons. La méthode d’extraction doit
conduire à l’obtention d’ADN suffisamment pur, tout en minimisant les risques d’oxydation
artéfactuelle. La quantité d’ADN contenue dans l’échantillons est déterminée à partir du signal de
dGuo obtenu. On considère pour cela, que dGuo représente 22% du total des bases de l’ADN. Il est
ainsi possible pour chaque échantillon, d’exprimer le nombre de lésions mesurées par rapport à celui
des bases normales. Les taux de 8-oxodGuo sont généralement exprimés en terme de nombre de 8-
oxodGuo pour 105 dGuo ou pour 106 bases.
C. Méthode d’extraction de l’ADN cellulaire utilisant le « kit Qiagen »
La première méthode d’extraction de l‘ADN que nous avons utilisée est la technique
développée par la société Qiagen sous forme d’un « kit » commercial. La méthode repose sur une lyse
des membranes cellulaires qui a lieu en deux temps. Tout d’abord, on effectue une lyse de la
membrane plasmique qui est suivie par celle de la membrane nucléaire. Le contenu nucléaire est
recueilli par centrifugation avant d’être incubé en présence d’une protéase. Le mélange est ensuite
déposé en tête d’une colonne échangeuse d’anions. Après élution, l’ADN purifié est précipité et
74 Chapitre II : Mise au point de méthodes chromatographiques
hydrolysé. Le protocole d’extraction est relativement long. Le rendement d’extraction est satisfaisant
et l’ADN obtenu est très pur. On obtient une quantité voisine de 100 µg d’ADN pour 10 millions de
cellules. Toutefois sur une série de colonnes utilisées, des différences de vitesse d’élution sont
observées. Celles-ci peuvent être responsables des variations des taux de modification mesurés sur des
échantillons identiques. Le niveau basal de 8-oxodGuo déterminé par cette méthode est d’environ 1
modification/105 dGuo.
D. Méthodes d’extraction de l’ADN cellulaire en phase homogèneL’intérêt d’utiliser des méthodes d’extraction en phase homogène réside dans le fait qu’elles
sont généralement plus rapides. De plus, l’ADN est maintenu dans un milieu aqueux pendant le
protocole d’extraction. Elles évitent l’utilisation de colonnes susceptibles de favoriser l’oxydation de
l’ADN.
1. Méthode au phénol/chloroformeNous n’avons pas utilisé cette méthode qui est pourtant parmi une des plus anciennes. Ses
principales caractéristiques seront abordées dans la discussion des résultats de ce chapitre.
2. Méthodes au NaCl ou chaotropique au NaI
a) Principe des deux méthodes d’extraction
Nous avons comparé deux techniques d’extraction de l’ADN cellulaire qui sont la méthode au
NaCl et l’approche chaotropique au NaI (Figure 30). Cette dernière, plus récente, se différencie, par
une lyse des cellules en deux étapes, par des quantités d’enzymes réduites, par des temps d’incubation
optimisés, par une précipitation de l’ADN au NaI, et enfin par l’utilisation d’un chélateur du fer, la
déféroxamine, dans tous les tampons utilisés. C’est aussi la plus rapide et elle permet l’extraction de
l’ADN d’une cinquantaine d’échantillons en 4 à 5 h. L’ADN extrait est hydrolysé sous forme de
nucléosides à l’aide du couple d’enzymes, nucléase P1-phosphatase acide ou alcaline.
Chapitre II : Mise au point de méthodes chromatographiques 75
Lyse de la membrane plasmique
Lyse de la membrane nucléaire
monocyte
Traitements protéase + RNase
Précipitation de l'ADN au NaI
(8-oxodGuo)
nucléase P1 phosphatase alcaline
Lyse des membranesplasmique et nucléaire
ARNADN ARNADN
Traitement à la protéasePrécipitation de l'ADN au NaCl
Traitement RNase
Hydrolyse enzymatique
monocyte
noyau
(8-oxodGMP)
NH
NN
N
O
ONH2O
OH
OPOH
OHO
HNH
NN
N
O
ONH2O
OH
HO
H
Figure 30 : Procédures de la méthode d’extraction au NaCl et au NaI
b) Hydrolyse enzymatique nucléase P1-phosphatase acide
Une hydrolyse enzymatique de l’ADN précipité a été effectuée à l’aide du couple d’enzymes
nucléase P1-phosphatase acide comme une alternative au couple d’enzymes nucléase P1-phosphatase
alcaline, plus classiquement utilisé. Les deux enzymes montrent une activité optimale à la même
valeur de pH. Il était possible de les associer au cours de l’hydrolyse, et de réduire ainsi la durée de
cette étape afin de limiter les sources possibles d’oxydation. Il était cependant nécessaire de s’assurer
au préalable que la 8-oxodGMP était un bon substrat de la phosphatase acide (Figure 31). Les
résultats présentés dans la Figure 31 indiquent qu’une hydrolyse en présence du mélange des deux
enzymes permet une libération totale de la 8-oxodGuo en 90 min. Il est par ailleurs important de
signaler que la présence de 8-oxodGuo dans l’ADN n’inhibe pas l’activité de la nucléase P1.
76 Chapitre II : Mise au point de méthodes chromatographiques
0
50
100
150
200
250
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
Temps d’incubation (h)
Phosphatase alcaline
8-oxodGuo/105 bases
0
50
100
150
200
250
300
0 5 10 15 20 25 30 35 40
8-oxodGuo/105 bases
Nucléase P1- Phosphatase acide
Temps d’incubation (h)
a)
b)
Figure 31 : Cinétiques d’hydrolyse de l’ADN commercial isolé de thymus de veau par a) :Phosphatase alcaline (précédée d’une hydrolyse par la nucléase P1 pendant 90 min) ; b) : Nucléase
P1-phosphatase acide
c) Résultats : Mesure de la 8-oxodGuo dans l’ADN de monocytes
exposés au rayonnement γγγγ du 60Co
Afin de comparer les deux méthodes d’extraction, le niveau de 8-oxodGuo a été mesuré dans
l’ADN de monocytes exposés au rayonnement gamma pour des doses comprises entre 0 et 600 Gy ou
0 et 100 Gy, selon l’étude. Les Figures 32 et 33 portent, en ordonnée, le nombre de 8-oxodGuo par
million de bases normales, et en abscisse la dose de rayonnement délivrée (en Gy). Dans le cas de la
méthode au NaCl, un niveau basal de 1,76 8-oxodGuo/106 bases est mesuré. Le taux de formation
déterminé en utilisant une droite de régression linéaire est de 0,022 8-oxodGuo/106 bases/Gy. Pour
mesurer un taux de formation significativement différent du bruit de fond, une dose de 100 Gy est
nécessaire !
Chapitre II : Mise au point de méthodes chromatographiques 77
8-oxodGuo/10 bases
600
10
15
20
y = 0,022 x + 1,76
0
5
0 200 400
Dose (Gy)
6
Figure 32 : Formation de la 8-oxodGuo déterminée par CLHP-DE dans l’ADN de monocytes exposésau rayonnement gamma du 60Co (méthode au NaCl)
y = 0,011x + 0,20
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
0 20 40 60 80Dose (Gy)
8-oxodGuo/106 bases
Figure 33 : Formation de la 8-oxodGuo déterminée par CLHP-DE dans l’ADN de monocytes exposésau rayonnement gamma du 60Co (méthode au NaI, après soustraction du niveau basal égal à 0,2
lésion/106 bases)
En utilisant la méthode au NaI (Figure 33), le niveau basal n’est plus que de 0,2 8-
oxodGuo/106 bases, soit une réduction par un facteur 9 du taux déterminé par la méthode au NaCl.
Cette valeur basale a été soustraite aux taux mesurés ce qui explique la valeur nulle de l’ordonnée à
l’origine portée dans la Figure 33. Le niveau de formation est établi en utilisant une droite de
régression linéaire de pente 0,011 8-oxodGuo/106 bases/Gy. Une dose de 35 Gy permet d’obtenir un
taux de formation significativement différent du niveau basal. Cette réduction du niveau basal
s’accompagne d’une diminution de la gamme de doses (entre 0 et 80 Gy) pour obtenir une courbe
dose-réponse significative. En utilisant la méthode au NaI sur des cellules exposées à des doses de
rayonnement comprises, cette fois-ci, entre 0 et 600 Gy, le taux de formation est de 0,015 8-
78 Chapitre II : Mise au point de méthodes chromatographiques
oxodGuo/106 bases/ Gy. Ceci suggère que l’oxydation artéfactuelle est d’autant plus importante que la
dose d’irradiation est élevée. Une des hypothèses pour expliquer la différence de pente observée entre
les deux méthodes pourrait être la libération de fer induite par l’irradiation. Cette libération conduirait
à la formation d'espèces réactives de l’oxygène via la réaction de Fenton.
d) Conclusion
La méthode chaotropique d’extraction au NaI apparaît être particulièrement intéressante.
Plusieurs hypothèses peuvent être avancées pour expliquer la diminution du niveau de 8-oxodGuo. Il
peut s’agir d’une interférence du NaI avec la détection électrochimique de 8-oxodGuo, ou encore de
l’extraction préférentielle des nucléosides normaux. Toutefois, des expériences contrôle ont été
effectuées de façon à écarter la première hypothèse. Pour cela des échantillons d’ADN cellulaire ont
été enrichis par 100 fmoles de 8-oxodGuo. Une calibration externe a permis de s’assurer que la
quantité ajoutée était bien détectée dans sa totalité. Par ailleurs, l’obtention d’une courbe réponse
similaire à celle obtenue par la méthode au NaCl, suggère que la diminution du niveau de 8-oxodGuo
n’est pas liée à l’extraction préférentielle des nucléosides normaux. L’hypothèse la plus vraisemblable
est que la méthode utilisée réduise les phénomènes artéfactuels d’oxydation (réduction d’un facteur
9). Tout en étant plus rapide, elle permet des analyses dans des gammes de doses plus faibles. Nous
l’avons utilisée, préalablement à toutes les mesures chromatographiques présentées dans la suite de
cet exposé.
III. UTILISATION DE LA TECHNIQUE DE CG-SM
A. Principe de la technique de CG-SML’utilisation de la spectrométrie de masse (SM) a permis dans les quinze dernières années, la
mesure de nombreuses lésions de l’ADN. C’est aujourd’hui la principale technique de détection des
dommages de bases de l’ADN. Couplée à la chromatographie gazeuse, la méthode (CG-SM) est
susceptible après optimisation de permettre la détermination du niveau basal, du taux de formation
ainsi que des cinétiques de réparation des bases modifiées dans un échantillon d’ADN. Plusieurs de
ces lésions ont été produites par irradiation gamma (153, 155, 215-220), ou par des systèmes
biochimiques de type xanthine oxydase/hypoxanthine (221). Nous verrons ultérieurement que
l’application de la version initiale de cette méthode a conduit à l’obtention de résultats dont la plupart
doivent être en fait reconsidérés.
1. Rappel sur la détection par spectrométrie de masseLa spectrométrie de masse (SM) permet la détermination des masses de fragments, après
ionisation de la molécule. Ainsi, des informations sur la nature et la structure de ces molécules sont
recueillies. Elle fait intervenir l’ionisation du composé à analyser afin de soumettre les espèces
chargées ainsi obtenues, à un champ électrique ou magnétique. Chaque ion produit est sélectionné en
Chapitre II : Mise au point de méthodes chromatographiques 79
fonction de son rapport masse/charge et apparaît dans le spectre de masse. Ce mode de détection est
particulièrement spécifique et permet la détection de nombreuses bases modifiées de l’ADN.
2. Principe de la CG-SM : Conditions opératoiresLa méthode n’est applicable qu’aux bases ou nucléosides thermostables après une étape de
dérivation. Les mesures effectuées dans l’ADN cellulaire nécessitent au préalable une étape
d’extraction de l’ADN cellulaire.
a) Hydrolyse de l’ADN
Une hydrolyse enzymatique (nucléase P1/phosphatase alcaline et/ou acide) est effectuée de
façon à libérer les nucléosides ou les bases. Certains nucléosides peuvent être directement analysés,
après une étape de dérivation (222, 223). Toutefois, une hydrolyse acide qui conduit à la libération
des lésions sous forme de bases est communément utilisée (Figure 34).
extraction de l'ADN
base
hydrolyse acide
quantificationbase silylée
dérivation analyse CG-SM
ADN
Figure 34 : Principe de la préparation des échantillons avant mesure par CG-SM
L’hydrolyse acide induit la rupture de la liaison N-glycosidique. De ce fait, les composés
doivent être stables en milieu acide dans les conditions de l’hydrolyse. C'est le cas de la 8-oxo-7,8-
dihydroguanine et de la 8-oxo-7,8-dihydroadénine (219, 224, 225). Par contre, d’autres bases
modifiées, comme les dérivés Fapy purines, sont instables et se recyclisent (226). Les cytosines
oxydées présentant une liaison 5,6 saturée peuvent subir une désamination qui conduit à la formation
d’analogues de l’uracile (227). L’importance de la dégradation de certains composés dépend de la
nature de l’acide (formique le plus souvent), de la durée d’hydrolyse (30 à 45 min) de la température
(140°C) (224). Une hydrolyse à température ambiante convient à peu près à tous les composés (219,
228). Mais, il reste à établir que la libération de la base modifiée de la chaîne d’ADN est quantitative
dans ces conditions.
b) Etape de dérivation
Une fois l’hydrolyse effectuée, les composés doivent être dérivés afin de les rendre volatils.
C’est une des étapes critiques de la préparation de l’échantillon (Cf. Chapitre III). Les principales
méthodes de dérivation impliquent la silylation des fonctions alcools, amines et énoles des bases par
des groupements triméthylsilyles (Figure 35) (229, 230).
80 Chapitre II : Mise au point de méthodes chromatographiques
N
N N
N
H2N
O
O
H
HH
8-oxo-7,8-dihydroguanine
N
N N
N
HN
O
O
dérivé silylé de la 8-oxo-7,8-dihydroguanine
Si(CH3)3
Si(CH3)3Si(CH3)3
Si(CH3)3
Figure 35 : Silylation de la 8-oxoGua en présence de BSTFA
Des agents de dérivation peuvent être utilisés comme le N-tertbutyldiméthylsilyl-N-méthyl-
trifluoroacétamide (MTBDSTFA) ou le N-bis(triméthyl-silyle)trifluoroacétamide (BSTFA) (Figure
35). La dérivation requiert un chauffage pendant une durée de 20 à 30 min à 130°C.
c) Analyses par CG-SM
Les composés rendus volatils sont injectés sur une colonne capillaire de silice (revêtue d’un
film de méthylsiloxane substitué par 5% de phénylméthylsiloxane) parcourue par de l’hélium. Le port
d’injection et l’interface CG-SM sont respectivement maintenus à 250°C et 290°C (Figure 36). Le
décrochage des composés s’effectue par une augmentation de la température de la colonne en utilisant
un gradient. Les composés sont ainsi libérés en fonction du temps et détectés en sortie de colonne par
un spectromètre de masse. L’ionisation est généralement effectuée par impact électronique avec un
mode de détection de type SIM (« Single Ion Monitoring »). Le mode SIM par opposition au mode
SCAN (qui permet de visualiser tous les ions issus de la fragmentation de l’ion parent) est beaucoup
plus sensible.
e-
M(SiCH3)X
M(S
iCH
3) x
gradient de température
température
min
colonne capillaire
[M (SiCH 3 )x
quadripôle
spectromètre de masse
chromatographie gazeuse
source d'ionisation
analyseur
injection
He ]+
Figure 36 : Principe de l’analyse par CG-SM
Chapitre II : Mise au point de méthodes chromatographiques 81
Les ions majoritaires détectés (pour les dérivés triméthylsilyles) sont d’une part l’ion parent
(M)+° et l’ion (M-15)+° correspondant à la perte d’un groupement méthyle. L’ajout le plus tôt
possible, de standards internes isotopiquement enrichis (Cf. sous-paragraphe III-B-3)-b)) à la solution
à analyser permet de rendre la mesure quantitative. Toutefois de faibles volumes sont injectés (de 1 à
2 µl). Il en résulte que la plus grande partie de l’échantillon (98%) est perdue pour le dosage limitant
la sensibilité de la méthode. Il a été proposé que la méthode CG-SM soit susceptible de mesurer dans
l’ADN de cellules irradiées au 60Co diverses lésions : diols de thymine (Tg), diols de cytosine, 5,6-
dihydrothymine, 5,6-dihydroxy-5,6-dihydrouracile, 5,6-dihydrocytosine, 5-hydroxy-5,6-
dihydrothymine, 5-hydroxy-5,6-dihydrocytosine, 5-hydroxy-5,6-dihydrouracile (5-OHUra), 5-
hydroxy-5,6-dihydrocytosine (5-OHCyt), 5-hydroxy-5-méthylhydantoïne (5-OH-5-Me-Hyd), 5-
hydroxyhdantoïne, 5-hydroxyméthyluracile (5-HmUra), 2,6-diamino-4-hydroxy-5-
formamidopyrimidine (FapyGua), 4,6-diamino-5-formamidopyrimidine (FapyAde), 8-oxo-7,8-
dihydroadénine (8-oxoAde), 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxoGua) et la 2-hydroxyadénine (2-
OHAde) (37, 153, 154, 217-219, 225, 231-239).
B. Mesure des dérivés Fapy de la guanine et de l’adénine
1. Procédure suivieLa méthode de CG-SM a été appliquée à la mesure de la FapyGua et de la FapyAde. Le
protocole optimisé que nous avons défini est représenté dans la Figure 37.
L’ADN cellulaire est préalablement extrait, selon la méthode chaotropique au NaI, et
hydrolysé sous forme de nucléotides. Des standards internes isotopiquement enrichis [M+3] sont
ajoutés de manière à rendre l’analyse quantitative (méthode de dilution isotopique). Une hydrolyse
acide est ensuite effectuée. Elle est suivie d’une étape de prépurification par CLHP qui permet
d’éliminer les sels présents dans les échantillons qui sont apportés par les tampons enzymatiques. Un
deuxième avantage de la séparation par CLHP est une meilleure pureté de l’échantillon pour l’analyse
ultérieure par CG-SM. Une étape de lyophilisation permet d’éliminer les sels de formiate qui ont été
introduits dans les échantillons lors de l’étape de prépurification. Les échantillons sont ensuite dérivés
à 120°C en présence de BSTFA avant d’être injectés sur le système CG-SM.
82 Chapitre II : Mise au point de méthodes chromatographiques
prépurification par CLHP
FapyGua et FapyAde
extraction de l’ADN (méthode NaI)
monocyte
ADN
hydrolyse enzymatique (nucléase P1)
hydrolyse acide (acide formique)
ajout de standards internes
Quantification de l’ADN par CLHP-UV
Quantification de FapyGua et FapyAde par CG-SM
Analyse
O
OH
OPOH
OHNH2
H
O
ON
HN N
NH
O
H
FapyGua FapyAde
H
O N
H2N N
N
NH2H
+ nucléotides normauxH
O N
H2N N
NH
O
NH2
H
dérivation
Figure 37 : Principe de la mesure de la FapyGua et de la FapyAde par CLHP/CG-SM
Chapitre II : Mise au point de méthodes chromatographiques 83
2. Ions caractéristiquesLa silylation de la FapyGua et de la FapyAde à l’aide du BSTFA conduit respectivement à la
fixation de quatre et trois groupements TMS sur la molécule mère (Figure 38).
HN
N
NNH2
NH2
OH
HH
N
N
N
H2N
O
NH2
O
H
N
N
NNH
NH
OH
3)Si(CH 3
)Si(CH 3
)Si(CH 3
HN
N
N
NH
O
NH
OH
3)Si(CH 3
3)Si(CH 3
3)Si(CH 33)Si(CH 3
BSTFA (120°C, 20 min.)
BSTFA (120°C, 20 min.)
FapyGua
FapyAde
Figure 38 : Dérivés silylés de la FapyGua et de la FapyAde
Les ions caractéristiques détectés par spectrométrie de masse, en mode d’ionisation par impact
électronique, correspondent, comme nous l’avons mentionné, aux molécules silylées présentées ci-
dessus, mais aussi aux molécules mères substituées ayant perdu un groupement méthyle (M - 15)
(Tableau VIII).
Tableau VIII: Ions caractéristiques de la FapyGua et de la FapyAde
Molécule mère Molécule dérivée Ions caractéristiques
Masse Masse Masse Masse - 15
FapyGua 169 457 457 442
[M+3] FapyGua 172 460 460 445
FapyAde 153 369 369 354
[M+3] FapyAde 156 372 372 357
3. Standards internes et calibration
a) Standards internes
Il s’agit de molécules identiques aux bases modifiés que l’on veut mesurer, mais possédant
dans leur structure des isotopes lourds, tels que 13C, 15N ou 18O. La molécule ainsi obtenue par
synthèse, possède le même comportement chromatographique et chimique que la base modifiée.
Toutefois, en raison de sa masse légèrement supérieure de 3 ou 4 uma, elle pourra être différenciée de
la molécule normale lors de l’étape de détection par spectrométrie de masse (Tableau IX). Avant
l’analyse, une quantité définie de standard interne est ajoutée à chaque échantillon. Ceci permet de
84 Chapitre II : Mise au point de méthodes chromatographiques
déterminer le rapport entre le produit et le standard interne lors de l’analyse CG-SM. En utilisant une
courbe de calibration, il est alors possible de calculer la quantité de la lésion étudiée. Le standard de
[M+3] FapyGua a été synthétisé selon le protocole décrit par Douki et al. (226). La [M+3] FapyAde a
été fournie par le Professeur H.E. Poulsen (Université de Copenhague, Copenhague, Danemark).
Tableau IX : Position et nature des isotopes incorporés dans les molécules de standards internes
Lésions Standards isotopiques internes
FapyGua [2,6-diamino,5-formamido-15N3]FapyGua
FapyAde [4,6-diamino-15N2, 5-formamido-13C]FapyAde
b) Droites de calibration
Afin de s’assurer de la linéarité de la réponse du système de détection en fonction de la
quantité de produit, une droite de calibration a été établie. Elle permet de démontrer l’existence d’une
corrélation linéaire entre le rapport des aires du produit normal (A1) à mesurer et du produit enrichi
isotopiquement (A2) et le rapport de leurs concentrations respectives (C1 et C2). Une valeur proche de
1 de la pente de la droite de la calibration, permet de s’assurer qu’à concentration égale, le produit
isotopiquement enrichi et le produit non enrichi donnent le même signal. La valeur nulle de
l’ordonnée à l’origine permet de s’assurer que la contribution isotopique du produit normal dans le
produit isotopiquement enrichi est nulle (Figures 39 et 40).
3,5y = 1,165 x
R2 = 0,9999
0,00,51,01,52,02,53,0
0 0,5 1 1,5 2
Rapport des aires A1/A2
Rapport des concentrations C1/C2
Figure 39 : Courbe de calibration de la FapyGua obtenue par CG-SM
Chapitre II : Mise au point de méthodes chromatographiques 85
y = 0,8578 x + 0,0086
R2 = 0,9998
0,0
0,4
0,8
1,2
1,6
2,0
0 0,5 1 1,5 2
Rapport des aires A1/A2
Rapport des concentrations C1/C2
Figure 40 : Courbe de calibration de la FapyAde obtenue par CG-SM
4. Exemples de profils d’élution chromatographiquePour chaque échantillon, quatre profils d’élution chromatographique correspondant aux ions
caractéristiques mentionnés précédemment sont obtenus. On porte en ordonnée l’abondance de l’ion,
et en abscisse le temps d’élution en minutes (Figure 41).
6.60 6.70 6.80 6.90 7.00 7.10 7.20 7.30 7.40 7.50 7.60 7.70 7.80 7.90
0
Ion 460.30 (460.00 to 461.00): 05049903.D
20000
Abondance
6.60 6.70 6.80 6.90 7.00 7.10 7.20 7.30 7.40 7.50 7.60 7.70 7.80 7.90
0 Temps (min.)
Ion 457.30 (457.00 to 458.00): 05049903.D500
Abondance
Fapy Gua
[ M+3 ] Fapy Gua
Temps (min.)
Figure 41 : Profil d’élution correspondant à la détection de la FapyGua par CG-SM (monocytesexposés à une dose de 500 Gy)
86 Chapitre II : Mise au point de méthodes chromatographiques
IV. UTILISATION DE LA TECHNIQUE DE CLHP-SM/SM
A. Principe de la technique de CLHP-SM/SMLa technique de chromatographie liquide haute performance couplée à la détection par
spectrométrie de masse en mode tandem (CLHP-SM/SM) est la méthode d’analyse proposée le plus
récemment. Pratiquement, les échantillons sont séparés sur une colonne chromatographique par une
phase mobile liquide avant d’arriver dans la source d’ionisation. L’ionisation peut s’effectuer à
pression atmosphérique (API) par « électrospray » ou par ionisation chimique à pression
atmosphérique (APCI). Dans le mode « électrospray », les ions sont produits par nébulisation de
l’échantillon au sein d’un champ électrique élevé.
quadripôle 1 cellule de collision quadripôle 3 analyseur
lentilles 1-3 lentilles 4-6 lentilles 7-9
échantillon
sélection de l'ion parent
dissociation de l'ion parent
sélection de l'ion fils
+
- -
+
Figure 42 : Spectrométrie de masse en mode tandem (240)
L’ionisation peut s’effectuer avec création d’ions positifs (+ H+) ou négatifs. La détection est
effectuée en mode SIM ou en mode tandem (« Multiple Reaction Monitoring »). Dans ce dernier cas,
trois quadripôles sont disposés en série (Figure 42). Le premier permet de sélectionner un ion parent
qui sera ensuite fragmenté dans le deuxième quadripôle encore appelé cellule de collision. L’ion
caractéristique issu de cette fragmentation est ensuite sélectionné dans le troisième quadripôle avant
d’être détecté. En raison de l’accessibilité très récente de la technique CLHP-SM/SM, on note une
absence quasi totale d’applications à la mesure des dommages dans l’ADN cellulaire (241).
Toutefois, on note quelques études sur l’action de xénobiotiques sur l’ADN isolé (242, 243). Ce
mode d’analyse est particulièrement adapté à la détection des composés thermolabiles (244) et ouvre
de nouvelles perspectives. Un champ d’application intéressant est celui des études mécanistiques. On
peut ajouter que cette méthode devrait apporter un gain de sensibilité. par rapport aux autres
techniques de mesure.
Chapitre II : Mise au point de méthodes chromatographiques 87
La méthode de chromatographie liquide associée à un mode de détection par spectrométrie de
masse en mode tandem, a été utilisée dans ce travail pour mesurer plusieurs bases modifiées dans un
même échantillon d’ADN cellulaire. Le mode d’ionisation de notre système CLHP-SM/SM est le
mode « électrospray » qui permet d’ioniser les bases modifiées par protonation (en mode positif) ou
par perte d’un proton (en mode négatif). Les composés ainsi ionisés sont ensuite fragmentés dans une
cellule de collision et donnent des ions fils qui seront filtrés et finalement détectés. La mesure d’un
produit en mode MRM, qui apporte une très grande sensibilité de détection, porte sur une transition
caractéristique. Ainsi, seuls les ions fils possédant une valeur m/z donnée et issus d’un ion
pseudomoléculaire de valeur m/z donnée seront détectés . La quantification de l’ions fils détecté sera
effectuée par calibration interne ou externe. La possession des bases et nucléosides modifiés ainsi que
des dérivés correspondants enrichis isotopiquement facilite la mise au point et l’optimisation des
méthodes d’analyse CLHP-SM/SM.
B. Mesure des dérivés Fapy de la guanine et de l’adénine parCLHP-SM/SM
1. Spectres de masse et transitions caractéristiques de la FapyGua et dela FapyAde
La technique de CLHP-SM/SM a permis d’accéder à la mesure de la FapyAde et de la
FapyGua dans l’ADN cellulaire exposé au rayonnement du 60Co. L’ion pseudomoléculaire est obtenu
par protonation des dérivés Fapy purines (mode positif [M+H]+) (Figure 43).
a) Spectres de masse
+Product (154) MCA (15 scans) : de FapyAde en mode SM/SM126.2
136.1
154.0
60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160m/z, amu
1.0e6
2.0e6
3.0e6
4.0e6
5.0e6
6.0e6
7.0e6
Inte
nsity
, cps
m/z, amu
+Product (170) MCA (15 scans) : de FapyGua en mode SM/SM142.1
151.9
170.2
70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170
2.0e5
4.0e5
6.0e5
8.0e5
1.0e6
1.2e6
1.4e6
Inte
nsity
, cps
- 28
[M]
[M-18]
[M-28][M-28]
[M-18]
[M]
HN
NH2N
CN
NH2O
H*
*
*HNH
NH2N
CN
O
OH
NH2*
*
*
- 28
Figure 43 : Spectres de masse issus de la fragmentation de l’ion pseudomoléculaire de la FapyGua etde la FapyAde obtenus par CLHP-SM/SM (mode positif)
Les isotopes incorporés sont signalés par une astérisque.
b) Transitions caractéristiques
A partir des spectres de masse établis précédemment (Figure 43), les transitions suivantes ont
été choisies pour mesurer les dérivés Fapy des bases puriques en mode MRM (Tableau X).
88 Chapitre II : Mise au point de méthodes chromatographiques
Tableau X : Transitions de détection
Bases modifiées Masse molaire Mode d’ionisation Transitions
FapyGua 169 positif 170 → 142
FapyAde 153 positif 154 → 126
[M+3] FapyGua 172 positif 173 → 145
[M+3] FapyAde 156 positif 157 → 128
La transition caractéristique utilisée pour le dosage de la FapyAde est la transition issue de la
fragmentation de l’ion pseudomoléculaire m/z = 154 en l’ion fils m/z = 126. On utilise la transition
m/z = 170 → m/z = 142 pour la FapyGua (Tableau X). Les deux transitions correspondent à la perte,
par l'ion pseudomoléculaire, d’un groupement carbonyle après perte du groupement formyle et
transfert d’un atome d’hydrogène. Les ions de masse 152 et 136 correspondent à la perte d’une
molécule d’eau.
2. Exemples de profils d’élution chromatographiqueLa Figure 44 représente les signaux des dérivés Fapy purines obtenus à partir d’ADN extrait
de monocytes exposés à 500 Gy (60Co). Les pics de standards internes [M+3] correspondent à une
injection de 100 pmoles.
XIC of +MRM (2 pairs): Period 1, for 157.0 / 128.0 amu from 500 GY ECH 3A
0.10 0.88 1.25
2.86
1.0 2.0 3.0Time, min
5.0e4
1.0e5
1.5e5
2.0e5
2.5e5
Inte
nsity
, cps
2.96e5 cps
XIC of +MRM (2 pairs): Period 2, for 173.0 / 145.0 amu from 500 GY ECH 3
4 5 6 7 8 9Time, min
10000
12000
14000
Inte
nsity
, cps
5.85
2000
4000
6000
8000
[M+3] FapyGua
FapyGua
[M+3] FapyAde
FapyAde
Figure 44 : Exemple de profils d’élution correspondant à la mesure par CLHP-SM/SM, de dérivésFapy purines dans l’ADN de monocytes exposés au rayonnement γ du 60Co (500 Gy)
3. Niveau basal de FapyGua dans l’ADN cellulaire : Influence de ladéféroxamine
La sensibilité de la technique de CG-SM pour la mesure des dérivés Fapy purines est de
l’ordre de 2 à 3 modifications pour 106 bases. On peut noter que cette sensibilité est trop faible pour
les mesures dans l’ADN de cellules contrôle malgré l’utilisation d’une étape de prépurification par
CLHP. La technique de CLHP-SM/SM s’est avérée être beaucoup plus sensible, et permet en
particulier la mesure de la FapyAde, dans l’ADN cellulaire contrôle. Afin d’accroître la sensibilité de
Chapitre II : Mise au point de méthodes chromatographiques 89
détection de la FapyGua par cette méthode, nous avons apporté des modifications à la méthodologie.
Les volumes des tampons enzymatiques ont ainsi été réduits, ce qui a permis d’éliminer une partie des
composés ou sels susceptibles d’affecter la détection. De plus, nous avons observé que l’élimination
de la déféroxamine du tampon d’hydrolyse de la nucléase P1 s’accompagnait d’une augmentation
sensible du taux des deux dérivés Fapy purines, aussi bien dans les cellules témoin, que dans les
cellules exposées au rayonnement gamma du 60Co, à des doses comprises entre 250 et 500 Gy (Figure
45).
0
1
2
3
4
0 250 350 500
déf (-)
déf (+)
FapyAde/10 6 bases
Dose (Gy)
Figure 45 : Influence de la déféroxamine (déf) sur le niveau de FapyAde mesuré par CLHP-SM/SM(cellules témoin et irradiées entre 250 et 500 Gy)
Ce résultat suggère que la déféroxamine, en piégeant Fe2+ empêche la formation de °OH et par
là même, la formation du radical neutre réducteur précurseur de la FapyGua et de la 8-oxodGuo.
C. Mesure simultanée des diols de thymidine, de la 5-OHdUrd , dela 5-FordUrd, de la 5-HmdUrd, de la 8-oxodAdo, de la 8-oxodGuo et de la dGuo
Il est apparu intéressant d’étendre la méthode de CLHP-SM/SM à la mesure d’autres lésions.
Nous nous sommes intéressés plus particulièrement à la mesure des diols de thymidine, de la 5-
hydroxyméthyl-2’-désoxyuridine (5-HmdUrd), de la 5-hydroxy-2’-désoxyuridine (5-OHdUrd), de la
5-formyl-2’-désoxyuridine (5-FordUrd), de la 8-oxo-7,8-dihydro-2’-désoxyadénosine (8-oxodAdo), de
la 8-oxo-7,8-dihydro-2’-désoxyguanosine (8-oxodGuo) et enfin de la 2’-désoxyguanosine (dGuo).
90 Chapitre II : Mise au point de méthodes chromatographiques
La mesure de la dGuo devait nous permettre d’estimer la quantité d’ADN présente dans chaque
échantillon.
1. Spectres de masseNous avons déterminé le spectre de masse issu de l’ion pseudomoléculaire de chacun des
nucléosides modifiés ainsi que celui de la dGuo. Il a été observé que le mode positif est plus adapté
aux molécules possédant des amines exocycliques, comme la 8-oxodGuo, la 8-oxodAdo et la dGuo.
Pour les autres nucléosides modifiés, le mode négatif est plus approprié. La comparaison avec les
spectres des produits marqués facilite la détermination des voies de fragmentation (la position des
isotopes incorporés est signalée par une astérisque).
+Product (284) MCA (10 «scans») : de 8-oxodGuo en mode SM/SM
99.1 117.2
168.1
284.0
60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280
m/z, amu
5e6
Inte
nsity
, cps [M-116]
[M]-116
OH
HOO
O
NH
NN
N
NH2O
H
**
*
**
Figure 46 : Spectre de masse issu de la fragmentation de l’ion pseudomoléculaire de la 8-oxodGuo
La fragmentation de l’ion parent de la 8-oxodGuo m/z = 284 donne l'ion fils m/z = 168
correspondant à la perte du 2-désoxyribose (Figure 46).
+Product (268) : 0.19 min (10 «scans») de 8-oxodAdo en mode SM/SM
152.1
80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280m/z, amu
1.0e5
Inte
nsity
, cps
5.0e4
[M-116]N
NO
HO
OH
N
N
NH2
O
- 116
*
H
*
*
*
*
Figure 47 : Spectre de masse issu de la fragmentation de l’ion pseudomoléculaire de la 8-oxodAdo
Chapitre II : Mise au point de méthodes chromatographiques 91
La fragmentation de l’ion parent m/z = 268 de la 8-oxodAdo, donne l’ion fils majoritaire m/z
= 152 correspondant à la perte du 2-désoxyribose (Figure 47).
–Product (274) MCA (25 «scans») : des diols de thymidine en mode SM/SM
m/z, amu
116.0
274.8
2.5e4
5.0e4
Inte
nsity
, cps
60 80 100 120 140 160 200 220 240 260 280180
[M-159]
[M]
OHO
OH
OH
OHH
CH3
O
O N
HN
- 43
- 116
**
*
Figure 48 : Spectre de masse issu de la fragmentation de l’ion pseudomoléculaire des diols dethymidine
L’ion pseudomoléculaire m/z = 275 des diols de thymidine se fragmente en donnant l’ion fils
majoritaire m/z = 116 correspondant à la perte du groupement NHCO et du 2-désoxyribose (Figure
48).
–Product (243) MCA (10 «scans»): de 5-OHdUrd en mode SM/SM neg
1.21e6 cps
110.0
127.0
152.8
243.0
110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240
m/z, amu
5e5
Inte
nsity
, cps O
O
N
N
OH
OHO
OH-90
*
*
*
[M]
[M-90]
[M-116]
Figure 49 : Spectre de masse issu de la fragmentation de l’ion pseudomoléculaire de la 5-OHdUrd
La fragmentation de l’ion pseudomoléculaire m/z = 243 de la 5-OHdUrd donne l’ion fils
majoritaire m/z = 153 correspondant à la perte d’un fragment de 2-désoxyribose (Figure 49).
92 Chapitre II : Mise au point de méthodes chromatographiques
m/z, amu
–Product (257) MCA (5 «scans») : de 5HmdUrd en mode SM/SM neg
109.9
124.0
141.1 166.0188.5
214.0
225.4
256.9
120 140 160 180 200 220 240 260 280
5.0e5
1.0e6
Inte
nsity
, cps
**N
N
O
O
HCH2OH
OHO
OH
- 43
- 90
*
[M]
[M-133]
Figure 50 : Spectre de masse issu de la fragmentation de l’ion pseudomoléculaire de la 5-HmdUrd
La fragmentation de l’ion pseudomoléculaire (m/z = 257) de la 5-HmdUrd donne l’ion fils
majoritaire m/z = 124 correspondant à la perte du fragment du 2-désoxyribose et du groupement
NHCO (Figure 50).
m/z, amu
139.9 166.0
211.9
255.1
120 140 160 180 200 220 240 260 280
5e6
Inte
nsity
, cps
–Product (255) MCA (10 «scans») : de 5-FordUrd en mode SM/SM neg
*NCHO
NO
O
OHO
OH
- 43
**
[M]
[M-43]
Figure 51 : Spectre de masse issu de la fragmentation de l’ion pseudomoléculaire de la 5-FordUrd
La fragmentation de l’ion parent m/z = 255 de la 5-FordUrd donne l'ion fils majoritaire m/z =
212 correspondant à la perte du groupement NHCO (Figure 51).
+Product (268) MCA (10 «scans») : de dGuo en mode SM/SM
139.0
151.9
188.2246.1
120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340m/z, amu
2.0e6
6.0e6
1.0e7
1.4e7
2.2e7
1.8e7
Inte
nsity
, cps
[M]
[M-116]
OH
HOO
O
NH
NN
N
NH2
- 116
Figure 52 : Spectre de masse issu de la fragmentation de l’ion pseudomoléculaire de la dGuo
La fragmentation de l’ion pseudomoléculaire m/z = 268 de la dGuo donne l'ion fils m/z = 152
correspondant à la perte du 2-désoxyribose (Figure 52).
Chapitre II : Mise au point de méthodes chromatographiques 93
2. Transitions caractéristiquesA partir des spectres de masse établis précédemment, les transitions suivantes ont été choisies
pour mesurer les nucléosides modifiés et la dGuo (Tableau XI).
Tableau XI : Transitions de détection
Bases modifiées Masse molaire Mode d’ionisation Transitions
Diols de thymidine 276 négatif 275→116
5-OHdUrd 244 négatif 243→153
5-HmdUrd 258 négatif 257→124
5-FordUrd 256 négatif 255→212
dGuo 267 positif 268→152
8-OxodGuo 283 positif 284→168
8-OxodAdo 267 positif 268→152
3. Hydrolyse enzymatique de l’ADNAvant d’effectuer la mesure de ces lésions dans l’ADN cellulaire, il était nécessaire de
s’assurer que les enzymes d’hydrolyse de l’ADN habituellement utilisées, la nucléase P1 et la
phosphatase acide, permettaient d’obtenir une hydrolyse totale de l’ADN en nucléosides. Pour cela,
de l’ADN isolé de thymus de veau, exposé à une dose de rayonnement de 40 Gy, a été incubé en
présence des deux enzymes pour des périodes de temps croissantes. Les résultats sont rapportés dans
la Figure 53.
0
20
40
60
80
100
120
140
0 3 6 9 12 15 18 21 24
pmoles/échantillon
5-OHdUrd 5-HmdUrd 5-FordUrd 8-oxodGuo 8-oxodAdo diols de thymidine
Temps d’incubation (h)
Figure 53 : Cinétique d’hydrolyse de l’ADN par la nucléase P1 associée à la phosphatase acide
94 Chapitre II : Mise au point de méthodes chromatographiques
Les résultats montrent que les niveaux de 8-oxodGuo, de 5-HmdUrd, de 8-oxodAdo, de 5-
OHdUrd et de 5-FordUrd ainsi libérées tendent vers un plateau. Toutefois, même pour un temps
d’incubation de 24 h, l’hydrolyse des diols de thymidine n’apparaît pas être totale.
Une nouvelle approche basée sur l’utilisation d’exonucléases a été adoptée. Une première
phosphodiestérase extraite de rate de veau (PRV) a été utilisée pour hydrolyser l’ADN en nucléosides
3’-monophosphate. L’efficacité d’une autre phosphodiestérase, extraite de venin de serpent (PVS) à
obtenir des nucléosides 5’-monophosphate a été déterminée. La PRV a été utilisée conjointement à la
nucléase P1 (compatibilité des tampons enzymatiques). Cette dernière en coupant l’ADN en courts
fragments, facilite l’action de la phosphodiestérase. La phosphatase alcaline est associée à la PVS
(compatibilité des tampons enzymatiques) pour achever l’hydrolyse de l’ADN sous forme de
nucléosides. Des expériences ont été effectuées afin de déterminer les temps d’incubation nécessaires
à PRV et PVS pour permettre une libération totale de toutes les bases normales et modifiées de
l’ADN. A cette fin, des échantillons d’ADN isolé de thymus de veau, et exposés à une dose de 40 Gy
de 60Co, ont été incubés à 37°C, en présence de PRV (associée à la nucléase P1), pour des durées
comprises entre 30 min et 24 h. L’enzyme PVS (associée à la phosphatase alcaline) a ensuite été
ajoutée à chaque échantillon, et les solutions ont été incubées à 37 °C pendant 5 h. Les résultats
obtenus sont rapportés dans la Figure 54. Ils montrent qu’une incubation en présence de PRV pendant
2 h, à 37°C des échantillons, est suffisante, quelle que soit la base modifiée étudiée, pour obtenir une
hydrolyse totale.
0
20
40
60
80
100
120
140
160
0 5 10 15 20 25
5-OHdUrd 5-HmdUrd 5-FordUrd 8-oxodGuo 8-oxodAdo diols de thymidine
Temps d’incubation (h)
pmoles/échantillon
Figure 54 : Cinétique d’hydrolyse de l’ADN par l’exonucléase PRV (complétée par une hydrolyse enprésence de l’exonucléase PVS pendant 5 h)
Chapitre II : Mise au point de méthodes chromatographiques 95
Il était ensuite nécessaire de déterminer la durée d’incubation nécessaire à PVS, pour
hydrolyser totalement l’ADN. Pour cela, tous les échantillons ont été incubés en présence de PRV
(associée à la nucléase P1) à 37°C, pendant 2 h, et ont ensuite été soumis à l’action de PVS (associée
à la phosphatase alcaline) à 37 °C, pour des durées croissantes. Les résultats obtenus sont rapportés
dans la Figure 55. Ils indiquent qu’une incubation de l’ADN, pendant 2 h en présence de PVS,
consécutivement à une digestion pendant 2 h par PRV, permet une libération totale des nucléosides de
l’ADN (Figure 55).
0
20
40
60
80
100
120
0 5 10 15 20 25
pmoles/échantillon
Temps d’incubation (h)
5-OHdUrd 5-HMdUrd 5-FordUrd 8-oxodGuo 8-oxodAdo diols de thymidine
Figure 55 : Cinétique d’hydrolyse de l’ADN par l’exonucléase PVS (précédée par une hydrolyse en
présence de l’exonucléase PRV pendant 2 h)
4. Profils d’élution chromatographiqueLes Figures 56-59-60-61-62 montrent les profils d’élution de cinq des sept nucléosides
d’intérêt, mesurés simultanément dans l’ADN de monocytes exposés à une dose de 500 Gy de
rayonnement gamma du 60Co. La Figure 58 donne, à titre indicatif, le profil d’élution
chromatographique obtenu dans le cas de l’exposition d’ADN isolé de thymus de veau à 500 Gy de
rayonnement gamma du 60Co. On rapporte dans la Figure 63 le profil CLHP-SM/SM de la 8-oxodAdo
obtenu dans le cas de monocytes exposés à des impulsions UV LASER correspondant à une dose de
500 mJ. Un gradient de phase mobile et une colonne chromatographique à polarité de phase inverse
permettent de séparer les sept nucléosides au sein d’un même échantillon.
96 Chapitre II : Mise au point de méthodes chromatographiques
XIC of –MRM (4 pairs): Period 1, for 274.2 / 116.1 amu from 500 Gy
4.214.88
9.63
Time, min
100200300400500600
Inte
nsity
, cps
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
diols (trans)diols (cis)
(5S,6R)
S(5R,6 )
(5R,6R)(5S,6S)
Figure 56 : Profil d’élution CLHP-SM/SM des diols de thymidine
Les diols de thymidine donnent un signal comportant 4 pics correspondant aux 4
diastéréoisomères cis et trans possibles (Figure 56). Les diols de configuration trans, séparés sur une
colonne chromatographique de silice à polarité de phase inversée, sont élués plus rapidement que les
diastéréoisomères cis. On peut ajouter que les diastéréoisomères 5S sont élués plus rapidement que les
diastéréoisomères 5R pour une même configuration relative. Les structures des diastéréoisomères sont
rapportées dans la Figure 57.
HN
N
O
OdR OH
H
CH3OH HN
N
O
OdR H
OH
CH3
OH
cis (5S,6R) trans (5S,6S)
trans (5R,6R) cis (5R ,6S )
HN
N
O
OdR H
OH
OH
CH3HN
N
O
OdR OH
H
OH
CH3
Figure 57 : Structure des 4 diastéréoisomères des diols de thymidine
Chapitre II : Mise au point de méthodes chromatographiques 97
XIC of –MRM (4 pairs): Period 1, for 243.0 / 153.0 amu from 500 GY
12.46
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Time, min
2000
4000
6000
8000
10000
Inte
nsity
, cps
5-OHdUrd
Figure 58 : Profil d’élution CLHP-SM/SM de la 5-OHdUrd mesurée dans l’ADN isolé de thymus deveau exposé à 500 Gy de rayonnement gamma du 60Co (pour information)
XIC of –MRM (5 pairs): Period 2, for 257.0 / 124.0 amu from 500 Gy
17.50
14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
1000
2000
3000
4000
Inte
nsity
, cps
Time, min
5-HmdUrd
Figure 59 : Profil d’élution CLHP-SM/SM de la 5-HmdUrd
XIC of –MRM (5 pairs): Period 2, for 255.0 / 212.0 amu from 500 Gy 22.97
14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24Time, min
50
100
150
200
Inte
nsity
, cps
5-FordUrd
Figure 60 : Profil d’élution CLHP-SM/SM de la 5-FordUrd
98 Chapitre II : Mise au point de méthodes chromatographiques
XIC of +MRM (5 pairs): Period 3, for 284.1 / 168.0 amu from 500 Gy
27.36
26 28 30 32 34 36 38 40 42 44
1000
Inte
nsity
, cps
2000
8-oxodGuo
Time, min
Figure 61 : Profil d’élution CLHP-SM/SM de la 8-oxodGuo
XIC of –MRM (5 pairs): Period 2, for 268.1 / 152.0 amu from 500 Gy23.90
14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
1e6
2e6
Inte
nsity
, cps
Time, min
dGuo
Figure 62 : Profil d’élution CLHP-SM/SM de la dGuo
XIC of +MRM (5 pairs): Period 3, for 268.1 / 152.0 amu from 500 Gy
33.33
26 28 30 32 34 36 38 40 42 44
Time, min
0
500
1000
Inte
nsity
, cps
8-oxodAdo
Figure 63 : Profil d’élution CLHP-SM/SM de la 8-oxodAdo (irradiation UV LASER)
5. Stabilité des diastéréoisomères cis et trans des diols de thymidineNous n’avons pas été en mesure de séparer, dans les conditions chromatographiques utilisées
pour la technique de CLHP-SM/SM, les 4 diastéréoisomères des diols de thymidine. De ce fait, la
Chapitre II : Mise au point de méthodes chromatographiques 99
mesure des diols de thymidine que nous présentons dans ce mémoire porte sur l’ensemble des
diastéréoisomères trans et cis, sans essayer de les individualiser. On peut penser que, la mesure des
diols de thymidine trans d’une part et des diastéréoisomères cis des diols de thymidine d’autre part,
suppose que l’équilibre entre les formes trans et cis, dû à un phénomène d’épimérisation par
tautomérie chaîne-cycle, est atteint. Cet équilibre entre les configurations cis et trans de chaque
couple de diastéréoisomère est de 80 : 20 et 70 : 30, respectivement en solution aqueuse neutre (245).
L’équilibre est rapidement atteint en solution aqueuse alcaline. Une comparaison entre des
échantillons trans maintenus à -20°C ou maintenus à 37°C soit dans l’eau, soit dans le tampon de la
nucléase P1 (pH 5,5), a donné les résultats suivants. Les quatre diastéréoisomères ont été séparés sur
colonne de silice à polarité de phase inversée de type Uptisphere (Interchim, Montluçon) et détectés
en sortie de colonne par l’utilisation d’un détecteur UV fixé à 230 nm.
min2 4 6 8 10 12 14
mAU
0
2.5
5
7.5
10
12.5
15
17.5diol trans 5R
Figure 64 : Stabilité du diastéréoisomère trans 5R du diol de thymidine conservé à -20°C en milieuaqueux, pendant une nuit
Lorsque les échantillons sont conservés à -20°C en solution aqueuse, seuls les
diastéréoisomères trans sont présents (Figure 64).
min2 4 6 8 10 12 14
mAU
0
1
2
3
4
5
6diol cis 5Rdiol trans 5R
Figure 65 : Stabilité du diastéréoisomère trans 5R du diol de thymidine conservé à 37°C en milieuaqueux, pendant une nuit
100 Chapitre II : Mise au point de méthodes chromatographiques
La conservation à 37 °C en solution aqueuse, des diastéréoisomères trans 5R pendant une nuit,
donne lieu à la formation du diastéréoisomère cis correspondant (Figure 65).
min2 4 6 8 10 12 14
mAU
0
2.5
5
7.5
10
12.5
15
17.5
diol trans 5R
diol cis 5R
Figure 66 : Stabilité du diastéréoisomère trans 5R du diol de thymidine conservé à 37°C dans letampon de la nucléase P1, pendant une nuit
Lorsque les diastéréoisomères trans 5R de thymidine sont conservés dans le tampon de la
nucléase P1 (pH 5,5) à 37°C, pendant une nuit, on observe très peu de formation du diastéréoisomère
cis (Figure 66). Le même résultat a été obtenu pour le diastéréoisomère 5S.
La comparaison de ces trois conditions de conservation montrent que les diastéréoisomères
trans s’épimérisent rapidement en diastéréoisomères cis lorsqu’ils sont conservés à 37°C dans l’eau.
Lorsqu’ils sont congelés à -20°C ou maintenus dans le tampon de la nucléase P1, le processus
d’épimérisation ne se produit pas. Ceci s'explique par le fait que l'épimérisation est favorisée en
milieu basique alors qu’elle s’effectue très difficilement à pH acide. L’hydrolyse de l’ADN que nous
proposons dans le paragraphe 3) est effectuée en milieu alcalin. L’équilibre devrait par conséquent
être rapide. Les proportions entre les configurations cis et trans des diols de thymidine citées ci-
dessus, devront être utilisées dans la calibration interne du signal, lorsqu’une mesure séparée des diols
trans et des diols cis sera effectuée.
Chapitre II : Mise au point de méthodes chromatographiques 101
6. Standards internes et droites de calibration
a) Standards internes
Le principe de l’utilisation de standards internes est le même que celui décrit lors de la
mesure des dérivés Fapy purines par CG-SM. Tous les standards isotopiques internes ont été obtenus
par synthèse chimique (246). Des isotopes tels que, 15N, 13C ou 18O, ont ainsi été incorporés à des
positions spécifiques qui sont rapportées dans le Tableau XII. Leur concentration est ensuite
déterminée par absorption ultra-violette ou par RMN (diols de thymidine).
Tableau XII : Position et nature des isotopes incorporés dans les molécules de standards internes
Lésions Standards isotopiques internes
8-OxodGuo [2-amino-1,3,7,9-15N5]8-oxodGuo
8-OxodAdo [6-amino-1,3,7,9-15N5]8-oxodAdo
5-HmdUrd [5-hydroxyméthyl-13C, 1,3-15N2]5-HmdUrd
5-OHdUrd [1,3-15N2, 2-13C]5-OHdUrd
5-FordUrd [5-formyl-13C, 1,3-15N2]5-FordUrd
Diols de thymidine [1,3-15N2, 2,5-méthyl-13C]diols de thymidine
FapyGua [2,6-diamino, 5-formamido-15N3]FapyGua
FapyAde [4,6-diamino-15N2, 5-formamido-13C]FapyAde
b) Droites de calibration
Pour chaque base modifiée étudiée, une droite de calibration, a été établie selon la stratégie
décrite dans le sous-paragraphe III-B-3)-b. La droite établie pour la 5-HmdUrd est donnée, à titre
d’exemple, dans la Figure 67.
2y = 0,70 x
R = 1
0
10
20
30
40
50
0 10 20 30 40 50
Rapport des aires A1/A2
Rapport des concentrations C1/C2
Figure 67 : Exemple de droite de calibration obtenue pour la 5-HmdUrd
Dans le Tableau XIII, on présente les gammes de quantités de produits utilisés pour établir les
courbes de calibration, ainsi que les coordonnées de la droite de régression linéaire obtenue pour
102 Chapitre II : Mise au point de méthodes chromatographiques
chaque base modifiée. Pour chaque base modifiée, deux picomoles de standard interne ont été
ajoutées.
Tableau XIII: Pente et ordonnée à l’origine des droites de calibration
Lésions Gamme de quantités
injectées (pmoles)
Pente de
la droite
Ordonnée àl’origine
8-OxodGuo 0,01-1000 1,270 0,026
8-OxodAdo 0,01-10 0,755 0,029
5-OHdUrd 0,01-10 1,300 0,000
5-FordUrd 0,01-100 0,780 0,000
5-HmdUrd 0,01-50 0,700 0,000
Diols de thymidine 0,01-50 0,518 0,000
FapyGua 0,1-100 1,628 0,000
FapyAde 0,1-100 0,806 0,095
V. CONCLUSION
Nous avons présenté dans ce chapitre les conditions d’utilisation des techniques
chromatographiques. Nous avons pour cela, au préalable optimisé la technique d’extraction de l’ADN
cellulaire afin de limiter les processus d’oxydation artéfactuelle qui surviennent au cours de cette
étape. Cette amélioration a permis d’améliorer la sensibilité de la technique de CLHP-DE pour la
mesure de la 8-oxodGuo. L’utilisation d’une hydrolyse à froid des nucléotides et le recours à une
étape de prépurification par CLHP a permis d’accéder à la mesure des dérivés Fapy purines dans
l’ADN cellulaire par la technique de CG-SM. Nous avons ensuite défini les conditions de séparation
et de détection de sept nucléosides de l’ADN par la technique de CLHP-SM. Dans tous les cas,
l’hydrolyse totale de l’ADN avant analyse a été vérifiée et les droites de calibration ont été établies
pour chaque composé à doser. La technique de CLHP-SM/SM a ainsi permis d’étendre les mesures au
sein d’un même échantillon aux diols de thymidine, à la 5-OHdUrd , à la 5-FordUrd, à la 5-HmdUrd,
à la 8-oxodAdo, à la 8-oxodGuo et à la dGuo.
Ces techniques ainsi optimisées ont été utilisées, dans le Chapitre III, dans le but d’estimer les
dommages induits dans l’ADN de monocytes exposés au rayonnement gamma du 60Co, à la lumière
UVA, au rayonnement UV LASER, ou encore photosensibilisés par le rose bengal ou l’acridine
orange.
- Chapitre III -
Mesure des dommages radio- et photo-induits
dans l’ADN cellulaire par des méthodes
chromatographiques
Chapitre III : Mesure des dommages radio- et photo-induits dans l’ADN cellulaire par des méthodes chromatographiques
104
IntroductionLa mise au point de techniques d’analyse chromatographiques présentée dans le chapitre II a
permis la mesure de dommages de bases induits dans l’ADN de monocytes exposés au rayonnement γ
du 60Co et au rayonnement UV LASER. Elles ont également été utilisées pour mesurer les taux de
formation de la 8-oxodGuo et des dérivés Fapy purines induits par des réactions de
photosensibilisation ou par la lumière UVA.
I. FORMATION DE DOMMAGES DE BASES DANS L’ADN DE MONOCYTESEXPOSES AU RAYONNEMENT γγγγ DU 60CO
A. Mesure par CLHP-DE du taux de formation de la 8-oxodGuoDes monocytes ont été exposés à une gamme de doses de rayonnement gamma du cobalt 60
comprises entre 0 et 80 Gy. Les résultats des mesures effectuées par CLHP-DE ont été présentés dans
le chapitre II (Figures 33). Ils sont rapportés ici (Figure 68).
y = 0,011x + 0,20
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
0 20 40 60 80Dose (Gy)
8-oxodGuo/106 bases
Figure 68 : Détermination par CLHP-DE du niveau basal et du taux de formation de la 8-oxodGuodans l’ADN de monocytes exposés au rayonnement γ du 60Co
B. Détermination par CG-SM du taux de formation des dérivésFapy purines
La mesure de la FapyGua et de la FapyAde dans l’ADN de monocytes exposés au
rayonnement γ du 60Co a été effectuée. Pour cela, les monocytes ont été exposés à des doses de
rayonnement comprises entre 0 et 1000 Gy. Le taux de formation du dérivé Fapy de la guanine est
déterminé en utilisant une droite de régression linéaire de pente 0,027 FapyGua/106 bases /Gy (Figure
69). Le niveau basal dans les cellules contrôle n’a pas été déterminé en raison du manque de
sensibilité de la méthode de détection. Toutefois, une extrapolation de la droite précédemment
105 Chapitre III : Mesure des dommages radio- et photo-induits dans l’ADN cellulaire par des méthodes chromatographiques
obtenue signale une valeur de 3,4 FapyGua/106 bases. Ce taux est voisin de la limite de sensibilité de
la méthode de mesure, estimée à environ 2 modifications pour 106 bases. Les mesures de la FapyAde
n’ont pas permis la détection de cette lésion entre 0 et 1000 Gy. La limite de détection est proche de 3
FapyAde/106 bases.
y = 0,027 x + 3,4
0
10
20
30
0 200 400 600 800 1000 Dose (Gy)
FapyGua/ 106 bases
Figure 69 : Formation de la FapyGua déterminée par CG-SM dans l’ADN de monocytes exposés aurayonnement γ du 60Co
C. Mesure par CLHP-SM/SM du taux de formation des dérivésFapy purines
La mesure des dérivés Fapy purines radio-induits a été effectuée par CLHP-SM/SM. Pour
cela, des monocytes ont été exposés à une gamme de doses de rayonnement gamma comprises entre 0
et 500 Gy. Le taux de FapyAde mesuré par la technique de CLHP-SM/SM est de 0,0024 FapyAde/106
bases/Gy. Le niveau basal mesuré est de 0,42/106 bases (Figure 70).
y = 0,0024 x + 0,42R2 = 0,9912
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
0 100 200 300 400 500
FapyAde /106 bases
Dose (Gy)
Figure 70 : Formation de la FapyAde déterminée par CLHP-SM/SM dans l’ADN de monocytesexposés au rayonnement γ du 60Co
Chapitre III : Mesure des dommages radio- et photo-induits dans l’ADN cellulaire par des méthodes chromatographiques
106
FapyGua/106 bases
y = 0,027 x + 9,2R2 = 0,941
05
10152025
0 100 200 300 400 500
Dose (Gy)
Figure 71 : Formation de la FapyGua par CLHP-SM/SM dans l’ADN de monocytes exposés aurayonnement γ du 60Co
Le taux de formation de 0,027 FapyGua/106 bases/Gy (Figure 71) est similaire à celui
déterminé par la méthode de CG-SM. Il n’est donné ici qu’à titre indicatif car le signal obtenu pour
cette modification est relativement médiocre, en dépit des efforts d’optimisation de cette détection.
Ceci explique sans doute l’incertitude élevée sur le niveau basal mesuré.
D. Mesure simultanée par CLHP-SM/SM du taux de formationdes diols de thymidine, de la 5-OHdUrd , de la 5-FordUrd, de la5-HmdUrd, de la 8-oxodAdo, de la 8-oxodGuo et de la dGuo
Les mesures ont été effectuées dans l’ADN de monocytes exposés au rayonnement gamma du
cobalt 60 à des doses comprises entre 0 et 450 Gy. Il n’a pas été possible de mesurer de façon
quantitative la 2’-désoxyguanosine dans les échantillons. En effet le nucléoside normal est présent en
quantités se situant hors du domaine de linéarité de la réponse du système de détection. Il a donc été
nécessaire pour chaque échantillon de quantifier l’ADN en parallèle en utilisant un système CLHP-
UV. Ceci est le cas pour toutes les mesures de dGuo par CLHP-SM/SM présentées dans la suite de ce
mémoire. De façon similaire, le taux de formation de la 5-OHdUrd, induit par une irradiation gamma,
LASER ou par un flux de particules de 12C6+ est inférieur à la limite de détection de la méthode. Il
n’est par conséquent pas rapporté dans la suite de ce chapitre.
1. Bases pyrimidiques modifiéesLa mesure de la 5-HmdUrd par CLHP-SM/SM donne un taux de formation par Gy de 0,029
lésion/106 bases pour un niveau basal proche de 0,9/106 bases (Figure 72).
107 Chapitre III : Mesure des dommages radio- et photo-induits dans l’ADN cellulaire par des méthodes chromatographiques
5-HmdUrd/10 6 bases
R
y = 0,029 x + 0,92 = 0,925
0
10
20
30
0 200 400 500
Dose (Gy)
300100
Figure 72 : Formation de la 5-HmdUrd, déterminée par CLHP-SM/SM, dans l’ADN de monocytesexposés au rayonnement gamma du 60Co
Le taux de formation des diols de thymidine a été estimé à 0,097 lésion/106 bases/Gy. Cette
valeur correspond à l’ensemble des 4 diastéréoisomères trans et cis. Le niveau basal est de 0,8
diol/106 bases (Figure 73).
Diols de thymidine/10 6 bases
y = 0,097 x + 0,8R2 = 0,9868
0
10
20
30
40
50
0 100 200 300 400 500
Dose (Gy)
Figure 73 : Détermination par CLHP-SM/SM de la formation des diols de thymidine, dans l’ADN demonocytes exposés au rayonnement gamma du 60Co
Chapitre III : Mesure des dommages radio- et photo-induits dans l’ADN cellulaire par des méthodes chromatographiques
108
5-FordUrd/10 6 bases
y = 0,022 x + 0,32R = 0,9661
0,0
5,0
10,0
0 200 400
Dose (Gy)
100 300 500
Figure 74 : Mesure de la 5-FordUrd par CLHP-SM/SM, dans l’ADN de monocytes exposés aurayonnement gamma du 60Co
La formation de la 5-FordUrd est de 0,022 lésion/106 bases/Gy, pour un niveau basal de 0,3 5-
FordUrd/106 bases (Figure 74).
2. Bases puriques modifiées
8-oxodGuo/106 bases20 y = 0,020 x + 0,4
R2 = 0,9751
0
5
10
15
0 200 400 500Dose (Gy)
100 300
Figure 75 : Formation de la 8-oxodGuo, déterminée par CLHP-SM/SM, dans l’ADN de monocytesexposés au rayonnement gamma du 60Co
La formation de la 8-oxodGuo et de la 8-oxodAdo est respectivement de 0,020 et 0,0035
lésion/106 bases/Gy pour des niveaux basaux respectivement de 0,4 et 0,1 lésion/106 bases (Figures 75
et 76). Il faut remarquer que le taux de 8-oxodGuo est sensiblement identique à celui déterminé par
CLHP-DE. Le niveau basal est en revanche environ 3 fois plus élevé.
109 Chapitre III : Mesure des dommages radio- et photo-induits dans l’ADN cellulaire par des méthodes chromatographiques
8-oxodAdo/106 bases
y = 0,0035 x + 0,12R = 0,8493
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
0 200 400 500Dose (Gy)
300100
Figure 76 : Mesure de la 8-oxodAdo par CLHP-SM/SM, dans l’ADN de monocytes exposés aurayonnement gamma du 60Co
II. IONISATION DE L’ADN CELLULAIRE PAR DES IMPULSIONS UV LASER
Afin d’étudier la contribution des réactions d’ionisation dans la formation radio-induite des
dommages de bases de l’ADN, de monocytes ont été exposés à un rayonnement LASER UV de haute
intensité de longueur d’onde égale à 266 nm. La particularité de ce système d’irradiation tient à la
longueur d’onde des radiations émises et au nombre de photons émis par unité de temps, i.e. à
l’intensité du faisceau. Les photons de 266 nm sont presque exclusivement absorbées par les bases de
l’ADN. De plus, l’intensité de la source est suffisamment élevée pour que deux photons puissent, dans
un laps de temps très court (≈ 5 nanosecondes) interagir avec une même molécule cible. Dans ce cas,
le premier photon émis va amener la molécule dans un état excité singulet d’une durée de vie voisine
d’une picoseconde qui se transforme par une réaction de croisement inter-système en un état excité
triplet de durée de vie plus longue. Si un deuxième photon, interagit alors à nouveau avec la molécule
dans son état excité triplet, un niveau d’excitation global d’au moins 7 eV peut être atteint. Dans ces
conditions, la molécule peut être ionisée.
Les cellules ont été exposées à des doses de rayonnement comprises entre 0 et 500
mJ/échantillon. Chaque échantillon contient environ 20 millions de cellules (≈ 250 µg d’ADN, soit 5
unités densité optique d’ADN) en suspension dans du tampon PBS.
Chapitre III : Mesure des dommages radio- et photo-induits dans l’ADN cellulaire par des méthodes chromatographiques
110
A. Mesure par CLHP-DE du taux de formation de la 8-oxodGuo
y = 1,2 x + 0,32R = 0,9968
0
200
400
600
0 100 200 300 400 500
8-oxodGuo/106 bases
Dose (mJ)
Figure 77 : Détermination par CLHP-DE, du niveau de 8-oxodGuo, dans l’ADN de monocytes
exposés à des impulsions LASER UV (266 nm) de haute intensité
Le taux de 8-oxodGuo/106 bases induit dans l’ADN cellulaire par mJ d’irradiation LASER est
de 1,2. Le niveau basal est de 0,3 8-oxodGuo/106 bases (Figure 77).
B. Mesure simultanée par CLHP-SM/SM du taux de formationdes diols de thymidine, de la 5-OHdUrd , de la 5-FordUrd, de la5-HmdUrd, de la 8-oxodAdo, de la 8-oxodGuo et de la dGuo
1. Mesure des bases pyrimidiques modifiées
5-HmdUrd/106 bases
y = 0,060 x + 0,42R = 0,9914
0
10
20
30
40
50
0 200 400 600Dose (mJ)
Figure 78 : Formation de la 5-HmdUrd, déterminée par CLHP-SM/SM, dans l’ADN de monocytes
exposés à des impulsions LASER UV (266 nm) de haute intensité
Le taux de formation de la 5-HmdUrd mesuré par CLHP-SM/SM est de 0,060 lésion/106
bases/mJ pour un niveau basal de 0,4 5-HmdUrd/106 bases (Figure 78).
111 Chapitre III : Mesure des dommages radio- et photo-induits dans l’ADN cellulaire par des méthodes chromatographiques
5-FordUrd/106 bases
y = 0,017 x
R2 = 0,9882
0
10
20
0 200 400 600Dose (mJ)
Figure 79 : Mesure de la 5-FordUrd par CLHP-SM/SM, dans l’ADN de monocytes exposés à des
impulsions LASER UV (266 nm) de haute intensité
Le taux de formation de la 5-FordUrd mesuré par CLHP-SM/SM est de 0,017 lésion/106
bases/mJ. Le niveau basal est inférieur à la limite de détection proche de 0,1 lésion/106 bases (Figure
79).
Diols de thymidine /10
y = 0,17 x + 0,5R2 = 0,9769
0
20
40
60
80
100
0 200 400 600
Dose (mJ)
6 bases
Figure 80 : Formation des diols de thymidine, déterminée par CLHP-SM/SM, dans l’ADN de
monocytes exposés à des impulsions LASER UV (266 nm) de haute intensité
Le taux de formation de l’ensemble des 4 diols de thymidine mesuré par CLHP-SM/SM est de
0,17 lésion/106 bases/mJ pour un niveau basal de 0,5 lésion/106 bases (Figure 80).
2. Mesures de bases puriques modifiéesLa formation de 8-oxodGuo par mJ de rayonnement reçu est de 1,29 lésions/106 bases. Le
niveau basal est de 0,6 lésion/106 bases (Figure 81).
Chapitre III : Mesure des dommages radio- et photo-induits dans l’ADN cellulaire par des méthodes chromatographiques
112
8-oxodGuo/106 bases
y = 1,29 x + 0,6
R 2 = 0,9941
0
200
400
600
800
1000
0 200 400 600
Dose (mJ)
Figure 81 : Formation de la 8-oxodGuo, déterminée par CLHP-SM/SM, dans l’ADN de monocytes
exposés à des impulsions LASER UV (266 nm) de haute intensité
8-oxodAdo/106 bases
y = 0,017 x + 0,1
R2 = 0,9891
0
5
10
15
0 200 400 600
Dose (mJ)
Figure 82 : Mesure de la 8-oxodAdo, par CLHP-SM/SM, dans l’ADN de monocytes exposés aurayonnement LASER à ionisation bi-photonique (266 nm)
La formation de 8-oxodAdo par mJ de rayonnement reçu est de 0,017 lésion/106 bases. Le
niveau basal obtenue par extrapolation est de 0,1 lésion/106 bases (Figure 82).
C. Expression du rendement quantiqueIl est possible, à partir du nombre de photons absorbés et du taux de modification observé
pour une base donnée de calculer le rendement quantique de formation des lésions.
1. Paramètres d’irradiation
L’énergie délivrée par une impulsion LASER, εp, est comprise entre 18 et 20 mJ.
L’énergie totale d’irradiation, εt s’exprime à l’aide de la relation suivante :
εt = nombre d’impulsions (N) εp
La dose par impulsion est Ep avec Ep étant égale à :
113 Chapitre III : Mesure des dommages radio- et photo-induits dans l’ADN cellulaire par des méthodes chromatographiques
Ep =εp
Sp
où Sp est la surface du faisceau en l’occurrence 0,125 cm2. Ep est donc égal à :
Ep =18
0,125= 0,15 J/cm2
La dose totale est égale au produit N Ep.
L’intensité par impulsion I est égale à :
I =Ep
τp
= 0,15
5 10−9= 30 106 w/cm2
où τp est la durée d’une impulsion (5 nanosecondes)
Le nombre de photons Nph s’exprime selon la relation suivante :
Nph =ε [J](266 nm)
hν= 1,34 1018 ε [J]
Si εt = 0,5 J (pour 250 µg d’ADN), Nphtot = 0,5 1,34 1018 = 6,7 1017 photons. La D.O. étant égale à
5, on peut considérer en première approximation, que tous les photons sont absorbés uniquement par
l’ADN cellulaire.
2. Calcul du rendement quantiqueLe calcul du rendement quantique, Q relatif à la 8-oxodGuo s’exprime à l’aide de la relation
suivante:
=Qnombre de 8-oxodGuo forméesnombre de photons absorbés
Or, N8-oxodGuo = 795/106 bases (pour 500 mJ/échantillon) ce qui représente pour 20 106
cellules/échantillons un nombre de 8-oxodGuo égal à 12000 20 106 cellules (sur la base de 12 109
bases/cellules). On peut alors calculer Q :
Q = 12 000 20 106 795
6,7 1017=
3 10-4
Chapitre III : Mesure des dommages radio- et photo-induits dans l’ADN cellulaire par des méthodes chromatographiques
114
III. FORMATION DES DOMMAGES DE BASES DANS L’ADN DE MONOCYTESEXPOSES AU RAYONNEMENT UVA
A. Mesure par CLHP-DE du taux de formation de la 8-oxodGuoLe taux de formation de la 8-oxodGuo a été mesuré dans l’ADN de monocytes exposés au
rayonnement UVA (λmax 372 nm) pour des doses comprises entre 0 et 800 kJ.m-2.
y = 0,00098 x + 0,15
0,0
0,4
0,8
1,2
0 200 400 600 800 1000
-2Dose (kJ.m )
68-oxodGuo/10 bases
Figure 83 : Détermination par CLHP-DE, du niveau de 8-oxodGuo, dans l’ADN de monocytesexposés au rayonnement UVA
Le niveau basal de 8-oxodGuo qui est estimé à 0,15 résidu/106 bases est proche de celui
mesuré précédemment dans le cas de l’irradiation gamma ou UV LASER. Le taux de formation de la
8-oxodGuo est de 9,8 10-4 lésion/106 bases/kJ.m-2 (Figure 83).
B. Mesure par CG-SM du taux de formation des dérivés Fapypurines
Nous n’avons pas été en mesure de mettre en évidence la formation de dérivés Fapy purines
par la technique de CG-SM dans la gamme de doses (0-800 kJ.m-2). Il est vraisemblable que cela est
dû au fait que ces modifications ne se forment pas, où du moins à un taux tel qu’elles ne sont pas
détectées par CG-SM.
IV. FORMATION DES DOMMAGES DE BASES DANS L’ADN DE MONOCYTESPHOTOSENSIBILISES
Deux photosensibilisateurs exogènes ont été utilisés : l’acridine orange et le rose bengal. Les
cellules ont été mises en contact avec ces agents pendant quelques minutes, puis rincées avec du
tampon PBS avant d’être exposées à la lumière visible. La structure ainsi que quelques
caractéristiques de ces photosensibilisateurs sont données ci-après (Figure 84).
115 Chapitre III : Mesure des dommages radio- et photo-induits dans l’ADN cellulaire par des méthodes chromatographiques
N(CH3)2N N(CH3)2+
H
M molaire : 301,8 g.mol-1
λλλλmax : 492 nmεεεε : 28100 l. cm-1. mol -1
Acridine orange
Cl
O OII
-O
I ICOO-
Cl
Cl
Cl
M molaire : 1017,6 g.mol-1
λλλλmax : 548 nmεεεε : 82000 l. cm-1. mol-1
Rose bengal
Figure 84 : Structures de l’acridine orange et du rose bengal
Ces deux agents possèdent un maximum d’absorption dans le domaine visible (λmax = 492 ou
548 nm) et peuvent donner lieu à des réactions de photosensibilisation.
A. Détermination par CLHP-DE du taux de formation de la 8-oxodGuo
1. Photosensibilisation par le rose bengal (10-2 D.O.) et par l’acridineorange (5 10-3 D.O.)
L’incubation de monocytes avec des solutions d’acridine orange et de rose bengal, utilisés,respectivement, à une densité optique de 5 10-3 et 10-2 D.O., suivie d’une exposition à la lumièrevisible, entraîne la formation de 8-oxodGuo dans l’ADN de ces cellules. Les taux de formation,linéaires en fonction du temps d’irradiation avec la lumière visible (en min), sont respectivement de0,097 et 0,054 8-oxodGuo/106 bases/min, pour des niveaux basaux de 0,2 et 0,05 lésion/106 bases(Figure 85).
y = 0,097 x + 0,20
y = 0,054 x + 0,05
0
1
2
3
4
0 10 20 30 40Durée d'exposition (min)
rose bengal
acridine orange
68-oxodGuo/10 bases
Figure 85 : Mesure du taux de 8-oxodGuo par CLHP-DE dans l’ADN de monocytes photosensibiliséspar 510-3 D.O. d’acridine orange ou par 10-2 D.O. de rose bengal
Chapitre III : Mesure des dommages radio- et photo-induits dans l’ADN cellulaire par des méthodes chromatographiques
116
2. Photosensibilisation par le rose bengal et par l’acridine orange (1D.O.)
Les taux de formation de 8-oxodGuo induits par l’acridine orange et le rose bengal, utilisés à
une concentration, respectivement 200 et 100 fois supérieure à celle des expériences précédentes, sont
de 3,93 et 1,88 8-oxodGuo/106 bases/ min. Le niveau basal est de 0,18 8-oxodGuo/106 bases (Figure
86).
Durée d'exposition (min)
0 10 20 300
40
80
120
160
y = 3,93 x + 0,18
y = 1,88 x + 0,18
acridine orange
rose bengal
68-oxodGuo/10 bases
Figure 86 : Mesure de la 8-oxodGuo par CLHP-DE dans l’ADN de monocytes photosensibilisés par 1D.O. de rose bengal ou d’acridine orange
B. Mesure du taux de formation des dérivés Fapy purines par CG-SM
y = 0,90 x + 2,4
6
0
10
20
30
40
50
0 10 20 30Durée d'exposition (min)
FapyGua/10 basesacridine orange
rose bengaly = 0,66 x + 2,4
Figure 87 : Formation de la FapyGua déterminée par CG-SM dans l’ADN de monocytesphotosensibilisés
117 Chapitre III : Mesure des dommages radio- et photo-induits dans l’ADN cellulaire par des méthodes chromatographiques
La formation de dérivés Fapy purines n’a pas été détectée dans l’ADN de monocytesphotosensibilisés par l’acridine orange ou par le rose bengal, pour des densités optiques,respectivement de 5 10-3 D.O. et 10-2 D.O.. Lorsque les photosensibilisateurs ont été utilisés à unedensité optique de 1, la formation de FapyGua a été mise en évidence avec des taux respectivementpour l’acridine orange et le rose bengal, de 0,90 et de 0,66 FapyGua/106 bases/min (Figure 87). Leniveau basal n’a pas pu être mesuré. Cependant, par extrapolation, une valeur de 2,4 FapyGua/106
bases est obtenue. Elle semble cohérente avec la valeur estimée dans le cas de l’irradiation gamma. Letaux du dérivé Fapy de l’adénine est inférieur à la limite de détection.
V. DISCUSSION DES RESULTATS
Nous avons effectué la mesure de plusieurs bases puriques et pyrimidiques modifiées aprèsirradiation gamma, exposition à la lumière UVA où à des impulsions UV LASER, ou enfin, après desréactions de photosensibilisation par le rose bengal ou l’acridine orange. Parmi les différentesmodifications de bases, nous discuterons plus en détail de la mesure de la 8-oxodGuo qui, comme celaa été mentionné dans la partie introductive à ce mémoire, revêt une importance toute particulière.
A. Mécanismes de formation de la 8-oxodGuoNous rappelons tout d’abord les principaux mécanismes conduisant à la formation de 8-
oxodGuo à partir de dGuo (38).
NH
NN
N
O
H NH2
HN
N N
N°O
OHH
HH2N
Oxydation Réduction
HN
N N
N
O
HH2N
+°
+H2O/-H+
(ADN)
(-e-)Guanine
radical neutreréducteur
cation radical
°OH
°OH
HN
N NH
N
O
H2NOH
°
N
N NH
N
O°
H2N
radical neutreoxydant
- H+
- H2O
N
NO NH2
H2N
H2O
O2
O
NO
H2N
NH2
NH2 oxazolone
imidazolone
2,6-diamino-4-hydroxy-5-formamidopyrimidine (FapyGua)
HHN
N NH2
N
O
O
HH2N
HHN
N N
N
O
O
HH2N
8-oxo-7,8-dihydroguanine(8-oxoGua)
Figure 88 : Schéma d’oxydation de la guanine
Chapitre III : Mesure des dommages radio- et photo-induits dans l’ADN cellulaire par des méthodes chromatographiques
118
Le premier implique l’arrachement d’un électron de la guanine et la formation d’un cation
radical (réaction de type I, ou effet direct du rayonnement ionisant). Le radical ainsi formé peut
s’hydrater dans l’ADN natif pour générer un radical neutre intermédiaire ou peut perdre un proton
pour pour donner naissance à un radical neutre oxydant. Le radical 8-hydroxy-7,8-dihydroguan-7-yle
produit par la réaction d’hydratation pourra être oxydé ou réduit pour conduire respectivement à la
formation de la 8-oxoGua et de FapyGua. D’autre part, le radical oxydant formé par déprotonation du
cation radical de la guanine est le précurseur de l’oxazolone (Figure 88).
La 8-oxoGua peut aussi être formée par addition du radical hydroxyle en position 8 de la
guanine qui se traduit par la formation du radical 8-hydroxy-7,8-dihydroguan-7-yle précédemment cité
(Figure 88). Enfin, le dernier mécanisme de formation commun est celui qui met en jeu l’oxygène
singulet (102, 103). L’oxygène singulet produit au cours de réaction de photosensibilisation peut
conduire à la formation soit de la 4-hydroxy-8-oxo-4,8-dihydroguanine, soit de la 8-oxodGuo. Seule
cette dernière modification a été identifiée dans l’ADN double brin (Figure 89).
NH
NN
N
O
NH2HO O
OH
2'-désoxyguanosine
NH
NN
N
O
ONH2OH
HO O
OH4-hydroxy-8-oxo-4,8-dihydro-2'-désoxyguanosine (dans le nucléoside seulement)
8-oxo-7,8-dihydro-2'-désoxyguanosine
NH
NN
HN
O
ONH2HO O
OH
1O2
Figure 89 : Modifications générées par réaction de l’oxygène singulet avec la guanine
B. Discussion des aspects méthodologiques
1. L’extraction de l’ADN cellulaireDans toutes les techniques de mesure directe des dommages, l’expérimentateur se trouve
confronté à deux difficultés. D’une part il doit disposer de méthodes suffisamment sensibles pour
mesurer 1 modification pour 106 ou 107 bases normales. D’autre part il doit s’assurer que le dommage
mesuré n’est pas le reflet de phénomènes d’oxydation parasites susceptibles de se produire au cours
des différentes étapes de préparation des échantillons. En effet, les niveaux de modifications sont très
faibles et de ce fait, peuvent être facilement accrus de façon artificielle.
119 Chapitre III : Mesure des dommages radio- et photo-induits dans l’ADN cellulaire par des méthodes chromatographiques
Ces observations justifient souvent l’utilisation de doses d’irradiation élevées pour mettre en
évidence un taux de formation significatif par rapport au niveau basal présent dans les cellules. Plus
ce niveau ou « bruit de fond » est élevé et plus la dose d’irradiation doit être élevée pour induire une
augmentation significative du niveau de la lésion. La valeur du niveau basal est l’objet de nombreux
débats dans la communauté scientifique puisqu’elle est devenue un des critères de la qualité de la
mesure. Il faut faire la part entre le niveau basal présumé dans l’ADN de la cellule et le niveau mesuré
qui peut être en partie induit par la méthode utilisée. Deux sources d’oxydation ont été mises en
évidence. La première se situe lors de l’étape d’extraction de l’ADN cellulaire. La deuxième est
rencontrée lors des analyses par CG-SM et sera abordée dans le paragraphe suivant. Nous avons
observé en comparant trois techniques d’extraction que le niveau basal de 8-oxodGuo présent dans les
cellules pouvait varier d’un facteur 10 selon la méthode d’extraction utilisée. Un niveau basal de 0,2
8-oxodGuo/106 bases normales a été déterminé par la méthode chaotropique au NaI. Ces résultats sont
en accord avec les travaux d’Helbock et al. (1998). La méthode d’extraction au phénol qui était la
technique la plus couramment utilisée a perdu de son intérêt lorsque plusieurs travaux ont montré
qu’elle pouvait conduire à une oxydation artificielle de l’ADN. Ainsi, on peut citer les résultats de
Claycamp et al., qui ont montré qu’une extraction de l’ADN par le phénol pouvait favoriser
l’oxydation photosensibilisée de l’ADN en présence d’oxygène (247). Même maintenu à -20 °C,
l’ADN extrait peut subir des phénomènes d’oxydation (247). La sensibilisation par le phénol peut
s’expliquer par la présence de composés dans la solution, qui s’intercalent dans la double hélice
d’ADN en jouant le rôle de photosensibilisateurs, ou qui réagissent avec dGuo en présence
d’oxygène. Une dernière possibilité est que le phénol favorise l’apparition de sites de coordination
Fe(II) ou Fe (III). On peut ajouter que la resolubilisation de l’ADN extrait dans des solutions tampons
désaérées s’accompagne d’une réduction du niveau de 8-oxodGuo par un facteur 4, soulignant ainsi
indirectement le rôle de l’oxygène dans l’oxydation artéfactuelle de l’ADN. Toutefois, Harris et al.
ont montré que le niveau de 8-oxodGuo n’était pas accru par l’utilisation de phénol fraîchement
distillé lorsque l’extraction était effectuée en absence d'oxygène (248). Finnegan et al. ont montré que
la technique basée sur l’utilisation de phénol donnait un niveau basal 10 à 20 fois supérieur à celui
déterminé par la méthode à la pronase E (249). Cet effet prooxydant était amplifié lorsque les cellules
étaient irradiées puisqu’aucune augmentation du niveau de 8-oxodGuo à 200 Gy n’était détectée dans
l’ADN extrait par la technique à la pronase alors que la méthode au phénol donnait un taux de 42 8-
oxodGuo/106 bases. Toutefois, au cours de ces travaux, l’ADN a été séché en présence d’air avant
d’être hydrolysé. Les taux obtenus sont bien supérieurs à ceux mesurés habituellement en absence
d’air, si bien qu’il est difficile de tirer des conclusions quant à l’efficacité de l’une ou l’autre des 2
méthodes. De plus les travaux de Nakajima et al. ont montré que ce n’était pas l’air seul qui pouvait
expliquer l’oxydation de l’ADN, mais en fait la présence simultanée d’impuretés (qui peuvent
Chapitre III : Mesure des dommages radio- et photo-induits dans l’ADN cellulaire par des méthodes chromatographiques
120
être apportées par exemple par le phénol) et d’oxygène (250). Il semble cependant que les résultats
que nous avons obtenus dans le cas de cellules exposées au rayonnement gamma du 60Co, soient aussi
affectés par une oxydation artificielle plus importante que dans l’ADN cellulaire utilisé comme
contrôle. En effet, la réduction du bruit de fond liée à l’utilisation de la méthode au NaI s’accompagne
d’un changement de pente de la courbe dose-réponse obtenue. De 0,011 8-oxodGuo/106 bases/Gy (par
CLHP-DE), une valeur de 0,015 8-oxodGuo/106 bases/Gy est alors mesurée (par CLHP-DE). Une des
raisons possibles de ce phénomène serait soit une extraction préférentielle de l’ADN endommagé
(249), soit une libération de fer par l’irradiation. Une comparaison a été établie entre six méthodes
d’extraction par Helbock et al. (209). Deux de ces dernières reposaient sur l’utilisation de la pronase,
une sur une extraction au phénol et enfin les trois autres faisaient appel à des variantes de la méthode
chaotropique au NaI. Leurs travaux ont montré que la méthode chaotropique au NaI permettait
d’obtenir le niveau basal de 8-oxodGuo le plus faible. Pour cela, la déféroxamine a été ajoutée dans
toutes les solutions tampons. De plus, les quantités d’enzymes et les temps d’incubation ont été
optimisés. Les auteurs ont aussi montré qu’une étape additionnelle d’extraction au phénol augmentait
le taux de 8-oxodGuo (de 0,1 à 0,6 8-oxodGuo/106 bases). L’effet de la déféroxamine semble indiquer
l’implication des métaux de transition dans les phénomènes d’oxydation de l’ADN. Il faut ajouter que
le niveau basal de 8-oxodGuo est d’autant plus élevé que la quantité d’ADN extraite est faible (< 20
µg).
2. La méthode d’analyse par CG-SMD’importantes différences existent entre les valeurs de niveau basal de 8-oxodGuo mesuré
dans l’ADN extrait de cellules ou de tissus (161) selon les méthodes d’analyse utilisées. Nous avons
rapporté dans le Tableau XIV quelques résultats tirés de la littérature.
121 Chapitre III : Mesure des dommages radio- et photo-induits dans l’ADN cellulaire par des méthodes chromatographiques
Tableau XIV : Niveau basal de 8-oxodGuo mesuré dans l’ADN cellulaire
Techniques 8-OxodGuo /106bases Cellules ou tissus Références
CG-SM 330 cellule de cancer du sein (239)
115 épithéliales bronchiques (251)
20 lymphoblastes (252)
CLHP-DE 8 leucocytes (149)
0,4 lymphocytes (253)
2,5 leucocytes (254)
0,1 foie (209)
0,4 monocytes (**)
0,2 monocytes (*)
Postmarquage 16 leucocytes (172)
66 foie (174)
(*) : étude présente mettant en œuvre la technique de CLHP-DE,
(**) : étude présente mettant en œuvre la technique de CLHP-SM/SM.
La seule technique d’extraction de l’ADN cellulaire ne suffit pas à expliquer les écarts
observés. En effet, des méthodes relativement proches peuvent aboutir à des taux très différents selon
que la méthode de mesure par CG-SM ou par CLHP-DE est utilisée. Cette dernière donne
actuellement les résultats les plus cohérents. En particulier, nous verrons dans le chapitre V qu’elle est
en accord avec les approches indirectes. Ces dernières sont moins sujettes aux artefacts liés à des
phénomènes d’oxydation. Dès 1995, des travaux ont mis en évidence la surestimation des taux de 8-
oxodGuo déterminés par la méthode CG-SM (164, 166). Les valeurs surestimées de 8-oxodGuo
s’expliquent par des phénomènes d’oxydation qui surviennent au cours de l’étape de silylation à
130°C des échantillons. Il a ainsi été montré qu’au cours de cette étape de dérivation, les bases
normales étaient partiellement oxydées. (166). Pour éviter cette oxydation artéfactuelle, deux
approches peuvent être adoptées. La première implique une étape de prépurification par CLHP (163)
ou par chromatographie d’immunoaffinité (38, 255) qui permet d’éliminer les bases normales avant
dérivation. Dans ces conditions, il n’y a plus de possibilités d’oxydation artéfactuelle en raison de
l’élimination du précurseur de la lésion à mesurer. Il est aussi important d’utiliser des standards
internes enrichis isotopiquement pour tenir compte de la perte partielle de matériel au cours des
différentes étapes (prépurification, silylation et analyse par CG-SM). L’utilisation de guanase pour
Chapitre III : Mesure des dommages radio- et photo-induits dans l’ADN cellulaire par des méthodes chromatographiques
122
éliminer la guanine a également été décrite (256). Une autre approche consiste à abaisser la
température de dérivation en absence d’oxygène (164) avec l’ajout d’un agent réducteur,
l’éthanethiol (256, 257). Toutefois, la validation des deux dernières méthodes n’a pas encore été
effectuée et les valeurs publiées de 8-oxodGuo, en utilisant ces nouvelles versions sont élevées. La
plupart des travaux reposant sur l’utilisation de la méthode CG-SM sous sa forme originale (258) sont
remis en question (163, 165). On peut remarquer à la lecture du Tableau XV, la grande dispersion
des résultats obtenus pour la mesure d’autres bases modifiées par la méthode CG-SM.
Tableau XV : Niveau basal de différentes lésions mesurées par CG-SM dans l’ADN de cellules (pour
106 bases)
FapyGua FapyAde 8-OxoAde 5-OHdUrd 5-HmdUrd 5-FordUrd Tg Références
109 156 15,6 7 81,7 (218)
55 24 133 12 14 (152)
120,9 16,4 (151)
28,9 65 4,7 36 14,4 (153)
25,6 32,6 29,8 3,8 7,7 16,3 (219)
32 16 30 8 (236)
3,4 0,7 0,1 ≈< 0,5 0,9 0,3 0,8 (*)
(*) : étude présente mettant en œuvre les techniques de CLHP/CG-SM et de CLHP-SM/SM.
Un autre biais méthodologique est lié à l’utilisation d’acide formique à chaud pour hydrolyser
l’ADN. Plusieurs travaux ont montré que son utilisation pouvait altérer la stabilité de certains
composés (224). Il faut s’assurer que les composés sont stables dans les conditions d’hydrolyse. C’est
le cas de la 8-oxo-7,8-dihydroguanine et de la 8-oxo-7,8-dihydroadénine qui sont stables dans l’acide
formique concentré porté à 140°C pendant 40 min (219, 224, 225). Au contraire, d’autres lésions,
comme la FapyGua et la FapyAde sont instables, donnant lieu à des réactions de recyclisation (226).
Ainsi, un traitement à 150°C pendant 60 min à l’acide formique (88%) entraîne la disparition de 90%
de la FapyGua. On peut ajouter que dans ces conditions, 80% de la 5-OH-5-Me-Hyd, un produit
d’oxydation de la thymine, sont dégradés. Les produits de modification de la cytosine peuvent subir
une désamination qui conduit à la formation des produits correspondants de l’uracile (227).
L’importance de la dégradation de certains composés dépendra de la nature de l’acide (formique le
plus souvent), du temps d’hydrolyse (30 à 45 min) de la température (140°C) (224). Une hydrolyse à
température ambiante est en général compatible avec l’instabilité de la plupart des bases modifiées
123 Chapitre III : Mesure des dommages radio- et photo-induits dans l’ADN cellulaire par des méthodes chromatographiques
(219, 228). Toutefois, dans ces conditions, les bases normales et la plupart des bases modifiées à
l’exception de quelques unes (les dérivés Fapy purines) ne sont pas hydrolysées. La nature et la
proportion des bases affectées par le traitement à chaud à l’acide formique dépendent de sa
concentration et de la température d’hydrolyse. L’instabilité de la liaison N-glycosidique des dérivés
Fapy purines est augmentée après libération de ces composés sous forme de nucléotides. Pour
permettre une hydrolyse plus rapide et plus complète, la méthode d’hydrolyse à froid consécutive à
une digestion de l’ADN en nucléotide par la nucléase P1 a été proposée pour les dérivés Fapy purines
dont la liaison N-glycosidique est particulièrement instable (228). Nous avons, en utilisant cette
nouvelle approche, mesuré un taux de FapyGua dans l’ADN de cellules exposées au rayonnement du60Co de l’ordre de 0,027 FapyGua/106 bases/Gy. La méthode de mesure de la FapyAde par CLHP-
SM/SM a donné un taux de formation de 0,0024 FapyAde/106 bases/ Gy. Cependant, il nous a été
impossible de mesurer par la méthode de CG-SM, le niveau basal de FapyGua et de FapyAde dans
l’ADN de cellules non irradiées. Le niveau basal des dérivés Fapy purines mesuré par CLHP-SM/SM
est, respectivement de 9,6 et de 0,4/106 bases. La formation de la FapyGua est environ deux fois
supérieure à celle de la 8-oxodGuo. Ceci semblerait indiquer, compte tenu du mécanisme de
formation de ces lésions décrit dans la Figure 88, que le milieu cellulaire est plutôt réducteur, ou que
l’accessibilité de l’oxygène à la molécule d’ADN est difficile. Le niveau basal de FapyGua est
supérieur à celui de la 8-oxodGuo. Une des raisons possibles, est que ce taux corresponde au bruit de
fond cellulaire. Toutefois, cette hypothèse est peu probable puisque la 8-oxodGuo et la FapyGua son
des lésions réparées toutes deux par la même ADN N-glycosylase. Une autre possibilité est que le
protocole d’extraction ou d’analyse, optimisé pour réduire l’artefact lié à l’oxydation de la guanine en
8-oxo-7,8-dihydroguanine ne protège pas d’un éventuel artefact conduisant à la formation de dérivé
Fapy de la guanine. Nous avons mis en évidence cet artefact en étudiant l’influence de la
déféroxamine sur le niveau des dérivés Fapy purines mesurés par CLHP-SM/SM.
C. Discussion des taux de formation des lésions
1. Irradiation gamma : 8-OxodGuo, lésion majoritaire ?Les mesures de bases modifiées dans l’ADN de cellules exposées au rayonnement gamma du
cobalt 60 indiquent que les 4 bases de l’ADN sont susceptibles d’être modifiées. Les valeurs des taux
de modification mesurés pour les bases sont comprises entre 0,1 et 10 modifications pour 108 bases
normales, par Gy, données qui concernent la 8-oxodAdo et les diols de thymidine, respectivement.
a) Bases puriques
Les taux de formation des différentes bases puriques modifiées déterminés, respectivement
par CLHP-SM/SM et par CG-SM, sont en désaccord avec la quasi-totalité des résultats des travaux
effectués jusqu’à présent (Tableau XVI) (218, 219, 235). Les nouvelles méthodes qui ont été mises
Chapitre III : Mesure des dommages radio- et photo-induits dans l’ADN cellulaire par des méthodes chromatographiques
124
en œuvre permettent, au moins en partie, de s’affranchir des problèmes d’oxydation rencontrés
préalablement au cours de la silylation ou de l’hydrolyse acide inhérents à la technique de CG-SM. Il
est intéressant de constater que la dégradation de l’adénine semble mineure puisque ses deux
principaux produits de dégradation, la FapyAde et la 8-oxodAdo sont formés en quantités très faibles,
comparativement à leurs homologues de la guanine. Des observations similaires ont été effectuées sur
l’ADN isolé, montrant des taux de formation de 8-oxoAde et de FapyAde environ dix fois plus faibles
que ceux de 8-oxoGua et de FapyGua.
Tableau XVI : Formation de bases modifiées dans l’ADN de cellules exposées au rayonnementgamma
Taux de formation/106 bases/Gy
FapyGua FapyAde 8-OxoAde Tg 5-FordUrd 5-HmdUrd 8-OxodGuo Références
0,11 0,04 0,011 0,0095 0,036 (153)
0,8 0,16 0,06 0,2 0,05 0,40 (219)
28S 0,32S
0,32R
1,12
0,48
0,16
0,10
0,32S
0,048R
(236)
0,027 0,0024 0,0035 0,097 0,022 0,029 0,020 (*)
S : lignée radiosensible,
R : lignée radiorésistante,
(*) : étude présente mettant en œuvre les techniques de CG-SM et de CLHP-SM/SM.
La mesure de 8-oxodGuo par CLHP-DE ou par CLHP-SM/SM donne sensiblement le même
taux de formation : respectivement 0,015 et 0,020 8-oxodGuo/106 bases/Gy, dans la même gamme de
doses considérée. Toutefois, le niveau basal de 8-oxodGuo mesuré par CLHP-SM/SM est environ 2 à
3 fois plus élevé que celui déterminé par CLHP-DE. Nous ne sommes pas en mesure actuellement
d’expliquer cet écart.
b) Bases pyrimidiques
Les bases pyrimidiques et en particulier la thymine, semblent particulièrement sensibles à
l’action du rayonnement gamma. En effet, l’ensemble des diols de thymidine, de la 5-FordUrd et de la
5-HmdUrd se forment en quantités environ deux fois supérieures à celle des bases puriques modifiées
(8-oxodGuo, FapyGua, 8-oxodAdo, FapyAde). Il serait cependant très intéressant d’étendre les
mesures à l’oxazolone et à plusieurs produits de réduction des bases pyrimidiques.
125 Chapitre III : Mesure des dommages radio- et photo-induits dans l’ADN cellulaire par des méthodes chromatographiques
c) Conclusion
La 8-oxodGuo n’est donc pas la lésion radio-induite majoritairement formée dans l’ADN
cellulaire, contrairement à ce qui a été observé dans le cas de l’irradiation d’ADN isolé de thymus de
veau en solution aqueuse aérée (226). La seule prise en compte de la formation de la 8-oxodGuo qui
est généralement utilisée comme marqueur biologique du stress oxydant ne peut, dans le cas d’une
irradiation gamma, donner qu’une vision très partielle des effets du rayonnement ionisant sur l’ADN
cellulaire.
2. Irradiation au LASER UV de haute intensitéLe rendement quantique relatif à la formation de 8-oxodGuo est environ inférieur d’un facteur
10 à celui déterminé dans de l’ADN isolé de thymus de veau par Angelov et al. (259). La différence
observée peut s’expliquer pour plusieurs raisons :
a) Perte de lumière par diffusion
Du fait de la densité optique élevée de la suspension cellulaire, une partie de la lumière émise
est perdue par diffusion.
b) Le système d’irradiation
Les irradiation ont été effectuées dans une cuve de quartz de 1 ml. Dans de telles conditions,
une partie du faisceau est atténuée par l’épaisseur de la matière à traverser. Le rendement quantique
est de ce fait d’autant diminué. L’échantillon idéal doit être suffisamment mince pour palier ce
problème. Il doit posséder une densité optique inférieure à 0,1 (260).
c) Absorption par d’autres constituants cellulaires
Des acides aminés comme le tryptophane, des protéines et les ARN peuvent absorber à 266
nm (261).
d) Différence entre ADN isolé et ADN cellulaire
L’ADN cellulaire présente une configuration très différente de l’ADN isolé. Il est en
particulier compacté et associé à des protéines qui peuvent influer sur la nature des réactions
chimiques produites en son sein.
e) Comparaison : Irradiations gamma et UV LASER
Dans le Tableau XVII, on compare les rapports entre les formations des différentes lésions
produites dans l’ADN cellulaire par une exposition au rayonnement gamma ou au rayonnement UV
LASER bi-photonique. Nous ne disposons pas actuellement de résultats relatifs à la mesure du taux de
formation de la FapyGua après irradiation UV LASER.
Chapitre III : Mesure des dommages radio- et photo-induits dans l’ADN cellulaire par des méthodes chromatographiques
126
Tableau XVII : Comparaison des rapports des différentes lésions mesurées dans l’ADN cellulaire
induite par une exposition au rayonnement gamma ou au rayonnement UV LASER
Rapports Irradiation gamma Irradiation LASER
8-OxodGuo/ensemble des autres bases modifiées 0,11 4,9
Diols de thymidine/8-oxodAdo 27 10
Bases puriques*/bases pyrimidiques modifiées 0,33 5,3
* : somme des taux de formation de la 8-oxodGuo, de la 8-oxodAdo et des dérivés Fapy purines.
Le Tableau XVII montre que l’irradiation LASER, utilisée pour déterminer la composante
ionisante de l’effet direct du rayonnement gamma, conduit principalement à la formation de 8-
oxodGuo. Si toutes les lésions semblent se former, elles sont produites en quantités bien inférieures et
représentent moins de 15% du taux de 8-oxodGuo. L’irradiation UV LASER induit la formation de 8-
oxodAdo dans des proportions relativement importantes. Le rayonnement gamma est à l’origine d’un
spectre de bases modifiées plus homogène, ce qui corrobore la prédominance de l’effet indirect, via la
radiolyse de l’eau. Il faut cependant ajouter que le taux élevé de 8-oxodGuo peut s’expliquer par deux
processus. Le premier pourrait impliquer les réactions de transfert de trous positifs (cations radicaux)
formés sur les différentes bases vers les bases guanines (262). La guanine qui possède le potentiel
d’ionisation le plus faible apparaît être un piège des trous positifs lorsqu’ils se déplacent le long de la
chaîne d’ADN. Compte tenu du mécanisme de formation de la 8-oxoGua et de FapyGua, on peut
s’attendre à mesurer des taux relativement élevés de cette dernière lésion. La mesure de la FapyGua
permettrait aussi de confirmer que la formation de 8-oxodGuo découle d’un mécanisme d’ionisation
et non d’oxydation par 1O2. En effet, le rayonnement LASER que nous utilisons possède une
composante mono-photonique. Dans ce cas le rayonnement se comporte comme un rayonnement
ultra-violet et des lésions de type dimères cyclobutyles de pyrimidines peuvent se former.
Des réactions de photosensibilisation par les bases de l’ADN elles-mêmes, peuvent également
avoir lieu et être à l’origine d’oxygène singulet.
3. Irradiation UVA et réactions de photosensibilisationLes taux de 8-oxodGuo mesurés dans l’ADN de cellules photosensibilisées par le rose bengal
ou l’acridine orange en présence de lumière sont relativement importants si on les compare à ceux
déterminés après irradiation gamma. Ces agents ont en effet été décrits comme agissant par des
mécanismes de type II (263-265). Comme cela a déjà été abordé, la formation de 8-oxodGuo peut
s’expliquer principalement par une oxydation par l’oxygène singulet (263).
127 Chapitre III : Mesure des dommages radio- et photo-induits dans l’ADN cellulaire par des méthodes chromatographiques
L’existence d’un mécanisme de type II est corroboré par l’absence de détection des dérivés
Fapy purines aux faibles concentrations de photosensibilisateurs. Lorsque ces derniers sont utilisés à
une concentration environ 100 fois plus élevée, le taux de 8-oxodGuo est multiplié par un facteur
compris entre 30 et 40. Les dérivés Fapy purines deviennent alors détectables. Leur taux de formation
représente environ 25 à 30% de celui de la 8-oxodGuo, ce qui tend à confirmer, que même pour ces
fortes concentrations de photosensibilisateurs, la réaction de type II reste prédominante. Bien que
minoritaire, l’implication de mécanismes de type I ou d’oxydation par les radicaux hydroxyle peut
expliquer la formation des dérivés Fapy purines.
Dans le cas de l’irradiation UVA, il n’est pas possible, à partir des présentes données, de tirer
des conclusions définitives concernant les mécanismes d’oxydation mis en jeu. Toutefois les taux
élevés de 8-oxodGuo et l’absence apparente de dérivés Fapy purines semblent indiquer un mécanisme
de type II. Le taux de formation de 8-oxodGuo est, par kJ.m-2, quasiment identique à celui mesuré par
Gy, dans le cas de l’irradiation gamma. Or dans ce dernier cas, aucun dérivé Fapy n’a pu, compte tenu
du manque de sensibilité de notre méthode, être mis en évidence en dessous de 250 Gy. Il aurait pour
cette raison, été intéressant de pouvoir délivrer une dose d’UVA de 250 kJ.m-2. Mais, l’application de
telles doses auraient requis des temps d’irradiation beaucoup trop longs qui auraient
vraisemblablement permis une réparation au moins partielle des lésions.
- Chapitre IV -
Mesure des dommages de l’ADN par la
méthode des comètes
Chapitre IV : Mesure des dommages de l’ADN par la méthode des comètes 129
IntroductionLes mesures des coupures simple (CSB) et double brin (CDB) ont fait l’objet de nombreux
travaux en raison principalement de la forte implication des CDB dans la létalité radio-induite.
D’autre part, les techniques mises en jeu dans la détermination des CDB ont été adaptées à la mesure
d’autres dommages (266). Plusieurs méthodes ont été proposées au cours des quarante dernières
années. Nous en présenterons brièvement le principe pour nous attarder sur la méthode de
microélectrophorèse de cellules isolées sur gel.
I. METHODES DE MESURE DES COUPURES DE BRINS DE L’ADN
A. Sédimentation sur gradient de sucroseUtilisée initialement pour déterminer la taille des molécules d’ADN, la technique de
sédimentation sur gradient de sucrose a ensuite été utilisée pour déterminer le nombre de coupures
simple brin (267). La méthode a été confrontée à plusieurs problèmes méthodologiques, tels que
l’effet de la vitesse de sédimentation sur les longs fragments d’ADN, l’instabilité du gradient, etc.
(268). De plus, la sensibilité de cette technique, du fait de l’existence d’un bruit de fond généré par la
manipulation des cellules (269), est relativement faible.
B. Méthode basée sur la relaxation de l’ADNLe principe de cette technique repose sur l’observation que la présence de coupures au sein
d’un ADN accélère la migration électrophorétique de la molécule dans un gel d’agarose en milieu
alcalin (26, 270). Les membranes cellulaires sont lysées en milieu basique. La solution est ensuite
neutralisée et une chromatographie sur colonne d’hydroxyapatite permet de séparer CSB et CDB. La
méthode a été utilisée par Rydberg et Johansson en 1978 sur des cellules isolées (271). Une
coloration de l’ADN au bromure d’éthidium permet d’estimer les proportions relatives d’ADN intact
et d’ADN fragmenté.
C. Sédimentation de nucléoïdeL’ADN de phage ou de cellules de mammifère se présente avec une structure plus ou moins
enroulée sur elle même. La formation de CSB entraîne une relaxation de la structure qui se traduit par
une migration plus lente sur un gradient de sucrose (272, 273).
D. Méthode de « Nick translation »Les cellules sont perméabilisées et les extrémités 3’-OH résultant des coupures de brins sont
marquées par des 2-désoxyribonucléosides triphosphate radioactifs à l’aide d’une ADN polymérase I
(274, 275). L’ADN polymérase, qui possède une activité exonucléase 5’-3’ se déplace le long de la
130 Chapitre IV : Mesure des dommages de l’ADN par la méthode des comètes
double hélice (translation) dans le sens 5’-3’ jusqu’à rencontrer un site avec des contraintes de
structure ou une deuxième coupure simple brin.
E. Electrophorèse en champ pulséLes cellules sont incluses dans des puits d’agarose et leurs membranes plasmique et nucléaire
sont ensuite lysées. Après un traitement adéquat (protéase et RNase), les molécules d’ADN se
déplacent sous l’action d’un champ électrique au sein d’un gel d’agarose et ce, d’autant plus qu’elles
sont de taille réduite. Les molécules d’ADN, ont été préalablement marquées par incubation des
cellules en présence de précurseurs 3H ou 14C. Cette technique est particulièrement utilisée pour la
mesure des CDB et est adaptée aux grandes molécules d’ADN. Plusieurs modifications
méthodologiques ont été apportées telles que l’utilisation de champ inversé ou perpendiculaire (276-
279).
F. La méthode d’élution sur filtreC’est une des techniques les plus faciles à mettre en œuvre. Elle repose sur l’utilisation de
filtre de polycarbonate pour discriminer les fragments d’ADN cellulaire en fonction de leur taille. La
méthode peut être utilisée pour la mesure des pontages ADN-protéines, des CSB des CDB et des sites
alcali-labiles. Les cellules incluses dans une solution de lyse sont déposées sur un filtre. La plupart du
contenu cellulaire hors ADN est éliminé par gravité. Une solution alcaline est ensuite délivrée sous
l’action d’une pompe et l’éluant est recueilli sous forme de diverses fractions. L’élution des fragments
d’ADN qui sont éliminés du filtre montre une relation semi-logarithmique avec la masse (280-282).
Malgré la très grande sensibilité de la méthode, divers travaux ont montré l’influence de facteurs
extrinsèques tels que le pH de lyse (283), la composition des tampons utilisés (280, 284) et la phase
du cycle cellulaire (285). Effectuée en milieu neutre, elle reste néanmoins particulièrement adaptée à
la mesure des CDB aux faibles doses d’irradiation gamma (286). La méthode peut être utilisée pour la
détection de dommages de l’ADN dus à des agents pontants (mitomycine, cis-platine) (287).
G. La méthode des comètes ou méthode de microélectrophorèsesur gel
En 1978, Rydberg et Johanson proposent la méthode des comètes. Pour cela, ils incluent des
cellules dans un gel d’agarose placé sur une lame de microscope. Les membranes plasmique et
nucléaire sont ensuite lysées en milieu alcalin doux, avant que l’ADN soit coloré avec de l’acridine
orange. La fluorescence rouge ou verte observée, selon que l’acridine est liée à de l’ADN simple ou
double brin, permet d’évaluer le rapport des deux classes de coupures. Afin d’augmenter la sensibilité
de la méthode, Ostling et Johanson (1984) (288) ont introduit une étape d’électrophorèse en milieu
neutre. Leur hypothèse était que les fragments d’ADN migrent d’autant plus qu’il sont petits, et qu’ils
sont d’autant plus nombreux que l’ADN est sectionné. En 1988, Singh introduit l’électrophorèse en
milieu alcalin (289). La méthode permet la révélation des coupures des brins de l’ADN et des sites
Chapitre IV : Mesure des dommages de l’ADN par la méthode des comètes 131
labiles en milieu basique. En permettant la détection d’une coupure simple brin/ 6 107 bases, la
méthode est beaucoup plus sensible que la plupart des techniques utilisées jusqu’alors (Tableau
XVIII).
Tableau XVIII : Sensibilité de diverses techniques de mesure des coupures simple brin
Méthodes Références Sensibilité
Sédimentation sur gradient de sucrose (290) 1 coupure/ 6-15 105 bases
Relaxation de l’ADN (291) 1 coupure/ 2-3 107 bases
Electrophorèse alcaline sur gel (292) 1 coupure/ 1 107 bases
Elution alcaline (282) 1 coupure/ 0,6-1 107bases
Microélectrophorèse sur gel (293) 1 coupure / 6 107 bases
Un autre intérêt de la méthode est l’analyse des dommages effectuée, cellule par cellule. Il est
ainsi possible au sein d’une population de distinguer des sous-populations, ce qui n’est pas le cas des
analyses globales de modifications de l’ADN. Ne nécessitant qu’un très faible nombre de cellules, elle
est particulièrement adaptée aux études cliniques (294-297).
1. Principe de la méthode des comètes en milieu alcalinLa méthodologie suivie consiste à inclure des cellules dans un gel d’agarose déposé sur une
lame de microscope (Figure 90). Les membranes plasmique et nucléaire sont ensuite lysées. Les lames
sont alors incubées dans un milieu alcalin fortement salin, qui permet la décondensation de l’ADN,
laquelle s’explique en partie par la perte des protéines de type histones. Sous l’action d’un champ
électrique, l’ADN qui est chargé négativement se déplace vers l’anode. Le modèle de migration
d‘ADN au sein d’un gel d’agarose décrit par Deutch (1988) (298) ne peut que partiellement
s’appliquer à la méthode des comètes. En effet la structure superenroulée de l’ADN formée autour des
nucléosomes persiste. Il en résulte que l’ADN est encore maintenu dans une structure appelée
nucléoïde. Le modèle de l’ADN sous forme de nucléoïde a été décrit par Cook et al. (272, 273).
Dans cette structure, l’ADN serait constitué de plusieurs brins qui se comportent comme des
chromosomes uniques (299) et qui seraient reliés à un ou plusieurs sites communs de la membrane
nucléaire (300). Cette fixation se ferait par l’intermédiaire de protéines (299, 301). La migration de
l’ADN n’est pas possible tant que l’ADN est fixé à cette matrice nucléaire. Une rupture de brin,
induite par les rayonnements, suffit à relâcher l’ensemble et à permettre la migration des boucles
d’ADN hors du nucléoïde. Il est alors possible d’observer, après coloration de l’ADN (bromure
d’éthidium, YOYO-1, DAPI) cette migration. L’ADN est réparti entre le nucléoïde (qui représente la
132 Chapitre IV : Mesure des dommages de l’ADN par la méthode des comètes
tête de la comète) et la queue de la comète. L’importance des dommages peut être évaluée par une
analyse sous microscope couplée à un traitement d’images.
Cellules Gelsd'agarose
Lame demicroscope
60Co
Marquage de l’ADN au BEt et analyse des lames
Lyse des membranes plasmique et nucléaire
Electrophorèse (pH 13)
Cellule :
peu modifiée
très modifiée
témoin
sens de migration de l’ADN
- +
microscope
Cellules Gelsd'agarose
Lame de
X, γ, γ, γ, γ, UV, etc....
Lyse des membranes plasmique et nucléaire
nucléoïde
Electrophorèse en milieu alcalin
coloration de l'ADN et analyse microscopiquedes lames
nucléoidenucléoïde
Electrophorèse en milieu alcalin
Figure 90 : Principe de la méthode des comètes
Différents paramètres, comme le moment de la queue de la comète, permettent de quantifier
ces dommages. Plusieurs améliorations portant sur la nature du colorant de l’ADN, sur l’utilisation de
protéases et de RNase, sur les conditions de lyse, sur les paramètres de l’électrophorèse et de
l’analyse des lames en font un outil très adapté à la mesure de faibles niveaux de dommages (293,
302-306). La méthode a été utilisée sur des cellules isolées du sang (307), sur des cellules en culture
(308), sur des colonocytes (309), sur les cellules des cryptes intestinales (310), sur les pneumocytes
ou sur les macrophages des alvéoles pulmonaires (311). Les tissus peuvent également être le support
de ces expérimentations (312, 313). Il est possible en fonction de la nature du tampon neutre ou
Chapitre IV : Mesure des dommages de l’ADN par la méthode des comètes 133
alcalin de mettre en évidence les cassures simple ou double brin (302, 314). La méthode a également
été utilisée pour étudier les cinétiques de réparation des cassures sans présager de la fidélité de cette
réparation (295, 303, 315, 316). Elle a permis d’estimer l’hétérogénéité des réponses au sein d’une
population cellulaire qu’il s’agisse de population radiosensible ou mal oxygénée (305, 317-320). La
méthode a aussi été employée pour mettre en évidence des adduits du cis-platine et de moutardes
azotées (306, 321) ou des pontages ADN-protéine (dus à l’étoposide) (322).
2. Objectifs de l’étudeDans ce quatrième chapitre, nous proposons d’utiliser la méthode des comètes, pour mesurer
les dommages de bases de l’ADN. La méthode sous sa forme standard, c’est à dire telle qu’elle vient
d’être décrite, permet de mettre en évidence simultanément les coupures simple (CSB) et double brin
(CDB) de l’ADN ainsi que les sites alcali-labiles (SAL). Associée à des enzymes de réparation, telles
que Fpg ou endo III, la méthode permet de révéler des bases modifiées, substrats des enzymes. Les
protéines Fpg et endo III qui possèdent une action endonucléasique produisent des coupures de l’ADN
aux sites des bases modifiées, selon les mécanismes décrits dans le chapitre I et représentés
schématiquement dans la Figure 91.
Fpg
(2)
O
NH
NN
N
NH2O
H
H
Extrémité 3'OH
O
OO
Base 2OHPOOH
Fpg
OO
OPOOH
OO
OPOOH
O
NH
NN
N
NH2
O
H
(1)
Extrémité 3'OHO
OO
Base 2
Cassure simple brin (CSB) 8-oxo-7,8-dihydroguanine
+
Extrémité 5'OHBase 1
(1) coupure de la liaison N-glycosidique
(2) action endonucléasique
Extrémité 5'OH
OHO P
O
OO
OH
Base 1
Figure 91 : Induction d’une coupure de chaîne de l’ADN par l’action de Fpg (Schéma simplifié)
Les premiers travaux mettant en évidence des bases modifiées de l’ADN sous irradiation
gamma ont été décrits dès 1972. Ils utilisaient des extraits bactériens de Micrococcus luteus (323).
Associés à la méthode d’élution alcaline, ils ont fait l’objet de plusieurs études parmi lesquelles
figurent celles de Fornace (324) et de van Loon et al. (325, 326). L’utilisation ultérieure d’enzymes
de réparation est apparue avec les travaux de Collins et al. (159) pour la méthode des comètes, et
ceux de Epe et al. (264) pour la méthode d’élution alcaline sur filtre. L’utilisation de cette nouvelle
approche a permis d’apporter des réponses semi-quantitatives là où des mesures plus spécifiques
avaient échoué. C’est en particulier le cas d’études d’incidences des cancers chez des populations
134 Chapitre IV : Mesure des dommages de l’ADN par la méthode des comètes
ayant reçu des régimes alimentaires contenant un apport d’antioxydants (327, 328) ou exposées à de
faibles doses de rayonnement (296, 297). La méthode d’élution alcaline sur filtre associée à des
enzymes de réparation a elle aussi fait l’objet de nombreux travaux (160, 264, 329-335).
Les principales bases modifiées substrats de l’enzyme Fpg sont la 8-oxodGuo, ainsi que la
FapyGua et la FapyAde (101). L’endonucléase III reconnaît, de façon préférentielle, la 5-hydroxy-5-
méthylhydantoïne et les diols de thymine (129). Après l’étape de lyse des membranes cellulaires, les
solutions enzymatiques contenant Fpg ou endo III sont déposées sur les lames et ces dernières sont
incubées à 37°C pendant 45 min. Les lames sont ensuite placées dans le tampon d’électrophorèse
pendant 20 min avant la poursuite du protocole. Dans la première partie de ce chapitre, nous
discuterons de l’optimisation de la méthode des comètes, utilisée d’une part sous sa forme standard et
d’autre part associée à Fpg ou à endo III. La méthode sera ensuite utilisée pour mesurer les
dommages, dans l’ADN de monocytes exposés au rayonnement gamma du cobalt 60, au rayonnement
UVA. Elle permettra aussi de mesurer ceux induits par l’acridine orange ou le rose bengal, excités par
la lumière visible.
II. OPTIMISATION DE LA MESURE DES DOMMAGES DE L’ADN PAR LAMETHODE DES COMETES
A. Le « tail moment » ou « moment de la queue de la comète »L’analyse par microscopie à fluorescence des lames portant les gels peut être effectuée
manuellement. Toutefois, une analyse à l’aide des logiciels de traitement d’images est plus
communément utilisée. Dans le premier cas, les cellules sont classées en catégories en fonction de
l’importance des dommages. Dans le deuxième cas, le logiciel permet de quantifier les intensités de
fluorescence des différentes parties de la comète. Il existe de nombreux paramètres, basés sur ces
valeurs d’intensité, pour estimer le nombre de coupures de l’ADN. Nous avons choisi parmi ceux-ci,
d’utiliser le « tail moment » ou « moment de la queue de la comète». Ce paramètre directement
proportionnel au nombre de coupures, est un rapport d’intensités de fluorescence, multiplié par une
longueur. Son unité est donc une distance, le micromètre (Figure 100).
intensité de fluorescence de la queue longueur de la queue«moment de la queue» =intensité de fluorescence de la tête
B. Méthode standard des comètesLa grande sensibilité de la technique de microélectrophorèse sur gel, en fait un outil très
précieux pour la mesure des dommages induits par de faibles doses d’irradiation. La gamme de doses
d’irradiation gamma a été choisie en partie, à la vue du taux de survie de notre modèle cellulaire,
après exposition à ce rayonnement.
Chapitre IV : Mesure des dommages de l’ADN par la méthode des comètes 135
A cette fin, un test au bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényl-tétrazolium
(MTT) a été effectué 24 h ou 48 h après irradiation (Tableau XIX).
Tableau XIX: Survie cellulaire de monocytes exposés à différentes doses de rayonnement gamma
(déterminée par un test au MTT)
Dose (Gy) Survie (en %) à 24 h Survie (en %) à 48 h
0 100 982 89 894 76 728 66 7515 52 56
L’analyse des dommages par la méthode des comètes a été effectuée dans une gamme de
doses de rayonnement gamma comprises entre 0 et 8 Gy. Cette gamme de doses, permet d’obtenir un
taux de survie proche de 75% à 48 h. Le choix des doses d’irradiation gamma, devait prendre en
considération, d’une part l’objectif de mieux connaître les dommages oxydatifs de l’ADN produits par
de faibles doses d’irradiation, mais aussi la nécessité de disposer de doses suffisamment élevées pour
permettre la formation significative des lésions étudiées. C’est en particulier le cas des substrats des
enzymes de réparation. Les mesures par CLHP-DE et par CG-SM ont en effet montré que la 8-
oxodGuo et le FapyGua, se formaient en quantités relativement faibles (Chapitre III).
La grande sensibilité de la méthode des comètes est paradoxalement aussi un de ses points
faibles, puisque la méthode est aussi très sujette à des facteurs externes susceptibles de moduler la
réponse de la technique. Parmi ces facteurs, la qualité du gel, la température des tampons utilisés, la
préparation des cellules (conditions de culture, manipulation des cellules, etc.), etc., sont autant de
paramètres susceptibles d’influer sur la qualité des résultats. Le gage d’une bonne expérience est
l’absence de « moment de la queue » mesuré dans les cellules témoin. La méthode repose sur une
analyse statistique, effectuée sur plusieurs cellules au sein du gel d’une lame, et sur plusieurs lames
par classe d’échantillon. L’analyse des dommages d’un nombre élevé de cellules et de lames, permet
de limiter l’influence des variations propres aux conditions expérimentales. Pour ces différentes
raisons, nous proposons ici des conditions qui nous paraissent satisfaisantes pour obtenir une bonne
reproductibilité de la méthode. Une analyse de 50 cellules par lame et d’au moins trois lames par
condition d’irradiation permet de couvrir l’hétérogénéité de la réponse qui peut exister pour une
même dose d’irradiation. De plus, l’établissement de courbe dose-réponse est préférable à l’analyse
effectuée à partir des résultats d’une seule dose d’irradiation. Il est possible d’observer des valeurs de
moment de la queue supérieures, pour des cellules irradiées à des doses plus faibles (5 versus 6 Gy).
La méthode reposant sur une analyse statistique, une reproduction en triple de l’expérience permet
d’atténuer ces variations. Les cellules étant distribuées selon une loi normale en fonction des
136 Chapitre IV : Mesure des dommages de l’ADN par la méthode des comètes
différentes classes de dommage, la valeur moyenne du moment de la queue a été utilisée. En
respectant ces conditions, nous avons obtenu une très bonne reproductibilité de la méthode sous sa
forme standard, avec des variations inférieures à 15% sur les pentes dose-réponse établies.
C. Méthode des comètes couplée à l’utilisation de Fpg et d’endo IIIL’utilisation d’enzymes de réparation est nettement plus délicate à mettre en œuvre. Elle
requiert, pour palier les variations obtenues d’une expérimentation à l'autre, la répétition des
expériences en quadruple ou quintuple. Trois lames doivent être analysées par expérimentation. Une
modification a été apportée au niveau de la concentration et du nombre de gels. De nombreux
protocoles impliquent l’inclusion des cellules dans un gel à 0,6% reposant sur un premier gel
d’agarose à 0,6% et recouvert ensuite par un troisième à 0,6%. L’utilisation des enzymes de
réparation nous a conduit à ne pas déposer de troisième gel et à élever la concentration du premier et
deuxième, respectivement à 1 et 1,2%. Ce changement de concentration influe, sur la réticulation du
gel. Il se traduit par une amélioration de la résolution du signal tout en accroissant la résistance
mécanique du gel, face aux différents traitements. Il était par ailleurs, plus approprié à l’application
d’un voltage et d’un ampérage relativement élevés (respectivement 25 Volts et 300 mA).
Il semblait possible que l’hétérogénéité de réponse obtenue en présence d’une enzyme de
réparation, telle que Fpg, pouvait s’expliquer par des différences d’accessibilité de l’enzyme aux sites
substrats. Nous avons donc chercher à améliorer cette accessibilité en effectuant une électrophorèse
de courte durée consécutive à l’étape de lyse des cellules et précédant l’étape d’incubation en
présence de l’enzyme.
1. Etape de « préélectrophorèse »Cette étape supplémentaire en permettant une migration de l’ADN, avait pour objectif de
décondenser l’ADN et le rendre ainsi plus accessible aux enzymes. Pour cela, des lames portant des
cellules irradiées à 8 Gy et préalablement lysées, ont été incubées dans un tampon de
préélectrophorèse (300 mM NaOH, 1 mM Na2EDTA, 2% DMSO) pendant 20 min avant de subir une
première électrophorèse d’une durée de 3, 6 ou 9 min (25 V, 300 mA). Les lames ont ensuite été
rincées et les solutions contenant les enzymes de réparation ont été déposées. Les lames ont alors été
incubées pendant 45 min à 37°C. Elles ont été ensuite placées dans le tampon d’électrophorèse
pendant 20 min avant qu’une électrophorèse soit effectuée (25 V, 300 mA) pendant 20 min.
Nous avons dans ces conditions, constaté une diminution de la dispersion des valeurs
obtenues entre les trois lames analysées (de 37% à 14%) pour les différents temps de
préélectrophorèse. Nous avons également observé une augmentation du moment de la queue de la
comète (Figure 92).
Chapitre IV : Mesure des dommages de l’ADN par la méthode des comètes 137
Temps de préélectrophorèse (min)
Moment de la queue (µm)
73,170,660,8
0
50
100
3 6 9
37 % 19,4 % 14 %
Figure 92 : Influence du temps de préélectrophorèse sur la reproductibilité
Ce résultat a montré l’intérêt de cette étape additionnelle. Il était cependant nécessaire de
définir le temps optimal de la durée de la préélectrophorèse. Afin de ne pas être confrontés à des
problèmes de saturation de réponse de la méthode (valeurs supérieures à 120 µm), nous avons répété
la même expérience sur des cellules non irradiées (Figure 93).
0
20
40
60
80
0 5 10 15 20 25 30
Moment de la queue (µm)
Temps de préélectrophorèse (min)
Figure 93 : Influence du temps de préélectrophorèse : monocytes contrôle
Dans ces conditions, la valeur maximale de la réponse est atteinte en 10 min. On obtient le
même profil sur des cellules irradiées à 2 Gy et 4 Gy (Figures 94 et 95, respectivement). Dans ce
dernier cas, le moment de la queue de la comète est compris entre 55 µm et 100 µm, respectivement
pour les cellules contrôle et pour les cellules irradiées (valeur moyenne proche de 70 µm). Le moment
de la queue de la comète atteint un plateau au bout de 20 min de préélectrophorèse.
138 Chapitre IV : Mesure des dommages de l’ADN par la méthode des comètes
0
20
40
60
80
100
0 5 10 20Temps de préélectrophorèse (min)
Moment de la queue (µm)
Figure 94 : Influence du temps de préélectrophorèse : monocytes exposés à 2 Gy
0
20
40
60
0 5 10 20
Temps (min)
Moment de la queue (µm)
Figure 95 : Influence du temps de préélectrophorèse : monocytes exposés à 4 Gy
La première courbe dose-réponse reliant le moment de la queue de la comète à la dose a
montré une augmentation de 1,7 µm/Gy correspondant aux coupures, et de 2,3 µm/Gy en présence de
Fpg (Figure 96). L’utilisation de la préélectrophorèse s’accompagne d’un « tassement » des valeurs
vers le haut, si bien que même pour des doses comprises entre 2 et 8 Gy, l’augmentation du moment
de la queue de la comète reste faible.
Chapitre IV : Mesure des dommages de l’ADN par la méthode des comètes 139
y = 2,3 x + 52,9
R2 = 0,81
y = 1,7 x + 13,7
R2 = 0,980
20
40
60
80
0 2 4 6 8
CSB + CDB + SAL +sites Fpg
CSB + CDB + SAL
Dose (Gy)
Moment de la queue (µm)
Figure 96 : Courbe dose-réponse obtenue en présence d’une préélectrophorèse de 10 min
Toutefois, le rapport entre les deux pentes dose-réponse obtenues ((CSB + CDB +SAL + sites
Fpg)/(CSB + CDB + SAL)) est de 1,3. Il est identique à celui déterminé dans le paragraphe III-A 1).
Une plus grande accessibilité de l’enzyme à ses sites substrats se traduirait par une augmentation du
rapport précédent. Cela veut donc dire que l’utilisation de la préélectrophorèse n’augmente pas
l’accessibilité de l’enzyme à l’ADN. De plus, la pente de la courbe dose-réponse en absence ou en
présence de Fpg est plus faible. La sensibilité de la méthode utilisant la préélectrophorèse est par
conséquent inférieure à celle obtenue en absence de cette étape additionnelle.
2. Composition du tampon d’électrophorèseL’augmentation du moment de la queue de la comète induite par l’étape de préélectrophorèse
peut s’expliquer par une plus grande vulnérabilité de l’ADN aux réactions d’oxydation par les espèces
réactives de l’oxygène. Nous avons, pour palier ce phénomène, utilisé des composés connus pour leur
propriété antioxydante ou anti-radicalaire.
a) Influence de la déféroxamine
L’efficacité de la déféroxamine à réduire l’oxydation de l’ADN cellulaire lors des expériences
d’extraction, nous a naturellement conduit à utiliser ce chélateur du fer dans le tampon
d’électrophorèse (300 mM NaOH, 1 mM Na2EDTA) à raison de 0,1 mM de déféroxamine. Une
préélectrophorèse de 10 min (25V, 300 mA) a été effectuée avant le traitement par Fpg et
l’électrophorèse de 10 min (25 V, 300 mA). La Figure 97 ne montre aucun effet significatif de la
déféroxamine sur le nombre de sites reconnus par Fpg.
140 Chapitre IV : Mesure des dommages de l’ADN par la méthode des comètes
0
10
20
30
40
50
déf. (-)Fpg (-)
déf. (-)Fpg (+)
déf. (+)Fpg (-)
déf. (+)Fpg (+)
Moment de la queue (µm)
Figure 97 : Influence de la déféroxamine (déf.) sur le moment de la queue de la comète en présenceou non de Fpg (monocytes contrôle)
b) Influence du DMSO et du Tris
Deux autres composés, le Tris et le DMSO, connus pour leurs propriétés de capteurs de
radicaux ont aussi été ajoutés au tampon d’électrophorèse de composition 300 mM de NaOH, 1 mM
de Na2EDTA, 20 mM de Tris (Figure 98).
10
20
30
40
50
0DMSO (-)Fpg (-)
DMSO (-)Fpg (+)
DMSO (+)Fpg (-)
DMSO (+)Fpg (+)
Moment de la queue (µm)
Figure 98 : Influence du DMSO sur le nombre de sites reconnus par Fpg
La comparaison des différentes expériences permet d’écarter toute influence du Tris sur le
nombre de sites Fpg. Aucun effet significatif de l’apport du DMSO (2%) n’est également montré
(Figures 97 et 98). Ces résultats nous ont permis d’écarter l’utilisation de chélateurs ou de piégeurs de
radicaux dans la méthodologie mise en œuvre.
L'utilisation de la préélectrophorèse, ne permet pas d'améliorer l'accessibilité de l’enzyme à
ses substrats (pas d’augmentation du rapport entre le nombre de sites Fpg et le nombre de coupures)
Au contraire, on observe même une diminution de la sensibilité de la méthode qui s’explique par un
Chapitre IV : Mesure des dommages de l’ADN par la méthode des comètes 141
« tassement » des valeurs vers le haut. L’étape de préélectrophorèse ne sera par conséquent pas
utilisée dans toute la suite de ce travail.
III. UTILISATION DE LA METHODE DES COMETES COUPLEE A FPG ET ENDO III
A. Monocytes exposés au rayonnement gamma du 60CoLa méthode a été utilisée sous sa forme standard et associée à Fpg et/ou endo III, pour mettre
en évidence les divers dommages dans l’ADN de cellules exposées à des doses de rayonnement
gamma du 60Co, comprises entre 0 et 8 Gy. Les Figures suivantes montrent des corrélations entre le
moment de la queue de la comète et la dose d’irradiation gamma délivrée.
1. Utilisation de la FpgEn l’absence d’enzyme de réparation, une régression linéaire relie le moment de la queue de
la comète à la dose. La pente obtenue est de 7,8 µm/Gy correspondant à la formation des cassures
simple et double brin (CSB et CDB) et des sites alcali-labiles (SAL). Par la suite, nous désignerons
ces trois catégories de lésions sous le terme CB. En présence de Fpg, la valeur de la pente augmente
jusqu’à 10,6 µm/Gy. Le moment de la queue mesuré dans les cellules contrôle est respectivement de
16,9 et 29,2, en absence ou en présence de Fpg (Figure 99).
0
40
80
120
0 2 4 6 8
Dose (Gy)
Moment de la queue (µm)
y = 7,8 x + 16,92 R = 0.9985
y = 10,6 x + 29,22 R = 0.9947
CSB + CDB + SAL
CSB + CDB + SAL+ sites Fpg
Figure 99 : Augmentation du moment de la queue de la comète correspondant aux sites reconnus parFpg, dans l’ADN de monocytes exposés au rayonnement gamma
La Figure 100 correspond à la visualisation par microscopie à épifluorescence, de cellules
témoin et irradiées à 8 Gy traitées ou non par Fpg.
142 Chapitre IV : Mesure des dommages de l’ADN par la méthode des comètes
cellules témoin cellules témoin traitées avec Fpg
cellule irradiée à 8 Gy
tête queue
cellule irradiée à 8 Gy et traitée par Fpg
Figure 100 : Observation par microscopie à épifluorescence de cellules témoin ou irradiées, traitéesou non par Fpg (ADN coloré au bromure d’éthidium)
2. Utilisation de l’endonucléase IIIL’utilisation de l’endonucléase III pour mettre en évidence les bases pyrimidiques modifiées,
permet d’obtenir les résultats présentés dans la Figure 101. On note une augmentation de la pente de
la droite de régression linéaire reliant le moment de la queue de la comète à la dose. Elle passe ainsi
de 7,8 µm/Gy à 11 µm/Gy. Le moment de la queue correspondant aux sites reconnus par endo III dans
les cellule contrôle est de 29,5 µm.
Chapitre IV : Mesure des dommages de l’ADN par la méthode des comètes 143
0
40
80
120
0 2 4 6 8
y = 7,88 x + 18,3R2 = 0,9839
y = 11,01 x + 29,5R2 = 0,9581
CSB + CDB +SAL+ sites endo III
CSB + CDB +SAL
Moment de la queue (µm)
Dose (Gy)
Figure 101 : Augmentation du moment de la queue de la comète correspondant aux sites reconnuspar endo III, dans l’ADN de monocytes exposés au rayonnement gamma
3. Utilisation simultanée de l’endonucléase III et de la FpgLorsque les deux enzymes sont utilisées simultanément, une augmentation de 5,2 µm/Gy de la
pente reliant le moment de la queue de la comète à la dose d’irradiation a été observée (Figure 102).
y = 12 x + 26,82
R = 0,9687
y = 6,8 x + 13,8
R2 = 0,9981
Dose (Gy)
Moment de la queue (µm)
0
40
80
120
160
0 2 4 6 8
CSB + CDB + SAL+ sites Fpg + sites endo III
CSB + CDB + SAL
Figure 102 : Augmentation du moment de la queue de la comète mesurée en présence de Fpg etd’endo III par la méthode des comètes, dans l’ADN de monocytes exposés au rayonnement gamma
Cette augmentation est de 76% par rapport à la pente obtenue en l’absence des deux enzymes
de réparation. Elle semble indiquer un effet additif des deux enzymes, dans le cas de cellules exposées
au rayonnement gamma et laisse supposer que les enzymes de réparation reconnaissent des substrats
différents. Toutefois une augmentation de 13 µm seulement a été observée dans les cellules contrôle
alors qu’un effet additif aurait donné une valeur de 23,5 µm.
144 Chapitre IV : Mesure des dommages de l’ADN par la méthode des comètes
B. Monocytes exposés au rayonnement UVALa méthode modifiée des comètes a également été utilisée pour mesurer les dommages de
l’ADN de monocytes exposés à des doses d’UVA comprises entre 0 et 150 kJ.m-2.
1. Utilisation de la FpgEn absence de Fpg, une pente de 0,056 µm/kJ.m-2 est observée avec un moment de la queue
dans les cellules contrôle de 10,1 µm. La reconnaissance des sites Fpg entraîne une augmentation dela pente qui atteint 0,17 µm/kJ.m-2 (Figure 103).
y = 0,17 x + 17,7
y = 0,056 x + 10,1R
2 = 0,8738
0
20
40
60
0 50 100 150Dose (kJ.m-2)
Moment de la queue (µm)
CSB + CDB + SAL
CSB + CDB + SAL+ sites Fpg
R2 = 0,8795
Figure 103 : Effet de Fpg sur le moment de la queue de la comète mesuré dans l’ADN de monocytesexposés au rayonnement UVA
2. Utilisation de l’endonucléase IIIEn présence d’endo III, une légère augmentation de la pente est observée (0,075 µm/kJ.m-2).
Le moment de la queue mesuré dans les cellules contrôle est de 19,9 µm (Figure 104).
Moment de la queue (µm)
y = 0,075 x + 19,9R2 = 0,9527
y = 0,056 x + 10,62R = 0,8837
CSB + CDB + SAL
CSB + CDB + SAL + sites endo III
1500
20
40
0 50 100Dose (kJ.m-2)
Figure 104 : Augmentation du moment de la queue de la comète correspondant aux sites reconnuspar endo III, dans l’ADN de monocytes exposés au rayonnement UVA
Chapitre IV : Mesure des dommages de l’ADN par la méthode des comètes 145
C. Monocytes photosensibilisés par de faibles concentrations derose bengal et d’acridine orange
Une première série d’expériences a été effectuée en utilisant des solutions de rose bengal et
d’acridine orange, à des concentrations correspondant à des densités optiques de 10-2 D.O. et 5 10-3
D.O., respectivement. Les monocytes, mis au contact des photosensibilisateurs, ont ensuite été
exposés à la lumière visible pour des durées comprises entre 0 et 10 min. Deux types de contrôle ont
été effectués. Le premier a consisté à mettre des monocytes au contact du photosensibilisateur en
absence de lumière. Le deuxième a impliqué l’exposition des monocytes à la lumière pendant 10 min,
en absence de photosensibilisateur. Nous n’avons observé aucune différence entre les deux types de
contrôle. Ceci montre que les dommages mesurés sont essentiellement issus de réactions photo-
dynamiques, et non de phénomènes liés à la cytotoxicité de ces agents, ou à l’effet de la lumière seule.
1. Rose bengal
a) Utilisation de la Fpg
Aucune augmentation en fonction du temps d’exposition à la lumière, du niveau basal de
coupures (5,8 µm), n’a été observée dans l’ADN de monocytes photosensibilisés par le rose bengal.
Par contre, pour des périodes d’irradiation comprises entre 0 et 10 min, l’utilisation de l’ADN N-
glycosylase (Fpg) s’est traduite par une augmentation du moment de la queue de la comète
relativement linéaire en fonction de la dose. Elle est estimée à 2,9 µm/min, nombre qui doit être
comparé à la valeur de 13,1 µm du moment de la queue dans les cellules contrôle (Figure 105).
100
20
40
60
0 2 4 6 8Temps d'exposition (min)
Moment de la queue (µm)
y = 2,9 x + 13,1
R2 = 0,8866
CSB + CDB + SAL + sites Fpg
CSB + CDB + SAL
Figure 105 : Augmentation du moment de la queue de la comète produite par Fpg, dans l’ADN demonocytes photosensibilisés par le rose bengal (10-2 D.O.)
b) Utilisation de l’endonucléase III
L’utilisation d’endo III entraîne une augmentation du moment de la queue de la comète dans
les cellules témoin qui est de 10,5 µm. Une augmentation similaire est notée dans les cellules
146 Chapitre IV : Mesure des dommages de l’ADN par la méthode des comètes
photosensibilisées sans qu’aucune relation temps d’exposition-augmentation du moment de la queue
de la comète ne puisse être établie (Figure 106). Cela indique l’absence de formation significative de
sites reconnus par endo III.
CSB + CDB + SAL+ sites endo III
CSB + CDB + SAL
0
5
10
15
20
0 3 6 9Temps d'exposition (min)
Moment de la queue (µm)
Figure 106 : Effet d’endo III sur le moment de la queue de la comète mesuré dans l’ADN demonocytes photosensibilisés par le rose bengal (10-2 D.O.)
2. Acridine orange
a) Utilisation de la Fpg
La photosensibilisation de monocytes par l’acridine orange entraîne la formation de coupures
et sites alcali-labiles correspondant à une augmentation du moment de la queue de la comète, valeur
estimée à 1,5 µm par min d’exposition à la lumière visible. Lorsque l’enzyme Fpg est utilisée, cette
augmentation est accrue 5 fois (7,5 µm/min) (Figure 107).
Chapitre IV : Mesure des dommages de l’ADN par la méthode des comètes 147
y = 7,5 x + 15,2
R 2 = 0,977
Temps d’exposition (min)
CSB + CDB + SAL + sites Fpg
y = 1,5 x + 5,92R = 0,9463
CSB + CDB + SAL
0
20
40
60
80
100
0 2 4 6 8
Moment de la queue (µm)
Figure 107 : Augmentation du moment de la queue de la comète correspondant aux sites reconnuspar Fpg, dans l’ADN de monocytes photosensibilisés par l’acridine orange (5 10-3 D.O.)
Le moment de la queue correspondant aux coupures et sites alcali-labiles, déterminé dans
l’ADN des cellules contrôle est de 5,9 µm. En, présence de Fpg, il atteint 15,2 µm.
b) Utilisation de l’endonucléase III
0
10
20
30
40
50
0 2 4 8
CSB + CDB + SAL+ sites endo III
CSB + CDB + SAL
Moment de la queue (µm)
Temps d'exposition (min)
Figure 108 : Augmentation du moment de la queue de la comète correspondant aux sites reconnuspar endo III, dans l’ADN de monocytes photosensibilisés par l’acridine orange (5 10-3 D.O.)
Comme dans le cas de la photosensibilisation par le rose bengal, aucune relation entre le
moment de la queue de la comète, mesuré en présence d’endo III, et le temps d’exposition n’a été
mise en évidence (Figure 108). L’augmentation du moment de la queue de la comète dans les cellules
contrôle qui est de 26 µm, est plus importante que dans l’expérience précédente avec l’acridine
orange.
148 Chapitre IV : Mesure des dommages de l’ADN par la méthode des comètes
D. Monocytes photosensibilisés par 1 D.O. de rose bengal etd’acridine orange
Les cellules ont été photosensibilisées par exposition à la lumière visible consécutivement à
une incubation dans des solutions de concentration équivalant à 1 D.O. de rose bengal ou d’acridine
orange.
1. Rose bengalLe moment de la queue de la comète correspondant à la formation des coupures et sites alcali-
labiles, mesuré dans l’ADN de cellules photosensibilisées par le rose bengal, après exposition à la
lumière visible pour des durées comprises entre 0 et 4 min, a été estimé à 24,7 µm/min. Dans ces
mêmes cellules, le moment mesuré dans les cellules contrôle est de 20,4 µm. En présence d’endo III,
le taux de formation des coupures, des sites alcali-labiles et des sites reconnus par l’enzyme atteint la
valeur de 30 µm. Le moment de la queue de la comète mesuré dans l’expérience contrôle est de 26,8
µm (Figure 109).
0
40
80
120
160
0 1 2 3 4Temps d’exposition (min)
Moment de la queue (µm)
y = 24,7 x + 20,4R
2 = 0,888
y = 30,0 x + 26,8R2 = 0,9244
CSB + CDB + SAL + sites endo III
CSB + CDB + SAL
Figure 109 : Moment de la queue de la comète mesuré en présence d’endo III, dans l’ADN demonocytes photosensibilisés par le rose bengal (1 D.O.)
2. Acridine orangeDans le cas des cellules photosensibilisées par l’acridine orange, la formation des coupures et
sites alcali-labiles dans l’ADN correspond à une augmentation du moment de la queue de la comète
de 72 µm/min. Cette valeur est à comparer à celle des expériences contrôle qui est de 15,8 µm. En
présence d’endo III, l’augmentation du moment de la queue de la comète est de 81,8 µm/min (valeur
de 32 µm dans les cellules non exposées) (Figure 110).
Chapitre IV : Mesure des dommages de l’ADN par la méthode des comètes 149
0
3060
100
140
180
0 0,5 1 1,5Temps d’exposition (min)
Moment de la queue (µm)
y = 81,8 x + 32,0R2 = 0,9636
y = 72,0 x + 15,8
R2 = 0,9531
CSB + CDB + SAL + sites endo III
CSB + CDB + SAL
Figure 110 :Augmentation du moment de la queue de la comète mesurée en présence d’endo III, dansl’ADN de monocytes photosensibilisés par l’acridine orange (1 D.O.)
IV. METHODE DES COMETES EN MILIEU NEUTRE
Deux protocoles ont été utilisés pour mettre en évidence les coupures double brin. La
première méthode utilisée est celle décrite par Singh et al. (302).
A. Mesure des CDB selon la méthode décrite par Singh et al.Les premières expériences ont porté sur des monocytes exposés à des doses de rayonnement gamma
comprises entre 0 et 8 Gy (Figure 111).
0
5
10
15
20
0 2 4 6 8
Dose (Gy)
Moment de la queue (µm)
y = 0,66 x + 9,8
R2 = 0,8024
CDB
Figure 111 : Moment de la queue de la comète mesuré par la méthode des comètes en milieu neutre,dans l’ADN de monocytes exposés au rayonnement gamma (0-8 Gy) (302)
Un taux de formation de 0,66 µm/Gy est mesuré pour une valeur du moment de la queue dans
les cellules contrôle de 9,8 µm. Dans ces conditions, l’incubation avec la protéine Fpg n’a montré
aucune augmentation significative du moment de la queue de la comète (Figure 112). Une hypothèse
est que les sites Fpg ne sont pas produits dans des zones suffisamment rapprochées de l'ADN, pour
que leur excision par Fpg produise l'apparition d'une coupure double brin.
150 Chapitre IV : Mesure des dommages de l’ADN par la méthode des comètes
0
5
10
15
20
0 2 4 8
Dose (Gy)
Moment de la queue (µm)
CDB
CDB + sites Fpg
Figure 112 : Effet de Fpg sur le moment de la queue de la comète mesuré par la méthode des comètesen milieu neutre
Afin de valider la valeur du taux de formation obtenu, nous avons renouvelé l’expérience dans
une gamme de doses de rayonnement gamma comprises entre 0 et 40 Gy. Dans ces conditions, nous
observons l'apparition d'un plateau. Le taux de formation des CDB croît entre 0 et 10 Gy pour ensuite
stagner autour de 17 µm (Figure 113).
0
5
10
15
20
25
0 10 20 30 40Dose (Gy)
Moment de la queue (µm)
Figure 113 : Moment de la queue de la comète mesuré par la méthode des comètes en milieu neutre,dans l’ADN de monocytes exposés au rayonnement gamma (0-40 Gy) (302)
Un traitement à la protéase Qiagen a été effectué (100 µg/lame) afin de dégrader les protéines
susceptibles de freiner la migration de l’ADN et d’être à l’origine du plateau observé. Cependant,
comme le montre la Figure 114, ce traitement n’a induit aucune augmentation du moment de la queue
de la comète (Figure 114).
Chapitre IV : Mesure des dommages de l’ADN par la méthode des comètes 151
0
5
10
15
20
25
0 10 20 30 40
Dose (Gy)
Protéase (-)
Protéase (+)
Moment de la queue (µm)
Figure 114 : Effet d’un traitement à la protéase sur le moment de la queue de la comètecorrespondant à la formation des CDB
B. Mesure des CDB selon la méthode décrite par Olive et al.Le deuxième protocole que nous avons utilisé est celui décrit par Olive et al. (322). Il diffère
du premier par la préparation des lames et par la nature du tampon d’électrophorèse.
y = 0,075 x + 8,8
R2 = 0,9702
0
5
10
15
20
0 20 40 60 80 100
Dose (Gy)
Moment de la queue (µm)
CDB
Figure 115 : Moment de la queue de la comète déterminée par la méthode des comètes en milieuneutre, dans l’ADN de monocytes exposés au rayonnement gamma (0-100 Gy) (322)
La Figure 115 représente la formation des CDB déterminée, par cette approche, dans l’ADN
de monocytes exposés à des doses de rayonnement comprises entre 0 et 100 Gy. Une augmentation du
moment de la queue de 0,075 µm/Gy est obtenue alors que la valeur dans les cellules contrôle est de
8,8 µm. Toutefois, ces résultats ne sont donnés qu’à titre indicatif, car d’importants problèmes de
reproductibilité ont été rencontrés.
152 Chapitre IV : Mesure des dommages de l’ADN par la méthode des comètes
V. EXPERIENCES METTANT EN JEU LA REPARATION DES LESIONS
A. Réparation des cassures de brins et sites alcali-labilesDes expériences de réparation ont été effectuées sur des cellules irradiées à 4 Gy. Les cellules
ont été mises en suspension dans 1,2% d’agarose, et le mélange a été déposé sur les lames de
microscope. Les cellules ont été irradiées, en l’état, et les lames ont ensuite été recouvertes de milieu
de culture avant d’être incubées à 37°C, dans une atmosphère enrichie à 5% de CO2. Les membranes
plasmique et nucléaire des cellules ont été lysées après différentes durées avant analyse par la
méthode des comètes. Des cellules témoin maintenues à l’obscurité pendant toute l’irradiation ont été
traitées dans les mêmes conditions. Les résultats obtenus sur ces dernières sont rapportés dans la
Figure 116. Aucune variation significative du moment de la queue de la comète n’a été observée pour
des temps d’incubation compris entre 0 et 5 h.
Temps (min)
Moment de la queue (µm)
0
20
40
60
0 100 200 300
Figure 116 : Réparation des CSB + CDB + SAL (monocytes témoin)
Dans le cas des cellules irradiées, une diminution rapide du moment de la queue de la comète
a été observé dans les 40 premières min.
0
10
20
30
40
0 50 100 150 200 250
Temps (min)
Moment de la queue (µm)
Figure 117 : Réparation des CSB + CDB + SAL (monocytes exposés à 4 Gy)
Chapitre IV : Mesure des dommages de l’ADN par la méthode des comètes 153
En moins d’une heure, la totalité des coupures et des sites alcali-labiles induits par le
rayonnement est réparée (Figure 117).
B. Réparation des sites FpgL’enzyme de réparation Fpg a été utilisée sur les mêmes échantillons afin d’étudier la
réparation des sites substrats de l’enzyme. La réparation des sites Fpg a pu être évaluée directement
en soustrayant la valeur du moment de la queue de la comète obtenue en présence de Fpg à la valeur
correspondant aux coupures seules (CB). Les résultats sont présentés dans la Figure 118.
Le moment de la queue de la comète correspondant aux sites Fpg augmente pendant les trente
premières minutes, diminue ensuite pour augmenter à nouveau. Néanmoins l’utilisation de ces
résultats doit être prudente. Une des hypothèses pour expliquer les variations du moment de la queue
observées pourrait être la présence de plusieurs composantes dans la cinétique de réparation, qui
serait due à la l’existence de lésions très diverses.
0
10
20
30
40
50
60
0 10 20 30 60 120 180 240
sites Fpg
Temps (min)
Moment de la queue (µm)
Figure 118: Réparation des sites Fpg (monocytes exposés à 4 Gy)
VI. DISCUSSION DES RESULTATS
A. La méthode des comètes sous ses formes standard et modifiéeBien que plusieurs travaux aient fait appel à la méthode des comètes en milieu neutre afin de
mesurer les coupures double brin (302, 314, 315), nos travaux ayant impliqué l’un ou l’autre des
protocoles ont conduit à l’obtention de résultats peu reproductibles. Il aurait été intéressant de
mesurer les CDB, afin de comparer les effets produits par l’irradiation gamma et ceux générés par
l’irradiation au 12C6+ (influence du TEL, Cf. Chapitre VI). La mise en évidence des sites Fpg en milieu
neutre aurait permis d’aborder la répartition de ces lésions le long de la chaîne d’ADN et en
particulier leur implication dans les sites multi-lésés (14, 336). Les expériences de réparation
conduites en milieu alcalin ont montré que la réparation des CB était totale en moins d’une heure, ce
qui est en accord avec les résultats de plusieurs travaux (295, 315, 316, 337, 338). Toutefois, nous
n’avons pas réussi à mettre en évidence la réparation des sites Fpg, du moins sur une période courte.
154 Chapitre IV : Mesure des dommages de l’ADN par la méthode des comètes
Ceci peut s’expliquer par un biais méthodologique, mais nous avons cependant observé dans les
mêmes conditions la réparation des coupures de brins. Une autre explication possible serait une
réparation plus tardive d’autres lésions comme les lésions complexes. Ce phénomène n’a cependant
pas été observé dans des travaux antérieurs.
Nous avons utilisé la méthode sous sa forme standard en milieu alcalin afin de mettre en
évidence les coupures correspondant à la somme CSB + CDB + SAL (CB). Nous avons défini les
conditions d’utilisation de la méthode qui associe des enzymes de réparation Fpg et endo III, dans le
but de mettre en évidence, respectivement les purines et les pyrimidines modifiées.
Une des principales difficultés rencontrées lors de l’utilisation de la méthode des comètes
associant les enzymes de réparation est la définition d’une gamme de dose ou de temps d’irradiation
qui soit compatible avec l’approche expérimentale. En effet diverses expériences effectuées, en
particulier avec des photosensibilisateurs, tels que le bleu de méthylène, se sont traduites par
l’absence de courbe dose-réponse (339). Il s’est avéré par la suite que ce composé avait, au cours des
expériences préliminaires, été utilisé à des concentrations trop élevées. Il faut en effet tenir compte de
la capacité de l’agent oxydatif utilisé à produire des coupures mais aussi des sites Fpg ou endo III. En
nombre trop élevé, la méthode peut rapidement être confrontée à des problèmes de saturation de
réponse. Les mesures de 8-oxodGuo, effectuées aux fortes doses d’irradiation, ont permis de définir
les domaines d’utilisation de la méthode modifiée des comètes.
B. Aspects mécanistiques
1. Rappel sur les mécanismes de formation des lésionsLa méthode des comètes associant les enzymes de réparation nous a permis d’établir le
spectre des dommages produits par le rayonnement gamma, la lumière UVA ou par les
photosensibilisateurs exogènes excités par la lumière visible. Dans le Tableau XX figurent les
rapports entre les différents taux de formation des lésions mesurées soit par les méthodes
chromatographiques (décrites dans le chapitre II) soit par la technique modifiée des comètes.
Chapitre IV : Mesure des dommages de l’ADN par la méthode des comètes 155
Tableau XX: Rapport de formation de différentes lésions dans l’ADN de monocytes exposés au
rayonnement γ du 60Co, à la lumière UVA ou à des photosensibilisateurs excités
RAPPORTSγγγγ UVA
RB
(10-2 DO)
AO
(5 10-3 D.O.)
RB
(1 D.O.)
AO
(1 D.O.)
CB/ sites (endo III+ Fpg) 1,4 0,04 ND1 ND1 4,6 7,4
CB/ sites endo III 2,4 3 ND1 ND1 4,6 7,4
CB/ sites Fpg 2,7 0,4 ND1 ND1 ND1 ND1
8-oxodGuo/FapyGua 0,4 ND2 ND2 ND2 2,6 4,5
ND1 : taux de formation de CB et/ou d’endo III inférieurs à la limite de détection,
ND2 : taux de formation de la FapyGua non déterminé.
Dans le chapitre III, nous avons présenté les mécanismes possibles de formation de la 8-
oxodGuo et des dérivés Fapy purines. Trois mécanismes de formation de la 8-oxodGuo pour l’ADN
sont connus à ce jour. Un fait intervenir l’oxygène singulet (102, 103) qui conduit exclusivement à la
formation de la 8-oxodGuo. Les deux autres mécanismes peuvent aussi générer de la FapyGua. Il
s’agit du mécanisme d’ionisation par arrachement d’un électron de la guanine et de l’addition du
radical °OH en position 8 de la guanine. Ces deux mécanismes se traduisent par la formation d’un
radical neutre intermédiaire qui peut être oxydé ou réduit pour donner, respectivement, la 8-oxodGuo
ou la FapyGua (38). Les coupures des chaînes de l’ADN peuvent principalement être générées par
action du radical °OH sur le 2-désoxyribose. Un mécanisme de coupure de l’ADN faisant intervenir
l’oxygène singulet a été proposé (340, 341). Il fait intervenir une deuxième molécule de 1O2. Cela
suppose en effet, que la 8-oxodGuo soit produite en quantités suffisamment importantes pour être à
son tour substrat de l’oxygène singulet. Or, ceci est peu probable dans l’ADN cellulaire puisque les
taux de formation de cette modification sont, quel que soit l’agent oxydant considéré, de l’ordre de 1
modification/106-108 bases (Cf. Chapitre III). Les principaux substrats d’endo III sont les diols de
thymine, la 5-hydroxy-5-méthylhydantoïne et la 5-hydroxycytosine (129). La formation de ces bases
modifiées résulte de l’attaque des pyrimidines par le radical hydroxyle (41, 342). Enfin, les sites Fpg,
constitués de 8-oxodGuo ou de dérivés Fapy purines, peuvent être produits selon les mécanismes
précédemment décrits.
2. Niveau basal des lésionsLe niveau basal des coupures (CB) varie entre 6 et 20,4 µm. La valeur la plus forte est
obtenue dans le cas des photosensibilisateurs utilisés à de fortes concentrations. On peut supposer que
156 Chapitre IV : Mesure des dommages de l’ADN par la méthode des comètes
le photosensibilisateur a un effet légèrement génotoxique par lui-même, ou que les échantillons en
dépit des précautions prises, aient été exposés à une source de lumière parasite. Dans le cas du
rayonnement gamma, un niveau basal de 16,9 µm est mesuré. Il est relativement plus important que
celui observé dans le cas de photosensibilisateurs utilisés aux faibles concentrations. Il peut
s’expliquer en partie par les contraintes matérielles imposées lors de ces expérimentations. Les
cellules étaient conservées, dans du tampon PBS, pendant un délai plus ou moins long avant
l’irradiation. En présence d’endo III, l’augmentation du moment de la queue de la comète la plus
importante est observée dans le cas de cellules traitées par 5 10-3 D.O. d’acridine orange. La plus
faible augmentation est mesurée dans le cas de l’utilisation du rose bengal à 10-2 D.O.. L’utilisation de
Fpg s’est accompagnée d’une augmentation de la valeur du moment de la queue comprise entre 5 et
12 µm, selon le modèle déterminé.
3. Irradiation gammaUn rapport de 1,4 entre les taux de formation des coupures (CB) et des sites reconnus par les
enzymes de réparation a été déterminé (Tableau XX). Cette valeur montre la contribution importante,
sur le plan quantitatif, des coupures et sites alcali-labiles dans les effets du rayonnement gamma. Ces
résultats sont assez proches de ceux de Banath qui s’est intéressé à la formation des sites Fpg et endo
III dans l’ADN de cellules exposées au rayonnement X (316). Il observe un rapport de deux en faveur
des coupures. La valeur du taux de formation des sites Fpg et des sites endo III que nous avons
déterminée est identique pour les deux enzymes. Elle est environ 2,5 fois plus faible que celle des
coupures et sites alcali-labiles. Un rapport de 1 entre bases modifiées et coupures avait été proposé
(16). Il faut ajouter que la mesure des sites reconnus par endo III ou par Fpg ne suffit à estimer
l’ensemble des dommages de bases induits par l’irradiation gamma. En effet, dans des travaux
antérieurs (343) il avait été supposé que l’utilisation des deux enzymes permettait de couvrir près de
95% du total des dommages de bases. Or, nous avons observé que le taux de formation de la 5-
HmdUrd déterminé dans le chapitre III, lésion qui n’est reconnue par aucune de ces deux enzymes et
qui de ce fait n’est pas prise en compte dans les présentes analyses, se forme en quantités importantes.
L’analyse des taux de formation des différents substrats d’endo III (Chapitre III) révèle qu’un nombre
supérieur de sites endo III était attendu. En effet le taux de formation des diols de thymidine (principal
substrat d’endo III) est de 0,097/106 bases/Gy. La somme des taux de formation de la 8-oxodGuo et de
la FapyGua, qui sont les principaux substrats de Fpg formés sous irradiation gamma, représente 0,047
lésion/106 bases/Gy. Il existe donc, d’après les données obtenues par la méthode modifiée des comètes
(qui mesurait un nombre de sites endo III et Fpg sensiblement équivalent) un déficit d’environ 0,05
substrat de Fpg/106 bases. Cette différence pourrait être encore accentuée par la mesure du taux de
formation de la 5-hydroxy-5-méthylhydantoïne et de la 5-hydroxycytosine, qui sont aussi substrats
d’endo III.
Chapitre IV : Mesure des dommages de l’ADN par la méthode des comètes 157
4. Réactions de photosensibilisationUn tout autre profil se dessine avec les photosensibilisateurs exogènes utilisés, puisque dans
ce cas, la lésion majoritairement formée est la 8-oxodGuo. Aux faibles concentrations en
photosensibilisateur, aucune formation de sites endo III n’est observée et les coupures ne sont
générées qu’en faibles quantités, lorsque l’acridine est utilisée. L’acridine orange et le rose bengal
sont connus pour générer de l’oxygène singulet (264, 265) qui explique la formation importante de 8-
oxodGuo (102, 103). Utilisés à plus forte concentration, les photosensibilisateurs produisent des
coupures de chaînes, et le rapport CB/endo III est compris entre 4,6 et 7,4. Le taux de 8-oxodGuo
mesuré par CLHP-DE est augmenté d’un facteur 40, par rapport à celui mesuré aux faibles
concentrations en photosensibilisateurs. Les dérivés Fapy purines sont mesurables mais représentent
moins de 30% du taux de 8-oxodGuo. Les sites Fpg n’ont pas pu être déterminés car on observe une
saturation de la valeur en raison du grand nombre de sites produits. Dans ces conditions très
oxydantes, les coupures peuvent provenir de l’attaque du radical hydroxyle sur le 2-désoxyribose.
Ceci peut s’expliquer par le transfert d’un électron du radical anion (réaction de type I) du
photosensibilisateur vers l’oxygène. L’anion superoxyde produit peut se dismuter en H2O2, pour
générer, via la réaction de Fenton, le radical °OH. Cependant l’implication de ce radical suggérerait
d’observer un rapport CB/endo III proche de celui observé dans le cas de l’irradiation gamma, ce qui
n’est pas le cas. Une deuxième possibilité pour expliquer la formation de coupures de brins de l’ADN
et de dérivés Fapy purines, est l’existence du mécanisme de type I qui conduirait à une ionisation de la
guanine. Le cation radical formé peut s’hydrater ou perdre un proton pour donner un radical
précurseur de la 8-oxodGuo et de la FapyGua d’une part, et de l’oxazolone d’autre part. Ce dernier
composé est alcali labile et pourrait être à l’origine de coupures des chaînes d’ADN, révélées par
l’étape d’électrophorèse en milieu alcalin.
Dans une étude de Epe et al. (264), l’induction des dommages dans l’ADN isolé ou cellulaire
par des photosensibilisateurs exogènes tels que le bleu de méthylène et l’acridine orange a été
estimée. Les résultats montrent la forte capacité de l’acridine orange à former des sites Fpg en
présence de lumière visible. Le rapport sites Fpg/coupures est de 2,6. Nous avons dans notre étude,
déterminé un rapport de 4. L’induction des sites endo III, mesurés dans l’ADN de bactéries ou dans de
l’ADN isolé est dans tous les modèles très faible, et négligeable devant l’importance des sites Fpg
(264). La mesure des dommages induits dans l’ADN isolé par les rayons X a également été effectuée.
Il a été observé que le taux de formation des sites Fpg est similaire à celui des coupures, avec une
valeur qui est environ 1,5 fois supérieure à celle des sites endo III. Toutefois l’extrapolation de ces
résultats à l’ADN cellulaire n’est pas possible.
158 Chapitre IV : Mesure des dommages de l’ADN par la méthode des comètes
5. Irradiation UVADans le cas d’exposition des cellules au rayonnement UVA, le profil de formation des lésions
induites apparaît être un compromis entre celui généré d’une part par le radical hydroxyle (irradiation
gamma), et celui produit par l’oxygène singulet (photosensibilisateurs exogènes). La présence de sites
endo III suggère l’implication du radical hydroxyle. Ceci est conforté par l’observation d’un rapport
CB/sites endo III de 3, proche de celui déterminé pour le rayonnement gamma. Le fait que plusieurs
travaux aient mis en évidence la présence du peroxyde d’hydrogène dans des cellules exposées au
rayonnement UVA (100) suggère que le radical hydroxyle est impliqué dans la formation des CB.
Des mécanismes de type I peuvent être à l’origine indirecte du radical hydroxyle selon le processus
décrit précédemment. Il faut souligner que les dérivés Fapy purines n’ont pas été mis en évidence par
la méthode de CG-SM. Toutefois, le manque de sensibilité de la technique empêche d’en exclure la
formation, qui au mieux serait relativement faible.
Le rapport CB/sites Fpg de 0,4 (Tableau XX) souligne l’importante formation des sites Fpg par
rapport aux coupures de chaînes de l’ADN. Cette forte contribution des sites Fpg impliquerait
l’oxygène singulet, ce qui est en accord avec d’autres études (86, 160, 329).
- Chapitre V -
Calibration de la méthode des comètes :
aspects mécanistiques
Chapitre V : Calibration de la méthode des comètes : aspects mécanistiques 160
IntroductionL’utilisation comparative de la méthode des comètes sous sa forme standard et celle associée
à des enzymes de réparation telles que Fpg ou endo III permet d’estimer le taux de formation des
coupures de brins (simples ou doubles et sites alcali-labiles) par rapport aux modifications de bases
reconnues par les enzymes. Le logiciel de traitement d’images met à la disposition de l’utilisateur de
nombreux paramètres pour quantifier les dommages de l’ADN, tels que la longueur de la queue ou le
moment de la queue de la comète. L’unité du moment de la queue de la comète que nous avons
choisie dans ce travail pour estimer les dommages de l’ADN, est le µm. Or, il est intéressant de
pouvoir exprimer l’atteinte de l’ADN non pas en terme de µm, mais en la rapportant au nombre de
modifications par million de bases normales. Pour cela il est nécessaire de calibrer la méthode. Nous
allons dans ce chapitre aborder les deux façons possibles de conforter l’aspect quantitatif de ces
mesures.
Nous aurons recours aux différents systèmes oxydants présentés dans les chapitres
précédents : rayonnements gamma et UVA, photosensibilisation par le rose bengal et l’acridine
orange en présence de lumière visible.
L’utilisation de rayonnement UVA ou de photosensibilisateurs exogènes pour compléter
l’étude des effets du rayonnement gamma se justifie par le fait que ces agents, comme le montrent les
résultats obtenus dans les chapitres III et IV, agissent principalement par l’intermédiaire de l’oxygène
singulet. De ce fait, ils produisent un spectre de lésions plus restreint que celui obtenu dans le cas de
l’irradiation gamma.
I. PRINCIPE DE LA CALIBRATION DE LA METHODE DES COMETES
A. IntroductionLa méthode des comètes associée à l’utilisation de Fpg a été utilisée dès 1996, pour estimer le
niveau basal de 8-oxodGuo dans l’ADN cellulaire (159, 344). Pour être quantitative, la méthode sous
sa forme standard devait être calibrée. Les auteurs ont eu recours à la valeur du nombre de coupures
(CB) radio-induite, qui avaient été déterminées par d’autres techniques. L’exposition de cellules au
rayonnement gamma du 60Co permettait d’établir une courbe dose-réponse, Y(µm), entre la dose
d’irradiation gamma et le moment de la queue de la comète exprimé en micromètres.
Y(µm) = tan α dose (Gy)
où tan α, représentait la pente de la courbe dose-réponse.
Cette courbe dose réponse était établie pour des conditions expérimentales définies telles que
la densité du gel et le temps d’électrophorèse. Afin de corréler 1 µm à un nombre de coupures
produites par cellule, les auteurs utilisaient la valeur de référence qui est de 1000 coupures produites
par Gy de rayonnement de faible TEL et par cellule (16, 270). Basée sur une simple extrapolation
161 Chapitre V : Calibration de la méthode des comètes : aspects mécanistiques
linéaire, la calibration de la méthode était établie en reliant l’augmentation du moment de la queue de
la comète obtenue pour un Gy, Y1Gy(µm), à la valeur de 1000 CSB/cellule (Figure 119) :
Y1Gy(µm) = tan α1 1 (Gy) = 1000 CSB/cellule
Cette approche négligeait cependant la formation des CDB + SAL. Elle assimilait en effet la
pente correspondant à la formation des CSB + CDB + SAL à celle correspondant à la formation des
CSB seules. Cette approximation est justifiée dans la mesure où le nombre de CDB, compris entre 40
et 100 par cellule/Gy, est négligeable, et que peu de sites alcali-labiles, comparativement aux CSB,
sont formés par irradiation gamma de l’ADN. Une fois la méthode calibrée, la correspondance établie
permettait de déterminer le taux de formation et le niveau basal des lésions par simple extrapolation
linéaire. Il était possible en utilisant les enzymes de réparation, Fpg ou endo III de quantifier le taux
de formation et le niveau basal des bases modifiées substrats des enzymes. Pour cela, la différence ye-
y0 donnait le niveau basal de ces lésions et la différence de pente tan (αe-α1) permettait d’accéder au
taux de formation à partir de la relation suivante :
nombre de lésions substrats de l’enzyme/cellule = Yenz.(µm) 1000/Y1Gy(µm)
Cette approche a été en particulier utilisée pour mesurer le niveau basal de 8-oxodGuo dans
l’ADN cellulaire. Dans ce cas, il était supposé qu’un site reconnu par Fpg correspondait à une 8-
oxodGuo et le calcul ne prenait pas en compte les autres substrats de l’enzymes comme les dérivés
Fapy purines.
X, dose d'irradiation (Gy)
Y, moment de la queue (µm)
α1
CSB +DSB +SAL
CSB +CDB +SAL + sites
recon
nus
par l'e
nzyme
0
αe
ye
y0
1000 CSB/cellule/Gytan α α α α1111 = = = =
Y1Gy (µm) = tan α 1 1 Gy
Yenz. (µm) = tan (αe −α 1) X
Figure 119 : Principe de la calibration de la méthode des comètes à partir du taux de formation desCSB sous irradiation gamma
Le système de calibration que nous avons utilisé repose sur une approche différente (Figure
120). Il ne se base pas sur le taux de formation des coupures simple brin produites sous irradiation
gamma mais sur le taux de formation des sites Fpg. L’augmentation du moment de la queue de la
comète due à l’utilisation de Fpg est corrélée à la valeur de formation, sous irradiation, des principaux
Chapitre V : Calibration de la méthode des comètes : aspects mécanistiques 162
substrats de l’enzyme. La mesure du taux de formation de la 8-oxoGua, de la FapyGua et de la
FapyAde a été déterminée dans le chapitre III par CLHP-DE, par CG-SM ou par CLHP-SM/SM, dans
des gammes de doses comprises entre 0 et 80 Gy pour la 8-oxoGua et 0 et 1000 Gy pour les dérivés
Fapy purines. Dans notre approche, l’augmentation de moment de la queue de la comète par Gy en
présence de Fpg, YFpg(µm), correspondant à une augmentation de la pente tan(αe−α1) est due, d’une
part à la 8-oxoGua (augmentations de pente tan α8-oxod.) et d’autre part aux dérivés Fapy de la guanine
et de l’adénine (augmentation de pente tan αFG et tan αFA, respectivement). Si l’approche est
satisfaisante, la calibration ainsi obtenue doit permettre de déterminer, à partir de la mesure de tan α1,
un nombre de coupures (CSB) produites par Gy proche de 1000/cellule, qui est la valeur de référence
utilisée précédemment.
X, dose d'irradiation (Gy)
Y, moment de la queue (µm)
CSB +DSB +SALCSB +C
DB +SAL + si
tes re
conn
us
par F
pg
0
αe
yey0
Substrats d
e Fpg
FapyGua
dosed'irradiation
CG-SMαFG
8-oxoGua
dosed'irradiation
CLHP/DEα8-oxod.
FapyAde
dosed'irradiation
CLHP-SM/SMαFA
α1
α e Y enz.(µm) = tan X = (tan α8-oxod. + tan αFA + tan αFG ) X
Figure 120 : Principe de la calibration de la méthodes des comètes à partir du taux de formation dessites Fpg
B. Hypothèses de la calibrationLa méthode de calibration que nous proposons de mettre en œuvre repose sur plusieurs
hypothèses :
- Hypothèse de spécificité de substrat : un site reconnu par Fpg correspond à une 8-oxoGua, à
une FapyGua où à une FapyAde ;
163 Chapitre V : Calibration de la méthode des comètes : aspects mécanistiques
- Hypothèse d’accessibilité : l’enzyme a accès à tous ses substrats ;
- Hypothèse basée sur l’extrapolation : il est possible d’extrapoler les taux de formation de 8-
oxoGua, FapyGua et de FapyAde, déterminés au delà de 30 Gy au domaine de dose utilisé
dans la méthode des comètes (< 8 Gy) ;
- Hypothèse de stabilité des substrats de l’enzyme en milieu alcalin.
C. Stabilité des substrats de la protéine Fpg en milieu alcalinToutes les études faisant appel à la méthode des comètes modifiée ou à la technique d’élution
alcaline, pour estimer le niveau basal de 8-oxoGua dans l’ADN cellulaire, reposent sur l’hypothèse de
travail, quel que soit le système de calibration, qu’un site Fpg correspond à une 8-oxoGua. En effet,
jusqu’à de récents travaux (228), aucune méthode décrite ne permettait d’effectuer un dosage correct
des dérivés Fapy purines. Lorsque l’on utilise la méthode modifiée des comètes, une des conditions
pour que les dérivés Fapy purines soient effectivement reconnus par l’enzyme Fpg, est que les
différents traitement alcalins utilisés lors de l’analyse, n’altèrent pas leur stabilité au sein de la
molécule d’ADN. Nous avons étudié la stabilité des dérivés Fapy purines dans le tampon de lyse (2,5
M NaCl, 100 mM Na2EDTA, 10 mM Tris, pH 10, 1% sodium sarcosinate, 1% Triton X-100, 10%
DMSO) et dans le tampon d’électrophorèse (300 mM NaOH, 1 mM Na2EDTA).
1. Stabilité de la 8-oxodGuoPlusieurs travaux ont montré la stabilité de la 8-oxoGua en milieu alcalin (345, 346). La
stabilité de la 8-oxodGuo dans les conditions plus spécifiques de la méthode modifiée des comètes a
été démontrée dans la plupart des études impliquant des photosensibilisateurs de type II.
2. Stabilité des dérivés Fapy purines
a) Stabilité des dérivés Fapy purines dans les conditions de lyse (pH
10)
L’ADN isolé de thymus de veau irradié à 40 Gy de rayonnement gamma du 60Co, a été
dissous dans le tampon de lyse des cellules pour une durée comprise entre 30 min et 24 h. Le mélange
a ensuite été élué sur colonne d’exclusion. Le principe de ces colonnes est basé sur une élution plus
rapide des molécules de grande taille, comparativement aux molécules de faible taille. Il a été
possible, dans ces conditions, de séparer physiquement l’ADN des éventuelles molécules de dérivés
Fapy purines libérées par le traitement alcalin. A chaque échantillon élué, ont été ajoutées 100 pmoles
de standard interne [M+3] avant séchage sous vide. Une hydrolyse par la nucléase P1 et par l’acide
formique a ensuite été effectuée avant dérivation des échantillons et analyse par CG-SM. Le rapport
entre l’aire du pic obtenu pour le dérivé Fapy [M] de l’ADN et pour son standard interne [M+3], a été
déterminé pour les différentes durées d’incubation dans le tampon de lyse (Figure 121).
Chapitre V : Calibration de la méthode des comètes : aspects mécanistiques 164
0
2
4
6
8
10
0 0,5 1 2 24
pH 7
pH 10
Rapport des aires [M]/[M+3]
Durée de l'incubation (h)
Figure 121 : Rapport [M]/[M+3], pour les dérivés FapyGua mesurés dans les échantillons d’ADNmaintenus à pH 7 ou 10
Aucune différence significative n’a été observée pour les valeurs de la FapyGua et de
FapyAde, dans les deux catégories d’échantillons maintenues à pH 7 et à 10 respectivement. La
mesure de l’ADN dans chaque échantillon a permis de s’assurer que la quantité d’ADN élué sur des
colonnes d’exclusion, était bien indépendante du traitement subi.
b) Stabilité des dérivés Fapy dans les conditions d’électrophorèse
L’ADN isolé de thymus de veau exposé à une dose de 40 Gy de rayonnement gamma du 60Co
a été incubé dans le tampon d’électrophorèse pour différentes durées. Le protocole suivi est le même
que celui décrit précédemment. Le rapport des aires entre le produit et son standard interne a été
calculé. Aucune différence notable n’a été observée entre les échantillons contrôle et ceux maintenus
à pH 13 (Figures 122-123).
Rapport des aires [M]/[M+3]
0
2
4
6
8
10
12
0 1 2 24
pH 7
pH13
Durée de l’incubation (h)
Figure 122 : Rapport [M]/[M+3], pour les dérivés FapyGua dosés dans les échantillons d’ADNmaintenus à pH 7 ou 13
165 Chapitre V : Calibration de la méthode des comètes : aspects mécanistiques
0,00,20,40,60,81,01,21,41,6
0 1 2 24
pH 7
pH 13
Rapport des aires [M]/[M+3]
Durée de l'incubation (h)
Figure 123 : Rapport [M]/[M+3], pour les dérivés FapyAde dosés dans les échantillons d’ADNmaintenus à pH 7 ou 13
c) Contrôle de l’efficacité des colonnes d’exclusion
Afin de conforter les résultats précédents, il était nécessaire de s’assurer de l’efficacité
d’exclusion des dérivés Fapy purines par les colonnes Nap 25, utilisées pour purifier l’ADN. Une
expérience a consisté à enrichir les échantillons d’ADN isolé de thymus de veau avec 100 pmoles de
FapyGua. Le niveau basal de FapyGua présent « spontanément » dans l’ADN est d’environ 15 à 20
pmoles de FapyGua par échantillon. L’ADN a été mis en présence ou non du tampon
d’électrophorèse, pendant 12 h. Comme précédemment, le mélange contenant l’ADN a été déposé sur
une colonne d’exclusion, et différentes fractions ont été recueillies. La fraction 1 correspond au
volume mort de la colonne. La fraction 2 correspond à l’élution de l’ADN proprement dite. Enfin, la
fraction 3 correspond à l’ajout d’un volume important (3,5 ml) d’eau désionisée en tête de colonne.
Comme dans les expériences précédentes, chaque fraction recueillie est soumise au traitement adéquat
avant analyse des rapports [M]/[M+3] par CG-SM. 100 pmoles de standard interne [M+3] ayant été
ajoutées à chaque échantillon, un rapport [M]/[M+3] supérieur à 1, suggérerait l’élution des dérivés
Fapy purines dans la fraction contenant l’ADN (Figure 124).
Fraction 2Rapport [M]/[M+3]
0,0
0,5
7 S 7 13 S 13
Echantillons
Figure 124 : Contrôle de l’efficacité d’exclusion des colonnes
Chapitre V : Calibration de la méthode des comètes : aspects mécanistiques 166
Il est confirmé qu’aucun dérivé Fapy n’est détecté dans la fraction 1. L’ADN est élué dans la
fraction 2. Le rapport [M]/[M +3] montre qu’il n’existe pas de différences entre les échantillons
enrichis en dérivés Fapy purines (7 S ou 13 S) et les échantillons contrôle (7 ou 13) (Fraction 2). Ceci
confirme bien les capacités d’exclusion des colonnes utilisées pour les dérivés Fapy purines. On ne
constate à nouveau aucune différence entre les échantillons maintenus à pH 7 ou 13. Les résultats
obtenus sur la fraction 3 ont confirmé que la plus grande partie de l’ADN était éluée dans la fraction
2, et que les dérivés Fapy de la guanine et de l’adénine correspondant au dopage des échantillons sont
présents dans la fraction 3.
d) Conclusion
Ces travaux montrent l’efficacité des colonnes d’exclusion Nap 25 pour séparer les dérivés
Fapy purines des molécules d’ADN. Les dérivés Fapy purines présents dans une molécule d’ADN
ayant été soumis aux traitements alcalins, analogues à ceux employés lors de l’analyse par
microélectrophorèse sur gel, restent présents dans la structure de l’ADN. Ils peuvent ainsi être ensuite
substrats de l’enzyme Fpg.
II. CALIBRATION
Nous avons pour les quatre systèmes d’oxydation présentés dans les chapitres III et IV,
exprimé le niveau basal et le taux de formation des différentes lésions en terme de migration de
l’ADN en µm. La méthode standard des comètes en milieu alcalin permet de déterminer le taux de
formation des CB. Associée à des enzymes de réparation, telles que Fpg ou endo III, elle permet
d’estimer, simultanément, la formation des coupures et de sites reconnus par les ADN N-glycosylases
(CB + sites substrats de l’enzyme). Afin d’obtenir uniquement le taux de formation des sites substrats
de l’enzyme, il suffit de faire la différence entre les deux taux de formation de ces deux classes de
lésions. Ceci revient à évaluer la différence des pentes des droites de régression linéaire reliant le
moment de la queue de la comète à la dose ou au temps d’exposition, obtenue en présence ou non de
Fpg et d’endo III : pente (CB + sites substrats de l’enzyme) - (CB). Le taux de formation des sites
reconnus par l’enzyme peut ensuite être corrélé aux valeurs de formation de 8-oxoGua, FapyGua et
FapyAde, mesurés après exposition à de fortes doses par les méthodes chromatographiques.
A. Modèle I : Irradiation gammaLe taux de formation des coupures et des sites reconnus par les enzymes Fpg et endo III, en
fonction de la dose appliquée est présenté dans la Figure 125. Une dose de 1 Gy se traduit par une
augmentation du moment de la queue de la comète de 7,8 µm, correspondant aux coupures (CB). On
note une augmentation de 2,8 µm et 3,1 µm du moment de la queue de la comète correspondant,
respectivement, à l’induction des sites Fpg et endo III.
167 Chapitre V : Calibration de la méthode des comètes : aspects mécanistiques
y = 7,8 x + 16,9
y = 3,1 x + 12,3
y = 2,8 x + 12,3
0
20
40
60
80
100
0 2 4 6 8 10Dose (Gy)
Moment de la queue
CSB +CDB + SAL
sites Fpg
sites endo III
Figure 125 : Augmentation du moment de la queue de la comète, correspondant à trois classes delésions oxydatives en fonction de la dose d’irradiation gamma
L’augmentation du moment de la queue de la comète de 2,8 µm/Gy correspondant à la mesure
des sites Fpg a été corrélée aux taux formation de 8-oxoGua et des dérivés Fapy purines, mesurés
respectivement par CLHP-DE ou par CG-SM et CLHP-SM/SM, soit, au total, 0,040 modification/106
bases/Gy.
Tableau XXI : Calibration de la méthode des comètes (irradiation gamma)
Méthode des comètes(µm/Gy)
Taux de formation des lésions par approchechromatographique (/106 bases/Gy)
Sites Fpg 8-oxodGuo FapyGua FapyAde
2,8 0,011 0,027 0,0024
CALIBRATION 1 modification pour 106 bases normales correspond à 70 µm
Une calibration de 1 modification par 106 bases correspondant à 70 µm peut ainsi être
déterminée.
B. Modèle II : Irradiation de type UVALa formation des coupures après irradiation UVA se traduit par une augmentation du moment
de la queue de la comète de 0,54 µm par kJ.m-2. Une augmentation de 1,14 µm et 0,2 µm par kJ.m-2
est mesurée en présence, respectivement, de Fpg et d’endo III (Figure 126).
Chapitre V : Calibration de la méthode des comètes : aspects mécanistiques 168
y = 1,14 x + 6,9 sites Fpg
y = 0,54 x + 10,1 CSB + CDB + SAL
y = 0,20 x + 9,8 sites endo III
0
5
10
15
20
25
0 5 10 15
Dose (kJ.m -2 )
Moment de la queue (µm)
Figure 126 : Augmentation du moment de la queue de la comète, correspondant à trois classes delésions oxydatives en fonction de la dose de rayonnement UVA
La corrélation entre l’augmentation du moment de la queue de la comète due à l’excision des
sites Fpg, et le taux de 8-oxoGua (0,00098 8-oxoGua/kJ.m-2), mesuré par CLHP-DE, permet d’obtenir
la calibration suivante : 1 modification/106 bases correspond à 116 µm. Le taux de formation des
dérivés Fapy purines qui n’a pas pu être déterminé par CG-SM a été estimé négligeable.
Tableau XXII : Calibration de la méthode des comètes (irradiation UVA)
Méthode des comètes(µm/kJ.m-2)
Taux de formation des lésions par approchechromatographique (/106 bases/kJ.m-2)
Sites Fpg 8-oxodGuo FapyGua FapyAde
1,14 0,00098 (< 2*) (< 3*)
CALIBRATION 1 modification pour 106 bases normales correspond à 116 µm
* : limite de sensibilité de détection des dérivés Fapy purines par la méthode de CG-SM (exprimée
pour 106 bases).
C. Modèle III : Réactions de photosensibilisationPour la calibration de la méthode des comètes, seuls les résultats des expériences mettant en
jeu de faibles concentrations de photosensibilisateurs (10-2 D.O. de rose bengal et 5 10-3 D.O.
d’acridine orange) ont été pris en compte. En effet, dans les conditions où les photosensibilisateurs
ont été utilisés à une densité optique de 1, la formation de sites Fpg était trop importante, pour qu’une
courbe dose-réponse soit établie.
169 Chapitre V : Calibration de la méthode des comètes : aspects mécanistiques
1. Acridine orangeAvec le modèle représenté par l’acridine orange en présence de lumière visible, un taux de
formation des CB correspondant à un moment de la queue de la comète de 1,5 µm/min a été mesuré.
Un moment de la queue de la comète de 6 µm/min correspond à l’excision des sites reconnus par Fpg.
Aucune formation de sites endo III n’a été mise en évidence (Figure 127).
CSB + CDB + SAL
0
20
40
60
0 2 4 6 8
sites Fpgy = 6 x + 9,3
y = 1,5 x + 5,9
Temps d’exposition (min)
Moment de la queue (µm)
Figure 127 : Augmentation du moment de la queue de la comète, correspondant à deux classes delésions oxydatives en fonction du temps d’exposition à la lumière visible (photosensibilisation par
l’acridine orange)
Tableau XXIII : Calibration de la méthode des comètes (photosensibilisation par l’acridine orange)
Méthode des comètes(µm/kJ.m-2)
Taux de formation des lésions par approchechromatographique (/106 bases/min)
Sites Fpg 8-oxodGuo FapyGua FapyAde
6 0,097 (< 2*) (< 3*)
CALIBRATION 1 modification pour 106 bases normales correspond à 62 µm
* : limite de sensibilité de détection des dérivés Fapy purines par la méthode de CG-SM (exprimée
pour 106 bases).
La corrélation entre l’augmentation du moment de la queue de la comète due à l’excision des
sites Fpg et le taux de 0,097 8-oxodGuo/min, mesuré par CLHP-DE, permet d’obtenir une calibration
de 1 modification/106 bases. Cette valeur correspond à un moment de la queue de la comète de 62 µm.
Le taux de formation des dérivés Fapy purines n’a pas pu être déterminé par la méthode de CG-SM. Il
a été estimé, au mieux à une valeur inférieure à 2 dérivés/106 bases.
Chapitre V : Calibration de la méthode des comètes : aspects mécanistiques 170
2. Rose bengalDans le cas du modèle représenté par le rose bengal, aucune formation de coupures ni de sites
endo III, n’a été mise en évidence pour des temps d’exposition compris entre 0 et 10 min (Figure 128).
y = 2,96 x + 5
0
10
20
30
0 5 10
Temps d'exposition (min)
Moment de la queue (µm)
Figure 128 : Augmentation du moment de la queue de la comète, correspondant aux sites Fpg enfonction du temps d’exposition à la lumière visible (photosensibilisation par le rose bengal)
L’augmentation du « moment de la queue de la comète" due à la reconnaissance des sites Fpg
est de 2,9 µm/min. Corrélée au taux de 8-oxodGuo mesuré par CLHP-DE, on conclut que 1
modification/106 bases correspond à un moment de la queue de la comète de 55 µm.
Tableau XXIV : Calibration de la méthode des comètes (photosensibilisation par le rose bengal)
Méthode des comètes(µm/kJ.m-2)
Taux de formation des lésions par approchechromatographique (/106 bases/min)
Sites Fpg 8-oxodGuo FapyGua FapyAde
2,96 0,054 (< 2*) (< 3*)
CALIBRATION 1 modification pour 106 bases normales correspond à 55 µm
* : limite de sensibilité de détection des dérivés Fapy purines par la méthode de CG-SM (exprimée
pour 106 bases).
III. EXPRESSION DES DOMMAGES
Le système représenté par les photosensibilisateurs exogènes est sans doute le modèle le plus
approprié pour établir une corrélation entre le nombre de sites Fpg et le taux de 8-oxodGuo mesuré
par CLHP-DE. De tels agents de photosensibilisation, sont en effet supposés agir préférentiellement
selon un mécanisme de type II, ce qui semble conforté par les résultats que nous avons obtenus. Le
mécanisme de type II conduit comme nous l'avons mentionné, à la formation d'oxygène singulet qui
réagit de façon préférentielle avec la dGuo pour produire la 8-oxodGuo. De tels systèmes photo-
oxydants permettent de s’affranchir de la mesure des dérivés Fapy purines qui bien souvent n’est pas
171 Chapitre V : Calibration de la méthode des comètes : aspects mécanistiques
possible par manque de sensibilité de la méthode CG-SM. De plus l'oxygène singulet a une action
spécifique sur la dGuo. En effet, il n’oxyde pas d'autres constituants de l'ADN. Or, un des problèmes
soulevés par l'utilisation d'enzymes de réparation est leur manque de spécificité. Plusieurs travaux font
état de reconnaissance par la protéine Fpg d'autres substrats que la 8-oxoGua, FapyGua ou FapyAde
(128, 347). L'utilisation d'un agent oxydatif comme le radical hydroxyle rend discutable l’hypothèse
selon laquelle un site Fpg correspond exclusivement à une des trois lésions précédemment citées. Le
radical °OH qui est très réactif peut produire d'autres substrats, connus ou non, de la protéine Fpg. Les
deux modèles représentés par les photosensibilisateurs donnent des calibrations très proches. Ainsi,
une valeur moyenne de 1 modification/106 bases correspondant à 58,5 µm a été retenue pour calibrer
la méthode modifiée des comètes.
A. Niveau basal de 8-oxodGuo (assimilée aux sites Fpg)Le niveau basal de 8-oxodGuo dans l’ADN cellulaire peut être déterminé à partir du niveau
mesuré des sites Fpg. Ceci suppose qu’un site reconnu par la protéine Fpg corresponde à une 8-
oxodGuo. Nous avons constaté que ceci n’était pas toujours vrai. Toutefois, cette approximation sera
faite afin de pouvoir estimer le niveau basal de 8-oxodGuo dans l’ADN cellulaire par cette approche.
La valeur obtenue surestimera, par conséquent le taux réel de 8-oxodGuo. Ce niveau basal est
rapporté dans le Tableau suivant. La quantité des dérivés Fapy purines (70%) déterminée dans le
modèle de l’irradiation gamma n’est par conséquent pas extrapolé au niveau basal. Pour les autres
agents d’oxydation, la contribution n’est également pas prise en compte. Le taux de 8-oxodGuo, sur la
base de la calibration précédemment définie, est compris entre 0,08 et 0,21 8-oxodGuo/106 bases
selon le système oxydant étudié (Tableau XXV).
Tableau XXV : Niveau basal des sites Fpg (assimilés ici à la 8-oxodGuo)
Méthode des comètes
Sites Fpg (µm) Nombre de 8-oxodGuo /106
bases
Irradiation gamma 12,3 0,21
Irradiation UVA 6,9 0,11
Rose bengal + lumière visible 5 0,08
Acridine orange + lumière visible 9,3 0,15
Chapitre V : Calibration de la méthode des comètes : aspects mécanistiques 172
B. Niveau basal des sites endo III
Tableau XXVI : Niveau basal des sites endo III
Méthode des comètes
Sites endo III(µm)
Nombre de sites endoIII/106 bases
Irradiation gamma 12,3 0,21
Irradiation UVA 9,8 0,16
Rose bengal + lumière visible 3,0 0,05
Acridine orange + lumière visible 20 0,34
Rose bengal + lumière visible (1 D.O.) 6,4 0,10
Acridine orange + lumière visible (1 D.O.) 16,2 0,27
Le niveau basal des sites endo III varie fortement entre 0,05 et 0,34 sites/106 bases. La plus
forte valeur obtenue avec l’acridine orange est due à la seule présence du photosensibilisateur. Le
niveau basal est sensiblement du même ordre de grandeur que le celui des sites Fpg (Tableau XXVI).
C. Niveau basal des coupures (CSB + CDB + SAL)
Tableau XXVII : Niveau basal des coupures
Méthode des comètes
CSB +CDB +SAL (µm)
Nombre de coupures/106 bases
Irradiation gamma 16,9 0,29
Irradiation UVA 10,6 0,18
Rose bengal + lumière visible (10-2 D.O.) 7,5 0,13
Acridine orange + lumière visible (5.10-3 D.O.) 6 0,10
Rose bengal + lumière visible (1 D.O.) 20,4 0,34
Acridine orange + lumière visible (1 D.O.) 15,8 0,27
Le niveau basal des coupures de chaîne de l’ADN et des sites alcali-labiles varie entre 0,10 et
0,34 coupures/106 bases (Tableau XXVII).
D. Taux de formation des différentes lésionsLes Figures 125-126-127-128 permettent à partir de la calibration précédemment définie,
d’estimer le taux de formation et le niveau basal des coupures (CSB +CDB +SAL), des sites Fpg et
173 Chapitre V : Calibration de la méthode des comètes : aspects mécanistiques
endo III. Les mesures effectuées par l’approche chromatographique donnent les taux de formation de
la 8-oxodGuo, de FapyGua et de FapyAde. Ces valeurs sont rapportées dans le Tableau ci-dessous.
Tableau XXVIII : Taux de formation des différentes lésions (exprimés en nombre de modifications/106
bases normales)
Irradiationgamma
Irradiation UVA Rose Bengal
(0,01 D.O.)
Acridine orange
(0,005 D.O.)
Formation/Gy Formation/ kJ.m-2 Formation/min Formation/min
8-OxodGuo (CLHP-DE) 0,011/106 bases 0,00098/106 bases 0,054/106 bases 0,097/106 bases
FapyGua (CG-SM) 0,027/106 bases N D N D N D
Sites Fpg 2,8 µm
0,049/106 bases *
0,114 µm
0,0020/106 bases*
2,96 µm
0,054/106 bases*
6 µm
0,097/106 bases *
Sites endo III 3,1 µm
0,054/106 bases *
0,019 µm
0,0003/106 bases *
< 0,5 µm
< 0,01/106 bases *
< 0,5 µm
< 0,01/106 bases *
CSB + CDB + SAL 7,8 µm
0,13/106 bases *
0,056 µm
0,0009/106 bases *
< 0,5 µm
< 0,01/106 bases *
1,5 µm
0,026/106 bases *
ND : formation en dessous de la limite de détection,
* : formation exprimée en nombre de lésions /106 bases en utilisant la valeur de la calibration selon
laquelle 1 modification/106 bases correspond à 58,5 µm.
IV. DISCUSSION DES RESULTATS
A. Niveau basal de la 8-oxodGuoUn des principaux intérêts de la calibration de la méthode des comètes a été de mesurer le
niveau basal de 8-oxodGuo. Comme rapporté dans le chapitre III, des écarts, parfois d’un facteur
1000, avaient été précédemment observés selon l’approche expérimentale utilisée.
Le niveau basal de 8-oxodGuo mesuré par la méthode des comètes couplée à l’utilisation de
Fpg indique des valeurs comprises entre 0,08 et 0,21 8-oxodGuo/106 bases. Ces valeurs bien
inférieures à celles déterminées par CG-SM (152, 234, 239, 251, 252) sont en accord avec les
récentes mesures effectuées par CLHP-DE (209), ou avec d’autres travaux faisant appel à la méthode
des comètes, ou la technique d’élution alcaline couplée à Fpg (161, 329, 344, 348). Ces travaux
montrent que les efforts pour limiter les artefacts liés à l’oxydation des bases normales
s’accompagnent d’une réduction du niveau basal d’un facteur 100 à 1000. La méthode des comètes
ainsi calibrée permet de mesurer le taux de 8-oxodGuo (assimilé aux sites Fpg) dans l’ADN de
cellules exposées à des doses aussi faibles que 2 Gy de rayonnement gamma, contre 35 Gy pour
Chapitre V : Calibration de la méthode des comètes : aspects mécanistiques 174
l’analyse par CLHP-DE (349, 350). La méthode est particulièrement adaptée à la mesure de faibles
niveaux de dommages. La calibration permet également d’estimer le taux de formation des coupures
et des sites endo III. Par exemple, dans le cas de l’irradiation gamma, un taux de formation de 0,13
CB/106 bases par Gy a été déterminé. Rapporté à la cellule, cette valeur correspond à 1600 CB. Ce
nombre est relativement proche des 1000 CSB qui avaient été suggérées.
B. Aspects mécanistiquesA partir de la méthode des comètes ainsi calibrée, il a été possible de comparer les taux de
formation des coupures et des sites endo III avec les mesures chromatographiques de 8-oxodGuo,
FapyGua et FapyAde, et ceci pour chaque système oxydant étudié. Ceci nous a permis de discuter des
mécanismes conduisant à la formation de ces lésions (349).
Un récapitulatif des résultats de mesure de plusieurs lésions induites par des
photosensibilisateurs à forte concentration est présenté dans le Tableau XXIX. L’intérêt d’utiliser ces
agents à plus forte concentration, se justifie par les informations qu’ils apportent en terme de
mécanismes de production des lésions. L’extrapolation aux domaines de concentrations cent fois plus
faibles demande néanmoins certaines précautions, car les mécanismes mis en jeu peuvent être
sensiblement différents.
Tableau XXIX : Taux de formation des lésions produites par les photosensibilisateurs, utilisés à une
densité optique de 1 et excités par la lumière visible (exprimés en nombre de modifications/106 bases
normales)
Rose bengal
(1 D.O.)
Acridine orange
(1 D.O.)Formation/min Formation/min
8-OxodGuo (CLHP-DE) 1,88/106 bases 3,93/106 bases
FapyGua (CG-SM) 0,66/106 bases 0,90/106 bases
Sites endo III 5,3 µm
0,09/106 bases *
9,8 µm
0,17/106 bases *
CSB + CDB + SAL 24,7 µm
0,42/106 bases *
72 µm
1,23/106 bases *
* : formation exprimée en nombre de lésions /106 bases en utilisant la valeur de la calibration selon
laquelle 1 modification/106 bases correspond à 58,5 µm.
175 Chapitre V : Calibration de la méthode des comètes : aspects mécanistiques
1. Niveau basal des différentes lésionsLes rapports entre les différentes lésions mesurées dans les cellules contrôle sont rapportés
dans le Tableau XXX. Ce niveau basal est le reflet du nombre de lésions correspondant au «bruit de
fond » cellulaire. Il peut aussi donner des indications sur la qualité des conditions expérimentales.
Tableau XXX : Rapports entre les différentes lésions mesurées dans l’ADN de cellules contrôle
RAPPORTSγγγγ UVA
R.B.
(10-2 D. O.)
A.O.
(5 10-3 D. O.)
R.B.
(1 D. O.)
A.O.
(1 D. O.)
Sites endo III/CB 0,72 0,92 0,40 3,33* 0,31 1,02
Sites Fpg/CB 0,72 0,65 0,66 1,55*
Sites endo III/ Fpg 1,00 0,70 1,66 0,46
CB : correspond à la somme CSB + CDB + SAL,
* : valeur élevée du nombre de sites endo III ou Fpg traduisant un possible effet oxydant du
photosensibilisateur en absence de lumière.
S’agissant du même type cellulaire utilisé dans tous les modèles, nous devrions obtenir des
valeurs de rapports similaires. En effet, même si des écarts peuvent être observés, des tendances
semblent se dessiner. Ainsi, la comparaison du rapport entre sites endo III et CB indique des valeurs
globalement comprises entre 0,3 et 1 (à l’exception de la valeur identifiée par l’astérisque). La valeur
moyenne est de 1,06. Le rapport entre sites Fpg et CB est proche de 0,7 (à l’exception de la valeur
identifiée par par l’astérisque). La valeur moyenne est de 0,89. Le rapport entre sites endo III et CB
est compris entre 0,5 et 1,66. La valeur moyenne est de 0,95.
2. Taux de formation des différentes lésions
a) Irradiation gamma
La somme des taux de formation des bases modifiées déterminés par les méthodes
chromatographiques est de 0,19 lésion/106 bases. Celui des coupures est de 0,13 lésion/106 bases. Le
rapport entre ces deux valeurs est de 1,5. Il est donc relativement proche de la valeur de 2 décrite dans
la littérature d’autant plus que plusieurs bases modifiées de l’ADN n’ont pas encore pu être
quantifiées (diols de cytosine, oxazolone, etc. ).
Le Tableau suivant montre les rapports des taux de formation des mêmes lésions après
irradiation ou réaction de photosensibilisation. Les sites endo III, FapyGua, et les coupures CB
n’ayant pas été mis en évidence lorsque les photosensibilisateurs ont été utilisés à de faibles
concentrations, ces aspects ne seront pas abordés dans la discussion.
Chapitre V : Calibration de la méthode des comètes : aspects mécanistiques 176
Tableau XXXI : Rapport entre les taux de formation des différentes lésions produites dans l’ADN de
cellules exposées à divers agents oxydants
RAPPORTS Irradiation
γγγγ
Irradiation
UVA
R.B.
(1 D.O.)
A.O.
(1 D.O.)CB/endo III 2,4 3 4,6 7,4
FapyGua/CB 0,2 ? 1,7 0,7
FapyGua/endo III 0,5 ? 7,9 5,0
8-OxodGuo/FapyGua 0,4 ? 2,6 4,5
8-OxodGuo/endo III 0,2 3,2 20 23
8-OxodGuo/CB 0,08 1,08 4,4 3,10
CB : correspond à la somme CSB + CDB + SAL.
La comparaison de ces valeurs (Tableau XXXI) montre une différence très nette entre
l’importance relative des différents dommages produits par l’irradiation gamma, et ceux générés par
l’action d’autres agents oxydants. En effet, parmi les lésions que nous avons mesurées, le
rayonnement gamma du 60Co génère au sein de l’ADN, de façon majoritaire, des coupures (CSB +
CDB + SAL), des sites endo III (diols de thymidine), de la FapyGua, de la 5-HmdUrd, de la 8-
oxodGuo. Ceci conforte les résultats présentés dans le chapitre III en soulignant le rôle primordial du
radical hydroxyle. En effet, la formation de ces trois grandes catégories de lésions peut s’expliquer
par l’action de ce radical (25, 38, 41, 42, 53, 342).
b) Réactions de photosensibilisation
Dans le cas des photosensibilisateurs que sont le rose bengal et l’acridine orange,
l’importance relative des divers dommages est très différente puisque la lésion majoritaire est la 8-
oxodGuo. Le rapport entre les taux de formation de la 8-oxodGuo et des sites endo III est voisin de
20. Dans le cas des rayonnements gamma et UVA, cette valeur est respectivement de 0,2 et 3. Si on
regarde le rapport entre 8-oxodGuo et CB obtenu pour A.O. et R.B., il est compris entre 3 et 4. Ceci
indique que la formation des coupures de chaîne de l’ADN reste minoritaire devant la formation des
bases modifiées. Ces résultats sont concordants avec l’implication de l’oxygène singulet dans le
mécanisme d’action des photosensibilisateurs.
L’examen des valeurs des rapports entre FapyGua et CB, d’une part, ou entre FapyGua et
sites endo III d’autre part, indique que le dérivé Fapy de la guanine est formé en plus grande quantité
que les coupures ou les sites endo III. Il peut être formé, soit à partir du radical hydroxyle, soit par
ionisation directe de la guanine. La première voie est dans les cas présents en partie exclue. Il reste
donc un mécanisme de type I pour expliquer la formation de la FapyGua. Ce mécanisme pourrait aussi
177 Chapitre V : Calibration de la méthode des comètes : aspects mécanistiques
expliquer la formation des coupures produites en quantités relativement importantes. Ainsi, entre 0,4
et 1,2 CB/106 bases sont produits par photosensibilisation contre 0,13 CB/106 bases dans le cas du
rayonnement gamma. En particulier, elles pourraient faire intervenir un mécanisme de type I (38),
conduisant à la formation d’oxazolone. Cette modification est alcali-labile et par là même peut être
convertie en coupure de chaîne dans les conditions d’analyse de la méthode des comètes. Ceci est
conforté par la valeur comprise entre 0,7 et 1,7 du rapport entre FapyGua et CB (contre 0,2 dans le cas
du rayonnement gamma). La valeur proche de 1 de ce rapport suggère que les deux types de lésions
sont générées par un même mécanisme.
c) Irradiation UVA
Les rapports entre 8-oxodGuo et endo III, d’une part, et entre 8-oxodGuo et CB d’autre part
sont respectivement de 3,2 et 1,08 contre 0,2 et 0,08 pour le rayonnement gamma. La formation
d’oxygène singulet explique la formation préférentielle de 8-oxodGuo. La présence de sites endo III,
suggère l’implication du radical hydroxyle via un mécanisme de type I, dans la formation des CB
observées. Il est raisonnable de suggérer que la FapyGua puisse être formée soit par action de °OH,
soit par ionisation directe de la guanine. Le taux doit être intermédiaire entre celui des CB (rapport
FapyGua/CB de 0,7 et 1,7 pour les photosensibilisateurs exogènes) et 20% des CB (rapport
FapyGua/CB de 0,2 dans le cas du rayonnement gamma).
Chapitre V : Calibration de la méthode des comètes : aspects mécanistiques 178
°OH sites endo IIIcassures de brins
2O °-
Fe 3+
oxydation1O2
Type II
2,6-diamino-4-hydroxy-5-formamidopyrimidine
Type I- e-
ιιιιrradiationγγγγ
effet direct
effet indirect
P .- 2 O
UVA, lumière visibleP
FapyGua
1P 3P
réduction
Photosensibilisateu
r (P)
pyrimidines
8-oxo-7,8 dihydroguanine
8-oxoGua
H2NH
NH2O O
NN
oxazolone
HN
N NH
N
O
OH2N
HN
N NH2
N
O
O
HH2N
HN
N NH
N
O
H2N
HN
N NH
NO
H2N
+°
HN
N NH
N°O
OHH
H2N
HN
N NH
NO
H2N
HN
N NH
NO
H2N
Figure 129 : Mécanismes de formation proposés des principales lésions mesurées par la méthode descomètes modifiée
La Figure 129 propose, à partir des informations apportées par la méthode des comètes ou par
les techniques d’analyse chromatographique, un schéma des mécanismes conduisant aux lésions
produites par les différents agents utilisés dans cette étude.
- Chapitre VI -
Effets des ions lourds chargés 12C6+ sur
l’ADN cellulaire
Chapitre VI : Effets des ions lourds chargés 12C6+ sur l’ADN cellulaire 180
IntroductionNous allons aborder dans ce chapitre, l’étude de l’influence du TEL sur la nature et la
quantité des dommages radio-induits de l’ADN, en nous intéressant plus particulièrement aux
dommages de bases. En effet, si les mécanismes mettant en jeu les cassures des chaînes de l’ADN
sont en partie connus, peu de travaux portent sur les dommages de bases de l’ADN induits par les ions
lourds. Dans ce but, des cellules ont été exposées au rayonnement particulaire constitué d’ions
carbone, d’une énergie de 95 MeV/u et possédant un TEL moyen de 28 keV/µm. Les doses délivrées
ont été comprises entre 0 et 1000 Gy d’une part et 0 et 4 Gy d’autre part, pour les échantillons
destinés à être analysés respectivement, par les techniques d’analyse chromatographique et par la
méthode des comètes. Nous allons tout d’abord effectuer un bref rappel sur les principales
caractéristiques des rayonnements de TEL élevé.
I. BREFS RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES SUR LES IONS LOURDS
Les différences que l’on peut attendre concernant la nature des dommages de l’ADN induits
par un rayonnement à TEL élevé tient à la nature des interactions de ce rayonnement avec la matière.
La trace des ions lourds comme le 12C6+ est très différente de celle des rayonnements à ionisation
diffuse comme le rayonnement gamma du 60Co. La trajectoire des particules est rectiligne et les
ionisations sont regroupées autour de cette trajectoire. Il est alors possible de distinguer deux zones
différentes de densités d’ionisation (351). La première caractérisée par une forte densité d’ionisation
s’appelle le coeur de la trace. La deuxième située à la périphérie de la précédente s’appelle la
pénombre et correspond à une zone de plus faible densité d’ionisation (Figure 130). Le coeur est la
zone centrale de la trace constituée de particules lourdes excitées ou ionisées par le premier ion
accéléré (ion de recul). Les électrons δ secondaires sont éjectés hors de la région centrale et
constituent la pénombre. La dose varie ainsi en 1/r2 où r est la distance à l’axe de la trace. Lorsque
l’ion lourd pénètre dans la matière, la dose qu’il délivre le long de sa trajectoire est maximale au
terme de celle-ci, i.e. quand les interactions avec le milieu sont les plus importantes (pic de Bragg).
12C6+
12C6+
coeur
pénombre
Figure 130 : Schéma de la trace d’un ion lourd (14)
181 Chapitre VI : Effets des ions lourds chargés 12C6+ sur l’ADN cellulaire
Du fait de la nature de la trace, une irradiation par les ions lourds se caractérise par son
hétérogénéité. Dans le cas de l’irradiation de cellules, seules les molécules suffisamment proches du
coeur de la trace pourront être ionisées. Le nombre d’impacts par noyau dépend du nombre de
particules émises par cm2 (fluence de particules) (Tableau XXXII). La probabilité pour qu’un noyau
soit touché par n impacts est calculée par la formule de Poisson :
P(n) =e-λ.λn
n!où λ est le nombre moyen de collisions par noyau
λ, est donc le rapport entre la fluence et la surface équatoriale du noyau cellulaire.
Tableau XXXII : Répartition des impacts dans des noyaux de lymphocytes humains (25 µm2 de
surface équatoriale) d’après la distribution de Poisson
Nombre d’impacts réels par noyau
Fluence
(part./cm2)
λλλλ 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
1,6 106 0,4 67 27 5,3 0,7
2 106 0,5 61 30 7,5 1,5
4 106 1, 37 37 18 6,1 1,9
8,4 106 2,1 12 26 27 19 10 4,1 1,4 0,5
107 2,5 9 21 26 21 13 6,8 2,8 10,4
2 107 5 0,7 3,4 8,4 14 18 17 15 10 6,5 3,6
Tableau XXXII : Répartition des impacts dans des noyaux de lymphocytes humains (25 µm2 de
surface équatoriale) d’après la distribution de Poisson (suite)
Nombre d’impacts réels par noyau
Fluence (part./cm2) λλλλ 0000 40404040 50505050 60606060 75757575 100100100100
2 108 50 ≈ 10−20 2,1 5,5 2 0,02 ≈ 10−8
Parmi les principaux dommages de l’ADN induits par des rayonnements de TEL élevé, lescoupures de brins ont fait l’objet d’un intérêt tout particulier. L’efficacité des rayonnements de TEL
élevé à produire des coupures a été mise en évidence dans plusieurs travaux (352-354). On peutrappeler que dans le cas de rayonnements à fort TEL, si le nombre de cassures simple brin estrelativement similaire à celui induit par les rayonnements de faible TEL, celui des cassures doublebrin ainsi que la complexité qui y est associée augmente de façon exponentielle avec la fluence des
particules (355). De même, la réparation des cassures simple et double brin est plus longue voire
inachevée (355, 356). Par ailleurs, les aberrations chromosomiques produites par les ions lourds sont
Chapitre VI : Effets des ions lourds chargés 12C6+ sur l’ADN cellulaire 182
beaucoup plus complexes. En particulier, les aberrations de type cassure sont beaucoup plusnombreuses que les aberrations de type échange, alors que ces deux types d’aberrations sont induits
dans les mêmes proportions dans le cas du rayonnement X (352). On peut ajouter que les échanges
entre chromatides soeurs sont aussi plus nombreux (357).
II. MESURE DE LA 5-HMDURD, DE LA 5-FORDURD, DES DIOLS DETHYMIDINE, DE LA 8-OXODGUO ET DE LA 8-OXODADO PAR CLHP-SM/SM
Dans le cadre des mesures des bases modifiées par CLHP-SM/SM, des monocytes ont étéexposés à des doses de 12C6+ comprises entre 100 et 1000 Gy. Ils ont ainsi été soumis à une fluencecomprise entre 2,4 109 et 2,4 1010 particules/cm2. Le flux utilisé était de 5 108particules/cm2.s-1.
5-HmdUrd/106 bases
y = 0,012 x + 0,3
R 2 = 0,9881
05
1015
2025
0 500 1000Dose (Gy)
Figure 131 : Formation de la 5-HmdUrd par CLHP-SM/SM dans l’ADN de monocytes exposés au12C6+
La formation de la 5-HmdUrd est de 0,012 lésion/106 bases/Gy avec un niveau basal de 0,3lésion/106 bases (Figure 131).
Dose (Gy)
5-FordUrd/106 bases
y = 0,011 x + 0,1
R 2 = 0,9717
0,00
5,00
10,00
15,00
20,00
0 500 1000
Figure 132 : Formation de la 5-FordUrd par CLHP-SM/SM dans l’ADN de monocytes exposés au12C6+
183 Chapitre VI : Effets des ions lourds chargés 12C6+ sur l’ADN cellulaire
La formation de 5-FordUrd est de 0,011 lésion/106 bases/Gy avec un niveau basal de 0,1
lésion/106 bases (Figure 132).
y = 0,062 x + 1,96
2R = 0,9734
0
20
40
60
80
0 500 1000
Diols de thymidine/106 bases
Dose (Gy)
Figure 133 : Formation des diols de thymidine par CLHP-SM/SM dans l’ADN de monocytes exposés
au 12C6+
L’ensemble des diols de thymidine se forme à raison de 0,062 lésion/106 bases/Gy avec un
niveau basal de 1,96 diols/106 bases (Figure 133).
8-oxodGuo/106 bases
y = 0,0097 x + 0,8
R2 = 0,9851
0
5
10
15
20
0 500 1000
Figure 134 : Formation de la 8-oxodGuo par CLHP-SM/SM dans l’ADN de monocytes exposés au12C6+
La formation de 8-oxodGuo est estimée à 0,0097 lésion/106 bases/Gy (Figure 134). Le niveau
basal est de 0,9 lésion/106 bases.
Chapitre VI : Effets des ions lourds chargés 12C6+ sur l’ADN cellulaire 184
8-oxodAdo/106 bases
y = 0,002 x + 0,1R
2 = 0,9605
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
0 200 400 600 800 1000
Dose (Gy)
Figure 135 : Formation de la 8-oxodAdo par CLHP-SM/SM dans l’ADN de monocytes exposés au12C6+
Le taux de 8-oxodAdo mesuré est de 0,002 lésion/106 bases/Gy pour un niveau basal de 0,1
lésion/106 bases (Figure 135).
III. UTILISATION DE LA METHODE MODIFIEE DES COMETES
Nous avons utilisé la méthode des comètes en milieu alcalin, associée ou non aux enzymes de
réparation afin de mesurer, d’une part, les coupures de chaîne de l’ADN induites par le 12C6+ et
d’autre part les bases modifiées, substrats de Fpg et d’endo III. Il ne s’agit que de résultats
préliminaires qui devront être confirmés par de nouvelles expériences. Les cellules ont été exposées à
des doses de rayonnement comprises entre 2 et 4 Gy, i.e. à une fluence comprise entre 4,8 107 et 9,6
107 particules/cm2. Le flux utilisé est de 3 106 particules/cm2.s-1.
A. Utilisation de la Fpg
y = 6,9 x + 63,9R2 = 0,6598
y = 5,6 x + 25,6R2 = 0,8214
0
20
40
60
80
100
0 1 2 3 4
CSB + CDB + SAL +sites Fpg
CSB + CDB + SAL
Moment de la queue (µm)
Dose (Gy)
Figure 136 : Augmentation du moment de la queue de la comète correspondant aux sites reconnuspar Fpg, dans l’ADN de monocytes exposés au 12C6+
185 Chapitre VI : Effets des ions lourds chargés 12C6+ sur l’ADN cellulaire
La mesure de la formation des coupures (CB) est estimée à l’aide d’une droite de régression
linéaire de pente 5,6 µm/Gy. Le niveau basal de ces lésions est de 25,6 µm. Lorsque l’enzyme Fpg est
utilisée, on constate une augmentation de la pente précédente avec une valeur de 6,9 µm/Gy. La
valeur du moment de la queue de la comète mesurée dans les cellules contrôle est de 63,9 µm (Figure
136). L’augmentation du niveau basal, due à l’utilisation de la protéine Fpg est élevée. Une des
raisons possibles pour expliquer cette forte valeur est le stress que peuvent subir les cellules avant
leur lyse. En effet, du fait de contraintes techniques imposées par l’irradiation au 12C6+, les cellules
sont maintenues pendant une période variable dans une solution de PBS avant que leur lyse ne soit
effectuée. On peut ajouter, à l’appui de cette hypothèse, que la valeur du moment de la queue de la
comète mesurée dans les cellules contrôle en absence de Fpg est également élevée.
On peut noter que, si nous calibrons la méthode des comètes, en utilisant l’approche décrite
dans le Chapitre V, nous obtenons une valeur de 1 8-oxodGuo/106 bases correspondant à 130 µm du
moment de la queue de la comète. Cette valeur est élevée car elle ne prend pas en compte le taux de
formation des dérivés Fapy purines, qui n’a pas été pour l’instant mesuré.
B. Utilisation de l’endonucléase III
y = 12,6 x + 40,5
R2 = 0,9132
y = 5,6 x + 25,6
0
20
40
60
80
100
0 1 2 3 4
CSB + CDB + SAL +sites endo III
CSB + CDB + SAL
2R = 0,9452
Dose (Gy)
Moment de la queue (µm)
Figure 137 : Augmentation du moment de la queue de la comète correspondant aux sites reconnuspar endo III, dans l’ADN de monocytes exposés au 12C6+
En présence d’endo III, l’augmentation du moment de la queue de la comète est de 12,6
µm/Gy et le moment de la queue atteint 40,5 µm dans les cellules contrôle (Figure137).
IV. DISCUSSION DES RESULTATS
Si nous comparons les taux de formation des lésions induites par le rayonnement gamma du
cobalt 60, par le 12C6+, ou par des impulsions UV LASER, il apparaît que les deux premiers types de
rayonnements produisent sensiblement le même spectre de bases modifiées (Tableau XXXIII). Les
diols de thymidine constituent la lésion majoritairement formée, suivie dans un ordre décroissant de la
Chapitre VI : Effets des ions lourds chargés 12C6+ sur l’ADN cellulaire 186
5-HmdUrd et de la FapyGua (même ordre de grandeur), de la 5-FordUrd, de la 8-oxodGuo et enfin de
la 8-oxodAdo. Il faut ajouter qu’aussi bien dans le cas de l’irradiation gamma que dans le cas de
l’irradiation au 12C6+, très peu de 8-oxodAdo est générée. L’utilisation de particules possédant un TEL
plus élevé que celui des ions 12C6+ serait très intéressante. Elle permettrait de mettre en évidence de
façon plus claire l’existence ou non d’un effet de TEL sur la distribution des différents produits de
modification des bases.
Tableau XXXIII : Comparaison entre les taux de formation des lésions induites par le rayonnement
gamma, les particules chargées 12C6+ ou le rayonnement UV LASER
Irradiation gamma Irradiation au 12C6+ Irradiation UV LASER
/106 bases/Gy /106 bases/Gy /106 bases/mJ
8-OxodGuo 0,020 0,0097 1,29
8-OxodAdo 0,0035 0,0026 0,017
Diols de thymidine 0,048 0,029 0,085
5-FordUrd 0,022 0,011 0,017
5-HmdUrd 0,029 0,012 0,06
La lecture du Tableau suivant montre que le rapport entre le taux de formation de la 8-
oxodGuo et celui de l’ensemble des autres bases modifiées est à peu près identique dans le cas de
l’irradiation gamma et de l’exposition au 12C6+. Il semble cependant que le rayonnement de faible TEL
produise entre 1,5 et 2 fois plus de bases modifiées. Une des hypothèses pour expliquer cette
différence peut être la formation par les ions lourds de sites multi-lésés. De telles lésions pourraient
inhiber en partie l’hydrolyse enzymatique de l’ADN et empêcher ainsi la libération des bases
modifiées. Le Tableau XXXIV montre que la distribution des lésions est similaire dans les deux types
d’irradiation.
Tableau XXXIV : Comparaison des rapports entre les taux de formation des diverses catégories de
lésions pour le rayonnement gamma et pour l’exposition au 12C6+
Rapports Irradiation gamma Exposition au 12C6+
8-OxodGuo/ensemble des autres bases modifiées* 0,11 0,11
8-OxodGuo/sites endo III** 0,38 0,08
8-OxodGuo/diols de thymidine 0,20 0,16
* : mesures par CLPH-SM/SM,
** : nombre de sites endo III obtenu à partir de la calibration de la méthode des comètesprécédemment utilisée dans le Chapitre V.
187 Chapitre VI : Effets des ions lourds chargés 12C6+ sur l’ADN cellulaire
Le rapport 8-oxodGuo/sites endo III est différent, mais la mesure des sites endo III par la
méthode des comètes dans le cas de l’irradiation au 12C6+ doit être confirmée.
Nous avons noté dans le chapitre III que l’effet d’ionisation (abordé par l’irradiation UV
LASER) se traduisait par des taux élevés de 8-oxodGuo, comparativement aux niveaux de formation
des autres lésions. Or, une irradiation à l’aide d’un rayonnement de TEL plus élevé, devrait se traduire
par une contribution plus importante de l’effet direct comparativement à l’effet indirect. De même, il
ressort à l’examen des rapports 8-oxodGuo/sites endo III et 8-oxodGuo/diols de thymidine, que le
taux de formation des diols de thymidine ne suffit pas, à lui seul, à expliquer la forte augmentation du
moment de la queue de la comète mesurée en présence d’endo III. Le taux de formation des CB est
par Gy légèrement plus faible que celui déterminé dans le cas de l’irradiation gamma. La mesure des
coupures double brin permettrait sans doute, comme cela a déjà été mentionné dans la partie
introductive de ce chapitre, de mettre en évidence un taux de formation supérieur à celui déterminé
avec les rayonnements de faible TEL.
Nous n’avons pas constaté, lors de l’analyse des lames, d’hétérogénéité morphologique entre
les différentes cellules soumises à une même fluence de particules. Ceci est surprenant au regard du
parcours rectiligne de ces particules dans la matière.
Conclusion et Perspectives
Conclusion et Perspectives 189
Conclusion et PerspectivesUne meilleure connaissance des effets des rayonnements ionisants sur l’organisme implique la
possibilité de mesurer les lésions radio-induites dans l’ADN cellulaire. Ces lésions peuvent être de
plusieurs sortes : cassures de brin, modifications de bases, pontages ADN-protéines, sites abasiques,
etc.. L’objectif de l’étude que nous avons présentée dans ce mémoire était de mesurer les principales
bases modifiées de l’ADN cellulaire exposé au rayonnement gamma du 60Co. Il s’agissait de
déterminer les taux de formation ainsi que les niveaux basaux des lésions radio-induites et de mieux
comprendre leurs mécanismes de formation au niveau cellulaire. La mesure de ces modifications a été
effectuée à l’aide de méthodes chromatographiques comme la CLHP-DE pour la mesure de la 8-
oxodGuo, la CG-SM pour la mesure des dérivés Fapy purines ou la technique de CLHP-SM/SM. La
première étape de notre travail a comporté une phase de mise au point de ces méthodes. Il a ainsi été
possible de mesurer le niveau basal ainsi que le taux de formation de sept bases modifiées dans
l’ADN de monocytes exposés au rayonnement gamma (0-1000 Gy) ou à la lumière UV LASER (0-
500 mJ). Cinq modifications de bases ont également été mesurées dans l’ADN de monocytes exposés
à un flux de particules de 12C6+ (0-500 Gy).
Il ressort de ces expériences que les modifications de bases se forment en quantités
relativement faibles. La meilleure sensibilité de détection obtenue est de l’ordre de 50 femtomoles
pour la 8-oxodGuo par la technique de CLHP-DE et de CLHP-SM/SM. La plus mauvaise est observée
dans le cas de la technique de CG-SM avec une limite de sensibilité de l’ordre de 1 pmole pour les
dérivés Fapy purines. Pour mettre en évidence de façon significative la formation des lésions étudiées,
il a été nécessaire d’exposer les échantillons à de fortes doses d’irradiation, i.e. supérieures à 40 Gy
pour la mesure de la 8-oxodGuo par CLHP-DE ainsi que pour la mesure des diols de thymidine par
CLHP-SM/SM et supérieures à 100 Gy pour la mesure des autres bases modifiées. Il faut ajouter que
pour accroître la sensibilité de détection, les mesures ont été effectuées sur des quantités d’ADN
relativement élevées (> 100 µg).
De toutes les bases de l’ADN, il est apparu que la thymine est particulièrement dégradée sous
irradiation gamma. En effet, les diols de thymidine constituent la lésion majoritaire avec un taux de
formation proche de 1 modification/107 bases/Gy. Ils sont suivis de la 5-HmdUrd, du dérivé Fapy de
la guanine et de la 5-FordUrd. Ces données semblent en accord avec les études effectuées sur les
nucléosides isolés qui montraient que les radicaux °OH, très électrophiles, réagissaient de façon
préférentielle avec les liaisons insaturées des bases pyrimidiques. Toutefois, les taux que nous avons
mesurés sont bien inférieurs à ceux déterminés dans de nombreuses études utilisant la technique de
CG-SM. Ils sont compris entre 0,003 et 0,1 modification/106 bases par Gy (données correspondant à
la 8-oxodAdo et aux diols de thymidine, respectivement). La mesure des principales modifications de
l’adénine (FapyAde et 8-oxodAdo) semble indiquer que cette base est peu modifiée. Toutefois, ces
190 Conclusion et Perspectives
conclusions doivent être nuancées. En effet, d’autres lésions, que nous ne sommes pas à l’heure
actuelle en mesure de quantifier, peuvent se former dans des proportions importantes. Il serait par
exemple intéressant de déterminer le taux de formation des diols de cytosine, des produits de
réduction des bases pyrimidiques ou de l’oxazolone. Nous avons en effet observé qu’un autre produit
de réduction, la FapyGua se formait en quantités importantes. Ces résultats montrent aussi que la 8-
oxodGuo généralement utilisée comme marqueur biologique du stress oxydant se forme en quantité 5
à 7 fois inférieure à celle des diols de thymidine (dans le cas de l’irradiation gamma). Cette dernière
lésion pourrait, par conséquent, constituer un marqueur plus sensible de l’altération de la molécule
d’ADN par le rayonnement gamma.
Afin d’étudier l’influence du TEL du rayonnement, des mesures de dommages induits par un
flux de particules de 12C6+ ont été effectuées. Nous n’avons pas observé de différences significatives
avec l’effet du rayonnement gamma. Les taux de formation de cinq lésions déterminés par CLHP-
SM/SM sont sensiblement équivalents à ceux obtenus dans le cas du rayonnement de faible TEL. Une
des explications à ceci est peut-être que l’ion 12C6+ ne possède pas un TEL suffisamment élevé pour
que des différences notables soient observables. Il serait par conséquent envisageable dans le futur
d’utiliser des particules possédant un TEL supérieur comme l’40Ar, l’17O, le 40Ca, etc.. Dans ces
dernières conditions, une contribution plus importante de l’effet direct au dépens de l’effet indirect du
rayonnement est attendue.
Pour déterminer la nature des lésions formées par ionisation directe de l’ADN, nous avons eu
recours à un rayonnement UV LASER de haute intensité. L’utilisation d’une telle source d’ionisation
permet d’étudier certains aspects de l’effet direct du rayonnement gamma. Les mesures de bases
modifiées que nous avons effectuées ont montré que la 8-oxodGuo était la lésion induite dans les
proportions les plus importantes, suivie des diols de thymidine. Un rayonnement de TEL
suffisamment élevé devrait produire le même spectre de dommages. Il faut noter que la 8-oxodAdo se
forme dans des proportions notables. La comparaison des taux de formation de la 8-oxodGuo produite
par irradiation gamma et UV LASER suggère que l’effet direct n’est pas dans le cas du rayonnement
gamma prédominant. La radiolyse de l’eau qui est à l’origine du radical °OH apparaît être le principal
processus responsable des altérations observées. Il sera néanmoins très intéressant de déterminer le
taux de formation des dérivés Fapy purines induits par des impulsions UV LASER. Ceci permettra de
déterminer la contribution de la composante mono-photonique de ce rayonnement dans la formation
de 8-oxodGuo (réactions de photosensibilisation).
Parallèlement à l’utilisation de méthodes chromatographiques, nous avons développé une
approche indirecte de mesure des dommages de bases de l’ADN, faisant appel à la méthode des
comètes associée à des enzymes de réparation (Fpg et endo III).
Nous avons défini les conditions d’utilisation de la méthode. La formation relative ainsi que
le niveau basal des CB (coupures + sites alcali-labiles) et des sites reconnus par Fpg ou endo III ont
Conclusion et Perspectives 191
été déterminés dans l’ADN de monocytes exposés au rayonnement gamma du 60Co (0-8 Gy), à la
lumière UVA (0-150 kJ.m-2) ou à des photosensibilisateurs exogènes (acridine orange et rose bengal
excités par la lumière visible).
Il a été observé dans le cas de l’irradiation gamma que les coupures de brin (CB) sont
produites en quantités sensiblement équivalentes à la somme des coupures induites par les deux
enzymes de réparation associées. De plus le nombre de sites Fpg mesuré est proche de celui des sites
endo III. Lorsque les photosensibilisateurs ont été utilisés à faible concentration, nous avons observé
une formation très faible voire nulle des coupures. Les sites révélés par l’endonucléase III se sont
avérés être formés en des quantités inférieures à la limite de détection de la méthode. En revanche, un
niveau important de sites Fpg a été mesuré.
Utilisés à une concentration correspondant à une unité densité optique de 1, les
photosensibilisateurs ont induit des coupures de brin de l’ADN et des sites endo III. Les sites Fpg
produits en trop grandes quantités n’ont pas pu être mesurés dans ces conditions.
Enfin, il a été montré que la lumière UVA produisait principalement des sites Fpg mais aussi
en plus faibles quantités des coupures et des sites alcali-labiles (CB). Des sites endo III ont également
été mesurés en faibles quantités.
Les modèles oxydatifs représentés par les radiations gamma, le rayonnement UVA et par les
photosensibilisateurs exogènes ont permis de calibrer la méthode des comètes. Pour cela,
l’augmentation du moment de la queue de la comète observée en présence de Fpg, a été corrélée aux
taux de formation, de la 8-oxodGuo et des dérivés Fapy purines, déterminés respectivement par
CLHP-DE, et par CG/SM ou CLHP-SM/SM. Une modification/106 bases normales a été corrélée avec
58,5 µm de moment de la queue de la comète. Cette calibration a permis de mesurer le niveau basal et
le taux de formation, des CB, des sites endo III et ceux des sites Fpg. Elle a rendu possible la
confrontation des deux approches et a conduit à la détermination des taux de 8-oxodGuo (assimilée
aux sites Fpg) dans l’ADN cellulaire pour des doses d’irradiation gamma aussi faibles que 2 Gy. Ce
niveau est voisin de 0,2 lésion/106 bases. Or de nombreuses études utilisant la technique de CG-SM
indiquaient des taux 100 à 1000 fois plus élevés. Nos résultats confirment les résultats d’autres études
qui ont souligné les problèmes d’oxydation artéfactuelle associés à l’utilisation des méthodes
chromatographiques. Parmi ceux-ci, on peut citer l’oxydation des bases normales qui se produit au
cours de l’extraction de l’ADN cellulaire, mais aussi au cours de l’étape de silylation des échantillons
avant l’analyse par CG-SM. La méthode des comètes, en s’affranchissant de ces contraintes
techniques semble, par conséquent moins sujette à ces artefacts.
La confrontation des deux approches a permis d’étudier les mécanismes de formation des
lésions. Les résultats obtenus ont montré que dans le cas du rayonnement gamma, le radical hydroxyle
était la principale espèce produite et conduisait à un spectre très large de lésions, incluant les coupures
de brin et les atteintes des bases dans des proportions sensiblement équivalentes. En revanche, le
192 Conclusion et Perspectives
modèle représenté par les photosensibilisateurs excités par la lumière visible indique que la lésion
majoritaire est la 8-oxodGuo via la formation d’oxygène singulet. Cela explique le spectre restreint de
lésions observé (pas de sites endo III, très peu de coupures et de dérivés Fapy purines). La lumière
UVA produit de faibles taux de formation des coupures et sites alcali-labiles ainsi que des sites endo
III. En contrepartie, la proportion des sites Fpg est importante, suggérant l’implication de l’oxygène
singulet.
Il ressort de cette étude que la plupart des travaux portant sur la mesure des dommages de
bases de l’ADN par la méthode CG-SM doivent être reconsidérés. Il serait par ailleurs intéressant de
déterminer le temps nécessaire à la cellule pour réparer chaque type de base modifiée ainsi mesurée.
Les études de cinétique de réparation des modifications de bases ont en effet, pour la plupart, été
effectuées en utilisant la méthode CG-SM. C’est par exemple le cas d’une étude de Jaruga et al.(252).
Dans cette dernière étude, le délai permettant la réparation de 50% des lésions est compris entre 8,5
min pour la 5-OH-Ura et, 62,2 min pour la FapyAde. Le rapport entre les bases modifiées et les
coupures de chaînes et sites alcali-labiles de 1,5 signifie que les bases modifiées se forment en
quantités relativement importantes. Par conséquent, il est indispensable pour la cellule d’assurer une
réparation complète de ces dommages.
Les études de réparation pourraient être également abordées par la méthode modifiée des
comètes. Enfin, il serait intéressant d’aborder l’étude des sites multi-lésés. Pour cela, l’association de
techniques de mesure de CDB aux enzymes de réparation pourrait fournir des indications.
- Chapitre VII -
Partie expérimentale
Chapitre VII : Partie expérimentale 194
I. PRODUITS CHIMIQUES
L’agarose et l’agarose « low melting point» sont des produits Promega (Madison, WI, USA).
Le Tris, le Na2EDTA et le BSTFA ont été obtenus chez Interbiotech (Interchim, Montluçon), alors
que KCl et NaOH proviennent de chez Carlo Erba (Milan, Italie). Tous les produits ou enzymes
suivants : nucléase P1, phosphatase acide, phosphatase alcaline, RNase A, RNase T1, DMSO, triton
X-100, BSA, sodium sarcosinate, NaI, MgCl2, bromure d’éthidium, déféroxamine, SDS, FapyAde, et
l’ADN isolé de thymus de veau ont été obtenus chez Sigma Co (St Louis, MO, USA). La PRV et la
PVS sont des produits de Boehringer (Mannheim, Allemagne). La protéase provient de chez Qiagen
Genomic (Hilden, Allemagne). Les enzymes de réparation surexprimées chez Escherichia coli, Fpg et
endo III, ont été gracieusement fournies par le Dr. Serge Boiteux (CEA, Fontenay-aux-Roses). Le
RPMI-1640, le FCS, le PBS Dulbecco's sont des produits de Life Technologies (Paisley, Royaume
Uni). Les lames et les lamelles de microscope proviennent respectivement de Touzart & Matignon
(Vitry-sur-Seine) et de Marienfeld (Allemagne). Les colonnes Nap 25 ont été obtenues chez
Pharmacia Biotech (Uppsala, Suède). Les dérivés enrichis [M+3] FapyGua et FapyGua ont été
synthétisés comme décrit dans (226). Le dérivé [M+3] FapyAde a été fourni par H. E. Poulsen
(Université de Copenhague, Copenhague, Danemark). Les composés [M+3] 5-OHdUrd, [M+3] 5-
FordUrd, [M+3] 5-HmdUrd, [M+3] diols de thymine, et les dérivés [M+5] 8-oxodGuo, [M+5] 8-
oxodAdo ont été synthétisés selon les méthodes décrites dans (246). La 5-OHdUrd, la 5-FordUrd, la
5-HmdUrd ont été préparées selon le protocole décrit dans (358). La 8-oxodGuo et la 8-oxodAdo ont
été synthétisées selon la méthode rapportée dans (359). Les diols de thymidine ont été obtenus
comme décrit dans (360).
II. LIGNEE ET CULTURE CELLULAIRE
Un lignée monocytaire tumorale THP-1 isolée du sang périphérique d’un jeune donneur
atteint de leucémie (ATCC, Rockville, MD, USA) a été cultivée dans une atmosphère enrichie en CO2
à 5% et maintenue à 37°C. Le milieu de culture comprenait du RPMI-1640 auquel 10% de sérum de
veau décomplémenté et 5% de glutamine à 200 mM ont été ajoutés.
III. COURBE DE SURVIE CELLULAIRE
La survie cellulaire de cellules exposées au rayonnement gamma du cobalt 60 a été mesurée à
l’aide d’une méthode colorimétrique au bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényl-
tétrazolium (MTT). Cette molécule de couleur jaune est réduite par les enzymes déshydrogénases
mitochondriales en sel de couleur bleu. Pour cela, 1,5 ml de suspension cellulaire irradiée ou témoin
ont été déposés dans des puits avant ajout de 200 µl de solution MTT préparée dans le tampon PBS (5
mg/ml). Les préparations ont ensuite été incubées pendant 24 ou 48 h dans une atmosphère enrichie
195 Chapitre VII : Partie expérimentale
en CO2 à 5% et maintenues à 37°C. La coloration bleue des cristaux formés par les cellules vivantes a
ensuite été dissoute dans 100 µl de DMSO et l’absorbance a été mesurée à 570 nm en utilisant un
spectrophotomètre (Titertek Multiskan, Labsystems Group, Les Ullis) relié à un système
informatique. L’absorbance mesurée est alors directement proportionnelle au nombre de cellules
vivantes. Les résultats sont ensuit exprimés en % de survie.
(M-B)(T-B)
% survie = 100
T : moyenne des densités optiques des cellules non traitées ;
M : moyenne des densités optiques des cellules traitées ;
B : moyenne des densités optiques des cristaux bleus.
IV. IRRADIATIONS ET REACTIONS DE PHOTOSENSIBILISATION
A. Irradiations γγγγ et UVALes irradiations UVA ont été effectuées en utilisant une lampe à haute pression Tecimex
(Dixwell, St Symphorien d’Ozon). Le spectre délivré par la lampe indique un maximum d’émission à
373 nm. Le débit de dose (45 mW.cm-2) a été mesuré par un radiomètre (Dixwell, St Symphorien
d’Ozon). Les irradiations gamma des échantillons pour les dosages des dérivés Fapy purines par CG-
SM ont été effectuées à l’aide d’une source de 60Co avec un débit de dose de 50 Gy. min-1. Les
échantillons destinés aux autres mesures de dommages de bases de l’ADN par l’approche
chromatographique, ont été irradiés à l’aide d’une source de 60Co d’un débit de dose de 20 Gy. min-1.
Dans ces deux cas, la dosimétrie a été effectuée à l'aide de poly-méthacrylate de vinyle.
Enfin, les irradiations des échantillons pour les mesures par la méthode des comètes ont été
effectuées avec une source de 60Co (service de Radiothérapie du C.H.U. Michallon, Grenoble). Le
faisceau était vertical et le débit de dose était de 0,8 Gy min-1. Les suspensions cellulaires ont été
transférées dans des boîtes cylindriques de 9 ml placées en « sandwich » entre des plaques de
polystyrène condensé, équivalent tissu (Figure 138). Ces dernières permettent d’atteindre les
conditions d'équilibre électronique. Le champ d’irradiation avait une dimension de 16 cm × 16 cm. La
distance entre la source et la plaque de polystyrène était de 80 cm (DSP). Le calcul du temps
d’irradiation a été effectué à l’aide du logiciel de calcul inclus dans le serveur TIGR du service.
Chapitre VII : Partie expérimentale 196
×
60Co
hν matériel équivalent tissu
échantillon
champ 16 cm 16 cm ( γ )
DSP = 80 cm ( γ )
Figure 138 : Dispositif d’irradiation aux faibles doses de 60Co
Avant irradiation UVA ou γ, les cellules ont été centrifugées à 240 g pendant 4 min, afin
d’éliminer le milieu de culture. Le culot a été rincé une fois dans du tampon PBS avant d’y être repris
afin d’obtenir une suspension cellulaire de 2 106 cellules/ml et de 20 106 cellules/ml pour les
échantillons destinés, respectivement à l’analyse par la méthode des comètes et aux analyses
chromatographiques. Toutes les irradiations ont pour des raisons pratiques été effectuées à
température ambiante. Les cellules contrôle ont été maintenues à l’obscurité à 4°C. Immédiatement
après l’irradiation, les cellules destinées à l’analyse par la méthode des comètes ont été mélangées
avec de l’agarose « low-melting point ». Le mélange a été déposé sur les lames de microscope et les
cellules ont ensuite été lysées. Les cellules destinées aux mesures chromatographiques ont été
centrifugées à 240 g pendant 4 min. Puis, les culots obtenus ont été repris dans le tampon de lyse
(320 mM sucrose, 5 mM MgCl2, 10 mM Tris/HCl, 0,1 mM déféroxamine, 1% TritonX-100) pour
l’extraction de l’ADN.
B. Irradiation par des particules de 12C6+
L’irradiation des échantillons au 12C6+ a été effectuée au GANIL (Grand Accélérateur
National d’Ions Lourds) à Caen en collaboration avec une équipe du CIRIL (Centre Interdisciplinaire
de Recherche sur les Ions Lourds).
Les suspensions cellulaires de monocytes, destinées aux mesures chromatographiques et à
l’analyse par la méthode des comètes ont été irradiées dans des tubes « Eppendorfs », d’un volume de
2 ml et de 200 µl, respectivement. Pour cela, les cellules ont été disposées face au faisceau horizontal
de particules d’une section diamétrale de 2,5 cm. Les conditions de préparation et de traitement des
échantillons avant et après irradiation étaient identiques à celles utilisées dans le cas de l’irradiation
gamma ou UVA.
197 Chapitre VII : Partie expérimentale
C. Irradiation par des impulsions UV LASERL’irradiation au LASER UV des suspensions de monocytes a été effectuée dans des cellules
de quartz de volume 1 ml. Les monocytes ont été préparés et concentrés dans du tampon PBS, à raison
de 20 millions de cellules/ml irradié, ce qui représente environ 5 D.O. d’ADN (250 µg d’ADN). La
source LASER de modèle Surelite II (Continuum) était constituée d’un cristal Nd YAG émettant à
1064 nm. L’énergie maximale que le système peut fournir à 1064 nm était de 0,7 J par impulsion. La
durée d’une impulsion était de 5 ns. La conversion de la lumière infra-rouge en lumière UV était
effectuée par deux doublements de fréquence consécutives (générateurs de seconde harmonique) à
l’aide de cristaux de kalium dihydro-phosphate deutéré (1064→538→266 nm). Seule la lumière à λ =
266 nm était conservée après passage au travers d’un filtre constitué par un miroir dichroïque et par
un prisme Pelin-Brocca. L‘énergie maximale que l’on pouvait délivrer à 266 nm était de 60 mJ par
impulsion. Le dispositif est représenté dans la Figure 139.
Nd : YAG laserλλλλλ λ λ λ = 1064 nm
GH GH λλλλ2
λλλλ4
MD PPB
CMM
DC
MEPPC
PC OEM
λλλλ4266 nm
GH λ2
λ4( (: générateur de 2 ème (4ème) harmonique
MD : miroir dichroïque
PPB : prisme en quartz de Pelin-Brocca
DC : diaphragme circulaire
DF : déviateur de faisceau R = 8%
MPE : système de mesure d’énergie pyroélectrique
OEM: obturateur électromagnétique
C : cuve en quartz
MM: mélangeur magnétique
PC
PC : système informatique
Figure 139 : Dispositif d’irradiation au LASER à ionisation bi-photonique
La source LASER, le système de mesure d’énergie pyroélectrique (MPE) Nova (Ophir,
Israël) et l’obturateur électromagnétique (OEM) étaient reliés à un système informatique. La
procédure d’irradiation (acquisition de l’énergie, fermeture-ouverture du faisceau, introduction de
l’énergie d’irradiation, etc.) était contrôlée par informatique, à l’aide d’une carte universelle
ADC/DAC/TTL. Avant l’irradiation, la densité optique de la suspension cellulaire, préalablement
lysée par ajout de 0,3% de SDS, était déterminée sur une fraction aliquote par absorption UV à 260
nm. Les suspensions cellulaires ont été exposées à des doses comprises entre 10 et 100 mJ/D.O.,
Chapitre VII : Partie expérimentale 198
correspondant à une gamme de doses comprises entre 50 et 500 mJ par ml de suspension cellulaire.
Immédiatement après irradiation, les échantillons ont été traités de manière conventionnelle pour les
mesures chromatographiques.
D. Réactions de photosensibilisationL’acridine orange et le rose bengal ont été utilisés à des concentrations de 5 10-3 D.O. et 10-2
D.O., respectivement. Les expériences ont été également effectuées à une concentration de 1 D.O.
pour les deux photosensibilisateurs. Avant exposition à la lumière, les cellules ont été centrifugées à
240 g pendant 4 min, afin d’éliminer le milieu de culture. Les culots ont été rincés une fois et repris
dans un volume de tampon PBS de manière à obtenir les concentrations en cellules décrites ci-dessus.
Le rose bengal ou l’acridine orange ont ensuite été ajoutés. Après 5 min, les cellules ont été
centrifugées deux fois à 240 g pendant 4 min, et rincées dans du tampon PBS afin d’éliminer toute
trace du photosensibilisateur. Les irradiations ont été effectuées à température ambiante en utilisant
une lampe (Philips) émettant dans le visible (puissance 100 watts), maintenue à 18 cm de
l’échantillon. Les cellules contrôle ont été maintenues à l’obscurité en présence de
photosensibilisateur ou exposées à la lumière seule. Immédiatement après l’irradiation visible, les
cellules destinées à l’analyse par la méthode des comètes ont été mélangées à de l’agarose « low-
melting point » avant d’être déposées sur les lames de microscope et lysées. Les cellules destinées aux
mesures chromatographiques ont été centrifugées à 240 g pendant 4 min et les culots obtenus ont
été repris dans le tampon de lyse (320 mM sucrose, 5 mM MgCl2, 10 mM Tris/HCl, 0,1 mM
déféroxamine, 1% TritonX-100) pour l’extraction de l’ADN.
V. METHODE DE MICROELECTROPHORESE SUR GEL
A. Méthode des comètes en milieu alcalin150 µl d’agarose standard 1% ont été déposés sur une lame de microscope puis ont été
recouverts d’une lamelle. Les lames ont été maintenues à température ambiante pendant 5 min.
Immédiatement après irradiation (UVA, gamma) ou réaction de photosensibilisation en présence de
lumière visible, 10 µl de la suspension cellulaire ont été mélangés à 100 µl d’agarose « low-melting
point » à une concentration de 1,2%. Les lamelles ont été retirées et le mélange a été déposé sur le
premier gel avant d’être recouvert par une lamelle. Les lames ont été ensuite déposées sur de la glace
pour solidification. Les lamelles ont été ensuite retirées et les lames ont été recouvertes d’un tampon
de lyse (2,5 M NaCl, 100 mM Na2EDTA, 10 mM Tris, pH 10, 1% sodium sarcosinate, 1% Triton X-
100 et 10% de DMSO). Puis l’ensemble a été laissé en contact pendant 1 h à 4°C.
Afin de convertir les bases modifiées en coupures de chaîne d’ADN, des enzymes de
réparation dont les gènes ont été surexprimés dans E. coli, à savoir Fpg et endo III ont été utilisées
séparément. Pour cela, les lames ont été rincées trois fois avec du tampon Tris/HCl (0,4 M, pH 7,4)
afin d’éliminer le tampon de lyse restant. Puis, elles l’ont été encore deux fois avec le tampon de la
199 Chapitre VII : Partie expérimentale
protéine Fpg (20 mM Tris, 0,2 mg/ml d’albumine de sérum de veau, 0,5 mM Na2EDTA, 0,1 M KCl,
pH 8). Dans l’étape suivante, 100 µl de la Fpg glycosylase (1 µg/ml) ou de l’endonucléase III
(1µg/ml) ont été déposés sur les lames. Des lamelles ont été ajoutées et les lames ont été incubées à
37°C pendant 45 min, avant d’être immergées dans le tampon d’électrophorèse (300 mM NaOH, 1
mM Na2EDTA) pendant 20 min. L’électrophorèse a été effectuée à 25 V et 300 mA pendant 45 min.
Les lames ont été ensuite rincées avec du Tris/HCl (0,4 M, pH 7,4) avant que l’ADN nucléaire soit
visualisé par l’ajout de 60 µl de bromure d’éthidium (0,5 mg/ml) par lame et l’observation avec un
microscope à épifluorescence.
B. Méthode des comètes en milieu neutreLes protocoles utilisés ont été ceux décrits pour la technique en milieu alcalin jusqu’à l’étape
de lyse.
1. Protocole décrit par Singh et al.Le protocole décrit par Singh et al. comprend les étapes suivantes (302) : après une lyse de 1
h (2,5 M NaCl, 100 mM Na2EDTA, 10 mM Tris, pH 10, 1% sodium sarcosinate, 1% Triton X-100),
les lames ont été incubées, pendant 1 h à 37°C, dans la solution de lyse à laquelle de la protéase de la
société Qiagen (1 mg/ml) a été ajoutée. Les lames ont été ensuite immergées dans le tampon
d’électrophorèse (300 mM NaOH, 0,1% 8-hydroxyquinoline, 2% DMSO, 10 mM Na2EDTA). Après
20 min d’attente, période qui permet la décondensation de l’ADN, l’électrophorèse a été effectuée à
un voltage de 25 volts pendant 1 h.
2. Protocole décrit par Olive et al.Le protocole décrit par Olive et al. a été utilisé (314, 315) : les lames ont été immergées
pendant 4 h à 50°C dans le tampon de lyse (1% sarkosyl, 2 M NaCl, et 30 mM Na2EDTA, pH 8,3).
Les lames ont été ensuite rincées dans un tampon (90 mM Tris, 90 mM acide borique, 2 mM
Na2EDTA) pendant une nuit. Une électrophorèse a alors été effectuée dans le tampon Tris-borate-
Na2EDTA à 0,6 V.cm-1 pendant 25 min.
C. Analyse des lames de microscopeL’analyse des lames a été effectuée en utilisant un microscope à épifluorescence (Carl Zeiss,
Microscope Division, OberKochen, Allemagne) muni d’une lampe à mercure HBO (50 W, 516-560
nm) de la société Zeiss (OberKochen, Alllemagne). Le logiciel de traitement d’image utilisé a été le
système Komet 3.1 (Kinetic Imaging, Liverpool, Royaume Uni) qui a permis la mesure du moment de
la queue de la comète de 50 cellules par lame. Pour chaque dose d’irradiation, le moment de la queue
de la comète moyen a été calculé à partir de trois lames.
Chapitre VII : Partie expérimentale 200
VI. METHODE D’EXTRACTION DE L’ADN CELLULAIRE
A. Méthode chaotropique au NaILe protocole décrit par Helbock et al. a été utilisé (209). Immédiatement après l’irradiation,
les cellules ont été centrifugées à 240 g pendant 4 min. Le culot obtenu (15 106
cellules/échantillon) a été repris deux fois dans 2 ml de tampon de lyse A (320 mM sucrose, 5 mM
MgCl2, 10 mM Tris/HCl, 0,1 mM déféroxamine, 1% TritonX-100) et centrifugé à 1500 g pendant
10 min. Les culots obtenus ont été repris dans 0,6 ml de tampon de lyse B (5 mM Na2EDTA, 10 mM
Tris/HCl, 0,15 mM déféroxamine). Du SDS (35 µl, 10%) a été ajouté et le mélange agité
vigoureusement avant addition de 30 unités de ribonucléase A (1 mg/ml) et de 8 unités de
ribonucléase T1. Les échantillons ont été incubés à 50°C pendant 15 min. Ensuite, 30 µl de protéase
Qiagen (20 mg/ml) ont été ajoutés et les échantillons ont été incubés pendant 1 h à 37°C.
L’ADN a été précipité par l’ajout de 0,8 ml de solution NaI (20 mM Na2EDTA, 7,6 M NaI, 40
mM Tris/HCl, 0,3 mM déféroxamine) et de 2 ml de propan-2-ol. L’ADN obtenu a été centrifugé à
5000 g pendant 10 min, et rincé successivement avec 1 ml de propan-2-ol à 40% et 1 ml d’éthanol
à 70%. Le culot a ensuite été dissous dans 100 µl d’une solution de déféroxamine à 0,1 mM.
B. Méthode au NaClLes culots cellulaires (106 cellules) ont été repris dans 1,5 ml de tampon de lyse (20 mM
NaCl, 20 mM Na2EDTA, 20 mM Tris, 5 mM déféroxamine, 10% SDS) auxquels 100 µl de protéase
(1mg/ml) ont été ajoutés. La solution obtenue a été incubée à 37°C pendant 1 h. Pour permettre la
précipitation des acides nucléiques, 300 µl d’une solution de NaCl 4 M ont été ajoutés ainsi que 7,5
ml d’éthanol froid. Les acides nucléiques ont été recueillis après centrifugation à 4500 g pendant
10 min. Les culots d’ADN ont été dissous dans 1 ml de tampon RNase (10 mM Tris, 2,5 mM
déféroxamine, 1 mM Na2EDTA, pH 7,4) et incubés pendant 1 h à 37°C en présence de 100 µl de
ribonucléase A (1 mg/ml ) et de 10 unités de ribonucléase T1. L’ADN a été ensuite précipité par
addition d’éthanol 100% froid, et rincé avec de l’éthanol 70%. Les échantillons ont été ensuite
dissous dans 100 µl d’eau désionisée.
C. Hydrolyse enzymatique de l’ADN sous forme de nucléosides
1. Hydrolyse de l’ADN préalable à la mesure de la 8-oxodGuo parCLHP-DE
L’hydrolyse de l’ADN sous forme de nucléosides par le couple d’enzymes nucléase P1-
phosphatase acide/ou phosphatase alcaline a permis la mesure de la 8-oxodGuo par CLHP-DE.
L’ADN extrait selon la méthode au NaCl ou au NaI, est incubé à 37°C pendant 90 min en
présence de 10 µl de tampon 10X de la nucléase P1 (300 mM acétate de sodium, 1 mM ZnSO4, pH
5,3), de 10 unités de nucléase P1 et de 0,5 unité de phosphatase acide. Les protéines ont été ensuite
201 Chapitre VII : Partie expérimentale
précipitées par addition de 50 µl de chloroforme. Une centrifugation à 5000 g pendant 15 min a
permis de recueillir la phase aqueuse avant analyse par CLHP-DE-UV.
2. Hydrolyse de l’ADN préalable à la mesure simultanée de septnucléosides par CLHP-SM/SM
Afin de mesurer par CLHP-SM/SM, au sein d’un même échantillon, la 8-oxodGuo les diols de
thymidine, la 5-FordUrd, la 5-OHdUrd, la 5-HmdUrd, la 8-oxodAdo et la dGuo, une hydrolyse
enzymatique de l’ADN par la nucléase P1 et la phosphatase alacaline associées à des exonucléases a
été effectuée.
Pour cela, l’ADN extrait selon la méthode chaotropique au NaI a été repris dans une solution
à 0,1 mM de déféroxamine. Il a alors été incubé en présence de 0,008 unité de phosphodiestérase de
rate de veau (PRV) diluée dans 10 µl de tampon 10 X (200 mM d’acide succinique, 100 mM CaCl2,
pH 6) et de 10 unités de nucléase P1. Les échantillons ont été incubés pendant 150 min à 37 °C. 0,003
unité de phosphodiestérase de venin de serpent (PVS) diluée dans 10 µl du tampon de la phosphatase
alcaline, et 10 unités de phosphatase alcaline ont été ajoutées aux échantillons avant incubation
pendant 150 min à 37°C.
VII. ANALYSES CHROMATOGRAPHIQUES
A. Courbes de calibrationAfin de rendre les mesures par CLHP-DE, CG-SM et CLHP-SM/SM quantitatives, des
courbes de calibration ont été établies pour chaque base modifiée. Pour la technique de CLHP-DE,
des quantités croissantes de 8-oxodGuo ont été injectées et le signal mesuré. Pour les techniques
faisant appel à la détection par spectrométrie de masse, la valeur du rapport des signaux entre le
produit recherché et l’étalon marqué a été déterminée. Pour cela des échantillons contenant une
quantité fixe de standard interne marqué isotopiquement ([M+3] ou [M+5]) et des quantités
croissantes de la base modifiée ont été préparés et analysés. Les Tableaux suivant donnent pour
chaque base modifiée, les concentrations des différents produits utilisés. On peut ajouter que 10 µl de
chaque solution préparée ont été injectés sur les colonnes chromatographiques.
1. Mesure par CLHP-DE
Tableau XXXVa : Concentrations des solutions utilisées pour établir la courbe de calibration de la 8-
oxodGuo mesurée par CLHP-DE
8-oxodGuo
Solution I II III IV V8-oxodGuo (µM) 0,01 0,05 0,1 1 10
Chapitre VII : Partie expérimentale 202
2. Mesures par CG-SM et par CLHP-SM/SM
Tableau XXXVb : Concentrations des solutions utilisées pour établir les courbes de calibration de la
FapyGua mesurée par CLHP-SM/SM
FapyGua
Solutions I II III IV VFapyGua (µM) 0,01 0,05 0,1 1 10
[M+3] FapyGua (µM) 0,5
Tableau XXXVc : Concentrations des solutions utilisées pour établir les courbes de calibration de la
FapyAde mesurée par CLHP-SM/SM
FapyAde
Solutions I II III IV VFapyAde (µM) 0,01 0,05 0,1 1 10
[M+3] FapyAde (µM) 0,5
Tableau XXXVd : Concentrations des solutions utilisées pour établir les courbes de calibration de la
5-OHdUrd mesurée par CLHP-SM/SM
5-OHdUrd
Solutions I II III IV V5-OHdUrd (µM) 0,001 0,01 0,1 0,5 1
[M+3] 5-OHdUrd (µM) 0,2
Tableau XXXVe : Concentrations des solutions utilisées pour établir les courbes de calibration de la
5-HmdUrd mesurée par CLHP-SM/SM
5-HmdUrd
Solutions I II III IV V VI VII VIII IX5-HmdUrd (µM) 0,001 0,01 0,025 0,05 0,1 0,5 1 5 10
[M+3] 5-HmdUrd (µM) 0,2
203 Chapitre VII : Partie expérimentale
Tableau XXXVf : Concentrations des solutions utilisées pour établir les courbes de calibration de la
5-FordUrd mesurée par CLHP-SM/SM
5-FordUrd
Solutions I II III IV V VI VII VIII IX5-FordUrd (µM) 0,001 0,005 0,01 0,05 0,1 0,2 1 5 10
[M+3] 5-FordUrd (µM) 0,2
Tableau XXXVg : Concentrations des solutions utilisées pour établir les courbes de calibration de la
8-oxodAdo mesurée par CLHP-SM/SM
8-oxodAdo
Solutions I II III IV V VI VII VIII8-oxodAdo (µM) 0,0005 0,001 0,005 0,01 0,05 0,1 0,5 1
[M+3] 8-oxodAdo (µM) 0,2
Tableau XXXVh : Concentrations des solutions utilisées pour établir les courbes de calibration de la
8-oxodGuo mesurée par CLHP-SM/SM
8-oxodGuo
Solutions I II III IV V VI VII VIII IX X8-oxodGuo (µM) 0,001 0,003 0,006 0,01 0,1 0,5 1 10 50 100
[M+5] 8-oxodGuo (µM) 0,2
Tableau XXXVi : Concentrations des solutions utilisées pour établir les courbes de calibration de la
8-oxodGuo mesurée par CLHP-SM/SM
diols de thymidine (Tg)
Solutions I II III IV V VI VII VIII IXTg (µM) 0,001 0,01 0,025 0,05 0,1 0,5 1 5 10
[M+3] Tg (µM) 0,2
Chapitre VII : Partie expérimentale 204
B. Mesure de la 8-oxodGuo par CLHP-DELe système de CLHP comprenait une pompe MERCK-Hitachi HPLC, modèle L-6200,
associée à un injecteur automatique SIL 9A (Shimadzu, Kyoto, Japon). La phase mobile isocratique
était constituée de 50 mM KH2PO4 et de 8% de méthanol. Le débit de l’éluant était de 1 ml.min-1. La
séparation des nucléosides a été effectuée sur une colonne chromatographique C18 de silice à polarité
de phase inversée Uptisphere (5 µm, 4,6 mm 250 mm) d’Interchim (Montluçon) maintenue à 30°C.
Dans ces conditions, le temps de rétention de la 8-oxodGuo et de la dGuo ont été respectivement de
18,6 et 13 min. Un détecteur électrochimique Coulochem II, modèle 5200A (ESA, Chelmsford, MA,
USA) a été utilisé pour mesurer la 8-oxodGuo. Les potentiels d’oxydation des électrodes de la cellule
de détection électrochimique (modèle 5011, ESA) reliée à la colonne ont été fixés respectivement à
200 mV et 450 mV. Le potentiel de la cellule de garde placée en sortie de pompe a été fixé à 500 mV.
L’élution des nucléosides normaux a été suivie avec un détecteur UV (modèle 2151, LKB Bromma) à
une longueur d’onde de 280 nm. L’ADN cellulaire a été extrait selon la méthode chaotropique au
NaCl où au NaI. Il a été hydrolysé sous forme de nucléosides et injecté sur le système CLHP-DE-UV.
Pour chaque échantillon, la quantité d’ADN a été a estimée à partir du signal UV de la dGuo après
calibration externe.
C. Mesures par CG-SM des dérivés Fapy purines
1. Système CG-SML’analyse par CG-SM a été effectuée sur un appareil de chromatographie gazeuse de type HP
5890 Series II (Hewlett-Packard, les Ulis) muni d’une colonne capillaire (0,25 mm, 15 m) revêtue
d’un film de 0,1 µm d’épaisseur de méthylsiloxane substitué par 5% de phénylsiloxane (HP5-MS,
Hewlett Packard). L’injection de 2 µl de l’échantillon a été effectuée dans le mode « splitless » à une
température du port d’injection fixée à 250°C. Le gradient de température a été le suivant :
température initiale de 110°C, avec une élévation de 15°C/min pour atteindre la température finale de
280 °C. La détection des ions positifs a été effectuée avec un détecteur de type HP 5972 en mode
d’ionisation par impact électronique. Les chromatogrammes ont été recueillis en mode « SIM ». Les
temps de rétention de la FapyGua et de la FapyAde silylées ont été respectivement de 7 min et de 5,4
min.
2. Préparation des échantillonsPour les mesures par CG-SM, 35 106 cellules ont été utilisés. L’extraction de l’ADN a été
effectuée selon la méthode chaotropique au NaI précédemment décrite. L’ADN a été hydrolysé par
ajout de 20 unités de nucléase P1 dissoute dans 20 µl de tampon (300 mM acétate de sodium, pH 5,3,
1 mM ZnSO4). Deux standards internes isotopiquement enrichis, à savoir la [M+3] FapyGua (100
pmoles) et la [M+3] FapyAde (100 pmoles) ont été ajoutés. Une fraction aliquote (100 µl) des
échantillons a été séchée sous vide avant l’étape d’hydrolyse acide. Le reste de la solution (10 µl) a
205 Chapitre VII : Partie expérimentale
été utilisé pour déterminer, par CLHP-UV, la quantité d’ADN présente dans chaque échantillon. Pour
cela, le système CLHP-DE-UV décrit précédemment a été utilisé (sans recueil du signal
électrochimique) pour mesurer la dGMP et estimer ainsi la quantité d’ADN, après calibration. La
phase mobile utilisée était constituée de 50 mM de KH2PO4 et de 1% de méthanol. Le débit d’élution
était de 1 ml.min-1. Dans ces conditions, le temps de rétention de la dGMP était de 18,0 min.
Parallèlement, une hydrolyse acide a été effectuée à température ambiante pendant 10 min,
dans 100 µl d’acide formique à 88%. Les échantillons ont ensuite été rincés 2 fois avec 50 µl d’eau
distillée et les solutions résultantes, séchées sous vide. Les résidus secs ont été repris dans une phase
contenant 25 mM de formiate d’ammonium pour prépurification.
Le système de prépurification était composé d’une pompe modèle 2150 LKB (Pharmacia
LKB Biotechnology, Uppsala, Suède) reliée à un injecteur automatique SIL-9A (Shimadzu, Kyoto,
Japon). La séparation a été effectuée sur une colonne de type C18 à polarité de phase inversée
Uptisphere (5 µm, 4,6 mm 250 mm) d’Interchim (Montluçon). Le gradient suivant a été utilisé pour
l’élution : 100% de formiate d’ammonium à 25 mM pendant les 10 premières minutes, puis la
proportion de méthanol a été augmentée linéairement de 20% à 100% en 25 min. Les conditions
finales ont été maintenues pendant 5 min avant retour à 100% de formiate d’ammonium à 25 mM. Le
débit était de 1 ml.min-1. Cinq fractions ont été collectées entre 2 et 7 min, après l’injection de 100 µl
de l’échantillon, en utilisant un collecteur de fraction (FC 204, Gilson, France). Les temps de
rétention de la FapyGua et de la FapyAde étaient respectivement de 3,5 min et 4,5 min, ( fractions 2 et
3 respectivement). Les fractions recueillies ont été lyophilisées afin d’éliminer le formiate
d’ammonium avant la dérivation des échantillons. Pour cela, les échantillons ont été dissous dans une
solution de 25 µl de BSTFA et de 25 µl d’acétonitrile. La silylation des bases modifiées a ensuite été
effectuée par chauffage à 120°C pendant 20 min, en présence de BSTFA. Les échantillons ont été
injectés en tête de colonne capillaire pour l’analyse CG-SM.
D. Mesures par CLHP-SM/SM
1. Système CLHP-SM/SMLe système chromatographique était constitué d’une pompe, modèle 2150 LKB (Pharmacia
LKB Biotechnology, Uppsala, Suède) reliée à un injecteur automatique SIL-9A (Shimadzu, Kyoto,
Japon). Le spectre de masse des composés a été obtenu sur un appareil type API 3000 (SCIEX,
Thornill, Canada) équipé d’une source « turboionspray » (SCIEX). Le gaz de nébulisation permettant
l’ionisation en mode « électrospray » était de l’azote circulant avec un débit de 1,23 l.min-1. Un
courant auxiliaire d’azote, possédant un débit de 8 l.min-1, et chauffé à 400°C, a été utilisé pour
accroître la sensibilité de l’analyse en favorisant l’évaporation des solvants. L’optimisation des
conditions de détection des nucléosides a été effectuée par infusion des composés utilisés à l’état pur.
Pour cela, ils ont été dissous dans de la phase mobile mise en mouvement à un débit de 5 µl min-1, par
un pousse seringue modèle 11 Harvard (Harvard Apparatus, South Natick, MA, USA). L’optimisation
Chapitre VII : Partie expérimentale 206
a porté sur les paramètres suivants : mode d’ionisation (positif ou négatif), tension d’ionisation (5000
Volts), tension de l’orifice et des différentes lentilles.
2. Mesures de la FapyGua et de la FapyAde
a) Préparation des échantillons
Comme dans le cas des mesures par CG-SM, 35 106 cellules ont été utilisés. L’ADN a été
extrait selon la méthode chaotropique au NaI et hydrolysé sous forme de nucléotides. Les standards
internes de [M+3)] FapyGua (100 pmoles) et de [M+3] FapyAde (100 pmoles) ont été ensuite ajoutés.
Comme décrit ci-dessus, une fraction aliquote (100 µl) des échantillons a été séchée sous vide avant
l’hydrolyse acide de l’ADN. Le restant de la solution (20 µl) a été utilisé pour déterminer par CLHP-
UV, la quantité d’ADN présente dans chaque échantillon. Un traitement à l’acide formique 88%, à
température ambiante a permis de libérer les bases FapyGua et FapyAde. Les échantillons ont été
ensuite rincés 2 fois avec 50 µl d’eau distillée et les solutions résultantes séchées sous vide. Les
résidus secs ont été repris dans 50 µl de phase mobile avant d’être injectés sur le système CLHP-
SM/SM.
b) Mesure des dérivés Fapy purines
Une colonne chromatographique de type NH2 (5 µm, 2 mm 150 mm) d’Interchim
(Montluçon) a permis de séparer les divers constituants du mélange. La phase mobile isocratique était
constituée de 10 mM de formiate d’ammonium en présence de 90% d’acétonitrile. Le débit était de
0,2 ml.min-1. Dans ces conditions, la FapyAde a été éluée en 2,9 min et la FapyGua en 5,8 min.
3. Cinétiques d’hydrolyse de l’ADNLa détermination des cinétiques d’hydrolyse a consisté à incuber en présences d’enzymes de
l’ADN isolé de thymus de veau après exposition à 40 Gy de rayonnement gamma. Le protocole
suivant a été utilisé:
a) Cinétique d’hydrolyse de l’ADN par la nucléase P1 et la
phosphatase acide
Cent µl d’une solution d’ADN (0,5 mg/ml) ont été incubés en présence de 10 unités de
nucléase P1 diluée dans son tampon 10 X (300 mM acétate de sodium, 1 mM ZnSO4, pH 5,3) et de
0,5 unité de phosphatase acide pendant différentes durées. Les échantillons ont été ensuite analysés
par CLHP-SM/SM.
b) Cinétique d’hydrolyse de l’ADN par la nucléase P1 et la
phosphatase alcaline associées à des exonucléases
Une première expérience a consisté à incuber 100 µl d’une solution d’ADN (0,5 mg/ml),
préalablement exposée à 40 Gy de rayonnement gamma du 60Co, en présence de 0,004 unité de
phosphodiestérase de rate de veau (PRV) diluée dans 10 µl de tampon 10 X ( 200 mM d’acide
207 Chapitre VII : Partie expérimentale
succinique, 100 mM CaCl2, pH 6) et de 10 unités de nucléase P1. Les solutions ont été maintenues à
37°C, pour des périodes comprises entre 30 min et 24 h. Puis, 0,003 unité de phosphodiestérase de
venin de serpent (PVS) diluée dans 10 µl du tampon 10 X de la phosphatase alcaline (500 mM Tris, 1
mM Na2EDTA, pH 8) et 10 unités de phosphatase alcaline ont été ajoutées aux échantillons avant une
incubation additionnelle de 5 h à 37°C. Dans une deuxième expérience, on a étudié plus
particulièrement l’influence du temps d’incubation en présence de PVS sur la cinétique d’hydrolyse
de l’ADN. Le temps d’incubation en présence de PRV a été fixé à 120 min. Les échantillons ont été
ainsi incubés en présence de PVS pour des périodes comprises entre 30 min et 24 h avant d’être
analysés par CLHP-SM/SM.
4. Mesure des diols de thymidine, de la 5-OHdUrd, de la 5-HmdUrd, dela 5-FordUrd, de la 8-oxodGuo, de la 8-oxodAdo et de la dGuo
a) Préparation des échantillons
L’ADN a été extrait de 25 106 cellules selon la méthode chaotropique au NaI avant d’être
hydrolysé sous forme de nucléosides à l’aide de la nuléase P1 et de la phosphatase alcaline associées
aux exonucléases PRV et PVS. Une fraction de 10 µl de l’échantillon a été utilisée pour quantifier
l’ADN par CLHP-UV alors que le restant a été analysé par CLHP-SM/SM. Deux picomoles de
standards [M+3] de 5-OHdUrd, de 5-HmdUrd, de 5-FordUrd, et des diols de thymidine ainsi que des
étalons [M + 5] de la 8-oxodGuo et de la 8-oxodAdo ont été ajoutés à chaque échantillon avant
analyse.
b) Mesure des diols de thymidine, de la 5-OHdUrd, de la 5-HmdUrd,
de la 5-FordUrd, de la 8-oxodGuo, de la 8-oxodAdo et de la dGuo
La colonne qui a permis de séparer les 7 nucléosides était de type C18 Uptisphere (5 µm, 2
mm 150 mm) d’Interchim (Montluçon). La phase mobile était le gradient suivant. Au cours des 10
premières min, la composition de l’éluant a été modifiée linéairement de 100% à 75% d’une solution
A de formiate d’ammonium (2 mM) et de 0 à 25% d’une solution B (2 mM formiate d’ammonium,
10% d’acétonitrile). La composition du mélange a été maintenue pendant 5 min avant d’être
constituée en 15 min de 100% de la solution B. Après 10 min dans ces conditions, l’élution était
effectuée avec le solvant initial. Le débit de la phase mobile était de 0,2 ml.min-1. Les temps de
rétention des nucléosides oxydés étaient les suivant : diols de thymidine trans et cis (4,2-4,9 min et
9,6 min ) ; 5-OHdUrd (12,4 min) ; 5-HmdUrd (17,5 min) ; 5-FordUrd (23 min ) ; 8-oxodGuo (27,3
min) ; dGuo (23,9 min) ; 8-oxodAdo (33,3 min).
Chapitre VII : Partie expérimentale 208
E. Epimérisation des diols de thymidineLes diols de thymidine ont été synthétisés selon le protocole décrit dans (360). Afin d’étudier
la stabilité des diastéréoisomères trans et cis des diols dans différentes conditions de pH et de
température, deux solutions ont été préparées dans de l’eau désionisée. Ainsi, les solutions des deux
diastéréoisomères trans (5R, 6R) et (5S, 6S) ont été maintenues à 37°C ou à -20°C, pendant une nuit.
Une troisième solution contenant également les diols de configuration trans (5R, 6R) et (5S, 6S) a été
maintenue à température ambiante, pendant une nuit, dans le tampon de la nucléase P1 (pH 5,5). Une
fraction aliquote de chaque solution a été analysée sur un système CLHP composé d’une pompe
modèle 2150 LKB (Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Suède). La séparation a été effectuée
sur une colonne de type C18 Uptisphere (5 µm, 4,6 mm 150 mm) d’Interchim (Montluçon). La
phase mobile qui a permis la séparation des diastéréoisomères trans et cis des diols de thymidine était
constituée d’une solution de 5 mM de formiate d’ammonium. Le débit d’élution était de 1 ml.min-1.
Dans ces conditions, les diols possédant la configuration trans ont été élués en 4,5-5,5 min et ceux
possédant la configuration cis en 11,4 min.
VIII. STABILITE DES DERIVES FAPY PURINES EN MILIEU ALCALIN
A. Stabilité à pH 10Des échantillons de 500 µl d’une solution aqueuse d’ADN isolé de thymus de veau (0,5
mg/ml) ont été exposés à une dose de 40 Gy de rayonnement gamma du 60Co. La moitié des
échantillons a été incubée en présence de tampon de lyse à 4°C, pour différentes durées. Les
échantillons contrôle maintenus à pH 7 ont été conservés à 4°C. L’ADN a ensuite été précipité avec
0,8 ml de solution NaI (20 mM Na2EDTA, 7,6 M NaI, 40 mM Tris/HCl, 0,3 mM déféroxamine) et 2
ml de propan-2-ol à 100%. L’ADN obtenu a été centrifugé à 5000 g pendant 10 min et rincé avec 1
ml de propan-2-ol à 40% et 1 ml d’éthanol à 70%. Le culot dissous dans 100 µl d’une solution de
déféroxamine à 0,1 mM a été soumis, après ajout de 100 pmoles de standards internes ([M+3]
FapyGua et [M+3] FapyAde), à une digestion enzymatique et à une hydrolyse acide afin de libérer les
dérivés Fapy purines selon la procédure précédemment décrite.
B. Stabilité à pH 13Des échantillons de 500 µl d’une solution aqueuse d’ADN isolé de thymus de veau (0,5
mg/ml) ont été exposés à une dose de 40 Gy de rayonnement gamma du 60Co. La moitié des
échantillons a été incubée en présence de 300 mM de NaOH, pendant différentes durées à une
température de 4°C. Un volume de HCl a été ajouté de façon à obtenir une concentration finale de 300
mM en acide afin de neutraliser la solution. Les échantillons contrôle maintenus à pH 7 ont été
conservés à 4°C. Un volume de 1 ml de chaque échantillon a été ensuite déposé en tête d’une colonne
d’exclusion de type Nap 25. L’ADN a été élué par 2,5 ml d’eau désionisée. La solution recueillie a été
séchée sous vide et le résidu obtenu repris dans une solution de déféroxamine (0,1 mM). Après ajout
209 Chapitre VII : Partie expérimentale
de 100 pmoles de standards internes ([M+3] FapyGua et [M+3] FapyAde), une digestion enzymatique
et une hydrolyse acide ont été effectuées avant le dosage des dérivés Fapy purines par CG-SM.
C. Efficacité d’exclusion des colonnes Nap 25L’efficacité des colonnes Nap 25 à séparer l’ADN des dérivés Fapy purines a été déterminée.
Pour cela, des échantillons de 500 µl d’ADN de thymus de veau (0,5 mg/ml) ont été enrichis avec 100
pmoles de FapyGua et de FapyAde. Le pH des solutions correspondantes a été porté à 13 puis a été
neutralisé par l’ajout de HCl comme décrit ci-dessus. Les échantillons ont été déposés sur une
colonne d’exclusion de type Nap 25 et ont été élués en trois fractions, correspondant à trois volumes
d’eau désionisée. La première fraction de 1 ml, correspond au volume mort de la colonne. La
deuxième fraction de 2,5 ml correspond à l’élution supposée de l’ADN. Enfin la troisième, de 3,5 ml,
correspond à un volume de rinçage. Chaque fraction recueillie a été séchée et le résidu a été repris
dans 100 µl d’une solution de 0,1 mM de déféroxamine. Puis, 100 pmoles de standards internes
[M+3] FapyGua et [M+3] FapyAde ont été ajoutés avant l’étape de digestion enzymatique et
d’hydrolyse acide, et la mesure des dérivés Fapy purines par CG-SM.
Références bibliographiques
Références bibliographiques 211
Liste des publications du candidat
Pouget (J.P.), Douki (T.), Richard (M.J.) and Cadet (J.) DNA damage induced in cells by gammaand UVA radiations: calibrated comet assay, with HPLC/GC-MS and HPLC-EC measurements,2000, Chem. Res. Tox. (soumise pour publication).
Pouget (J.P.), Ravanat (J.L.), Douki (T.), Richard (M.J.) and Cadet (J.) Measurement of DNA basedamage after low doses of gamma irradiation: comparison between the HPLC-EC and the cometassays, 1999, Int. J. Radiat. Biol. 75, 1, 51-58.
Pouget (J.P.), Ravanat (J.L.), Douki (T.), Richard (M.J.) and Cadet (J.) Use of the comet assay todetect DNA base damage in cells exposed to gamma irradiation or to photosensitizers, 1999, J.Chim. Phys. 96,143-146.
Cadet (J.), Delatour (T.), Douki (T.), Gasparruto (D.), Pouget (J.P.), Ravanat (J.L.) and Sauvaigo(S.), Hydroxyl radicals and DNA base damage, 1999, Mutat. Res. 424, 1-2, 9-21.
Cadet (J.), D’Ham (C.), Douki (T.), Pouget (J.P.), Ravanat (J.L.) and Sauvaigo (S.) Facts andartifacts in the measurement of oxidative base damage to DNA, 1999, Free Rad. Res. 29, 541-550.
Cadet (J.), Berger (M.), Douki (T.), Gasparutto (D.), Pouget (J. P.), Ravanat (J.L.) et Sauvaigo (S.)Dommages des acides nucléiques induits après exposition aux rayonnements X et UV, 1999,J.Phys. IV France 9, Pr5-91-Pr5-95.
Cadet (J.), Douki (T.), Gasparruto (D.), Gromova (M.), Pouget (J.P.), Ravanat (J.L.), Romieu (A.)and Sauvaigo (S.), Radiation-induced damage to DNA: Mechanistic aspects and measurement ofbase lesions, 1999, Nuclear Inst. Methods Phys. Res. B 151, 1-7.
Cadet (J.), Douki (T.), Pouget (J.P.), Ravanat (J.L.) Singlet oxygen DNA damage products:formation and measurement, 2000, Methods Enzymol. (sous presse).
Références bibliographiques 212
Références bibliographiques
[1] Lemaire, G. & Foos, J. (1995) Tome 3 : Les effets biologiques des rayonnements - éléments deradioprotection. Formascience, Orsay.
[2] Barendsen, G. W. (1994) The relationships between RBE and LET for different types of lethaldamage in mammalian cells: biophysical and molecular mechanisms. Radiat. Res. 139, 257-270.
[3] ICRP (1991) Recommendations of the International Commission on Radiological Protection -Publication ICRP 60. International Commission on Radiological Protection, New York.
[4] UNSCEAR (1994) United Nations Scientific Committee on the Effects of Atomic Radiation:Source and effects of ionizing radiations. UNSCEAR, New York.
[5] ICRP (1993) Protections against Radon 222 at home and at work. Recommendations of theInternational Commission on Radiological Protection - Publication ICRP 65. InternationalCommission on Radiological Protection, New York.
[6] Lubin, J. H., Boice, J. D. J., Edling, C., Hornung, R. W., Howe, G., Kunz, E., Kusiak, R. A.,Morrison, H. I., Radford, E. P. & Samet, J. M. (1995) Radon-exposed underground miners andinverse dose-rate (protraction enhancement) effects. Health Phys. 69, 494-500.
[7] Hubert, P. (1993) Exposition de la population française aux radiations naturelles. IVème
Conférence Internationale de l'Acomen, France.[8] Dousset, M. & Jammet, H. (1986) Les sources naturelles d'exposition aux rayonnements
ionisants. Clefs CEA, Paris.[9] BEIR (1988) National Research Council Committee on the Biological Effects of Ionizing
Radiation: health risks of radon and other internally deposited alpha-emitters. Washington DC,USA.
[10] AIEA (1986) Sureté. Agence Internationale de l'Energie Atomique, Vienne.[11] Symons, M. C. R. (1994) Direct and indirect damage to DNA by ionising radiation. Radiat.
Phys. Chem. 43, 403-405.[12] Bensasson, R. V., Land, E. J. & Truscott, T. G. (1993) Light and ionizing radiation: generation
of excited states and radicals. Dans Excited States and Free Radicals in Biology and Medicinepp. 249-289, Oxford University Press, New York.
[13] Ward, J. F. (1988) DNA damage produced by ionizing radiation in mammalian cells: identities,mechanism of formation and repairability. Prog. Nucleic Acids Res. Mol. Biol. 35, 95-125.
[14] Goodhead, D. T. (1994) Initial events in the cellular effects of ionizing radiations: clustereddamage in DNA. Int. J. Radiat. Biol. 65, 7-17.
[15] Prise, K. M., Folkard, M., Newman, H. C. & Michael, B. D. (1994) Effect of radiation qualityon lesion complexity in cellular DNA. Int. J. Radiat. Biol. 66, 537-542.
[16] Goodhead, D. T. (1989) The initial physical damage produced by ionizing radiations. Int. J.Radiat. Biol. 56, 623-634.
[17] Holley, W. R. & Chatterjee, A. (1996) Clusters of DNA damage induced by ionizing radiation:formation of short DNA fragments. I. Theoretical modeling. Radiat. Res. 145, 188-199.
[18] Chaudhary, A. K., Reddy, G. R., Blair, I. A. & Marnett, L. J. (1996) Characterization of an N6-oxopropenyl-2'-deoxyadenosine adduct in malondialdehyde-modified DNA using liquid
213 Références bibliographiques
chromatography/electrospray ionization tandem mass spectrometry. Carcinogenesis 17, 1167-1170.
[19] Chen, H. J. & Chung, F. L. (1996) Epoxidation of trans-4-hydroxy-2-nonenal by fatty acidhydroperoxides and hydrogen peroxide. Chem. Res. Toxicol. 9, 306-312.
[20] Ramakrishnan, N., Mc Clain, D. E. & Catravas, G. N. (1993) Membranes as sensitives targets inthymocytes apoptosis. Int. J. Radiat. Biol. 63, 693-701.
[21] Elia, M. C. & Bradley, O. (1992) Influence of chromatin structure on the induction of DNAdouble strand breaks by ionizing radiation. Cancer Res. 52, 1580-1586.
[22] Téoule, R. & Duplaa, A. M. (1987) Gamma-irradiation of homodeoxyoligonucleotides 32P-labelled at one end: computer simulation of the chain length distribution of the radioactivefragments. Int. J. Radiat. Biol. 51, 429-439.
[23] Frankenberg-Schwager, M. (1990) Induction, repair and biological relevance of radiation-induced DNA lesions in eukaryotic cells. Radiat. Environ. Biophys. 29, 273-292.
[24] Cadet, J. & Téoule, R. (1978) Comparative study of oxidation of nucleic acid components byhydroxyl radical, singlet oxygen and superoxide anion radical. Photochem. Photobiol. 28, 661-667.
[25] von Sonntag, C. (1987) The chemical basis of radiation biology. pp. 117-166, pp. 221-294,Taylor & Francis, New York.
[26] Ahnström, G. & Erixon, K. (1981) Measurement of strand breaks by alkaline denaturation andhydroxyapatite chromatography. Dans DNA repair: A Laboratory Manuel Research Procedures(E. C. Friedberg & P. C. Hanawalt eds) pp. 403-418, Marcel Dekker, New York.
[27] Tubiana, M., Dutreix, M. & Wambersie, A. (1986) Effets des rayonnements sur les moléculesd'ADN et les chromosomes. Dans Radiobiologie pp. 33-71, Hermann, Paris.
[28] Lemaire, D. G. E., Bothe, E. & Schulte-Frohlinde, D. (1984) Yields of radiation-induced mainchain scission of poly U in aqueous solution: strand break formation via base radicals. Int. J.Radiat. Biol. 45, 351-358.
[29] Deeble, D. J., Schulz, D. & von Sonntag, C. (1984) γ-Radiolysis of poly(U) in aqueous solution:the role of primary sugar and base radicals in the release of undamaged uracil. Int. J. Radiat.Biol. 49, 915-926.
[30] Siddiqi, M. A. & Bothe, E. (1987) Single and double strand break formation in DNA irradiatedin aqueous solution: dependence on dose and °OH radical scavenger concentration. Radiat. Res.112, 449-463.
[31] Ward, J. F. (1985) Biochemistry of DNA lesions. Radiat. Res. 104, S103-S111.[32] Radford, I. R. (1986) Evidence for a general relationship between the induced level of DNA
double-strand breakage and cell-killing after X-irradiation of mammalian cells. Int. J. Radiat.Biol. 49, 611-620.
[33] Iliakis, G. (1991) The role of DNA double strand breaks in ionizing radiation-induced killing ofeukaryotic cells. BioEssays 13, 641-648.
[34] Frankenberg-Schwager, M. & Frankenberg, D. (1990) DNA double-strand breaks: their repairand relationship to cell killing in yeast. Int. J. Radiat. Biol. 58, 569-575.
[35] Ross, G. M., Eady, J. J., Mithal, N. P., Bush, C., Steel, G. & Jeggo, P. A. (1995) DNA strandbreak rejoining defect in xrs-6 is complemented by transfection with the human Ku80 Gene.Cancer Res. 55, 1235-1238.
Références bibliographiques 214
[36] Téoule, R. (1987) Radiation-induced DNA damage and its repair. Int. J. Radiat. Biol. 51, 573-589.
[37] Dizdaroglu, M. (1992) Oxidative damage to DNA in mammalian chromatin. Mutat. Res. 275,331-342.
[38] Cadet, J., Berger, M., Douki, T. & Ravanat, J.-L. (1997) Oxidative damage to DNA: formation,measurement and biological significance. Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol. 31, 1-87.
[39] Cadet, J. & Téoule, R. (1974) Radiation chemistry of nucleic acids: characterization of thyminehydroxy-hydroperoxides. Biochem. Biophys. Res. Commun. 59, 1047-1052.
[40] Cadet, J. & Téoule, R. (1971) Peroxides produced from thymine by gamma irradiation inaerated solution. Biochim. Biophys. Acta 238, 8-26.
[41] Wagner, J. R., van Lier, J. E., Berger, M. & Cadet, J. (1994) Thymidine hydroperoxides:structural assignment, conformational features, and thermal decomposition in water. J. Am.Chem. Soc. 116, 2235-2242.
[42] Cadet, J., Delatour, T., Douki, T., Gasparutto, D., Pouget, J.-P., Ravanat, J.-L. & Sauvaigo, S.(1999) Hydroxyl radicals and DNA base damage. Mutat. Res. 424, 9-21.
[43] Fuciarelli, A. F., Miller, G. G. & Raleigh, J. A. (1985) An immunochemical probe for 8,5'-cycloadenosine 5'-monophosphate and its deoxy analog in irradiated nucleic acids. Radiat. Res.104, 272-283.
[44] Raleigh, J. A., Kremers, W. & Whitehouse, R. (1976) Radiation chemistry of nucleotides: 8,5'-cyclonucleotide formation and phosphate release initiated by hydroxyl radical attack onadenosine monophosphates. Radiat. Res. 65, 414-422.
[45] Mariaggi, N., Cadet, J. & Téoule, R. (1976) Cyclisation radicalaire de la désoxy-2'-adénosine ensolution aqueuse, sous l'effet du rayonnement gamma. Tetrahedron 32, 2385-2387.
[46] Kamiya, H. & Kasai, H. (1995) Formation of 2-hydroxydeoxyadenosine triphosphate, anoxidatively damaged nucleotide, and its incorporation by DNA polymerases. J. Biol. Chem.270, 19446-19450.
[47] Nackerdien, Z., Kasprzak, K. S., Rao, G., Halliwell, B. & Dizdaroglu, M. (1991) Nickel(II)- andCobalt(II)-dependent damage by hydrogen peroxide to the DNA bases in isolated humanchromatin. Cancer Res. 51, 5837-5842.
[48] Oleinick, N. L., Chiu, S., Ramakrishnan, N. & Xue, L. (1987) The formation, identification, andsignificance of DNA-protein cross-links in mammalian cells. Br. J. Cancer 55 (Suppl. VIII),135-140.
[49] Dizdaroglu, M. & Gajewski, E. (1989) Structure and mechanism of hydroxyl radical-inducedformation of a DNA-protein cross-link involving thymine and lysine in nucleohistone. CancerRes. 49, 3463-3467.
[50] Nackerdien, Z., Rao, G., Cacciuttolo, M. A., Gajewski, G. E. & Dizdaroglu, M. (1991)Chemical nature of DNA-protein cross-links produced in mammalian chromatin by hydrogenperoxide in the presence of iron or copper ions. Biochemistry 30, 4873-4879.
[51] Gajewski, G. E., Fuciarelli, A. F. & Dizdaroglu, M. (1988) Structure of hydroxyl radical-induced DNA-protein cross-links in calf thymus nucleohistone in vitro. Int. J. Radiat. Biol. 54,445-459.
[52] Beesk, F., Dizdaroglu, M., Schutle-Frohlinde, D. & von Sonntag, C. (1979) Radiation-inducedstrand breaks in deoxygenated aqueous solution. The formation of altered sugars as end groups.Int. J. Radiat. Biol. 36, 565-576.
215 Références bibliographiques
[53] Decarroz, C., Wagner, J. R., van Lier, J. E., Murali, K. C., Riesz, P. & Cadet, J. (1986)Sensitized photo-oxidation of thymidine by 2-methyl-1,4-naphthoquinone. Characterization ofstable products. Int. J. Radiat. Biol. 50, 491-505.
[54] Lindahl, T. (1993) Instability and decay of the primary structure of DNA. Nature 362, 709-715.[55] Billen, D. (1990) Spontaneous DNA damage and its significance for the "negligible dose"
controversy in radiation protection. Radiat. Res. 124, 242-245.[56] Buckton, K. E. & Evans, H. J. (1973) Methods for the analysis of human chromosome
aberrations. World Health Organization, Genève.[57] Sax, K. (1938) Chromosome aberrations induced by X-rays. Genetics 23, 494-516.[58] Brown, J. M. & Kovaks, M. S. (1993) Visualization of nonreciprocal chromosome exchanges in
irradiated human fibroblasts by fluorescence in situ hybridization. Radiat. Res. 136, 71-76.[59] Revell, S. H. (1959) The accurate estimation of chromatid breakage and its relevance to a new
interpretation of chromatid aberrations induced by ionising radiations. Proc. Royal Soc. LondonB150, 563-589.
[60] Bryant, P. E. (1984) Enzymatic restriction of in situ mammalian cell DNA using PuvII andBamHI: evidence for the double strand break origin of chromosomal aberrations. Int. J. Radiat.Biol. 46, 57-65.
[61] Dutrillaux, B., Viégas-Péquignot, E., Prod'homme, M. & Sportes, M. (1985) Distribution of thevarious radiation-induced chromosomal rearrangements in relation to the dose and samplingtime. Mutat. Res. 152, 197-203.
[62] Lloyd, D. C. (1990) Biological dosimetry by cytogenetic methods. Dans Reunion internationalsobre dosimetria biologica pp. 60-73, LISSE, Madrid.
[63] Tubiana, M. & Bertin, M. (1989) Radiobiologie, Radioprotection. 2439 Que sais je?, Paris.[64] Galle, P. & Paulin, R. (1992) Biophysique: Radiobiologie, Radiopathologie. Masson, Paris.[65] Bertin, M. (1994) Energie électronucléaire : Les effets biologiques des rayonnements ionisants.
388 p, Comité de Radioprotection EDF, Paris.[66] Académie des Sciences (1995) Problèmes liés aux effets des faibles doses des radiations
ionisantes. Académie des Sciences, Paris.[67] Nenot, J. C. (1996) Radioprotection et faibles doses. Dans Revue Générale du Nucléaire 6,
Paris.[68] Morgan, W. F., Day, J. P., Kaplan, M. I., McGhee, E. M. & Limoli, C. L. (1996) Genomic
instability induced by ionizing radiation. Radiat. Res. 146, 247-258.[69] Painter, R. B. (1980) The role of DNA damage and repair in cell killing induced by ionizing
radiation. Dans Radiation Biology in Cancer Research (R. E. Meyn & H. R. Withers eds)Raven Press, New York.
[70] Ron, E. (1998) Ionizing radiation and cancer risk: evidence from epidemiology. Radiat. Res.150, S30-S41.
[71] Preston, D. L., Kusumi, S., Tomonaga, M., Izumi, S., Ron, E., Kuramoto, A., Kamada, N.,Dohy, H. & Matsuo, T. (1994) Cancer incidence in atomic bomb survivors. Part III: Leukemia,lymphoma and multiple myeloma, 1950-1987. Radiat. Res. 139, 1-129.
[72] Thompson, D. E., Mabuchi, K., Ron, E., Soda, M., Tokunaga, M., Ochikubo, S., Sugimoto, S.,Ikeda, T., Terasaki, M. & Izumi, S. (1994) Cancer incidence in atomic bomb survivor. Part II:solid tumors, 1985-1987. Radiat. Res. 137, S17-S67.
Références bibliographiques 216
[73] Howe, G. R. (1997) Overview of epidemiological studies of radiation and cancer risk based onmedical series. Implications of new data on radiation cancer risk. Proceedings of the thirty-second Annual Meeting, National Council on Radiation Protection and MeasurementsBethesda, MD, USA.
[74] Smith, P. G. & Doll, R. (1981) Mortality from cancer and all causes among British radiologists.Br. J. Radiol. 54, 187-194.
[75] Gilbert, E. S., Cragle, D. L. & Wiggs, L. D. (1989) Updated analyses of combined mortalitydata for workers at the Hanford Site, Oak Ridge National Laboratory, and Rocky FlatsWeapons Plant. Radiat. Res. 136, 408-421.
[76] Nowell, P. C. (1976) The clonal evolution of tumor cell populations. Science 194, 23-28.[77] Loeb, L. A., Springgate, C. F. & Battula, N. (1974) Errors in DNA replication as a basis of
malignant changes. Cancer Res. 34, 2311-2321.[78] Loft, S. & Poulsen, H. E. (1996) Cancer risk and oxidative DNA damage in man. J. Mol. Med.
74, 297-312.[79] Kennedy, A. R., Cairns, J. & Little, J. B. (1984) Timing of the steps in transformation of
C3H10T1/2 cells by X-irradiation. Nature 307, 85-86.[80] Dutrillaux, B. (1998) Quand un cancer est il d'origine radioactive? La Recherche 308 p 68-77.[81] ICRP (1977) Recommendations of the International Commision on Radiological Protection -
Publication ICRP 26. International Commission on Radiological Protection, New York.[82] Dubertret, L., Santus, R. & Morlière, P. (1995) Ozone, Sun, Cancer. Les éditions INSERM,
Paris.[83] IARC (1992) Monographs on the evaluation of carcinogenic Risks to Humans, Solar and UV
Radiation. IARC, Lyon, France.[84] Strickland, P. T. (1986) Photocarcinogenesis by near-ultraviolet (UVA) radiation in Sencar
mice. J. Invest. Dermatol. 87, 272-275.[85] Setlow, R. B., Grist, E., Thompson, K. & Woodhead, A. D. (1993) Wavelengths effective in
induction of malignant melanoma. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6666-6670.[86] Tyrrell, R. M. & Keyse, S. M. (1990) New trends in photobiology. The interactions of UVA
radiation with cultured cells. J. Photochem. Photobiol., B 4, 349-361.[87] Roza, L., Baan, R. A., van der Leun, J. C., Kligman, L. & Young, A. R. (1990) UVA hazards in
skin associated with the use of tanning equipment. Photochem. Photobiol. 3, 281-289.[88] Sciences et avenir (1992) Le soleil. 107, 6-32.[89] Coohill, T. P., Peak, M. J. & Peak, J. G. (1987) The effects of the ultraviolet wavelengths of
radiation present in sunlight on human cells in vitro. Photochem. Photobiol. 46, 1043-1050.[90] Bruls, W. A. G., Slaper, H., van der Leun, J. C. & Berrens, L. (1984) Transmission of human
epidermis and stratum corneum as a function of thickness in the ultraviolet and visiblewavelengths. Photochem. Photobiol. 40, 485-494.
[91] Tuveson, R. W. & Sammartano, S. J. (1986) Sensitivity of HemA mutant Escherichia coli cellsto inactivation by near-UV light depends on the level of supplementation with δ-aminolevulinicacid. Photochem. Photobiol. 43, 621-626.
[92] Eisenstark, A. (1987) Mutagenic and lethal effects of near-ultraviolet radiation (290-400 nm) onbacteria phage. Environ. Mol. Mutagen. 10, 317-337.
217 Références bibliographiques
[93] Kjeldstad, B. & Johnsson, A. (1986) An action spectrum for blue and near ultravioletinactivation of propionibacterium acnes with emphasis on possible porphyrinphotosensitization. Photochem. Photobiol. 43, 67-70.
[94] Sage, E. (1993) Distribution and repair of photolesions in DNA: genetic consequences and therole of sequence context. Photochem. Photobiol. 57, 163-174.
[95] Mitchell, D. L. & Nairn, R. S. (1989) The biology of the (6-4) photoproduct. Photochem.Photobiol. 49, 805-819.
[96] Pfeifer, G. P. (1997) Formation and processing of UV photoproducts: effects of DNA sequenceand chromatin environment. Photochem. Photobiol. 65, 270-283.
[97] Kochevar, I. E. & Dunn, D. A. (1990) Photosensitized reactions of DNA: cleavage and addition.Dans Bioorganic Photochemistry (H. Morrison ed) pp. 273-315, John Wileg and Sons, NewYork.
[98] Foote, C. S. (1991) Definition of type I and type II photosensitized oxidation. Photochem.Photobiol. 54, 659.
[99] Ito, K., Inoue, S., Yamamoto, K. & Kawanishi, S. (1993) 8-Hydroxydeoxyguanosine formationat the 5'-GG-3' sequences in the double-stranded DNA by UV radiation with riboflavin. J. Biol.Chem. 268, 13221-13227.
[100] Peak, M. J., Jones, C. A., Sedita, B. A., Dudek, E. J., Spitz, D. R. & Peak, J. G. (1990)Evidence that hydrogen peroxide generated by 365-nm UVA radiation is not important inmammalian cell killing. Radiat. Res. 123, 220-223.
[101] Boiteux, S., Gajewski, E., Laval, J. & Dizdaroglu, M. (1992) Substrate specificity of theEscherichia coli Fpg protein (formamidopyrimidine-DNA glycosylase): excision of purinelesions in DNA produced by ionizing radiation or photosensitization. Biochemistry 31, 106-110.
[102] Ravanat, J.-L. & Cadet, J. (1995) Reaction of singlet oxygen with 2'-deoxyguanosine andDNA. Isolation and characterization of the main oxidation products. Chem. Res. Toxicol. 8,379-388.
[103] Cadet, J., Ravanat, J.-L., Buchko, G. W., Yeo, H. C. & Ames, B. N. (1994) Singlet oxygenDNA damage: chromatographic and mass spectrometric analysis of damage products. MethodsEnzymol. 234, 79-88.
[104] Taylor, J. R. (1987) Photoaging, photodamage and photoprotection. J. Am. Acad. Dermatol.17, 703-734.
[105] Mullenders, L. H. F., Hazekamp-van Dokkum, A. M., Kalle, W. H. J., Vrieling, H.,Zdzienicka, M. Z. & van Zeeland, A. A. (1993) UV-induced photolesions, their repair andmutations. Mutat.Res. 299, 271-276.
[106] Thomas, D. C. & Kunkel, T. A. (1993) Eluting solution composition affects DNA double-strand break analysis by filter elution. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 7744-7748.
[107] Kelfkens, G., de Gruijl, F. R. & van der Leun, J. C. (1991) Tumorigenesis by short-waveultraviolet A: papillomas versus squamous cell carcinomas. Carcinogenesis 12, 1377-1382.
[108] De Laat, J. M. T. & de Gruijl, F. R. (1996) The role of UVA in the etiology of non-melanomaskin cancer. Cancer Surv. 26, 173-191.
[109] Kantor, G. J. (1985) Effects of sunlight on mammalian cells. Photochem. Photobiol. 41, 741-746.
Références bibliographiques 218
[110] Brash, D. E., Rudolph, J. A., Simon, J. A., Lin, A., Makenna, G. J., Baden, H. P., Halperin, A.J. & Ponten, J. (1991) A role for sunlight in skin cancer: UV-induced p-53 mutations insquamous cell carcinoma. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 10124-10128.
[111] Anansthaswamy, H. N. & Pierceall, W. E. (1990) Molecular mechanisms of ultravioletradiation carcinogenesis. Photochem. Photobiol. 52, 1119-1136.
[112] Stewart, M. S., Cameron, G. S. & Pence, B. C. (1996) Antioxidants nutrients protect againstUVB-induced oxidative damage to DNA of mouse keratinocytes in culture. J. Invest. Dermatol.106, 1086-1089.
[113] Hollows, C. D. (1981) Cataract: The ultraviolet risk factor. Lancet 256, 1249-1250.[114] Matsuoka, L. Y. (1990) Skin types and epidermal photosynthesis of vitamin D3. J. Am. Acad.
Dermatol. 23, 525-526.[115] Beckman, K. B. & Ames, B. N. (1997) Oxidative decay of DNA. J. Biol. Chem. 272, 19633-
19636.[116] Diplock, A. T. (1991) Antioxidants nutrients and disease prevention: an overview. Am. J. Clin.
Nutr. 53, 189S-193S.[117] Ames, B. N., Shigenaga, M. K. & Hagen, T. M. (1993) Oxidants, antioxidants, and the
degenerative diseases of aging. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 7915-7922.[118] Halliwell, B. & Gutteridge, J. M. C. (1989) Free Radicals in Biology and Medicine. 2 1-543,
Oxford University Press, New York.[119] Halliwell, B. (1994) Free radicals, antioxidants, and human disease: curiosity, cause or
consequence. Lancet 344, 721-724.[120] Li, C., Nagasawa, H., Tsang, N.-M. & Little, J. B. (1995) Radiation-induced irreversible
G(0)/G(1) block is abolished in human diploid fibroblasts transfected with the humanpapilloma virus E6 gene: implication of the p53-Cip1/WAF1 pathway. Int. J. Oncol. 6, 233-236.
[121] Slichenmyer, W. J., Nelson, W. G., Slebos, R. J. & Kastan, M. B. (1993) Loss of a p53-associated G1 checkpoint does not decrease cell survival following DNA damage. Cancer Res.53, 4164-4168.
[122] Sabatier, L., Al Achkar, W., Hoffschir, F., Luccioni, C. & Dutrillaux, B. (1987) Qualitativestudy of chromosomal lesions induced by neutrons and neon ions in human lymphocytes at G0phase. Mutat. Res. 178, 91-97.
[123] Szumiel, I. (1998) Monitoring and signaling of radiation-induced damage in mammalian cells.Radiat. Res. 150, S92-S101.
[124] Wallace, S. S. (1994) DNA damages processed by base excision repair: biologicalconsequences. Int. J. Radiat. Biol. 66, 579-589.
[125] Wallace, S. S. (1998) Enzymatic processing of radiation-induced free radical damage in DNA.Radiat. Res. 150 (suppl.), S60-S79.
[126] Tchou, J., Bodepudi, V., Shibutani, S., Antoshechkin, I., Miller, J., Grollman, A. P. &Johnson, F. (1994) Substrate specificity of Fpg protein. J. Biol. Chem 269, 15318-15324.
[127] Karakaya, A., Jaruga, P., Bohr, V. A., Grollman, A. P. & Dizdaroglu, M. (1997) Kinetics ofexcision of purine lesions from DNA by Escherichia coli Fpg protein. Nucleic Acids Res. 25,474-479.
[128] Hatahet, Z., Kow, Y. W., Purmal, A. A., Cunningham, R. P. & Wallace, S. S. (1994) Newsubstrates for old enzymes. 5-Hydroxy-2'-deoxycytidine and 5-hydroxy-2'-deoxyuridine are
219 Références bibliographiques
substrates for Escherichia coli endonuclease III and formamidopyrimidine DNA N-glycosylase,while 5-hydroxy-2'-deoxyuridine is a substrate for uracil DNA N-glycosylase. J. Biol. Chem.269, 18814-18820.
[129] Boiteux, S. (1993) Properties and biological functions of the NTH and FPG proteins ofEscherichia coli: two DNA glycosylases that repair oxidative damage in DNA. J. Photochem.Photobiol. B: Biol. 19, 87-96.
[130] Wang, D. & Essingmann, J. M. (1997) Kinetics of oxidised cytosine repair by endonuclease IIIof Escherichia coli. Biochemistry 36, 8628-8633.
[131] D'Ham, C., Romieu, A., Jaquinod, M., Gasparutto, D. & Cadet, J. (1999) Excision of 5,6-dihydroxy-5,6-dihydrothymine, 5,6-dihydrothymine and 5-hydroxyxytosine from definedsequence oligonucleotides by Escherichia coli endonuclease III and Fpg proteins: kinetic andmechanistic aspects. Biochemistry 38, 3335-3344.
[132] Kerr, J. F. R., Wyllie, A. H. & Currie, A. R. (1972) Apoptosis: a basic biological phenomenonwith wide-ranging implications in tissue kinetics. Br. J. Cancer 26, 239-257.
[133] Cox, L. S. & Lane, D. P. (1995) Tumour suppressors, kinases and clamps: how p53 regulatesthe cell cycle in response to DNA damage. BioEssays 17, 501-508.
[134] Ames, B. N. (1995) The causes and prevention of cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 5258-5265.
[135] Cadet, J., Douki, T., Gasparutto, D., Gromova, M., Pouget, J.-P., Ravanat, J.-L., Romieu, A. &Sauvaigo, S. (1999) Radiation-induced damage to DNA: mechanistic aspects and measurementof base lesions. Nuclear Inst. Methods Phys. Res. B151, 1-7.
[136] Cadet, J., Berger, M., Douki, T., Gasparutto, D., Pouget, J.-P., Ravanat, J.-L. & Sauvaigo, S.(1999) Dommages des acides nucléiques induits après exposition aux rayonnements X et UV.J.Phys. IV France 9, Pr5-91-Pr5-95.
[137] Kasai, H., Tanooka, H. & Nishimura, S. (1984) Formation of 8-hydroxyguanine residues inDNA by X-irradiation. Gann 75, 1037-1039.
[138] Kasai, H. & Nishimura, S. (1986) Hydroxylation of guanine in nucleosides and DNA at the C-8 position by heated glucose and oxygen radical-forming agents. Environ. Health Perspect. 67,111-116.
[139] Kasai, H., Yamaizumi, Z., Berger, M. & Cadet, J. (1992) Photosensitized formation of 7,8-dihydro-8-oxo-2'-deoxyguanosine (8-hydroxy-2'-deoxyguanosine) in DNA by riboflavin: a nonsinglet oxygen mediated mechanism. J. Am. Chem. Soc. 114, 9692-9694.
[140] Kasai, H. (1997) Analysis of a form of oxidative DNA damage, 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine,as a marker of cellular oxidative stress during carcinogenesis. Mutat. Res. 387, 147-163.
[141] Kasai, H., Crain, P. F., Kuchino, Y., Nishimura, S., Ootsuyama, A. & Tanooka, H. (1986)Formation of 8-hydroxyguanine moiety in cellular DNA by agents producing oxygen radicalsand evidence for its repair. Carcinogenesis 7, 1849-1851.
[142] Rosen, J. E., Prahalad, A. K. & Williams, G. M. (1996) 8-Oxodeoxyguanosine formation inthe DNA of cultured cells after exposure to H2O2 alone or with UVB and UVA irradiation.
Photochem. Photobiol. 64, 117-122.[143] Ito, K. & Kawanishi, S. (1997) Site-specific DNA damage induced by UVA radiation in the
presence of endogenous photosensitizer. Biol.Chem. 378, 1307-1312.
Références bibliographiques 220
[144] Cheng, K. C., Cahill, D. S., Kasai, H., Nishimura, S. & Loeb, L. A. (1992) 8-Hydroxyguanine,an abundant form of oxidative DNA damage, causes G→T and A→C substitutions. J. Biol.Chem. 267, 166-172.
[145] Moriya, M. & Grollman, A. P. (1993) Mutations in the mutY gene of Escherichia coli enhancethe frequency of targeted G:C -> T:A transversions induced by a single 8-oxoguanine residue insingle-stranded DNA. Mol. Gen. Genet. 239, 72-76.
[146] Shibutani, S., Takeshita, M. & Grollman, A. P. (1991) Insertion of a specific base during DNAsynthesis past the oxidation-damage base 8-oxodG. Nature 349, 431-434.
[147] Ames, B. N. (1983) Dietary carcinogens and anticarcinogens. Oxygen radicals anddegenerative diseases. Science 221, 1256-1264.
[148] Floyd, R. A. (1990) The role of 8-hydroxyguanine in carcinogenesis. Carcinogenesis 11, 1447-1450.
[149] Degan, P., Bonassi, S., De Caterine, M., Korkina, L. G., Pinto, L., Scopacasa, F., Zatterale, A.,Calzone, R. & Pagano, G. (1995) In vivo accumulation of 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine inDNA correlates with release of reactive oxygen species in Fanconi's anaemia families.Carcinogenesis 16, 735-742.
[150] Dandona, P., Thusu, K., Cook, S., Snyder, B., Makowski, J., Armstrong, D. & Nicotera, T.(1996) Oxidative damage to DNA in diabetes mellitus. Lancet 347, 444-445.
[151] Lipinski, L. J., Hoehr, N., Mazur, S. J., Dianov, G. L., Senturker, S., Dizdaroglu, M. & Bohr,V. A. (1999) Repair of oxidative DNA base lesions induced by fluorescent light is defective inxeroderma pigmentosum group A cells. Nucleic Acids Res. 27, 3153-3158.
[152] Anson, R. M., Senturker, S., Dizdaroglu, M. & Bohr, V. A. (1999) Measurement ofoxidatively induced base lesions in liver from Wistar rats of different ages. Free Radic. Biol.Med. 27, 1999.
[153] Mori, T. & Dizdaroglu, M. (1994) Ionizing radiation causes greater DNA base damage inradiation-sensitive mutant M10 cells than in parent mouse lymphoma L5178 cells. Radiat. Res.140, 85-90.
[154] Olinski, R., Zastawny, T., Budzbon, J., Skokowski, J., Zegarski, W. & Dizdaroglu, M. (1992)DNA base modifications in chromatin of human cancerous tissues. FEBS Lett 309, 193-198.
[155] Dizdaroglu, M. (1985) Application of gas-chromatography mass-spectrometry to chemicalcharacterization of radiation-induced base damage of DNA - implications for assessing DNA-repair processes. Anal. Biochem. 144, 593-603.
[156] Floyd, R. A., Watson, J. J., Wong, P. K., Altmiller, D. H. & Rickard, R. C. (1986) Hydroxylfree radical adduct of deoxyguanosine: sensitive detection and mechanisms of formation. FreeRad. Res. Commun. 1, 163-172.
[157] Schuler, D., Otteneder, M., Sagelsdorff, P., Eder, E., Gupta, R. C. & Lutz, W. K. (1997)
Comparative analysis of 8-oxo-2'-deoxyguanosine in DNA by 32P- and 33P-postlabeling andelectrochemical detection. Carcinogenesis 18, 2367-2371.
[158] Möller, L. & Hofer, T. (1997) [32P] ATP mediates formation of 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine
from 2'-deoxyguanosine, a possible problem in the 32P-postlabeling assay. Carcinogenesis 18,2415-2419.
[159] Collins, A. R., Duthie, S. J. & Dobson, V. L. (1993) Direct enzymic detection of endogenousoxidative base damage in human lymphocyte DNA. Carcinogenesis 14, 1733-1735.
221 Références bibliographiques
[160] Pflaum, M., Boiteux, S. & Epe, B. (1994) Visible light generates oxidative DNA basemodifications in high excess of strand breaks in mammalian cells. Carcinogenesis 15, 297-300.
[161] Collins, A., Cadet, J., Epe, B. & Gedik, C. (1997) Problems in the measurement of 8-oxoguanine in human DNA. Report of a workshop, DNA oxidation, held in Aberdeen, UK, 19-21 January 1997. Carcinogenesis 18, 1833-1836.
[162] Collins, A. R., Dobson, V. L., Dusinskà, M., Kennedy, G. & Stetina, R. (1997) The cometassay : what can it really tell us? Mutat. Res. 375, 183-193.
[163] Douki, T., Delatour, T., Bianchini, F. & Cadet, J. (1996) Observation and prevention of anartefactual formation of oxidized DNA bases and nucleosides in the GC-EIMS method.Carcinogenesis 17, 347-353.
[164] Hamberg, M. & Zhang, L.-Y. (1995) Quantitative determination of 8-hydroxyguanine andguanine by isotope dilution mass spectrometry. Anal. Biochem. 229, 336-344.
[165] Cadet, J., Douki, T. & Ravanat, J. L. (1997) Artifacts associated with the measurement ofoxidized DNA bases. Environ. Health Perspect. 105, 1034-1039.
[166] Ravanat, J.-L., Turesky, R. J., Gremaud, E., Trudel, L. J. & Stadler, R. H. (1995)Determination of 8-oxoguanine in DNA by gas chromatography - mass spectrometry and HPLC- electrochemical detection. Overestimation of the background level of the oxidized base by thegas chromatography - mass spectrometry assay. Chem. Res. Toxicol. 8, 1039-1045.
[167] Hariharan, P. V. & Cerutti, P. A. (1972) Formation and repair of gamma-ray induced thyminedamage in Micrococcus radiodurans. J. Mol. Biol. 66, 65-81.
[168] Gupta, R. C. (1985) Enhanced sensitivity of 32P-postlabelling analysis of non-radioactivearomatic carcinogen-DNA adducts. Carcinogenesis 3, 1081-1092.
[169] Randerath, K., Reddy, M. V. & Gupta, R. C. (1981) 32P-postlabelling test for DNA damage.Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 6126-6129.
[170] Lu, L.-J., Tasaka, F., Hokanson, J. A. & Kodha, K. (1991) Detection of 8-hydroxy-2'-
deoxyguanosine in deoxyribonucleic acid by the 32P-postlabeling method. Chem. Pharm. Bull.39, 1880-1882.
[171] Povey, A. C., Wilson, V. L., Taffe, B. G., Wood, M. L., Essigman, J. M. & Harris, C. C.
(1989) Detection and quantification of 8-hydroxyguanosine residues by 32P-postlabeling. Proc.Natl. Acad. Sci. USA 30, 201.
[172] Wilson, V. L., Taffe, B. G., Shields, P. G., Povey, A. C. & Harris, C. C. (1993) Detection andquantification of 8-hydroxydeoxyguanosine adducts in peripheral blood of people exposed toionizing radiation. Environ. Health Perspect. 99, 261-263.
[173] Podmore, K., Farmer, P. B., Herbert, K. E., Jones, G. D. D. & Martin, E. A. (1997) 32P-Postlabelling approaches for the detection of 8-oxo-2'-deoxyguanosine 3'-monophosphate inDNA. Mutat. Res. 178, 139-149.
[174] Devanaboyina, U. & Gupta, R. C. (1996) Sensitive detection of 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine
in DNA by 32P-postlabeling assay and the basal levels in rat tissues. Carcinogenesis 17, 917-924.
[175] Cadet, J. & Berger, M. (1985) Radiation-induced decomposition of the purine bases withinDNA and related model compounds. Int. J. Radiat. Biol. 47, 127-143.
[176] Cadet, J., Jouve, H., Mouret, J. F., Foray, J.-F., Odin, F., Berger, M. & Polverelli, M. (1989)Oxidation reactions of DNA within Proteus Mirabilis cells exposed to hydrogen peroxide.
Références bibliographiques 222
Dans Medical, Biochemical and Chemical Aspects of Free Radicals (O. Hayaishi, E. Niki, M.Kondo & T. Yoshikawa eds) pp. 1517-1520, Elsevier, Amsterdam.
[177] Mouret, J. F., Odin, F., Polverelli, M. & Cadet, J. (1990) 32P-postlabeling measurement ofadenine N-1-oxide in cellular DNA exposed to hydrogen peroxide. Chem. Res. Toxicol. 3, 102-110.
[178] Mouret, J. F., Polverelli, M., Sarrazin, F. & Cadet, J. (1991) Ionic and radical oxidations ofDNA by hydrogen peroxide. Chem. Biol. Interactions 77, 187-201.
[179] Cadet, J., Odin, F., Mouret, J.-F., Polverelli, M., Audic, A., Giacomoni, P., Favier, A. &Richard, M.-J. (1992) Chemical and biochemical postlabeling methods for singling out specificoxidative DNA lesions. Mutat. Res. 275, 343-354.
[180] Povey, A. C., Wilson, V. L., Weston, A., Doan, V. T., Wood, M. L., Essingman, J. M. &
Shields, P. G. (1993) Detection of oxidative damage by 32P-postlabeling: 8-hydroxy-deoxyguanosine as a marker of exposure. Dans Postlabeling Methods for Detection of DNAAdducts (D. H. Phillips, M. Castegnaro & H. Bartsch eds) pp. 105-114, International Agencyfor Cancer Research, Lyon.
[181] Hegi, M. E., Sagelsdorff, P. & Lutz, W. K. (1989) Detection by32P-postlabeling of thymidineglycol in γ-irradiated DNA. Carcinogenesis 10, 43-47.
[182] Weinfeld, M. & Soderlind, K.-J. M. (1991) 32P-postalbeling detection of radiation-inducedDNA damage: identification and estimation of thymine glycols and phosphoglycolate termini.Biochemistry 30, 1091-1097.
[183] Weinfeld, M., Liuzzi, M. & Jones, G. D. D. (1996) A postlabeling assay for oxidative DNAdamage. Dans Technologies for Detection of DNA damage and Mutations (G. P. Pfeifer ed) pp.63-71, Plenum Press, New York.
[184] Reddy, M. V. & Randerath, K. (1986) Nuclease P1-mediated enhancement of sensitivity of32P-postlabeling test for structurally diverse DNA adducts. Carcinogenesis 7, 1543-1551.
[185] Carmichael, P. L., Hewer, A., Osborne, M. R., Strain, A. J. & Phillips, D. H. (1995) Detectionof bulky DNA lesions in the liver of patients with Wilsons disease and primaryhemochromatosis. Mutat. Res. 326, 235-243.
[186] Lloyd, D. R., Phillips, D. H. & Carmichael, P. L. (1997) Generation of putative intrastrandcross-links and strand breaks in DNA by transition metal ion-mediated oxygen radical attack.Chem. Res. Toxicol. 10, 393-400.
[187] Randerath, K., Yang, P.-F., Danna, T. F., Reddy, M. V., Watson, W. P. & Randerath, E.
(1991) Bulky adducts detected by 32P-postlabeling in DNA modified by oxidative damage invitro. Comparison with rat lung I-compounds. Mutat. Res. 250, 135-144.
[188] Leadon, S. (1990) Production and repair of DNA damage in mammalian cells. Health Phys.59, 15-22.
[189] West, G. J., West, I. W.-L. & Ward, J. F. (1982) Radioimmunoassay of a thymine glycol.Radiat. Res. 90, 595-608.
[190] Leadon, S. A. & Hanawalt, P. C. (1983) Monoclonal antibody to DNA containing thymineglycol. Mutat. Res. 112, 191-200.
[191] Hubbard, K., Huang, H., Laspia, M. F., Ide, H., Erlanger, B. F. & Wallace, S. S. (1989)Immunochemical quantitation of thymine glycol in oxidised and X-irradiated DNA. Radiat.Res. 118, 257-268.
223 Références bibliographiques
[192] Chen, B. X., Hubbard, K., Ide, H., Wallace, S. S. & Erlanger, B. F. (1990) Characterization ofa monoclonal antibody to thymidine glycol monophosphate. Radiat. Res. 124, 131-136.
[193] Greferath, R. & Nehls, P. (1997) Monoclonal antibodies to thymidine glycol generated bydifferent immunization techniques. Hybridoma 16, 189-193.
[194] Jaruga, P., Zastawny, T. H., Skokowski, J., Dizdaroglu, M. & Olinski, R. (1994) OxidativeDNA damage and antioxidant enzymes-activities in human lung cancer. FEBS Lett 341, 59-63.
[195] Strickland, P. T. & Boyle, J. M. (1981) Characterization of two monoclonal antibodies specificfor dimerized and non-dimerized adjacent thymidines in single stranded DNA. Photochem.Photobiol. 34, 595-601.
[196] Herbert, K. E., Mistry, N., Griffiths, H. R. & Lunec, J. (1994) Immunochemical detection ofsequence-specific modifications to DNA induced by UV light. Carcinogenesis 15, 2517-2521.
[197] Park, E. M., Shigenaga, M. K., Degan, P., Korn, T. S., Kitzler, J. W., Wehr, C. M., Kolachana,P. & Ames, B. N. (1992) Assay of excised oxidative DNA lesions: isolation of 8-oxoguanineand its nucleoside derivatives from biological fluids with a monoclonal antibody column. Proc.Natl. Acad. Sci. USA 89, 3375-3379.
[198] Degan, P., Shigenaga, M. K., Park, E., Alperin, P. E. & Ames, B. N. (1991) Immunoaffinityisolation of urinary 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine and quantitation of 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine in DNA by polyclonal antibodies. Carcinogenesis 12, 865-871.
[199] Erlanger, B. F. & Beiser, S. M. (1964) Antibodies specific for ribonucleosides andribonucleotides and their reaction with DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 52, 62-78.
[200] Musarrat, J. & Wani, A. A. (1994) Quantitation immunoanalysis of promutagenic 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine in oxidized DNA. Carcinogenesis 15, 2037-2043.
[201] Yin, B., Whyatt, R. M., Perera, P., Randall, M. C., Cooper, T. B. & Santella, R. M. (1995)Determination of 8-hydroxydeoxyguanosine by an immunoaffinity chromatography-monoclonalantibody-based ELISA. Free Radic. Biol. Med. 18, 1023-1032.
[202] Osawa, T., Yoshida, A., Kawakishi, S., Yamashita, K. & Ochi, H. (1995) Protective role ofdietary antioxidants in oxidative stress. Dans Oxidative Stress and Aging (R. G. Cutler, L.Packer, J. Bertram & A. Mori eds) pp. 367-377, Birkhauser Verlag, Basel.
[203] Erhola, M., Toyokuni, S., Okada, K., Tanaka, T., Hiai, H., Ochi, H., Uchida, K., Osawa, T.,Nieminen, M. M., Alho, H. & Kellokumpu-Lethinen, P. (1997) Biomarker evidence of DNAoxidation in lung cancer patients: association of urinary 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine excretionwith radiotherapy, chemotherapy, and response to treatment. FEBS Lett 409, 287-291.
[204] Hattori, Y., Nishigori, C., Tanaka, T., Uchida, K., Nikaido, O., Osawa, T., Hiai, H.,Immamura, S. & Toyokuni, S. (1997) 8-Hydroxy-2'-deoxyguanosine is increased in epidermalcells of hairless mice after chronic ultraviolet B exposure. J. Invest. Dermatol. 107, 733-737.
[205] West, G. J., West, I. W.-L. & Ward, J. F. (1982) Radioimmunoassay of 7,8-dihydro-8-oxoadenine (8-hydroxyadenine). Int. J. Radiat. Biol. 42, 481-490.
[206] Ide, H., Kow, Y. W., Chen, B., Erlanger, B. F. & Wallace, S. S. (1997) Antibodies to oxidativeDNA damages: characterization of antibodies to 8-oxopurines. Cell Biol. Toxicol. 13, 405-417.
[207] Fraga, C. G., Shigenaga, M. K., Park, J.-W., Degan, P. D. & Ames, B. N. (1990) Oxidativedamage to DNA during aging: 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine in rat organ DNA and urine. Proc.Natl. Acad. Sci. USA 87, 4533-4537.
Références bibliographiques 224
[208] Floyd, R. A., West, M. S., Eneff, K. L., Schneider, J. E., Wong, P. K., Tingey, D. T. &Hogsett, W. E. (1990) Conditions influencing yield and analysis of 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine in oxidatively damaged DNA. Anal. Biochem. 188, 155-158.
[209] Helbock, H. J., Beckman, B. K., Shigenaga, M. K., Walter, P. B., Woodall, A. A., Yeo, H. C.& Ames, B. N. (1998) DNA oxidation matters: the HPLC-electrochemical detection assay of 8-oxo-deoxyguanosine and 8-oxo-guanine. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 288-293.
[210] Claycamp, H. G. & Ho, K.-K. (1993) Background and radiation-induced 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine in gamma-irradiated Escherichia coli. Int. J. Radiat. Biol. 63, 597-607.
[211] Richter, C., Park, J.-W. & Ames, B. N. (1988) Normal oxidative damage to mitochondrial andnuclear DNA is extensive. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 6465-6467.
[212] Shigenaga, M. K., Gimeno, C. J. & Ames, B. N. (1989) Urinary 8-hydroxy-2'-deoxyguanosineas a biological marker of in vivo oxidative DNA damage. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 9697-9701.
[213] Shigenaga, M. K. & Ames, B. N. (1991) Assays for 8-hydroxy-2-deoxyguanosine: a biomarkerof in vivo oxidative DNA damage. Free Radic. Biol. Med. 10, 211-216.
[214] Wagner, J. R., Hu, C. C. & Ames, B. N. (1992) Endogenous oxidative damage ofdeoxycytidine in DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 3380-3384.
[215] Dizdaroglu, M. (1986) Characterization of free radical induced base damage to DNA by thecombined use of enzymatic hydrolysis and gas-chromatography mass-spectrometry atbiologically relevant levels. J. Chromatogr. 367, 357-366.
[216] Dizdaroglu, M. (1990) Gas-chromatography mass-spectrometry of free radical-inducedproducts of pyrimidines and purines in DNA. Methods Enzym. 193, 842-857.
[217] Dizdaroglu, M. (1993) Quantitative determination of oxidative base damage in DNA by stableisotope-dilution mass spectrometry. FEBS Lett 315, 1-6.
[218] Mori, T., Hori, Y. & Dizdaroglu, M. (1993) DNA base damage generated in vivo in hepaticchromatin of mice upon whole body γ-irradiation. Int. J. Radiat. Biol. 64, 645-650.
[219] Nackerdien, Z., Olinski, R. & Dizdaroglu, M. (1992) DNA base damage in chromatin of γ-irradiated cultured human cells. Free Rad. Res. Commun. 16, 259-273.
[220] Singer, B. & Hang, B. (1997) What structural features determine repair enzyme specificity andmechanism in chemically modified DNA? Chem. Res. Toxicol. 10, 713-732.
[221] Aruoma, O. I., Halliwell, B. & Dizdaroglu, M. (1989) Iron ion-dependent modification ofbases in DNA by the superoxide radical-generating system hypoxanthine/xanthine oxidase. J.Biol. Chem. 264, 13024-13028.
[222] Dizdaroglu, M., Dirksen, M. L., Jiang, H. & Robbins, J. H. (1987) Ionizing radiation-induceddamage in DNA of human cultured cells. Identification of 8,5'-cyclopurine-2'-deoxyguanosine.Biochem. J. 241, 929-932.
[223] Dizdaroglu, M. (1986) Free radical induced formation of 8,5'-cyclopurine-2'-deoxyguanosinemoiety in deoxyribonucleic acid. Biochem. J. 235, 531-536.
[224] Swarts, S. G., Smith, G. S., Liao, L. & Wheeler, K. T. (1996) Effects of formic acid hydrolysison the quantitative analysis of radiation-induced DNA base damage products assayed by gaschromatography/mass spectrometry. Radiat. Environ. Biophys. 35, 41-53.
[225] Fuciarelli, A. F., Wegher, B. J., Gajewski, E., Dizdaroglu, M. & Blakely, W. F. (1989)Quantitative measurement of radiation-induced base products in DNA using gaschromatography-mass spectrometry. Radiat. Res. 119, 219-231.
225 Références bibliographiques
[226] Douki, T., Martini, R., Ravanat, J.-L., Turesky, R. J. & Cadet, J. (1997) Measurement of 2,6-diamino-4-hydroxy-5-formamidopyrimidine and 8-oxo-7,8-dihydroguanine in isolated DNAexposed to gamma radiation in aqueous solution. Carcinogenesis 18, 2385-2391.
[227] Dizdaroglu, M., Holwitt, E., Hagan, M. P. & Blakely, W. F. (1986) Formation of cytosineglycol and 5,6-dihydroxycytosine in deoxyribonucleic acid on treatment with osmiumtetraoxide. Biochem. J. 235, 531-536.
[228] Douki, S., Spinelli, S., Ravanat, J. L. & Cadet, J. (1999) Hydroxyl radical-induced degradationof 2'-deoxyguanosine under reducing conditions. J. Chem. Soc. Perkin Trans. 2 , 1875-1880.
[229] Mc Closkey, J. A. (1990) Electron ionization mass spectra of trimethylsilyl derivatives ofnucleosides. Methods Enzym. 193, 825-842.
[230] Pang, H., Schram, K. H., Smith, D. L., Gupta, S. P., Townsend, L. B. & Mc Closkey, J. A.(1982) Mass spectrometry of nucleic acid constituents-trimethylsilyl derivatives of nucleosides.J. Org. Chem. 47, 3923-3932.
[231] Fuciarelli, A. F., Wegher, B. J. & Dizdaroglu, M. (1990) Yields of radiation-induced baseproducts in DNA: effects of DNA conformation and gassing conditions. Int. J. Radiat. Biol. 58,397-415.
[232] Olinski, R., Zastawny, T. H., Foksinski, M., Windorbska, W., Jaruga, P. & Dizdaroglu, M.(1996) DNA base damage in lymphocytes of cancer patients undergoing radiation therapy.Cancer Lett 106, 207-215.
[233] Spencer, J. P. E., Wong, J., Jenner, A., Aruoma, O. I., Cross, C. E. & Halliwell, B. (1996) Basemodification and strand breakage in isolated calf thymus DNA and in DNA from human skinepidermal keratinocytes exposed to peroxynitrite or 3-morpholinosydnonimine. Chem. Res.Toxicol. 9, 1152-1158.
[234] Zastawny, T. H., Altman, S. A., Randers-Eirchorn, L., Maldurawe, R., Lumpkin, J. A.,Dizdaroglu, M. & Rao, G. (1995) DNA base damage modifications and membrane damage incultured mammalian cells treated with iron ions. Free Radic. Biol. Med. 18, 1013-1022.
[235] Zastawny, T. H., Czerwinska, B., Drzewiecka, B. & Olinski, R. (1997) Radiation-inducedoxdative DNA base damage and its repair in nuclear matrix-associated DNA and bulk DNA inhepatic chromatin of rat upon whole-body gamma-irradiation. Free Radic. Biol. Med. 22, 101-107.
[236] Zastawny, T. H., Kruszewski, M. & Olinski, R. (1998) Ionizing radiation and hydrogenperoxide induced oxidative DNA base damage in two L5178Y cell lines. Free Radic. Biol.Med. 24, 1250-1255.
[237] Malins, D. C., Ostrander, G. K., Haimanot, R. & Williams, P. (1990) A novel DNA lesion inneoplastic livers of feral fish: 2,6-diamino-4-hydroxy-5-formamidopyrimidine. Carcinogenesis11, 1045-1047.
[238] Malins, D. C. & Haimanot, R. (1990) 4,6-Diamino-5-formamidopyrimidine, 8-hydroxyguanineand 8-hydroxyadenine in DNA from neoplastic liver of English sole exposed to carcinogens.Biochem. Biophys. Res. Commun. 173, 614-619.
[239] Malins, D. C. & Haimanot, R. (1991) Major alterations in the nucleotide structures of DNA incancer of the female breast. Cancer Res. 51, 5430-5432.
[240] Ringden, D., Chaudhary, A. K. & Blair, I. A. (1998) Applications of advanced massspectrometry to detect oxidative DNA damage: carcinogenic implications. Dans DNA and Free
Références bibliographiques 226
Radicals: Techniques, Mechanisms & Applications (O. I. Aruoma & B. Halliwell eds) pp. 195-213, OICA International, London, Saint Lucia.
[241] Ravanat, J.-L., Duretz, B., Guiller, A., Douki, T. & Cadet, J. (1998) Isotope dilution high-performance liquid chromatography-electrospray tandem mass spectrometry assay for themeasurement of 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine in biological samples. J. Chromatogr. B115, 349-356.
[242] Kambouris, S. J., Chaudhary, A. K. & Blair, I. A. (1996) Liquid chromatography/electrosprayionization tandem mass spectroscopy (LC/ESI MS/MS) analysis of 1,2-epoxybutene adducts ofpurine deoxynucleosides. Toxicology 113, 331-335.
[243] Quilliam, M. A., Janecek, M. & Lawrence, J. F. (1993) Characterization of the oxidationproducts of paralytic shellfish poisoning toxins by liquid chromatography/mass spectrometry.Rapid Commun. Mass Spectrom. 7, 482-487.
[244] Huang, E. C., Wachs, T., Conboy, J. J. & Henion, J. D. (1990) Atmospheric pressureionization mass spectrometry. Anal. Chem. 62, 713A-725A.
[245] Lustig, M. J., Cadet, J., Boorstein, R. J. & Teebor, G. W. (1992) Synthesis of thediastereomers of thymidine glycol, determination of concentrations and rates of interconventionof their cis-trans epimers at equilibrium and demonstration of different alkali lability withinDNA. Nucleic Acids Res. 20, 4839-4845.
[246] Ravanat, J.-L., Guicherd, P., Tuce, Z. & Cadet, J. (1999) Simultaneous determination of fiveoxidative DNA lesions in human urine. Chem. Res. Toxicol. 12, 802-808.
[247] Claycamp, H. G. (1992) Phenol sensitization of DNA to subsequent oxidative damage in 8-hydroxyguanine assays. Carcinogenesis 13, 1289-1292.
[248] Harris, G., Bashir, S. & Winyard, P. G. (1994) 8-Oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine presentin DNA is not simply an artefact of isolation. Carcinogenesis 15, 411-413.
[249] Finnegan, M. T. V., Herbert, K. E., Evans, M. D., Griffiths, H. R. & Lunec, J. (1996) Evidencefor sensitisation of DNA to oxidative damage during isolation. Free Radic. Biol. Med. 20, 93-98.
[250] Nakajima, M., Takeuchi, T. & Morimoto, K. (1996b) Determination of 8-hydroxydeoxyguanosine in human cells under oxygen-free conditions. Carcinogenesis 17, 787-791.
[251] Spencer, J. P. E., Jenner, A., Aruoma, O. I., Cross, C. E., Wu, R. & Halliwell, B. (1996)Oxidative DNA damage in human respiratory tract epithelial cells. Time course in relation toDNA strand breakage. Biochem. Biophys. Res. Commun. 224, 17-22.
[252] Jaruga, P. & Dizdaroglu, M. (1996) Repair of products of oxidative DNA base damage inhuman cells. Nucleic Acids Res. 24, 1389-1394.
[253] Nakajima, M., Takeuchi, T., Takeshita, T. & Morimoto, K. (1996) 8-Hydroxydeoxyguanosinein human leukocyte DNA and daily health practice factors: effects of individual alcoholsensitivity. Environ. Health Perspect. 104, 1336-1338.
[254] Takeuchi, T., Nakajima, M., Ohta, Y., Kanae, M. & Morimoto, K. (1994) Evaluation of-hydroxydeoxyguanosine, a typical oxidative DNA damage, in human leukocytes.Carcinogenesis 15, 1519-1523.
[255] Herbert, K. E., Evans, M. D., Finnegan, M. T. V., Farooq, S., Mistry, N., Podmore, I. D.,Farmer, P. & Lunec, J. (1996) A novel HPLC procedure for the analysis of 8-oxoguanine inDNA. Free Radic. Biol. Med. 20, 467-473.
227 Références bibliographiques
[256] Jenner, A., England, T. G., Aruoma, O. I. & Halliwell, B. (1998) Measurement of oxidativeDNA damage by gas chromatography-mass spectrometry: ethanethiol prevents artifactualgeneration of oxidized DNA bases. Biochem. J. 331, 365-369.
[257] Hong, J., Oh, C. H., Johnson, F. & Iden, C. R. (1998) Suppression of adventitious formation of8-oxoguanine(TMS)4 from guanine during trimethylsilylation. Anal. Biochem. 261, 57-63.
[258] Dizdaroglu, M. (1984) The use of capillary gas-chromatography mass-spectrometry foridentification of radiation-induced DNA-base damage and DNA-base amino-acid cross-links. J.Chromatogr. 295, 103-121.
[259] Angelov, D., Spassky, A., Berger, M. & Cadet, J. (1997) High-intensity UV laser photolysis ofDNA and purine 2'-deoxyribonucleosides: Formation of 8-oxopurine damage andoligonucleotides strand cleavage as revealed by HPLC and gel electrophoresis studies. J. Am.Chem. Soc. 119, 11373-11380.
[260] Nikogosyan, D. N. (1990) Two-quantum UV photochemistry of nucleic acids: comparisonwith conventional low-intensity UV photochemistry and radiation chemistry. Int. J. Radiat.Biol. 57, 233-299.
[261] Spassky, A. & Angelov, D. (1997) Influence of the local helical conformation on the guaninemodifications generated from one-electron DNA oxidation. Biochemistry 36, 6571-6576.
[262] Hall, D. B., Holmlin, R. E. & Barton, J. K. (1996) Oxidative DNA damage through long-rangeelectron transfer. Nature 382, 731-735.
[263] Cadet, J., Bardet, M., Berger, M., Berthod, T., Delatour, T., D'Ham, C., Douki, T., Gasparutto,D., Grand, A., Guy, A., Jolibois, F., Molko, D., Polverelli, M., Ravanat, J.-L., Romieu, A., N.,S. & Sauvaigo, S. (1997) Oxidative base damage to DNA: recent mechanistic aspects,measurement and repair. Dans Advances in DNA Damage and Repair: Oxygen Radical effects,Cellular Protection and Biological Consequences (M. Dizdaroglu & A. E. Karakaya eds) 302pp. 47-58, NATO ASI Series,
[264] Epe, B., Pflaum, M. & Boiteux, S. (1993) DNA damage induced by photosensitizers in cellularand cell-free systems. Mutat. Res. 299, 135-145.
[265] Lee, P. C. C. & Rodgers, M. A. J. (1987) Laser flash photokinetic studies of rose bengalsensitized photodynamic interactions of nucleotides and DNA. Photochem. Photobiol. 45, 79-86.
[266] Ahnström, G. (1988) Techniques to measure DNA single-strand breaks in cells: A review. Int.J. Radiat. Biol. 54, 695-707.
[267] Mc Grath, R. A. & Williams, R. W. (1966) Reconstruction in vivo of irradiated Escherichiacoli deoxyribonucleic acid; the rejoining of broken species. Nature 212, 534-535.
[268] Lett, J. T. (1981) Measurement of single-strand breaks by sedimentation in alkaline sucrosegradients. Dans DNA repair: A Laboratory Manual in Research Procedures (E. C. Friedberg &P. C. Hanawalt eds) pp. 403-418, Marcel Dekker, New York.
[269] Whitaker, S. N., Powell, S. N. & Mc Millan, T. J. (1991) Molecular assays of radiation-induced DNA damage. Eur. J. Cancer 58, 569-575.
[270] Ahnström, G. & Edvardsson, K. A. (1974) Radiation-induced single-strand breaks in DNAdetermined by rate of alkaline strand separation and hydroxyapatite chromatography: analternative to velocity sedimentation. Int. J. Radiat. Biol. 26, 493-497.
Références bibliographiques 228
[271] Rydberg, B. & Johanson, K. J. (1978) Estimation of DNA strand breaks in single mammaliancells. Dans DNA Repair Mechanisms (P. C. Hanawalt & E. C. Friedberg eds) pp. 465-468,Academic Press, New York.
[272] Cook, P. R. & Brazell, I. A. (1976) Conformational constraints in nuclear DNA. J. CellScience 22, 287-302.
[273] Cook, P. R. & Brazell, I. A. (1975) Supercoils in human DNA. J. Cell Science 19, 261-275.[274] Nose, K. & Okamoto, H. (1983) Detection of carcinogen-induced DNA breaks by nick
translation in permeable cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 111, 383-389.[275] Snyder, R. D. & Matheson, D. W. (1985) Nick translation- a new assay for monitoring DNA
damage and repair in cultured human fibroblasts. Environ. Mutagenesis 7, 267-279.[276] Kiltie, A. E. & Ryan, A. J. (1997) SYBR Green I staining of pulsed field agarose gel is a
sensitive and inexpensive way of quantitating DNA double-strand breaks in mammalian cells.Nucleic Acids Res. 25, 2945-2946.
[277] Carle, G. F., Frank, M. & Olson, M. V. (1986) Electrophoretic separation of large DNAmolecules by periodic inversion of the electric field. Science 232, 65-68.
[278] Gardiner, K. & Patterson, D. (1988) Transverse alternating electrophoresis. Nature 331, 371-372.
[279] Schwartz, D. C. & Cantor, C. R. (1984) Separation of yeast chromosome-sized DNA by pulsedfield gradient gel electrophoresis. Cell 37, 67-75.
[280] Bradley, M. O. & Kohn, K. W. (1979) X-ray induced DNA double-strand break productionand repair in mammalian cells as measured by neutral filter elution. Nucleic Acids Res. 7, 793-804.
[281] Kohn, K. W. & Grimeg-Ewig, R. A. (1973) Alkaline elution analysis, a new approach to thestudy of DNA single-strand interruptions in cells. Cancer Res. 33, 1849-1853.
[282] Kohn, K. W., Erickson, L. C., Ewig, R. A. G. & Friedman, C. A. (1976) Fractionation of DNAfrom mammalian cells by alkaline elution. Biochemistry 15, 4629-4637.
[283] Evans, H. H., Ricanati, M. & Horng, M. F. (1987) Deficiency in DNA repair in mouselymphoma strain L5187Y-S. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 7562-7566.
[284] Koval, T. M. & Kazmar, E. R. (1988) Eluting solution composition affects DNA double strandbreaks analysis by filter elution. Int. J. Radiat. Biol. 54, 739-747.
[285] Okayasu, R., Blocher, D. & Iliakis, G. (1988) Variation through the cell cycle of DNA filterelution dose response in X-irradiated synchronous CHO-cells. Int. J. Radiat. Biol. 53, 729-747.
[286] Peak, J. G., Blazek, E. R. & Peak, M. J. (1990) On the measurement of DNA double-strandbreaks by neutral elution. Radiat. Res. 122, 104-105.
[287] Hartley, J. A., Souhami, R. L. & Berardini, M. D. (1993) Electrophoretic and chromatographicseparation methods used to reveal interstrand crosslinking of nucleic acids. J. Chromatogr. 618,277-288.
[288] Ostling, O. & Johanson, K. J. (1984) Microelectrophoretic study of radiation-induced DNAdamages in individual mammalian cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 123, 291-298.
[289] Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R. & Schneider, E. L. (1988) A simple technique forquantitation of low levels of DNA damage in individual cells. Exp. Cell Res. 175, 184-191.
[290] Lett, J. T., Klucis, E. S. & Sun, C. (1970) On the size of the DNA in the mammalianchromosome. Biophys. J. 10, 277-292.
229 Références bibliographiques
[291] Rydberg, B. (1980) Detection of induced DNA strand breaks with improved sensitivity inhuman cells. Radiat. Res. , 492-495.
[292] Freeman, S. E., Blackett, A. D., Monteleone, D. C., Setlow, R. B., Sutherland, B. M. &Sutherland, J. C. (1986) Quantitation of radiation, chemical or enzyme-induced single strandbreaks in nonradioactive DNA by alkaline gel electrophoresis: Application to pyrimidinedimers. Anal. Biochem. 158, 119-129.
[293] Singh, N. P., Stephens, R. E. & Schneider, E. L. (1994) Modifications of alkaline microgelelectrophoresis for sensitive detection of DNA damage. Int. J. Radiat. Biol. 66, 23-28.
[294] Alapetite, C., Thirion, P., de la Rochefordiere, A., Cosset, J. M. & Moustacchi, E. (1999)Analysis by alkaline comet assay of cancer patients with severe reactions to radiotherapy:defective rejoining of radioinduced DNA strand breaks in lymphocytes of breast cancerpatients. Int. J. Cancer 83, 83-90.
[295] Alapetite, C., Wachter, T., Sage, E. & Moustacchi, E. (1996) Use of the alkaline comet assayto detect DNA repair deficiencies in human fibroblasts exposed to UVC, UVB, UVA and γ-rays. Int. J. Radiat. Biol. 69, 359-369.
[296] Kruszewski, M., Wojewodzka, M., Iwanenko, T., Collins, A. R. & Szumiel, I. (1998)Application of the comet assay for monitoring DNA damage in workers exposed to chroniclow-dose irradiation II. Base damage. Mutat. Res. 416, 37-57.
[297] Wojewodzka, M., Kruszewski, M., Iwanenko, T., Collins, A. R. & Szumiel, I. (1998)Application of the comet assay for monitoring DNA damage in workers exposed to chroniclow-dose irradiation I. Strand breakage. Mutat. Res. 416, 21-35.
[298] Deutch, J. M. (1988) Theoretical studies of DNA during gel electrophoresis. Science 240, 922-924.
[299] Sasaki, M. S. & Norman, A. (1966) DNA fiber from human lymphocytes nuclei. Exp. Cell.Res. 66, 642-645.
[300] Comings, D. E. (1980) Arrangement of chromatin in the nucleus. Hum. Genet. 53, 131-143.[301] Krauth, W. & Werner, D. (1979) Analysis of the most tightly bound proteins in eukaryotic
DNA. Biochim. Biophys. Acta 564, 390-401.[302] Singh, N. P. & Stephens, R. E. (1997) Microgel electrophoresis : sensitivity, mechanisms, and
DNA electrostretching. Mutat. Res. 383, 167-175.[303] Collins, A. R., Ma, A. G. & Duthie, S. J. (1995) The kinetics of repair of oxidative DNA
damage (strand breaks and oxidised pyrimidines) in human cells. Mutat. Res. 336, 69-77.[304] Vijayalaxmi, Tice, R. R. & Strauss, G. H. S. (1992) Assessment of radiation-induced DNA
damage in human blood lymphocytes using the single cell gel electrophoresis. Mutat. Res. 271,243-252.
[305] Gedik, G. M., Ewen, S. W. B. & Collins, A. R. (1992) Single-cell gel electrophoresis appliedto the analysis of UV-C damage and its repair in human cells. Int. J. Radiat. Biol. 62, 313-320.
[306] Olive, P. L. (1990) Heterogeneity in radiation-induced DNA damage and repair in tumor andnormal cells measured using the comet assay. Radiat.Res. 122, 86-94.
[307] Duthie, S. J., Ma, A., Ross, M. A. & Collins, A. R. (1996) Antioxidant supplementationdecreases oxidative DNA damage in human lymphocytes. Cancer Res. 56, 1291-1295.
[308] Duthie, S. J., Johnson, M. A. & Dobson , V. L. (1997) The effect of dietary flavonoids onDNA damage (strand breaks and oxidized pyrimidines) and growth in human cells. Mutat. Res.390, 141-145.
Références bibliographiques 230
[309] Pool-Zobel, B. L. & Leucht, U. (1997) Induction of DNA damage by risk factors of coloncancer in human colon cells derived from biopsies. Mutat. Res. 375, 105-115.
[310] Brooks, R. A. & Winton, D. J. (1996) Determination of spatial patterns of DNA damage andrepair in intestinal crypts by multi-cell gel electrophoresis. J. Cell Sci. 109, 2061-2068.
[311] Dusinska, M., Kovacikova, Z., Vollova, B. & A., C. (1998) Response of alveolar macrophagesand epithelial type II cells to oxidative DNA damage caused by paraquat. Carcinogenesis 19,809-812.
[312] Navarrete, M. H., Carrera, P., de Miguel, M. & de la Torre, C. (1997) A fast comet assayvariant for solid tissue cells. The assessment of DNA damage in higher plants. Mutat. Res. 389,271-277.
[313] Miyamae, Y., Yamamoto, M., Sasaki, Y. F., Kobayashi, H., Igarashi-Soga, M., Shimoi, K. &Hayashi, M. (1998) Evaluation of a tissue homogenization technique that isolates nuclei for thein vivo single cell gel electrophoresis (comet) assay: a collaborative study by five laboratories.Mutat. Res. 418, 131-140.
[314] Olive, P. L., Wlodek, D. & Banath, J. P. (1991) DNA double strand breaks measured inindividual cells subjected to gel electrophoresis. Cancer Res. 51, 4671-4676.
[315] Banath, J. P., Fushiki, M. & Olive, P. L. (1998) Rejoining of DNA single-and double strandbreaks in human white blood cells exposed to ionizing radiation. Int. J. Radiat. Biol. 73, 649-660.
[316] Banath, J. P., Wallace, S. S., Thompson, J. & Olive, P. O. (1999) Radiation-induced DNA basedamage detected in individual aerobic and hypoxic cells with endonuclease III andformamidopyrimidine-glycosylase. Radiat. Res. 151, 550-558.
[317] Olive, P. L., MacPhail, S. H. & Banath, J. P. (1994b) Lack of correlation between DNAdouble-strand break induction/rejoining and radiosensitivity in six human tumor cell lines.Cancer Res. 54, 3939-3946.
[318] Olive, P. L. & Banath, J. P. (1993) Induction and rejoining of radiation-induced DNA single-strand breaks: "tail moment" as a function of position in the cell cycle. Mutat. Res. 294, 275-283.
[319] Evans, H. H., Ricanati, M., Horng, M.-F., Jiang, Q., Mencl, J. & Olive, P. L. (1993) DNAdouble-strand break rejoining deficiency in TK6 and other human B lymphoblast cell lines.Radiat. Res. 134, 307-315.
[320] Green, M. H. L., Lowe, J. E., Harcourt, S. A., Akinluyi, P., Rowe, T., Cole, J., Anstey, A. V.& Arlett, C. F. (1992) UV-C sensitivity of unstimulated and stimulated lymphocytes fromnormal and xeroderma pigmentosum donors in the comet assay: a potential diagnostictechnique. Mutat. Res. 273, 137-144.
[321] Olive, P. L., Wlodek, D., Durand, R. E. & Banath, J. P. (1992) Factors influencing DNAmigration from individual cells subjected to gel electrophoresis. Exp. Cell Res. 198, 259-267.
[322] Olive, P. L. & Banath, J. P. (1993) Detection of DNA double-strand breaks through the cell
cycle after exposure to X-rays, bleomycin, etoposide and 125IdUrd. Int. J. Radiat. Biol. 64,349-358.
[323] Paterson, M. C. & Setlow, R. B. (1972) Endonucleolytic activity from Micrococcus luteus thatacts on γ-ray-induced damage in plasmid DNA of Escherichia coli mini cells. Proc. Natl. Acad.Sci. USA 69, 2927-2931.
231 Références bibliographiques
[324] Fornace, A. J. J., Kinsella, T. J., Dobson, P. P. & Mitchell, J. B. (1986) Repair of ionizingradiation DNA base damage in ataxia telangiectasia cells. Cancer. Res. 4 Pt 1, 1703-1706.
[325] van Loon, A. A., Groenendijk, R. H., van der Schans, G. P., Lohman, P. H. M. & Baan, R. A.(1991) Detection of base damage in DNA in human blood exposed to ionizing radiation atbiologically relevant doses. Int. J. Radiat. Biol. 59, 651-660.
[326] van Loon, A. A., Groenendijk, R. H., Timmerman, A. J., van der Schans, G. P., Lohman, P. H.& Baan, R. A. (1992) Quantitative detection of DNA damage in cells after exposure to ionizingradiation by means of an improved immunochemical assay. Mutat. Res. 274, 19-27.
[327] Blot, W. J., Li, J.-Y. & Taylor, P. R. (1993) Nutrition intervention trials in Linxian, China:supplementation with specific vitamin/mineral combinations, cancer incidence, and disease-specific mortality in the general population. J. Nat. Cancer Instit. 85, 1483-1487.
[328] Ommen, G. S., Goodman, G., Thornquist, M. D., Balmes, J., Cullen, M. R., Keogh, J. P.,Meyskens, F. L., Valanis, J. H., Williams, J. H., Barnhart, S. & Hammer, S. (1996) Effects of acombination of β−carotene and vitamin A on lung cancer and cardiovascular disease. NewEngl. J. Med. 334, 1150-1155.
[329] Pflaum, M., Will, O. & Epe, B. (1997) Determination of steady-state levels of oxidative DNAbase modifications in mammalian cells by means of repair endonucleases. Carcinogenesis 18,2225-2231.
[330] Kielbassa, C., Roza, L. & Epe, B. (1997) Wavelength dependence of oxidative DNA damageinduced by UV and visible light. Carcinogenesis 18, 811-816.
[331] Humar, B., Muller, H. & Scott, R. J. (1997) Elevated frequency of p53-independent apoptosisafter irradiation increases levels of DNA breaks in ataxia telangiectasia lymphoblasts. Int. J.Radiat. Biol. 72, 257-269.
[332] Haring, M., Rudiger, H., Demple, B., Boiteux, S. & Epe, B. (1994) Recognition of oxidizedabasic sites by repair endonucleases. Nucleic Acids Res. 22, 2010-2015.
[333] Epe, B. (1996) DNA damage by peroxynitrite characterized with DNA repair enzymes.Nucleic Acids Res. 24, 4105-4110.
[334] Epe, B., Ballmaier, D., Adam, W., Grimm, G. N. & Saha-Möller, C. R. (1996) Photolysis of N-hydroxypyridinethiones: a new source of hydroxyl radicals for the direct damage of cell-freeand cellular DNA. Nucleic Acids Res. 24, 1625-1631.
[335] Epe, B. & Hegler, J. (1994) Oxidative DNA damage: endonuclease fingerprinting. MethodsEnzymol. 234, 122-131.
[336] Ward, J. F. (1994) The complexity of DNA damage: relevance to biological consequences. Int.J. Radiat. Biol. 66, 427-432.
[337] Bock, C., Dittmar, H., Gemeinhardt, H., Bauer, E. & Greulich, K.-O. (1998) Comet assaydetects cold repair of UVA damages in a human B-lymphoblast cell line. Mutat. Res. 408, 111-120.
[338] Singh, N. P., Danner, D. B., Tice, R. R., Brant, L. & Schneider, E. L. (1990) DNA damage andrepair with age in individual human lymphocytes. Mutat. Res. 237, 123-130.
[339] Pouget, J. P., Ravanat, J.L., Douki, T., Richard, M.J., Cadet, J. (1999) Use of the comet assayto measure DNA damage in cells exposed to photosensitizers and gamma radiation. J. Chim.Phys. 96, 143-146.
Références bibliographiques 232
[340] Devasagayam, T. P. A., Steenkens, S., Obendorf, M. S. W., Schulz, W. A. & Sies, H. (1991)Formation of 8-hydroxy(deoxy)guanosine and generation of strand breaks at guanine residuesin DNA by singlet oxygen. Biochemistry 30, 6283-6289.
[341] Di Mascio, P., Wefers, H., Do-Thy, H.-P., Lafleur, M. V. & Sies, H. (1989) Singlet molecularoxygen causes loss of biological activity in plasmid and bacteriophage DNA and inducessingle-strand breaks. Biochim. Biophys. Acta 1007, 151-157.
[342] Wagner, J. R., Decarroz, C., Berger, M. & Cadet, J. (1999) Hydroxyl-radical induceddecomposition of 2'-deoxycytidine in aerated aqueous solutions. J. Am. Chem. Soc. 121, 4101-4110.
[343] Ward, J. F. (1998) Nature of lesions formed by ionizing radiation. Dans DNA Damage andRepair, Vol II. DNA repair in Higher Eukaryotes (J. A. Nickoloff & M. F. Hoekstra eds) pp.65-84, Humana press, Totawa, NJ, USA.
[344] Collins, A. R., Dusinška, M., Gedik, C. M. & Stetina, R. (1996) Oxidative damage to DNA: dowe have a reliable biomarker ? Environ. Health Perspect. 104, 465-469.
[345] Cullis, P. M., Malone, M. & Merson-Davies, L. A. (1996) Guanine radical cations areprecursors of 7,8-dihydro-8-oxo-2'-deoxyguanosine but are not precursors of immediate strandbreaks in DNA. J. Am. Chem. Soc. 118, 2775-2781.
[346] Gasparutto, D., Ravanat, J.-L., Gérot, O. & Cadet, J. (1998) Characterization and chemicalstability of photooxidized oligonucleotides that contain 2,2-diamino-4-[(2-deoxy-β-D-erythro-pentofuranosyl)-amino-5(2H)-oxazolone. J. Am. Chem. Soc. 120, 10283-10286.
[347] Bourdat, A. G., Gasparutto, A. D. & Cadet, J. (1999) Synthesis and enzymatic processing ofoligodeoxynucleotides containing tandem base damage. Nucleic Acids Res. 27, 1015-1024.
[348] Gedik, C. M., Wood, S. G. & Collins, A. R. (1998) Measuring oxidative damage to DNA;HPLC and the comet assay compared. Free Radic. Res. 29, 609-615.
[349] Pouget, J.-P., Douki, T., Richard, M.-J. & Cadet, J. (2000) DNA damage induced in cells bygamma and UVA radiations: calibrated comet assay, with HPLC/GC-MS and HPLC-ECmeasurements. Chem. Res. Toxicol. , (soumise pour publication).
[350] Pouget, J.-P., Ravanat, J.-L., Douki, T., Richard, M.-J. & Cadet, J. (1999) Measurement ofDNA base damage in cells exposed to low doses of gamma radiation: comparison between theHPLC-EC and the comet assays. Int. J. Radiat. Biol. 75, 51-58.
[351] Chatterjee, A. & Holley, W. R. (1991) Energy deposition mechanisms and biochemical aspectsof DNA strand breaks by ionizing radiation. Int. J. Quant. Chem. , 709-727.
[352] Kraft, G. (1987) Radiobiological effects of very heavy ions: inactivation, induction ofchromosome aberrations and strand breaks. Nuclear Sc. Appl. 3, 1-28.
[353] Kiefer, J. (1985) Review: cellular and subcellular effects of very heavy ions. Int. J. Radiat.Biol. 48, 837-892.
[354] Ritter, M. A., Cleaver, J. E. & Tobias, C. A. (1977) High-LET radiations induce a largeproportion of non-rejoining DNA breaks. Nature 266, 653-655.
[355] Hagen, U. (1994) Mechanisms of induction and repair of DNA double-strand breaks byionizing radiation-Some contradictions. Radiat. Environ. Biophys. 33, 45-61.
[356] Weber, K. J. & Flentje, M. (1993) Lethality of heavy ion-induced DNA double strand-breaksin mammalian cells. Int. J. Radiat. Biol. 64, 169-178.
[357] Griffin, C. S., Harvey, A. N. & Savage, J. R. K. (1994) Chromatid damage induced by 238Pu aparticles in G2 and S phase Chinese hamster V79 cells. Int. J. Radiat. Biol. 66, 85-98.
233 Références bibliographiques
[358] Friedkin, M. & Roberts, D. (1954) The enzymatic synthesis of nucleosides. J. Biol. Chem. 207,257-266.
[359] Berger, M., Anselmino, C., Mouret, J.-F. & Cadet, J. (1990) High performance liquidchromatography-electrochemical assay for monitoring the formation of 8-oxo-7,8-dihydroadenine and its related 2'-deoxyribonucleoside. J. Liq. Chromatogr. 13, 929-932.
[360] Cadet, J., Ulrich, J. & Téoule, R. (1975) Isomerization and new specific synthesis of thymineglycols. Tetrahedron 31, 2057-2061.
Table des matières
- Table des matières -
CHAPITRE I : Etude bibliographiqueI. Rayonnements ionisants et Société __________________________________________ 10
A. Introduction ________________________________________________________________10
B. Rayonnements ionisants_______________________________________________________111. Définition d’un rayonnement ionisant ___________________________________________________122. Quelques notions de base de physique nucléaire ___________________________________________12
C. Le cobalt 60 _________________________________________________________________161. Schéma de désintégration du 60Co ______________________________________________________162. Désintégration β- ___________________________________________________________________163. Emission gamma____________________________________________________________________17
D. Coefficients d’interaction _____________________________________________________171. Pouvoir massique total de ralentissement_________________________________________________172. Coefficient massique de transfert d’énergie µtr/ρ ___________________________________________18
E. Nature des interactions _______________________________________________________181. Interaction des particules chargées ______________________________________________________182. Interaction du rayonnement γ avec la matière______________________________________________20
F. Notions de radiométrie________________________________________________________221. Les unités de radiométrie _____________________________________________________________222. Energie transférée et énergie absorbée localement__________________________________________253. Variation de la dose en fonction de la profondeur __________________________________________26
G. La qualité du rayonnement et la radiosensibilité des tissus__________________________261. Le Transfert d’Energie Linéique (TEL) __________________________________________________272. L’Efficacité Biologique Relative (EBR)__________________________________________________273. La dose équivalente _________________________________________________________________284. La dose efficace ____________________________________________________________________285. Les grandeurs opérationnelles _________________________________________________________29
H. Sources d’exposition _________________________________________________________291. Sources d’irradiation industrielles ______________________________________________________302. Sources d’irradiation médicales ________________________________________________________313. Sources d’irradiation naturelles ________________________________________________________32
II. Effets des rayonnements ionisants __________________________________________ 33A. Effets direct et indirect du rayonnement gamma du 60Co ___________________________33
1. Effet direct ________________________________________________________________________332. Effet indirect_______________________________________________________________________333. Trace d’un rayonnement de faible TEL __________________________________________________35
B. Effets sur les membranes______________________________________________________35
C. Effets sur l’ADN _____________________________________________________________351. Structure de l’ADN__________________________________________________________________352. Fonctions de l’ADN _________________________________________________________________373. Lésions radio-induites de l’ADN _______________________________________________________374. Lésions spontanées de l’ADN _________________________________________________________44
D. Effets d’une irradiation sur les chromosomes : Aberrations chromosomiques__________451. Nature des aberrations _______________________________________________________________452. Transmission des aberrations à la descendance ____________________________________________453. Dosimétrie biologique _______________________________________________________________45
E. Effets d’une irradiation sur le corps humain______________________________________461. Effets déterministes _________________________________________________________________462. Effets aléatoires ____________________________________________________________________46
F. Radioprotection : Les trois principes ____________________________________________491. Les effets déterministes ______________________________________________________________492. Les effets aléatoires _________________________________________________________________493. Justification _______________________________________________________________________504. Limitation _________________________________________________________________________505. Optimisation _______________________________________________________________________506. Limites d’exposition des travailleurs ____________________________________________________50
III. Rayonnements ultra-violets et visible _______________________________________ 51A. Introduction ________________________________________________________________51
B. Origine_____________________________________________________________________51
C. Spectre solaire_______________________________________________________________52
D. Mode d’action des rayonnements ultra-violets et visible ____________________________521. Des réactions directes par transfert d’énergie intramoléculaire ________________________________522. Des réactions de photosensibilisation____________________________________________________52
E. Effets du rayonnement solaire__________________________________________________541. Effets à court terme _________________________________________________________________542. Effets à long terme __________________________________________________________________543. Effets génotoxiques _________________________________________________________________554. Effets cytotoxiques __________________________________________________________________555. Autres effets du rayonnement solaire ____________________________________________________55
IV. La réponse du matériel biologique face aux rayonnements______________________ 55A. Les défenses antioxydantes de la cellule__________________________________________56
B. Les systèmes de réparation des lésions___________________________________________561. Cycle cellulaire_____________________________________________________________________562. Les systèmes de réparation ____________________________________________________________583. La réparation par excision de bases (REB) _______________________________________________59
C. La mort cellulaire____________________________________________________________61
OBJECTIFS DE L’ÉTUDE ___________________________________________ 63
CHAPITRE II : Mise au point de méthodes chromatographiques
I. La technique de postmarquage et les méthodes immunologiques __________________ 67A. La technique de postmarquage _________________________________________________67
1. Principe __________________________________________________________________________672. Mesure des adduits et des bases oxydées de l’ADN_________________________________________67
B. Approche immunologique _____________________________________________________691. Principe __________________________________________________________________________692. Exemples d’utilisation _______________________________________________________________69
II. Optimisation de la méthode d’extraction de l’ADN cellulaire ____________________ 70A. Problématique_______________________________________________________________70
B. Technique de CLHP-DE : Application à la mesure de la 8-oxodGuo __________________711. Présentation de la technique de CLHP-DE________________________________________________712. Mesure de la 8-oxodGuo _____________________________________________________________72
Table des matières
C. Méthode d’extraction de l’ADN cellulaire utilisant le « kit Qiagen » _________________73
D. Méthodes d’extraction de l’ADN cellulaire en phase homogène ______________________741. Méthode au phénol/chloroforme _______________________________________________________742. Méthodes au NaCl ou chaotropique au NaI _______________________________________________74
III. Utilisation de la technique de CG-SM ______________________________________ 78A. Principe de la technique de CG-SM _____________________________________________78
1. Rappel sur la détection par spectrométrie de masse _________________________________________782. Principe de la CG-SM : Conditions opératoires ____________________________________________79
B. Mesure des dérivés Fapy de la guanine et de l’adénine _____________________________811. Procédure suivie ____________________________________________________________________812. Ions caractéristiques _________________________________________________________________833. Standards internes et calibration________________________________________________________834. Exemples de profils d’élution chromatographique __________________________________________85
IV. Utilisation de la technique de CLHP-SM/SM_________________________________ 86A. Principe de la technique de CLHP-SM/SM_______________________________________86
B. Mesure des dérivés Fapy de la guanine et de l’adénine par CLHP-SM/SM ____________871. Spectres de masse et transitions caractéristiques de la FapyGua et de la FapyAde _________________872. Exemples de profils d’élution chromatographique __________________________________________883. Niveau basal de FapyGua dans l’ADN cellulaire : Influence de la déféroxamine __________________88
C. Mesure simultanée des diols de thymidine, de la 5-OHdUrd , de la 5-FordUrd, de la 5-HmdUrd, de la 8-oxodAdo, de la 8-oxodGuo et de la dGuo ____________________________89
1. Spectres de masse___________________________________________________________________902. Transitions caractéristiques ___________________________________________________________933. Hydrolyse enzymatique de l’ADN ______________________________________________________934. Profils d’élution chromatographique ____________________________________________________955. Stabilité des diastéréoisomères cis et trans des diols de thymidine _____________________________986. Standards internes et droites de calibration ______________________________________________101
V. Conclusion ____________________________________________________________ 102
CHAPITRE III : Mesure des dommages radio- et photo-induits dans l’ADN cellulairepar des méthodes chromatographiques
I. Formation de dommages de bases dans l’ADN de monocytes exposés au rayonnement γγγγdu 60Co _________________________________________________________________ 104
A. Mesure par CLHP-DE du taux de formation de la 8-oxodGuo______________________104
B. Détermination par CG-SM du taux de formation des dérivés Fapy purines ___________104
C. Mesure par CLHP-SM/SM du taux de formation des dérivés Fapy purines___________105
D. Mesure simultanée par CLHP-SM/SM du taux de formation des diols de thymidine, de la5-OHdUrd , de la 5-FordUrd, de la 5-HmdUrd, de la 8-oxodAdo, de la 8-oxodGuo et de ladGuo ________________________________________________________________________106
1. Bases pyrimidiques modifiées ________________________________________________________1062. Bases puriques modifiées ____________________________________________________________108
II. Ionisation de l’ADN cellulaire par des impulsions UV LASER __________________ 109A. Mesure par CLHP-DE du taux de formation de la 8-oxodGuo______________________110
B. Mesure simultanée par CLHP-SM/SM du taux de formation des diols de thymidine, de la5-OHdUrd , de la 5-FordUrd, de la 5-HmdUrd, de la 8-oxodAdo, de la 8-oxodGuo et de ladGuo ________________________________________________________________________110
1. Mesure des bases pyrimidiques modifiées _______________________________________________110
2. Mesures de bases puriques modifiées___________________________________________________111
C. Expression du rendement quantique ___________________________________________1121. Paramètres d’irradiation _____________________________________________________________1122. Calcul du rendement quantique _______________________________________________________113
III. Formation des dommages de bases dans l’ADN de monocytes exposés au rayonnementUVA____________________________________________________________________ 114
A. Mesure par CLHP-DE du taux de formation de la 8-oxodGuo______________________114
B. Mesure par CG-SM du taux de formation des dérivés Fapy purines _________________114
IV. Formation des dommages de bases dans l’ADN de monocytes photosensibilisés____ 114A. Détermination par CLHP-DE du taux de formation de la 8-oxodGuo________________115
1. Photosensibilisation par le rose bengal (10-2 D.O.) et par l’acridine orange (5 10-3 D.O.)___________1152. Photosensibilisation par le rose bengal et par l’acridine orange (1 D.O.) _______________________116
B. Mesure du taux de formation des dérivés Fapy purines par CG-SM _________________116
V. Discussion des résultats__________________________________________________ 117A. Mécanismes de formation de la 8-oxodGuo______________________________________117
B. Discussion des aspects méthodologiques ________________________________________1181. L’extraction de l’ADN cellulaire ______________________________________________________1182. La méthode d’analyse par CG-SM _____________________________________________________120
C. Discussion des taux de formation des lésions_____________________________________1231. Irradiation gamma : 8-OxodGuo, lésion majoritaire ? ______________________________________1232. Irradiation au LASER UV de haute intensité _____________________________________________1253. Irradiation UVA et réactions de photosensibilisation ______________________________________126
CHAPITRE IV : Mesure des dommages de l’ADN par la méthode des comètes
I. Méthodes de mesure des coupures de brins de l’ADN __________________________ 129A. Sédimentation sur gradient de sucrose _________________________________________129
B. Méthode basée sur la relaxation de l’ADN_______________________________________129
C. Sédimentation de nucléoïde___________________________________________________129
D. Méthode de « Nick translation » _______________________________________________129
E. Electrophorèse en champ pulsé________________________________________________130
F. La méthode d’élution sur filtre ________________________________________________130
G. La méthode des comètes ou méthode de microélectrophorèse sur gel ________________1301. Principe de la méthode des comètes en milieu alcalin ______________________________________1312. Objectifs de l’étude ________________________________________________________________133
II. Optimisation de la mesure des dommages de l’ADN par la méthode des comètes____ 134A. Le « tail moment » ou « moment de la queue de la comète » ________________________134
B. Méthode standard des comètes ________________________________________________134
C. Méthode des comètes couplée à l’utilisation de Fpg et d’endo III____________________1361. Etape de « préélectrophorèse »________________________________________________________1362. Composition du tampon d’électrophorèse _______________________________________________139
III. Utilisation de la méthode des comètes couplée à Fpg et endo III ________________ 141A. Monocytes exposés au rayonnement gamma du 60Co ______________________________141
Table des matières
1. Utilisation de la Fpg ________________________________________________________________1412. Utilisation de l’endonucléase III_______________________________________________________1423. Utilisation simultanée de l’endonucléase III et de la Fpg____________________________________143
B. Monocytes exposés au rayonnement UVA _______________________________________1441. Utilisation de la Fpg ________________________________________________________________1442. Utilisation de l’endonucléase III_______________________________________________________144
C. Monocytes photosensibilisés par de faibles concentrations de rose bengal et d’acridineorange _______________________________________________________________________145
1. Rose bengal ______________________________________________________________________1452. Acridine orange ___________________________________________________________________146
D. Monocytes photosensibilisés par 1 D.O. de rose bengal et d’acridine orange __________1481. Rose bengal ______________________________________________________________________1482. Acridine orange ___________________________________________________________________148
IV. Méthode des comètes en milieu neutre _____________________________________ 149A. Mesure des CDB selon la méthode décrite par Singh et al. _________________________149
B. Mesure des CDB selon la méthode décrite par Olive et al.__________________________151
V. Expériences mettant en jeu la réparation des lesions __________________________ 152A. Réparation des cassures de brins et sites alcali-labiles_____________________________152
B. Réparation des sites Fpg _____________________________________________________153
VI. Discussion des résultats _________________________________________________ 153A. La méthode des comètes sous ses formes standard et modifiée ______________________153
B. Aspects mécanistiques _______________________________________________________1541. Rappel sur les mécanismes de formation des lésions _______________________________________1542. Niveau basal des lésions_____________________________________________________________1553. Irradiation gamma _________________________________________________________________1564. Réactions de photosensibilisation______________________________________________________1575. Irradiation UVA __________________________________________________________________158
CHAPITRE V : Calibration de la méthode des comètes et aspects mécanistiques
I. Principe de la calibration de la méthode des comètes ___________________________ 160A. Introduction _______________________________________________________________160
B. Hypothèses de la calibration __________________________________________________162
C. Stabilité des substrats de la protéine Fpg en milieu alcalin _________________________1631. Stabilité de la 8-oxodGuo____________________________________________________________1632. Stabilité des dérivés Fapy purines _____________________________________________________163
II. Calibration____________________________________________________________ 166A. Modèle I : Irradiation gamma ________________________________________________166
B. Modèle II : Irradiation de type UVA ___________________________________________167
C. Modèle III : Réactions de photosensibilisation ___________________________________1681. Acridine orange ___________________________________________________________________1692. Rose bengal ______________________________________________________________________170
III. Expression des dommages_______________________________________________ 170A. Niveau basal de 8-oxodGuo (assimilée aux sites Fpg)______________________________171
B. Niveau basal des sites endo III ________________________________________________172
C. Niveau basal des coupures (CSB + CDB + SAL)__________________________________172
D. Taux de formation des différentes lésions _______________________________________172
IV. Discussion des résultats _________________________________________________ 173A. Niveau basal de la 8-oxodGuo _________________________________________________173
B. Aspects mécanistiques _______________________________________________________1741. Niveau basal des différentes lésions ____________________________________________________1752. Taux de formation des différentes lésions_______________________________________________175
CHAPITRE VI : Effets des ions lourds chargés 12C6+ sur l’ADN cellulaire
I. Brefs rappels bibliographiques sur les ions lourds _____________________________ 180II. Mesure de la 5-HmdUrd, de la 5-FordUrd, des diols de thymidine, de la 8-oxodGuo et dela 8-oxodAdo par CLHP-SM/SM ____________________________________________ 182III. Utilisation de la méthode modifiée des comètes ______________________________ 184
A. Utilisation de la Fpg _________________________________________________________184
B. Utilisation de l’endonucléase III _______________________________________________185
IV. Discussion des résultats ________________________________________________ 185
CONCLUSION ET PERSPECTIVES __________________________________ 188
CHAPITRE VII : Partie expérimentale
I. Produits chimiques ______________________________________________________ 194II. Lignée et culture cellulaire _______________________________________________ 194III. Courbe de survie cellulaire ______________________________________________ 194IV. Irradiations et réactions de photosensibilisation _____________________________ 195
A. Irradiations γγγγ et UVA________________________________________________________195
B. Irradiation par des particules de 12C6+ __________________________________________196
C. Irradiation par des impulsions UV LASER______________________________________197
D. Réactions de photosensibilisation ______________________________________________198
V. Méthode de Microélectrophorèse sur gel ____________________________________ 198A. Méthode des comètes en milieu alcalin__________________________________________198
B. Méthode des comètes en milieu neutre__________________________________________1991. Protocole décrit par Singh et al. _______________________________________________________1992. Protocole décrit par Olive et al. _______________________________________________________199
C. Analyse des lames de microscope ______________________________________________199
VI. Méthode d’extraction de l’ADN cellulaire __________________________________ 200A. Méthode chaotropique au NaI ________________________________________________200
B. Méthode au NaCl ___________________________________________________________200
Table des matières
C. Hydrolyse enzymatique de l’ADN sous forme de nucléosides _______________________2001. Hydrolyse de l’ADN préalable à la mesure de la 8-oxodGuo par CLHP-DE_____________________2002. Hydrolyse de l’ADN préalable à la mesure simultanée de sept nucléosides par CLHP-SM/SM ______201
VII. Analyses chromatographiques ___________________________________________ 201A. Courbes de calibration_______________________________________________________201
1. Mesure par CLHP-DE ______________________________________________________________2012. Mesures par CG-SM et par CLHP-SM/SM ______________________________________________202
B. Mesure de la 8-oxodGuo par CLHP-DE ________________________________________204
C. Mesures par CG-SM des dérivés Fapy purines___________________________________2041. Système CG-SM___________________________________________________________________2042. Préparation des échantillons__________________________________________________________204
D. Mesures par CLHP-SM/SM __________________________________________________2051. Système CLHP-SM/SM _____________________________________________________________2052. Mesures de la FapyGua et de la FapyAde _______________________________________________2063. Cinétiques d’hydrolyse de l’ADN _____________________________________________________2064. Mesure des diols de thymidine, de la 5-OHdUrd, de la 5-HmdUrd, de la 5-FordUrd, de la 8-oxodGuo, dela 8-oxodAdo et de la dGuo ____________________________________________________________207
E. Epimérisation des diols de thymidine___________________________________________208
VIII. Stabilité des dérivés Fapy purines en milieu alcalin _________________________ 208A. Stabilité à pH 10 ____________________________________________________________208
B. Stabilité à pH 13 ____________________________________________________________208
C. Efficacité d’exclusion des colonnes Nap 25 ______________________________________209
RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES ________________________________ 211
TABLE DES MATIÈRES_______________________________________________ 234
RésuméNous avons mesuré plusieurs modifications de bases dans l’ADN de monocytes, exposés au
rayonnement γ du 60Co, à la lumière UV LASER de haute intensité, ou soumis à un flux de particulesde 12C6+. Nous avons eu recours à deux approches complémentaires. La première a impliqué lesméthodes de chromatographie liquide haute performance ou gazeuse couplées à une détection parspectrométrie de masse (CLHP-SM/SM ou CG-SM) ou par électrochimie (CLHP-DE). Ces différentestechniques ont permis la mesure du niveau basal et du taux de formation de 7 lésions.
La deuxième approche était basée sur l’utilisation de la méthode des comètes associée auxenzymes de réparation Fpg et endo III. La méthode, sous sa forme standard, permet de mettre enévidence les cassures simple et double brin ainsi que les sites alcali-labiles de l’ADN. Associée à Fpget à endo III, elle a permis de quantifier respectivement des purines et des pyrimidines modifiées. Laconfrontation des deux approches et le recours à d’autres agents oxydants comme le rayonnementUVA ou des photosensibilisateurs exogènes, a permis de calibrer la méthode afin d’estimer le niveaudes différentes classes de lésions. Il ressort de ces travaux que l’approche indirecte, bien que moinsspécifique est moins sujette aux problèmes d’oxydation des bases normales rencontrés lors de lapréparation et de l’analyse des échantillons par les méthodes chromatographiques d’analyse.Toutefois, lorsque ces problèmes d’oxydation sont pris en considération dans les mesures analytiques,les deux approches donnent approximativement les mêmes valeurs. Dans le cas contraire, desvariations d’un facteur 100 à 1000 peuvent être observées. Ainsi, il apparaît aujourd’hui que laplupart des travaux antérieurs concernant la mesure des bases modifiées de l’ADN par la méthodeCG-SM doivent être reconsidérés.
Mots clés : 8-oxoGua, FapyGua, diols de thymidine, dommages de bases, CLHP-SM/SM, CLHP-DE,CG-SM, méthodes des comètes, Fpg, ions lourds, rayonnement gamma, oxydation.
AbstractThe main objective of the current project was to measure DNA base damage in the DNA of a
monocytic cell line exposed to γ-ray, UV LASER pulses or to 12C6+ particles. For this purpose, twoapproaches were developed. The first one consisted of chromatographic methods including highperformance liquid or gas chromatography assay coupled with either an electrochemical (HPLC-EC)or a mass spectrometry detection (HPLC-MS/MS, GC-MS). After optimisation, the latter methodsallowed the measurement of the level of 7 base lesions.
An indirect approach based on the comet assay associated to DNA N-glycosylases was alsoapplied. The latter method, under its standard form, allowed the detection of single and double strandbreaks together with alkali-labile sites. Associated to DNA repair enzymes such as Fpg and endo III, itallowed the measurement of modified purines and pyrimidines, respectively. It was possible tocalibrate the modified comet assay in order to evaluate the level of the previous classes of lesions. Forthis purpose, cells were also exposed to UVA and exogenous photosensitisers. Although the cometassay associated to Fpg and endo III can suffer from a lack of specificity, it was shown to be lesssubject to the artefactual oxidation of the normal bases which occurs during the preparation of thesamples prior to their analysis by HPLC-EC or GC-MS. However, when much attention is devoted toreduce these drawbacks, indirect and direct approaches give approximately the same values. Theselevels are at least 100 fold lower than those reported by many previous studies involving the use ofGC-MS assay. Therefore, many results inferred from the latter method have today to be reconsidered.
Nous avons mesuré plusieurs modifications de bases dans l’ADN de monocytes, exposés aurayonnement γ du 60Co, à la lumière UV LASER de haute intensité, ou soumis à un flux de particulesde 12C6+. Nous avons eu recours à deux approches complémentaires. La première a impliqué lesméthodes de chromatographie liquide haute performance ou gazeuse couplées à une détection parspectrométrie de masse (CLHP-SM/SM ou CG-SM) ou par électrochimie (CLHP-DE). Ces différentestechniques ont permis la mesure du niveau basal et du taux de formation de 7 lésions.
La deuxième approche était basée sur l’utilisation de la méthode des comètes associée auxenzymes de réparation Fpg et endo III. La méthode, sous sa forme standard, permet de mettre enévidence les cassures simple et double brin ainsi que les sites alcali-labiles de l’ADN. Associée à Fpget à endo III, elle a permis de quantifier respectivement des purines et des pyrimidines modifiées. Laconfrontation des deux approches et le recours à d’autres agents oxydants comme le rayonnementUVA ou des photosensibilisateurs exogènes, a permis de calibrer la méthode afin d’estimer le niveaudes différentes classes de lésions. Il ressort de ces travaux que l’approche indirecte, bien que moinsspécifique est moins sujette aux problèmes d’oxydation des bases normales rencontrés lors de lapréparation et de l’analyse des échantillons par les méthodes chromatographiques d’analyse.Toutefois, lorsque ces problèmes d’oxydation sont pris en considération dans les mesures analytiques,les deux approches donnent approximativement les mêmes valeurs. Dans le cas contraire, desvariations d’un facteur 100 à 1000 peuvent être observées. Ainsi, il apparaît aujourd’hui que laplupart des travaux antérieurs concernant la mesure des bases modifiées de l’ADN par la méthodeCG-SM doivent être reconsidérés.
The main objective of the current project was to measure DNA base damage in the DNA of amonocytic cell line exposed to γ-ray, UV LASER pulses or to 12C6+ particles. For this purpose, twoapproaches were developed. The first one consisted of chromatographic methods including highperformance liquid or gas chromatography assay coupled with either an electrochemical (HPLC-EC)or a mass spectrometry detection (HPLC-MS/MS, GC-MS). After optimisation, the latter methodsallowed the measurement of the level of 7 base lesions.
An indirect approach based on the comet assay associated to DNA N-glycosylases was alsoapplied. The latter method, under its standard form, allowed the detection of single and double strandbreaks together with alkali-labile sites. Associated to DNA repair enzymes such as Fpg and endo III, itallowed the measurement of modified purines and pyrimidines, respectively. It was possible tocalibrate the modified comet assay in order to evaluate the level of the previous classes of lesions. Forthis purpose, cells were also exposed to UVA and exogenous photosensitisers. Although the cometassay associated to Fpg and endo III can suffer from a lack of specificity, it was shown to be lesssubject to the artefactual oxidation of the normal bases which occurs during the preparation of thesamples prior to their analysis by HPLC-EC or GC-MS. However, when much attention is devoted toreduce these drawbacks, indirect and direct approaches give approximately the same values. Theselevels are at least 100 fold lower than those reported by many previous studies involving the use ofGC-MS assay. Therefore, many results inferred from the latter method have today to be reconsidered.